Machine Translated by Google
© 2021. Được xuất bản bởi Công ty TNHH Nhà sinh học | Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589
BÀI NGHIÊN CỨU
Biến đổi biểu hiện gen ở phôi Arabidopsis ở phân giải
đơn nhân
Ping Kao1 , Michael A. Schon1 ,Magdalena Mosiolek1 , Balaji Enugutti1 và Michael D. Nodine1,2, *
TRỪU TƯỢNG
Ngay sau khi trứng và tinh trùng được thụ tinh, bộ gen thực vật sẽ
được kích hoạt phiên mã và thúc đẩy một loạt các lần phân chia tế bào
phối hợp để tạo thành kế hoạch cơ thể cơ bản trong quá trình hình thành
phôi. Các tế bào phôi sớm đa dạng hóa nhanh chóng với nhau, và việc
khảo sát động lực biểu hiện gen tương ứng có thể giúp làm sáng tỏ các
chương trình biệt hóa tế bào cơ bản. Tuy nhiên, các bộ dữ liệu phiên
mã phôi thực vật hiện tại hoặc thiếu thông tin cụ thể về tế bào hoặc
bị nhiễm RNA từ các mô không phải phôi xung quanh.
Chúng tôi đã kết hợp việc phân loại hạt nhân được kích hoạt huỳnh quang
cùng với giải trình tự mRNA đơn nhân để tạo ra bản đồ biểu hiện gen
của phôi giai đoạn đầu Arabidopsis thaliana ở độ phân giải đơn bào.
Ngoài việc mô tả đặc điểm của các transcriptomes dành riêng cho tế
bào, chúng tôi đã tìm thấy bằng chứng cho thấy các cơ chế điều hòa biểu
sinh và phiên mã khác biệt hoạt động trên các loại tế bào phôi mới
nổi. Các bộ dữ liệu và phân tích này, cũng như phương pháp chúng tôi
nghĩ ra, được kỳ vọng sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho việc khám phá các
cơ chế phân tử cơ bản hình thành mô hình trong phôi thực vật.
Bài báo này có một cuộc phỏng vấn liên quan đến 'Những người đứng sau
giấy tờ' .
TỪ KHÓA: Arabidopsis, Phôi, RNA-seq đơn nhân, Biểu hiện gen, Yếu tố phiên
mã, Biểu sinh
GIỚI THIỆU CHUNG
và thực vật trên cạn thiết lập kế hoạch cơ thể của chúng trong quá
trình hình thành phôi (Dresselhaus và Jürgens, 2021; Gerri và cộng
sự, 2020), và các cơ chế điều hòa gen tương ứng đã phát triển độc
lập trong hai dòng sinh vật nhân thực chính này để giúp tạo ra sự
đa dạng hình thái bao la được quan sát thấy trong tự nhiên (Bai,
2015; Clark và cộng sự, 2006; Meyerowitz, 2002). Ví dụ, ở động vật,
người ta đã công nhận từ lâu rằng các sản phẩm của gen mẹ kiểm soát
sự hình thành kiểu mẫu ban đầu trước khi chuyển đổi kiểm soát từ
gen mẹ sang gen hợp tử (Lee và cộng sự, 2014; Tadros và Lipshitz,
2009). Ngược lại, sự kích hoạt phiên mã của bộ gen hợp tử ngay sau
khi thụ tinh là cần thiết để kéo dài hợp tử và phân chia ban đầu ở
Nicotiana tabacum (thuốc lá) (Zhao et al.,
1
Viện Gregor Mendel (GMI), Viện Hàn lâm Khoa học Áo, Trung tâm Sinh học Vienna (VBC),
Tiến sĩ Bohr-Gasse 3, 1030 Vienna, Áo. 2 Phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Đại học
Wageningen, Wageningen 6708 PB, Hà Lan.
* Tác giả cho thư từ (michael.nodine@wur.nl)
MAS, 0000-0002-4756-3906; MM, 0000-0002-2204-1298; BE, 0000-0002- 0816-024X; MDN,
0000-0002-6204-8857
Đây là một bài viết về Truy cập Mở được phân phối theo các điều khoản của Giấy phép Ghi công
Creative Commons (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0), cho phép sử dụng, phân phối và sao
chép không hạn chế trong bất kỳ phương tiện nào với điều kiện là tác phẩm gốc phù hợp quy ra.
Biên tập viên xử lý: Ykä Helariutta
Nhận ngày 5 tháng 3 năm 2021; Được chấp nhận ngày 24 tháng 5 năm 2021
2011) và mô hình thực vật có hoa Arabidopsis thaliana (Arabidopsis)
(Kao và Nodine, 2019; Zhao et al., 2019). Ngoài ra, phần lớn các
gen quy định sự phát sinh hình thái của phôi Arabidopsis được biểu
hiện hợp tử (Nodine và Bartel, 2012; Zhao và cộng sự, 2019) và bắt
buộc (Meinke, 2020; Muralla và cộng sự, 2011).
Do đó, gen được biểu hiện từ bộ gen hợp tử trong các giai đoạn phát
triển ban đầu của phôi, và sự đa dạng hóa các chương trình biểu hiện
gen giữa các loại tế bào phôi thực vật góp phần hình thành cơ thể cơ
bản.
Đặc điểm hóa cách các chương trình biểu hiện gen được thiết lập
trong các loại tế bào riêng lẻ của phôi ban đầu là rất quan trọng
để hiểu cơ sở phân tử của sự hình thành kiểu hình ở phôi thực vật
và rộng hơn là các nguyên tắc chung và duy nhất của kiểu hình phôi
ở các sinh vật đa bào.
Màn hình di truyền chuyển tiếp đã xác định thành công nhiều gen
cần thiết cho sự hình thành phôi thực vật thích hợp (Lukowitz và
cộng sự, 2004; Mayer và cộng sự, 1998; Meinke, 2020), nhưng tương
đối ít đột biến trong gen mã hóa các cơ quan điều hòa phiên mã cụ
thể của tế bào đã được phục hồi. Điều này ít nhất một phần là do mức
độ dư thừa di truyền cao giữa các yếu tố phiên mã thực vật (TF)
thường thuộc họ đa gen (Riechmann, 2002). Như một cách tiếp cận
khác, các quần thể RNA có thể được đặc trưng để suy ra các quá trình
điều hòa gen làm cơ sở cho các sự kiện biệt hóa tế bào. Các
transcriptomes được tạo ra từ các phôi ban đầu ở các giai đoạn phát
triển khác nhau do đó đã mang lại những hiểu biết sâu sắc về các quá
trình sinh học vận hành trong các giai đoạn phôi khác nhau (Belmonte
và cộng sự, 2013; Hofmann và cộng sự, 2019; Xiang và cộng sự, 2011;
Zhao và cộng sự, 2019). Tuy nhiên, những transcriptomes này được tạo
ra từ toàn bộ phôi. Các nghiên cứu bổ sung đã tiết lộ các gen được
ưu tiên biểu hiện rộng (Belmonte và cộng sự, 2013; Casson và cộng
sự, 2005; Chen và cộng sự, 2021; Slane và cộng sự, 2014; Zhou và
cộng sự, 2020) hoặc cụ thể hơn (Palovaara và cộng sự, 2017) các vùng
phôi thực vật, nhưng thiếu sự phân giải tế bào hoặc bị nhiễm RNA có
nguồn gốc từ vỏ hạt mẹ bao bọc phôi đang phát triển (Schon và Nodine,
2017).
Giải trình tự mRNA đơn bào (scRNA-seq) là công cụ giúp hiểu các
sự kiện phát triển ở độ phân giải tế bào trong thập kỷ qua (Chen và
cộng sự, 2019; Hwang và cộng sự, 2018). Một số nghiên cứu đã áp dụng
những cách tiếp cận này cho các mô thực vật (Brennecke và cộng sự,
2013; Efroni và Birnbaum, 2016; Jean Baptiste và cộng sự, 2019; Ryu
và cộng sự, 2019; Satterlee và cộng sự, 2020; Shulse và cộng sự,
2019; Song và cộng sự, 2020; Xu và cộng sự, 2021; Zhang và cộng sự,
2019), nhưng scRNA-seq vẫn chưa được báo cáo cho các loại tế bào
riêng lẻ trong phôi thực vật. Điều này chủ yếu là do sự hiện diện
của các thành tế bào cứng để giữ các tế bào thực vật lại với nhau.
Mặc dù các thành tế bào có thể được loại bỏ bằng cách xử lý bằng
enzym đối với các mô dễ tiếp cận, nhưng các kỹ thuật nguyên sinh
như vậy vẫn không thực tế đối với các phôi ban đầu vì chúng ăn sâu vào các mô hạt
Giải trình tự mRNA đơn nhân (snRNA-seq) (Habib và cộng sự, 2016) đưa
ra một phương pháp thay thế để kiểm tra các bản sao chép ở quá trình
phân giải đơn bào ở thực vật và gần đây đã được áp dụng cho
1
Machine Translated by Google
BÀI NGHIÊN CỨU
rễ (Farmer và cộng sự, 2021) và các mô nội nhũ trong hạt (Long và cộng
sự, 2021; Picard và cộng sự, 2021). Ở đây, chúng tôi trình bày một quy
trình làm việc để thu được các bản sao chất lượng cao không bị ô nhiễm
từ các nhân phôi ban đầu riêng lẻ, tiếp theo là việc gán chúng cho các
tiền thân của các mô thực vật cơ bản nhất bao gồm mô phân sinh chồi,
các vùng xa của mô phân sinh rễ và các mô biểu bì và mạch. Đáng chú ý,
các loại tế bào phôi ban đầu này đã biểu hiện các bộ gen đặc trưng, có
các quỹ đạo tiến hóa khác nhau và dường như được điều chỉnh bởi các cơ
chế phiên mã và biểu sinh riêng biệt.
KẾT QUẢ
Thu nhận các bản sao không nhiễm bẩn từ các nhân phôi riêng lẻ
Để thu được các bản sao đơn bào của các phôi Arabidopsis ban
đầu, chúng tôi đã sử dụng phân loại nhân kích hoạt huỳnh quang (FANS)
kết hợp với snRNA-seq (Hình 1A, B). Cụ thể hơn, chúng tôi đã sử dụng một
dòng chuyển gen biểu hiện protein huỳnh quang màu xanh lục cục bộ trong
hạt nhân (GFP) dưới sự kiểm soát của promoter WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX
2 (WOX2) đặc hiệu cho phôi (pWOX2 :: H2B-GFP, pWOX2 :: tdTomato-LTI6b;
sau đây được gọi là pWOX2 :: NLS-GFP) để đánh dấu huỳnh quang các hạt
nhân trong phôi chứ không phải các mô mẹ hoặc nội nhũ xung quanh (Hình
1A) (Gooh và cộng sự, 2015). Chúng tôi chọn tập trung vào phôi giai đoạn
hình cầu vì đây là lúc tiền thân của các mô thực vật cơ bản nhất xuất
hiện dọc theo các trục phôi cơ bản và hướng tâm (Palovaara và cộng sự,
2016). Một cách ngắn gọn, chúng tôi cố định siliques hoặc hạt chứa phôi
giai đoạn hình cầu với nồng độ dithiobis thấp (succinimidyl propionate)
(DSP) trước khi phân lập hạt nhân để bảo tồn RNA. Các hạt nhân cũng được
nhuộm bằng 4 ′, 6- diamidino-2-phenylindole (DAPI), và các hạt nhân
nguyên vẹn được chọn dựa trên cấu hình DAPI (Hình. S1A, C). Sau đó, các
hạt nhân phôi được phân lập dựa trên tín hiệu GFP mạnh của chúng (Hình
S1B, D) và được sắp xếp
Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589
Hình 1. Thu nhận các bản sao không nhiễm bẩn
từ các nhân phôi riêng lẻ. (A) Sơ đồ thể hiện
bộ sưu tập các hạt nhân đơn phôi. Các hạt nhân cố
định dương tính với GFP từ hạt giống đang phát triển
chuyển gen pWOX2 :: NLS-GFP đã được FANS phân loại
và thu thập. Thanh chia độ: 20 μm. (B) Sơ đồ cho
thấy cách các thư viện đơn nhân được tạo ra bằng
giao thức Smart seq2 đã được sửa đổi (Picelli và
cộng sự, 2014a, b), được định lượng theo trình tự và
biểu hiện gen riêng lẻ.
(C) Đánh giá và loại bỏ ô nhiễm của người mẹ.
Các hạt nhân từ mỗi đĩa được chỉ định là phôi hoặc
có nguồn gốc từ áo hạt theo các thử nghiệm phân nhóm
và làm giàu mô không được giám sát (Hình S2A-C). Các
thử nghiệm làm giàu mô dựa trên sự biểu hiện trung
bình của tất cả các hạt nhân hoặc các hạt nhân được
phân loại là phôi hoặc vỏ hạt được trình bày.
riêng lẻ thành các đĩa 96 giếng. Các hạt nhân cố định được khử liên kết
chéo với dithiothreitol (DTT) để cho phép tạo cDNA và giao thức Smart
seq2 (Picelli và cộng sự, 2014a, b) được sử dụng để xây dựng các thư
viện tương thích với giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS). Thư viện NGS
sau đó được giải trình tự trên Illumina HiSeq 2500, tiếp theo là sự căn
chỉnh của các lần đọc NGS với bảng điểm Araport11 (Cheng và cộng sự,
2017) và định lượng bảng điểm bởi Kallisto (Bray và cộng sự, 2016)
(Hình 1B). Sau khi kiểm tra chất lượng (xem Vật liệu và Phương pháp),
534 trong số 744 (72%) hạt nhân được giữ lại để phân tích thêm. Tổng
cộng có 24.591 gen được phát hiện từ tất cả các hạt nhân với trung bình
440.289 lần đọc được căn chỉnh và 2576 gen được phát hiện trên mỗi thư
viện snRNA-seq (Hình. S1E, F; Bảng S1). Do đó, cách tiếp cận của chúng
tôi cho phép chúng tôi có được các thư viện RNA-seq chất lượng cao từ
hàng trăm nhân phôi riêng lẻ.
Việc lây nhiễm bộ dữ liệu mRNA-seq của phôi sớm với RNA từ các mô hạt
mẹ xung quanh là một hạn chế lớn đối với phiên mã phôi (Schon và Nodine,
2017).
Để đánh giá mức độ ô nhiễm của mẹ trong các thư viện snRNA-seq riêng lẻ,
chúng tôi đã áp dụng thử nghiệm làm giàu mô (Schon và Nodine, 2017).
Mặc dù chúng tôi đã cố gắng đạt được độ chính xác 99,9% với sự lựa chọn
nghiêm ngặt của FANS (Hình S1), nhân phôi chỉ bao gồm 0,1-1% hạt nhân
và do đó các sự kiện dương tính giả là không đáng kể và cần phải lọc
thêm.
Theo đó, 20-50% thư viện snRNA-seq trên mỗi đĩa được làm giàu đáng kể
cho các bản sao vỏ hạt hoặc nội nhũ, trong khi các thư viện snRNA-seq
còn lại được làm giàu cho các bản sao phôi hoặc có danh tính không rõ
ràng (Hình S2A). Để xác định một cách có hệ thống các thư viện snRNA-seq
bị ô nhiễm, chúng tôi đã tiến hành phân nhóm không giám sát trên tất cả
các thư viện và gắn nhãn chúng theo điểm làm giàu mô của chúng (Hình
S2B, C).
Bởi vì các cụm 12 và 13 đã được làm giàu cho các thư viện bị nhiễm lớp
vỏ hạt, chúng tôi đã loại trừ chúng khỏi các phân tích tiếp theo
2
Machine Translated by Google

BÀI NGHIÊN CỨU Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589

Hình 2. Xác định các loại tế bào phôi. (A) Giải quyết chín loại ô đã xác định bằng cách phân cụm được giám sát. Các gen đánh dấu biểu hiện ở ít nhất một trong
chín loại tế bào được sử dụng để tính điểm loại tế bào bằng các bài kiểm tra siêu đo. Mỗi chấm đại diện cho một hạt nhân và các hạt nhân được đánh dấu theo loại
tế bào có điểm loại tế bào cao nhất. (B) Mười ba cụm tương ứng với A. Số lượng hạt nhân của mỗi cụm được chỉ ra trong biểu đồ hình bánh rán. (C) Biểu đồ chấm
minh họa các mẫu biểu hiện của các điểm đánh dấu cụ thể cho loại ô đã biết. Các loại tế bào trong đó gen đánh dấu được biểu hiện được mã hóa màu theo A. Kích
thước của các chấm biểu thị tỷ lệ phần trăm nhân mà bản sao được phát hiện cho mỗi cụm và màu sắc đại diện cho mức biểu hiện trung bình được biến đổi theo log10
của mỗi cụm. . (D) Hệ số tương quan của Spearman giữa biểu hiện trung bình cụm và phiên mã phôi giai đoạn hình cầu (32E) và huyền phù (32S) được công bố (Zhou
và cộng sự, 2020) (trái). Kết quả thử nghiệm làm giàu mô dựa trên biểu hiện trung bình của cụm sử dụng các bản sao được công bố từ các mô hạt làm tài liệu tham
khảo (Belmonte và cộng sự, 2013; Schon và Nodine, 2017) (phải). EP, phôi thích hợp; SUS, hệ thống treo; MCE, nội nhũ vi hạt; PEN, nội nhũ ngoại vi; KÍCH THƯỚC,
nội nhũ chalazal; CSC, vỏ hạt chalazal; GSC, vỏ hạt chung. (E) Biểu đồ chấm của các mẫu phiên mã được chọn cho RNA ISH như trong C. Biểu đồ chấm cho 13 ứng viên
RNA ISH còn lại được thể hiện trong Hình S3E. (F) Hình ảnh RNA ISH đại diện cho 20 bản sao được chọn. 13 ứng cử viên RNA ISH còn lại được trình bày trong Hình
S3F. Thang chia vạch: 20 μm. Định lượng hình ảnh RNA ISH được trình bày trong Hình S4. (G) Các loại ô được chỉ định và chữ viết tắt cho các cụm.

3
Machine Translated by Google
BÀI NGHIÊN CỨU
(Hình S2B, C). Để đánh giá thêm về khả năng chúng ta có thể loại bỏ
các hạt nhân không phải phôi, chúng tôi đã kết hợp các mức độ biểu
hiện của thư viện snRNA-seq từ mỗi đĩa và thực hiện các xét nghiệm làm
giàu mô (Hình 1C). Các hạt nhân được giữ lại và bị loại trừ được làm
giàu tương ứng cho các loại tế bào phôi và tế bào áo hạt.
Hơn nữa, các phiên mã từ các hạt nhân được giữ lại giống với các phiên
mã phôi đã được công bố (Hofmann và cộng sự, 2019; Nodine và Bartel,
2012) hơn so với các phiên mã từ các hạt nhân bị loại bỏ (Hình S2C).
Nhìn chung, các tiêu chí nghiêm ngặt của chúng tôi cho phép chúng tôi
loại bỏ thành công các thư viện snRNA-seq không phải phôi và thu được
486 thư viện snRNA-seq chất lượng cao từ các tế bào phôi.
Xác định các loại tế bào phôi Phân nhóm
xấp xỉ và chiếu (UMAP) đồng nhất không giám sát của các thư viện snRNA-
seq có thể phân biệt nhân phù hợp và nhân huyền phù của phôi, nhưng
không phân biệt được các loại tế bào riêng lẻ (Hình S3A). Việc phân
nhóm UMAP không được giám sát không có khả năng phân giải các loại tế
bào riêng lẻ có thể là do số lượng thư viện snRNA-seq được sử dụng
tương đối thấp (n = 486) hoặc số phận thoáng qua của các loại tế bào
phôi sớm. Tuy nhiên, để thay thế cho việc phân nhóm không được giám
sát, chúng tôi đã sử dụng phương pháp làm giàu và cạn kiệt các bản sao
cụ thể của tế bào đã biết trong mỗi nhân để xác định khả năng từng nhân
đến từ mỗi loại tế bào. Đầu tiên, chúng tôi xác định được 174 gen tham
chiếu được biểu hiện trong phôi từ tài liệu và ghi lại các kiểu biểu
hiện của chúng được biểu hiện hoặc không được biểu hiện trong các loại
tế bào có trong phôi hình cầu (Bảng S2; Hình 2A). Cụ thể hơn, chín loại
tế bào được tìm thấy trong phôi hình cầu (Palovaara và cộng sự, 2016)
và có thể được phân loại dựa trên việc chúng có nguồn gốc từ tế bào
đáy lớn hơn hay tế bào đỉnh nhỏ hơn được hình thành khi phân chia hợp
tử. Dòng tế bào cơ bản tương ứng (BCL) bao gồm hệ thống treo đã biệt
hóa tận cùng, kết nối các mô mẹ với phôi thích hợp, cũng như các đầu
cột và trung tâm tĩnh lặng, là tiền thân của các vùng xa của mô phân
sinh rễ. Không giống như BCL, dòng tế bào đỉnh (ACL) phân chia dọc
theo trục phôi hướng tâm để tạo thành các lớp mô đồng tâm. Lớp biểu bì
ngoài cùng, mô đệm ở giữa và các đầu mạch trong cùng tạo ra các mô biểu
bì, mô đất và mô mạch tương ứng; trong khi mô phân sinh chồi ban đầu
sẽ tạo ra các mô không khí sau khi nảy mầm. Sự hiện diện hay vắng mặt
của các gen tham chiếu này sau đó được sử dụng trong các bài kiểm tra
siêu đo để tính điểm loại tế bào cho mỗi nhân của chín loại tế bào này
trong tất cả 486 thư viện snRNA-seq (xem Vật liệu và Phương pháp). Sau
đó, chúng tôi thực hiện phân cụm UMAP dựa trên điểm số loại tế bào và
xác định 12 cụm mà mỗi cụm được làm giàu cho một loại tế bào cụ thể
(Hình 2A, B).
Chúng tôi cũng xác định được một cụm (cụm 4) đã được làm giàu cho nhiều
loại tế bào và có ít gen được phát hiện trên mỗi thư viện snRNA-seq hơn
đáng kể so với các cụm khác. Chúng tôi đã loại bỏ các thư viện snRNA-
seq thuộc cụm này khỏi các phân tích tiếp theo vì chất lượng kém của
chúng, có thể do được tạo ra từ các hạt nhân tổng hợp hoặc phân mảnh.
Các bảng điểm tham chiếu dành riêng cho ô có xu hướng đồng bản địa hóa
thành cùng một cụm (Hình 2C; Hình. S3B) cho thấy rằng việc phân nhóm
theo điểm loại ô tổng hợp lại các mẫu biểu hiện của các điểm đánh dấu
tham chiếu. Ví dụ: bảng điểm WOX5 và JACKDAW (JKD) được làm giàu ở mức
độ viết tắt chữ cái đầu ở tâm tĩnh (Haecker và cộng sự, 2004; Welch và
cộng sự, 2007) và đồng bản địa hóa thành cụm 12. Do đó, bằng cách làm
nổi bật sự khác biệt giữa các loại ô dựa trên bộ gen tham chiếu, chúng
tôi có thể phân giải 486 thư viện snRNA-seq thành 12 cụm đại diện cho
các loại tế bào riêng biệt.
Để kiểm tra độc lập các dự đoán dựa trên điểm đánh dấu này, chúng
tôi so sánh các bản sao của từng cụm tế bào với các bản sao đã được
công bố từ các vùng thích hợp của phôi và vùng huyền phù của
Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589
phôi hình cầu (Belmonte và cộng sự, 2013). Phù hợp với các nhiệm vụ
dựa trên chất đánh dấu, các cụm 8, 10 và 13 được làm giàu độc quyền
cho các bảng điểm huyền phù dựa trên các xét nghiệm làm giàu mô (Hình
2D). Cũng phù hợp với sự phân công loại tế bào, các cụm 1, 2, 5, 6, 7
và 11 chỉ được làm giàu cho các phiên mã thích hợp của phôi. Cụm 9 có
phân loại tế bào hỗn hợp và do đó đã được làm giàu cho cả bản sao phôi
phù hợp và huyền phù. Hầu hết các hạt nhân trong cụm 3 và 12, tương
ứng, được đánh dấu là các chữ cái đầu của columella và các chữ cái đầu
của trung tâm tĩnh lặng, chúng nằm giữa huyền phù và phôi. Trong khi
cụm 3 chỉ được làm giàu cho các bản sao của huyền phù, thì cụm 12 đã
được làm giàu cho cả bản sao phù hợp của huyền phù và phôi. Chúng tôi
cũng xác nhận những kết quả này với một bộ dữ liệu bảng điểm đã được
công bố khác được tạo ra từ bộ phận nâng đỡ phôi và hệ thống treo của
phôi hình cầu (Zhou và cộng sự, 2020) (Hình 2D). Khi hỗ trợ thêm cho
việc gán loại tế bào của các cụm, ba gen không có trong danh sách tham
khảo của chúng tôi gần đây đã được phát hiện biểu hiện cụ thể trong
các chữ cái đầu của mạch máu (Smit và cộng sự, 2020) và cả ba gen này
đều đặc trưng cho cụm 11 (Hình. S3C ) cùng với các gen biểu hiện mạch
máu khác (Hình 2C).
Sau đó, chúng tôi sử dụng lai RNA tại chỗ (ISH) để đánh giá thêm các
chỉ định dựa trên marker của các cụm snRNA-seq cho các loại tế bào
riêng lẻ. Chúng tôi đã chọn 33 gen không có các mẫu biểu hiện được báo
cáo đại diện cho một tế bào hoặc một nhóm tế bào cụ thể dựa trên các
mẫu biểu hiện của chúng (Hình 2E; Hình S3D). Chúng tôi có thể phát hiện
tín hiệu RNA ISH trong ít nhất 50% số phôi cho 26 trong số 33 đầu dò
được thử nghiệm (78,8%) và so sánh mô hình biểu hiện RNA ISH và snRNA-
seq cho những thứ này một cách chi tiết hơn (Hình 2F; Hình S3E, F và Hình S4).
AT3G13690, AT4G29020 và SERINE CARBOXYPEPTIDASE LIKE 25 (SCPL25) được
biểu hiện ở mức cao trong các cụm 2, 5 và 6, và được phát hiện bởi RNA
ISH hầu như chỉ có trong biểu bì.
AT5G01870 cũng được biểu hiện cao trong các cụm 2, 5 và 6, cũng như
cụm 12, và được phát hiện trong các ký tự đầu của biểu bì và columella;
trong khi AT1G04880 được biểu hiện trong các cụm 6 và 9, và được phát
hiện trong biểu bì trên. AT1G80133, AT2G42660, AT3G54780 và GH3.2 được
biểu hiện cao trong các cụm 3 và 12, đồng thời các tín hiệu RNA ISH
được phát hiện trong các chữ cái đầu của cột và trung tâm tĩnh lặng,
cũng như trong toàn bộ hệ thống treo cho GH3.2. LITTLE ZIPPER 4 (ZPR4)
được biểu hiện cụ thể trong cụm 7 dựa trên snRNA-seq và được RNA ISH
phát hiện ở mô phân sinh chồi. PHẢN ỨNG ĐỐI VỚI SỰ CHẾT CHẾT Các phiên
mã 19 (RD19) cũng được phát hiện bởi RNA ISH trong các đoạn đầu của mô
phân sinh chồi, nhưng được biểu hiện ở mức độ vừa phải trong tất cả
các cụm.
Tương tự, AT4G38370 được biểu hiện khắp các cụm, mặc dù mạnh nhất ở
cụm 8, nhưng tín hiệu RNA ISH mạnh hơn ở phôi thích hợp. Hai sự khác
biệt rõ ràng này giữa biểu hiện gen và bản địa hóa RNA có thể là do sự
khác biệt giữa các quần thể mRNA trong nhân và tế bào chất, bao gồm cả
sự biến đổi trong quy định sau phiên mã giữa các loại tế bào. ALCATRAZ
TƯƠNG TÁC PROTEIN 1 (ACI1), AT3G15680 và AT3G15720 được biểu hiện nhiều
nhất trong cụm 11 và được phát hiện trong các đoạn đầu mạch với RNA
ISH. YẾU TỐ TĂNG TRƯỞNG CỦA ROOT MERISTEM 8 (RGF8) được biểu hiện cao
trong các cụm 11 và 12, và các bản sao RGF8 được phát hiện trong các
chữ cái đầu của mạch máu và columella.
AT5G61412, BETA GLUCOSIDASE 17 (BGLU17), COBRA LIKE PROTEIN 6 PRECURSOR
(COBL6), CYSTEINE ENDOPEPTIDASE 1 (CEP1), SỚM SỚM GIỐNG NODULIN PROTEIN
2 (ENODL2), MAYOR LANSFASE PROTEIN 28 (MLTAPI) được biểu hiện trong các
cụm 8, 10 hoặc 13, và tất cả các bản sao tương ứng của chúng đã được
phát hiện trong các chất treo bởi RNA ISH. AT3G13230, MITOTIC ARREST-
DEFICIENT 2 (MAD2) và MỤC TIÊU
4
Machine Translated by Google

BÀI NGHIÊN CỨU Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589

PROTEIN CHO XKLP2 (TPX2) được biểu hiện nhiều trong các cụm 1, 5 và / hoặc 9, các điều khoản GO phát triển, tương ứng. 250 gen được xếp hạng hàng đầu của

và RNA ISH tương ứng tạo ra các mẫu 'muối và hạt tiêu', là dấu hiệu của các cụm smi đã được làm giàu cho các gen liên quan đến quá trình sao chép DNA,

gen quy định chu kỳ tế bào. bao gồm tổ hợp phức hợp trước sao chép, phù hợp với cụm smi đang bị cạn kiệt

Theo đó, chúng tôi quan sát thấy rằng các cụm 1, 5 và 9 đã được làm giàu cho cho các dấu hiệu giai đoạn nguyên phân (Hình S3G). Nhìn chung, các thuật ngữ

các phiên mã được điều chỉnh theo pha phân bào (Menges và cộng sự, 2003) (Hình. GO được làm giàu phù hợp với đặc điểm nhận dạng cụm được chỉ định (Hình 2G)

S3G). Các gen được biểu hiện một cách ưu tiên trong các cụm 1, 5 và 9 cũng có và chỉ ra rằng chúng tôi đã phân loại các loại tế bào phôi với các chức năng

xu hướng được bản địa hóa vào lớp dưới, biểu bì hoặc cả hai lớp, tương ứng. riêng biệt.

Do đó, kết quả của chúng tôi gợi ý rằng các cụm 1, 5 và 9 đại diện cho các tế

bào con đang phân chia (chia bên trong; div.i), biểu bì nguyên mẫu (phân chia Tiếp theo, chúng tôi kiểm tra xem liệu các gen cần thiết cho sự hình thành

bên ngoài; div.o) và các ô phân chia nói chung (div), tương ứng (Hình 2G). phôi có được ưu tiên làm giàu trong 250 gen được xếp hạng hàng đầu của mỗi

Nhìn chung, xác nhận in silico và in situ của chúng tôi chỉ ra rằng chúng tôi cụm hay không. Các gen EMBRYO-DEFECTIVE (EMB) là một tập hợp các gen cần thiết

có thể gán các nhóm thư viện snRNA-seq cho các loại tế bào chính có trong phôi cho sự phát triển bình thường của phôi ở Arabidopsis (Meinke, 2020). Các gen

hình cầu: thể treo (sus1, cụm 10; sus2, cụm 8; sus3, cụm 13); tên viết tắt EMB đã được làm giàu trong 250 gen hàng đầu của các cụm ACL bao gồm sự làm

columella (col; cụm 3), chữ cái đầu ở trung tâm tĩnh lặng (qc; cụm 12); đầu giàu đáng kể trong các cụm smi, div.o và upd. Ngược lại, các gen EMB đã bị

mạch (vas; cụm 11); mô phân sinh chồi ngọn (smi; cụm 7); và biểu bì dưới và cạn kiệt từ 250 gen hàng đầu của các cụm BCL, bao gồm cả sự suy giảm đáng kể

trên (lpd, cụm 2; upd, cụm 6) (Hình 2G). trong các cụm col và sus2 (Hình 3B). Hỗ trợ thêm rằng các gen được biểu hiện

ưu tiên trong ACL có nhiều khả năng được yêu cầu để phát triển thích hợp hơn

so với các gen trong BCL, chúng tôi nhận thấy rằng 250 gen được xếp hạng hàng

đầu trong ACL, và đặc biệt là các cụm div, vas và lpd, có giá trị cao hơn
Đặc điểm chung của các phiên mã từ các loại tế bào phôi Để cung cấp một được bảo tồn trên các loài thuộc họ Cải và cây trồng trên cạn nói chung so
tham số ngắn gọn và thống nhất để kiểm tra các kiểu biểu hiện gen trên với các cụm BCL (Haudry và cộng sự, 2013; Tian và cộng sự, 2020) (Hình 3C;

các loại tế bào phôi, chúng tôi đã tính toán 'điểm làm giàu' ở mỗi nhóm trong Hình. S5A, B). Cũng phù hợp với các phân tích của EMB, 250 gen được xếp hạng

số 12 cụm cho 13.893 phiên mã được phát hiện trong ≥10% hạt nhân trong ≥ 1 hàng đầu trong các cụm BCL được bảo tồn kém hơn, đặc biệt là các gen được làm
cụm (Bảng S3). giàu trong các cụm sus1, sus2, col và qc. Nhìn chung, những kết quả này gợi ý

rằng các gen được biểu hiện ưu tiên trong các cụm ACL, và đặc biệt là các cụm
Điểm tăng cường là sự kết hợp giữa độ lệch của các mức bảng điểm trung bình mạch và div, đang được chọn lọc tinh sạch mạnh hơn so với các gen trong các

và tỷ lệ phần trăm hạt nhân mà nó được phát hiện trong mỗi cụm so với 11 nhóm cụm BCL, đặc biệt là cụm col, đang đột biến với tốc độ nhanh hơn. Điều này

khác (xem Vật liệu và Phương pháp; Bảng S3), và do đó tóm tắt một cách ngắn cũng phù hợp với các hình thái biến đổi hơn của dây treo so với giá đỡ phôi

gọn mức độ phong phú tương đối của mỗi bảng điểm trong mỗi cụm. 250 gen có (Chen và cộng sự, 2021).

điểm làm giàu cao nhất (250 gen được xếp hạng cao nhất) từ mỗi cụm được coi

là các gen biểu hiện ưu tiên cho cụm đó.

Điểm tăng cường của các điểm đánh dấu đã biết phù hợp với các mẫu biểu thức

được báo cáo của chúng (Hình 2C; Hình. S3D). Ví dụ: 74 trong số 118 (62,7%) Các bản sao mã hóa các cơ quan điều hòa biểu sinh khác nhau giữa các

gen tham chiếu nằm trong 250 gen được xếp hạng cao nhất của ít nhất một cụm, loại tế bào phôi Ngay sau khi trứng và tinh trùng được thụ tinh, các

bao gồm bốn gen được xếp hạng cao nhất: PIN FORMED 1 (PIN1; cụm 1), KANADI 1 trạng thái biểu sinh được lập trình lại trong thế hệ mới (Gehring, 2019).

(KAN1; cụm 2), WOX5 (cụm 12) và WUSCHEL LIÊN QUAN ĐẾN HOMEOBOX 8 (WOX8; cụm Điều này bao gồm việc thay thế các histon, cũng như tái thiết lập cảnh quan

13). Để hiểu rõ hơn về quá trình sinh học nào được làm giàu trong mỗi loại tế methyl hóa DNA trên toàn bộ bộ gen bằng các con đường phụ thuộc và phụ thuộc

bào phôi, chúng tôi đã tiến hành phân tích làm giàu thuật ngữ bản thể học gen vào RNA nhỏ (Bouyer và cộng sự, 2017; Ingouff và cộng sự, 2010; Jullien và

(GO) trên 250 gen được xếp hạng hàng đầu của mỗi cụm (Hình 3A; Bảng S4). Các cộng sự, 2012; Nagasaki và cộng sự, 2007; Papareddy và cộng sự, 2020). Bởi vì

thuật ngữ GO được làm giàu đáng kể đã được xác định cho 250 gen xếp hạng cao các trạng thái nhiễm sắc khác biệt như vậy có thể ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự

nhất trong các cụm div, vas, div.i, smi, lpd, div.o và upd, nhưng không phải biểu hiện gen, chúng tôi đã kiểm tra mức độ phiên mã của các gen liên quan

các cụm sus1 / 2/3, col hoặc qc. Không có khả năng phát hiện các thuật ngữ đến điều hòa nhiễm sắc trước đây. Cụ thể hơn, chúng tôi phát hiện ra rằng

được làm giàu trong các cụm BCL này có thể là do chú thích hạn chế của các 50/191 gen liên quan đến các đặc điểm chung của chất nhiễm sắc, sửa đổi

gen được biểu hiện cụ thể trong các loại tế bào này. Phù hợp với các cụm div, histone (tức là acetyl hóa, methyl hóa và ubiquitination), phức hợp ức chế

div.i và div.o đại diện cho các tế bào đang phân chia tích cực, các thuật ngữ polycomb, methyl hóa hoặc demethyl hóa DNA, hoặc sản xuất hoặc hoạt động RNA

GO liên quan đến sự tiến triển qua các giai đoạn phân bào (div và div.o) và nhỏ, có điểm làm giàu ≥ 2,5 trong ≥ 1 cụm tế bào phôi (Erdmann và Picard,

các vi ống (div.i và div.o) đã được làm giàu. Các thuật ngữ GO liên quan đến 2020; Pikaard và Mittelsten Scheid, 2014)

đặc điểm kỹ thuật trục cơ thể cũng được làm giàu trong 250 gen được xếp hạng

hàng đầu của cụm div.i, cũng như cụm mạch. Thuật ngữ GO 'biệt hóa tế bào vi

mô' chỉ được kết hợp với BARELY BẤT KỲ MERISTEM 1 (BAM1) và BAM2, mã hóa các (Hình 4A). Các yếu tố nhiễm sắc nói chung và các thành phần của phức hợp ức

kinase giống như thụ thể. Cả hai đều nằm trong số 250 gen được xếp hạng hàng chế polycomb có xu hướng khác nhau giữa phôi phù hợp và thể treo. HISTONE

đầu của cụm mạch (Bảng S3) và cần thiết cho việc tạo thành mạch ở các mô lá ACETYLTRANSFASE OF THE CBP FAMILY 1 (HAC1) được làm giàu trong các cụm huyền

và rễ (DeYoung và cộng sự, 2006; Fan và cộng sự, 2021). phù, trong khi HISTONE DEACETYLASE 3/4 (HDA3 / 4) được làm giàu trong phôi

thích hợp. Hơn nữa, JUMONJI DOMAIN-CONTAINING16 / 27/29 (JMJ16 / 27/29) và

JMJ22 histone demethylases đã được làm giàu tương ứng trong huyền phù và phôi

thích hợp. Điều thú vị là, hệ treo phân biệt ở cuối được làm giàu cho các

Các cụm biểu bì (lpd và upd) đều được làm giàu cho đặc điểm kỹ thuật của các phiên mã mã hóa protein cần thiết để sản xuất các RNA can thiệp nhỏ 24-nt

thuật ngữ sinh tổng hợp cực trục và sinh tổng hợp cutin trong 250 gen được (siRNA) như CLASSY1 (CLSY1), NUCLEAR RNA POLYMERASE

xếp hạng hàng đầu của chúng. Hơn nữa, 250 gen được xếp hạng hàng đầu của các

cụm lpd và upd có thể được phân biệt với nhau bằng sự biểu hiện quá mức của

chúng ở biểu bì và lá mầm.

5
Machine Translated by Google
BÀI NGHIÊN CỨU
D1A (NRPD1A) và DICER-LIKE3 (DCL3) và điều này phù hợp với các bộ
dữ liệu đã xuất bản trước đây (Belmonte và cộng sự, 2013; Zhou và
cộng sự, 2020). Ngược lại, các gen mã hóa protein Argonaute (AGO;
AGO1 / 5/8/9/10), liên kết với các RNA nhỏ và làm trung gian cho
quá trình ức chế gen, được làm giàu trong tiền chất của mô phân
sinh chồi. Sự phong phú của AGO trong các mô phân sinh ban đầu
được hỗ trợ bởi các báo cáo trước đây (Gutzat và cộng sự, 2020;
Jullien và cộng sự, bản in trước năm 2020; Tucker và cộng sự,
2008) và phù hợp với các con đường giám sát nhỏ qua trung gian RNA
ngăn chặn huy động transposon và các sự kiện làm mất ổn định bộ
gen khác được làm giàu trong tiền thân của tất cả các mô không khí
bao gồm cả các giao tử. Nhìn chung, những kết quả này gợi ý rằng
các con đường phụ thuộc và phụ thuộc RNA nhỏ thiết lập các môi
trường nhiễm sắc riêng biệt trong các tiền chất của dòng tế bào riêng điều
Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589
Hình 3. Đặc điểm chung của các thể
phiên mã từ các loại tế bào phôi. (A)
Năm thuật ngữ bản thể học gen được làm
giàu (GO) hàng đầu được PANTHER xác định
cho mỗi cụm theo 250 gen được xếp hạng
hàng đầu cho mỗi cụm.
Các cụm huyền phù (8,10,13) và cụm
hypophysis (3,12) không có các thuật ngữ
GO phong phú đáng kể và do đó không được hiển
thị. Kích thước và màu sắc của các chấm tương
ứng đại diện cho các thay đổi trong nếp gấp
và -log10- các giá trị P được biến đổi.
(B) Mức độ biểu hiện quá mức của các
gen khuyết tật ở phôi (EMB) đối với 250
gen được xếp hạng cao nhất cho mỗi cụm.
Dấu hoa thị cho biết sự phong phú hoặc
suy giảm đáng kể (P≤0,05) của các gen
EMB so với mong đợi. (C) Điểm bảo tồn
PhastCons (Haudry và cộng sự, 2013) của 250
gen được xếp hạng hàng đầu cho mỗi cụm. Điểm
PhastCons trung bình của tất cả các gen được
biểu hiện được biểu thị bằng một đường đứt nét
và độ lệch so với giá trị trung bình được
trình bày ở hàng trên dưới dạng điểm z. *
P≤0,05, ** P≤0,01, *** P≤0,001; dựa trên các
thử nghiệm Kolmogorov – Smirnov hai mặt với
giả thuyết thay thế rằng sự phân bố điểm bảo
tồn cụm của 250 gen xếp hạng cao nhất không
bằng với tất cả các gen biểu hiện trong phôi.
Điểm PhastCons và PhyloP từ một báo cáo khác
(Tian và cộng sự, 2020) có xu hướng tương tự
(Hình S5).
Sự làm giàu đặc trưng cho tế bào nổi bật nhất là trong các con
đường ảnh hưởng đến quá trình methyl hóa cytosine, thường liên
quan đến sự im lặng phiên mã của các transposon và sự ức chế của
gen promoter (Law và Jacobsen, 2010). CHROMOMETHYL TRANSFERASE 3
(CMT3) và METHYLTRANSFERASE 1 (MET1) mã hóa DNA methyltransferase
để duy trì sự methyl hóa cytosine trong bối cảnh CHG (H G) và
CG, và cả hai đều được làm giàu trong phôi thích hợp. Ngược lại,
các bản sao mã hóa REPRESSOR OF SILENCING (ROS1), DEMETER LIKE 2
(DML2) và DML3 DNA glycosylase cần thiết để loại bỏ các cytosine
bị methyl hóa được làm giàu cao trong BCL bao gồm các ký tự đầu
chuỗi huyền phù, columella và trung tâm tĩnh lặng.
Gần đây, người ta đã tìm thấy 275 gen bị hypermethyl hóa và giảm
lẻ. hòa trong cây con đột biến ba (rdd) ros1 dml2 dml3
6
Machine Translated by Google

BÀI NGHIÊN CỨU Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589

Hình 4. Các bản phiên mã mã hóa

các chất điều hòa biểu sinh khác nhau
giữa các loại tế bào phôi. (A) Bản đồ
nhiệt minh họa điểm làm giàu trong 12
cụm tương ứng với các loại tế bào phôi
khác nhau. Bảng điểm có điểm tăng cường
≥2,5 trong cụm ô ≥1 được hiển thị và điểm
tăng cường được tô màu theo khóa. Tên gen

được chỉ ra và nhận dạng cụm được đánh

dấu và mã hóa màu ở dưới cùng theo Hình
2G. (B) Biểu đồ vĩ cầm (trên cùng) và bản

đồ nhiệt (dưới) của điểm tăng cường cho

16/50 mục tiêu ROS1 / DML2 / DML3 (RDD)
được phát hiện và làm giàu trong dòng tế

bào cơ bản. (C, D) Sơ đồ các bản sao RDD

(C) và các mục tiêu phôi giả định của
chúng (D) dựa trên mRNA-seq đã được công
bố từ các dòng tế bào đỉnh và tế bào đáy
trong phôi giai đoạn một tế bào và 32 tế
bào (Zhou và cộng sự, 2020) .

Các mức bản ghi (các đoạn trên một

kilobase của bản ghi trên một triệu lần
đọc được ánh xạ; FPKM) được tô màu theo các phím.

đang trải qua quá trình phân biệt thành phần khí quản và được coi là một tập khiếm khuyết hình thái trong phôi đột biến thứ ba (Hình S7), điều này có thể

hợp con của các mục tiêu ROS1 / DML2 / DML3 trực tiếp (tức là các mục tiêu RDD) là do dư thừa với DEMETER (DME), mã hóa thành viên họ DNA glycosylase có liên

(Lin và cộng sự, 2020). Chúng tôi đã phát hiện 50/275 mục tiêu RDD trong ≥10% quan chặt chẽ (Choi và cộng sự, 2002; Gong và cộng sự, 2002). Phù hợp với giả

hạt nhân trong ≥1 cụm tế bào phôi với điểm làm giàu ≥2 (Hình 4B; Hình S6). thuyết này, các bản sao DME đã được làm giàu trong BCL và đã tăng mức độ BCL

Mười sáu trong số các mục tiêu RDD này đã được làm giàu cao trong BCL. Các bản giữa các giai đoạn một tế bào và 32 tế bào, tương tự như những gì chúng tôi

sao ROS1, DML2 và DML3 đã được tăng đặc biệt trong BCL giữa các giai đoạn một quan sát được đối với ROS1, DML2 và DML3 (Hình S7). Dựa trên những kết quả

tế bào và 32 tế bào (Zhou và cộng sự, 2020) (Hình 4C). Nhất quán, hầu hết các này, chúng tôi đề xuất rằng các demethylase DNA được kích hoạt trong BCL ở

ứng cử viên mục tiêu RDD phôi thai cũng được tăng BCL trong các giai đoạn phôi giai đoạn hình cầu và xúc tác việc loại bỏ các nhóm methyl khỏi một tập hợp

sớm này (Hình 4D). Mặc dù chúng tôi không thể phát hiện các gen xúc tiến để loại bỏ sự biểu hiện của chúng.

7
Machine Translated by Google

BÀI NGHIÊN CỨU Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589

Sự phong phú khác biệt của các mô-típ liên kết TF
Để hiểu rõ hơn về các quá trình phiên mã giúp xác định các phiên mã dành
riêng cho tế bào phôi thai này, chúng tôi đã kiểm tra xem có bất kỳ mô-
típ DNA đồng thuận nào từ cơ sở dữ liệu CIS-BP của các thí nghiệm liên
kết TF (Weirauch và cộng sự, 2014) bị mô tả quá mức hay không trong phần
khởi động của 250 gen xếp hạng cao nhất của mỗi cụm. Chúng tôi nhận thấy
rằng có tổng cộng 18 họ mô típ TF được mô tả quá mức trong ít nhất một
cụm (Hình 5A). Sự trình bày quá mức của một mô típ cho thấy rằng ít nhất
một trong số các thành viên trong gia đình TF ảnh hưởng đến sự biểu hiện
của 250 gen được biểu hiện ưu tiên hàng đầu của cụm đó. Các nhóm TF gắn
kết các mô típ gần giống nhau có thể rất lớn, gây khó khăn cho việc xác
định nhóm TF hoặc nhóm TF nào trong một gia đình có thể tương tác với
một mô típ nhất định. Chúng tôi đã tìm cách tạo ra một tập hợp các gen
ứng cử viên có nhiều khả năng tương tác với từng mô típ quan trọng trong
phôi thai. Chúng tôi đã coi TF là một ứng cử viên nếu mô-típ ràng buộc
của nó tồn tại trong cơ sở dữ liệu CIS-BP và đã được làm giàu hoặc nếu mô-
và họ.
típ đã được bổ sung tồn tại trong cơ sở dữ liệu cho một TF trong cùng một phân cộng sự, 2007). Nhìn chung, các mô hình làm giàu vị trí liên kết TF
Chúng tôi đã xem xét mối tương quan giữa mức độ làm giàu mô típ họ TF và
mức độ phong phú biểu hiện của các ứng viên TF riêng lẻ (Bảng S5; Hình
5B) và đánh dấu ứng viên có tương quan tích cực hoặc tiêu cực mạnh nhất
(Hình 5C). Ví dụ, WRKY DNA-BINDING PROTEIN 2 (WRKY2) là một chất hoạt
hóa phiên mã trong BCL và được chứng minh là có thể kích hoạt trực tiếp
WOX8 và WOX9 (Ueda et al., 2011). Phù hợp với báo cáo này, mô-típ được
trình bày nhiều nhất trong các cụm BCL là hộp W bị ràng buộc bởi các TF
Mô-típ ràng buộc họ WOX tập trung tương tự trong các cụm BCL, phù hợp
với mô hình biểu hiện quan sát được của WOX8 (Hình 5C) và ở mức độ thấp
hơn của WOX9. RNA mã hóa miền B3 TF FUSCA3 (FUS3) được ưu tiên làm giàu
trong BCL và mô-típ RY được liên kết bởi FUS3 chỉ được làm giàu tương tự
trong các cụm BCL. Duy trì nhận dạng trung tâm tĩnh lặng (QC) trong rễ
yêu cầu JACKDAW (JKD), một thành viên của phân họ INDETERMINATE DOMAIN
(IDD) của các TF ngón tay kẽm C2H2 (Welch và cộng sự, 2007). Mô típ IDD
được làm giàu độc quyền trong các chữ cái đầu QC, trong đó JKD là gen
được xếp hạng cao thứ hai sau WOX5. Lớp IV HOMEODOMAIN LEUCINE ZIPPER
(HD-ZIP) bao gồm các gen đánh dấu lớp L1 MERISTEM LAYER 1 (ATML1) và
PROTODERMAL FACTOR 2 (PDF2), và các vị trí liên kết của chúng được đại
diện quá mức trong ba cụm biểu bì. Các mô-típ liên kết của R1R2R3 Myb
TFs, còn được gọi là các phần tử kích hoạt nguyên phân (MSA), được làm
giàu trong ba cụm được xác định trước đây là các mô đang phân chia tích
cực (div, div.i, div.o), phù hợp với vai trò của R1R2R3 Myb TFs trong
việc điều hòa tích cực các gen cần thiết cho quá trình tạo tế bào (Haga
phù hợp với các tài liệu về quá trình phát triển phôi sớm và danh sách
các TF ứng cử viên có thể đóng vai trò là nguồn tài liệu có giá trị cho
các nghiên cứu trong tương lai.
THẢO LUẬN

WRKY và điều này tương quan tốt với sự làm giàu biểu thức của WRKY2
(Pearson r = 0,86; Bảng S5). Ngoài WRKY2, mẫu biểu hiện của hai TF WRKY
khác (WRKY28 và WRKY19) có tương quan chặt chẽ với sự làm giàu của mô
típ WRKY (tương ứng r = 0,94 và 0,96 của Pearson; Hình 5B, C).
Chúng tôi đã phát triển một phương pháp để tạo ra các bản sao chất lượng
cao từ các nhân phôi đơn lẻ mà không bị nhiễm bẩn từ các mô hạt xung
quanh (Hình 1). Sau đó, các phiên mã hạt nhân riêng lẻ được nhóm lại
theo loại tế bào của chúng, được xác nhận bằng cách sử dụng bộ dữ liệu
đã xuất bản và RNA ISH (Hình 2). Điều này cho phép chúng tôi xây dựng
bản đồ biểu hiện gen của phôi Arabidopsis ở

Hình 5. Các họa tiết liên kết TF được làm giàu theo cụm. (A) Biểu đồ chấm của các họ TF có mô-típ liên kết DNA được làm giàu đáng kể trong ít nhất một cụm. Kích
thước chấm cho thấy mức độ phong phú đáng kể nhất (-log10 P-value, AME) của một mô-típ trong họ; màu chấm mô tả tỷ lệ phần trăm của 250 gen được xếp hạng cao
nhất có trình tự khởi động chứa mô típ xác định. (B) Số TF trong mỗi họ được phát hiện trong tập bản đồ hình cầu (trái), có mối tương quan Pearson giữa làm giàu
biểu thức và làm giàu mô típ trên các cụm lớn hơn 0,5 (giữa) hoặc nhỏ hơn 0,5 (phải). (C) Bản đồ nhiệt về điểm số làm giàu biểu thức cho TF trong mỗi gia đình
với điểm làm giàu biểu thức có mối tương quan chặt chẽ nhất với làm giàu mô típ.

số 8
Machine Translated by Google

BÀI NGHIÊN CỨU Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589

giai đoạn hình cầu khi kế hoạch cơ thể cơ bản đang được thiết lập. Kết quả của phát triển hệ thống treo (Lotan và cộng sự, 1998). Mặc dù VRN và AHL TFs không

chúng tôi được xây dựng dựa trên nghiên cứu cơ bản kiểm tra sự khác biệt của có các chức năng được báo cáo trong hệ thống treo, nhưng mô-típ ràng buộc và

biểu hiện gen giữa hai dòng tế bào hư hỏng đầu tiên (Belmonte và cộng sự, biểu hiện của các thành viên gia đình tương ứng của chúng (tức là VRN1, AHL1

2013; Chen và cộng sự, 2021; Zhou và cộng sự, 2020) để giúp mô tả các chương và AHL6) đã được làm giàu huyền phù, phù hợp với các chức năng điều chỉnh

trình biểu hiện gen khác biệt như thế nào, và các loại tế bào tương ứng, được phiên mã. Các TF của TELOMERE BINDING PROTEIN (TBP) cũng không liên quan đến

tạo ra trong quá trình hình thành phôi sớm. sự phát triển của huyền phù, và sự biểu hiện TBP và các mô-típ liên kết TBP đã

Bởi vì quỹ đạo tiến hóa và các bản sao mã hóa các yếu tố biểu sinh hoặc các được làm giàu và cạn kiệt trong các chất xúc tiến gen được làm giàu huyền phù,

cơ quan điều hòa phiên mã khác nhau ở các loại tế bào phôi sớm, chúng tôi đã tương ứng. TBP có thể tuyển dụng các phức hợp nhóm polycomb (PcG) để nhắm mục

khảo sát các khía cạnh này để hiểu sâu hơn về cách các chương trình biểu hiện tiêu các locus và giúp kìm hãm sự biểu hiện của chúng (Zhou và cộng sự, 2016,

gen khác biệt được thiết lập trong các phôi ban đầu. 2018). Tương tự, các TF PENTACYSTEINE (BPC) CƠ BẢN cũng có thể tuyển dụng các

Phù hợp với một nghiên cứu gần đây, chúng tôi phát hiện ra rằng các gen PcG để nhắm mục tiêu các locus (Hecker và cộng sự, 2015; Xiao và cộng sự,

được biểu hiện ưu tiên trong hệ thống treo có xu hướng khác nhau nhiều hơn 2017), và biểu hiện của các thành viên gia đình BPC cụ thể (ví dụ: BPC5 / 7)

đã được làm giàu trong các chất treo, và Các mô-típ liên kết BPC đã cạn kiệt
giữa các loài so với các gen trong các động vật hỗ trợ phôi (Geist và cộng sự, 2019).

Hơn nữa, các gen có biểu hiện phong phú trong các chữ cái đầu của columella từ các trình khởi động của 250 gen huyền phù được xếp hạng hàng đầu (Bảng S5).

là một trong những gen tiến hóa nhanh nhất trong các loại tế bào mà chúng tôi Các thí nghiệm trong tương lai được yêu cầu để kiểm tra xem việc tuyển dụng

đã kiểm tra (Hình 3C; Hình. S5). Xung đột giữa các anh chị em trong gia đình PcG qua trung gian TBP / BPC và kết quả là sự im lặng biểu sinh có cần thiết

vì nguồn lực của mẹ được cho là thúc đẩy sự tiến hóa thích nghi của các chất cho sự phát triển của huyền phù hay không.

treo (Geist và cộng sự, 2019), hỗ trợ phôi phát triển thích hợp và có thể đóng

vai trò như một đường dẫn cho các phân tử có nguồn gốc từ mẹ (Nagl, 1990; Các chữ cái đầu QC có nguồn gốc từ dẫn xuất trên cùng của BCL và, không

giống như chất treo, đóng góp vào các mô sau phôi.
Robert và cộng sự, 2018 ; Shi và cộng sự, 2019; Stadler và cộng sự, 2005; Yeung, 1980).

Bởi vì chữ cái đầu của columella nằm giữa hệ thống treo và phôi, chúng có thể Mô-típ ràng buộc IDD TF đã được làm giàu đặc biệt trong các chữ cái đầu QC và

giúp điều chỉnh giao tiếp giữa mẹ và con của chúng. Ngoài ra, các glycosylase biểu hiện của thành viên gia đình IDD, JKD, được yêu cầu cho nhận dạng QC từ

DNA cần thiết cho quá trình khử methyl của DNA được điều chỉnh trong BCL của gốc (Welch và cộng sự, 2007), được làm giàu ở các chữ cái đầu QC nhưng không

phôi thai và kết quả của chúng tôi phù hợp với việc chúng xúc tác loại bỏ quá phải chất treo (Hình. 5). Điều này ngụ ý rằng việc chồng chất JKD lên các tổ

trình methyl hóa đàn áp phiên mã từ các gen xúc tiến ở giai đoạn hình cầu hợp BCL TF có thể thúc đẩy nhận dạng ban đầu QC trong các phôi ban đầu. Ngược

(Hình 4). Điều thú vị là, các gen cần thiết cho quá trình sinh sinh 24-nt siRNA lại với BCL, biểu bì con (tức là các tế bào bên trong của phôi thích hợp) được

(ví dụ CLSY1, NRPD1A và DCL3) được ưu tiên biểu hiện trong các chất treo trong làm giàu trong các mô típ bao gồm các mô hình cho BPC, TBP và ERF TFs (Hình

khi các bản sao mã hóa một số protein AGO liên kết với các RNA nhỏ và làm 5). Trong số một số thành viên gia đình ERF khác được ưu tiên biểu hiện trong

trung gian ức chế gen đã được làm giàu trong các bộ nâng phôi, đặc biệt là các phôi phù hợp, DRN có chức năng ngược dòng của auxin và liên kết với các mô típ

đoạn đầu mô phân sinh từ đó các giao tử cuối cùng được tạo ra (Hình 4A). Hơn GCC để thúc đẩy nhận dạng mô phân sinh (Chandler et al., 2007; Eklund et al.,

nữa, các RNA nhỏ có thể di chuyển giữa các tế bào thông qua plasmodesmata 2011; Iwase et al., 2017; Kirch et al. al., 2003). Biểu bì đã biểu hiện các

(Vatén và cộng sự, 2011), nó cũng kết nối các chất treo với các giá đỡ phôi gen đặc trưng của các quá trình cụ thể vốn có ở lớp ngoài cùng trong quá trình

(Mansfield và Briarty, 1991). Tương tự như những gì đã được đề xuất trong các hình thành phôi sớm (Hình 3A) và được làm giàu cho các mô típ HD-ZIP IV TF

loại tế bào biệt hóa giai đoạn cuối khác trong các mô sinh sản (Calarco và (Hình 5A). Theo đó, các bảng điểm mã hóa các thành viên họ ATML1 và PDF2 đã

cộng sự, 2012; Feng và cộng sự, 2013; Hsieh và cộng sự, 2009; Ibarra và cộng được bổ sung thêm trong biểu bì nguyên mẫu và được yêu cầu cho đặc điểm kỹ

sự, 2012; Mosher và Melnyk, 2010 ; Slotkin và cộng sự, 2009), có thể tưởng thuật của nó (Abe và cộng sự, 2003; Ogawa và cộng sự, 2015). Một tế bào khác

tượng rằng các chất treo tạo ra một lượng lớn các siRNA 24-nt chảy vào các bộ làm giàu các mô típ điều hòa cis đã được quan sát thấy đối với các TF RKD

phận nâng đỡ phôi và giúp im lặng và cố định các transposon để hạn chế khả trong các mô phân sinh chồi ban đầu. Các gen RKD có xu hướng được biểu hiện

năng gây đột biến của chúng. Mặc dù nằm ngoài phạm vi của nghiên cứu hiện tại, trong các mô sinh sản của cây trồng trên cạn (Jeong và cộng sự, 2011; Koi và

việc định hình siRNAs và dấu hiệu biểu sinh ở tế bào cụ thể trong tương lai sẽ cộng sự, 2016; Kő szegi và cộng sự, 2011; Waki và cộng sự, 2011) và sự biểu

cho phép xác định đặc điểm của quá trình khử methyl DNA và sản xuất siRNA hiện quá mức của chúng đủ để gây ra biểu hiện của các loại tế bào không biệt

trong chất treo. hóa (Kő szegi và cộng sự, 2011; Waki và cộng sự, 2011). Do đó, sự phong phú

của các mô típ RKD, cũng như sự biểu hiện ưu tiên của các thành viên họ RKD3 /

5, trong các mô phân sinh ban đầu làm cho RKD3 / 5 trở thành ứng cử viên tốt

cho việc điều tra trong tương lai về việc thiết lập các chương trình biểu hiện

Rõ ràng rằng TF thúc đẩy sự hình thành kiểu hình trong quá trình phát sinh gen ban đầu của mô phân sinh chồi.

phôi động vật, nhưng tương đối ít người biết về quy định phiên mã trong phôi

thực vật, một phần do sự dư thừa giữa các thành viên họ TF. Bằng cách kiểm tra

mối quan hệ giữa các mức biểu hiện TF và sự phong phú / cạn kiệt của các mô Ngoài việc cung cấp tập bản đồ biểu hiện gen phôi sớm, quy trình làm việc

liên kết tương ứng của chúng trên các loại tế bào phôi, chúng tôi vừa xác minh được trình bày có thể giúp hướng dẫn các thí nghiệm snRNA-seq trên phôi và các

các mô hình hiện có vừa đưa ra các giả thuyết có thể kiểm tra được về cách các mô thực vật khác khó tiếp cận. Việc áp dụng các kỹ thuật tương tự trong tương

TF cụ thể ảnh hưởng đến các chương trình biểu hiện gen cụ thể của tế bào trong lai ở các giai đoạn phôi ở Arabidopsis và các loài khác sẽ góp phần hiểu sâu

phôi Arabidopsis ban đầu (Hình. 5; Bảng S5). Ví dụ, chúng tôi đã quan sát thấy hơn về cách các chương trình biểu hiện gen được thiết lập động trong quá trình

các mô hình đặc trưng của sự phong phú mô típ liên kết TF và các mô hình biểu hình thành phôi thực vật. Hơn nữa, tích hợp dữ liệu snRNA-seq với các công

hiện trong dây treo, các ký tự đầu ở tâm tĩnh lặng, biểu bì phụ, biểu bì gốc nghệ gen đơn bào khác như ATAC-seq đơn bào (Buenrostro và cộng sự, 2015;

và các ký tự đầu của mô phân sinh chồi (Hình 5). WRKY2 điều chỉnh sự phát Cusanovich và cộng sự, 2015) có thể cho phép xác định rõ hơn các cơ chế điều

triển của hệ thống treo bằng cách kích hoạt phiên mã WOX8 và WOX9, do đó chúng hòa gen hoạt động trong phôi thực vật. Chúng tôi hy vọng rằng, cùng với các

được yêu cầu dư thừa để phát triển hệ thống treo (Breuninger và cộng sự, 2008; nghiên cứu tập trung hơn, các bộ dữ liệu toàn bộ bộ gen này sẽ giúp chúng ta

Ueda và cộng sự, 2011, 2017). Theo đó, hệ thống treo đã được làm phong phú hiểu rõ hơn về cơ sở phân tử của sự hình thành mẫu trong phôi thực vật.

thêm cho các họa tiết WRKY và WOX, cũng như các họa tiết cho FUS3 cũng được

liên quan đến

9
Machine Translated by Google
BÀI NGHIÊN CỨU
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu
thực vật, điều kiện sinh trưởng và kính hiển vi Cây Arabidopsis
thaliana gia nhập Columbia (Col-0) Cây chứa pWOX2 :: H2B-GFP, pWOX2 :: tdTomato-
RCI2b (pWOX2 :: NLS-GFP)
(Gooh và cộng sự, 2015) hoặc không có gen chuyển được phát triển ở 20-22 ° C và
chu kỳ 16 giờ sáng / 8 giờ tối dưới đèn sợi đốt (130-150 µmol / m2 / s) trong
buồng tăng trưởng được kiểm soát khí hậu. Các thể đột biến ba lần thứ nhất bao
gồm ros1-3, dml2-1 và dml3-1 (Penterman và cộng sự, 2007) và kính hiển vi Nomarski
đã được thực hiện như đã mô tả trước đây (Plotnikova và cộng sự, 2019).
Phân lập hạt nhân và FANS Phát
triển hạt chứa phôi hình cầu từ các dòng chuyển gen pWOX2 :: H2B-GFP, pWOX2 ::
tdTomato-RCI2b và Col-0 kiểu dại đã được phân lập trước khi phân loại. Đối với mỗi
bộ, các hạt đang phát triển được phân lập bằng kim vonfram dưới kính hiển vi soi
nổi từ 20 siliques tự thụ phấn ở giai đoạn 17 (Smyth và cộng sự, 1990), tương ứng
với 72 giờ sau khi thụ phấn khi hầu hết các phôi ở giai đoạn đầu / giữa hình cầu
trong các điều kiện tăng trưởng được sử dụng. Các hạt đang phát triển được phân
lập vào cùng một thời điểm trong ngày để giảm thiểu các biến thể do nhịp sinh học
gây ra và ngay lập tức được chuyển vào đệm cố định 600 μl được làm lạnh bao gồm
đệm của 1 × Galbraith [20 mM MOPS (pH 7,0), 30 mM natri xitrat, 1% Triton X -100,
45 mM MgCl2] và 500 µM dithiobis (succinimidyl propionat) (DSP; Thermo Fisher
Scientific). Tất cả các bộ đệm được sử dụng trong phân lập và phân loại hạt nhân
đều chứa chất ức chế RNAse 0,4 U / ml (New England Biolabs). Các mẫu liên kết chéo
được ủ với 800 μl đệm dập tắt [1 M Tris-HCl (pH 7,0), 30 mM natri xitrat, 1%
Triton X-100 và 45 mM MgCl2] ở nhiệt độ phòng trong 15 phút với lắc nhẹ. Các mẫu
đã được dập tắt được rửa hai lần với 600 μl HG-GB (1 × Galbrath's đệm và 1 M
hexylene glycerol; Sigma-Aldrich). Các hạt sau đó được đồng nhất nhẹ nhàng bằng
chày vi sinh trong các ống vi 1,5 ml với 200 μl HG GB. Các chày siêu nhỏ được
tráng với 400 μl HG-GB, và các mẫu đã đồng nhất được dùng pipet nhẹ nhàng dùng
pipet hút mười lần trước khi ủ ở 4 ° C trong 15 phút để tối đa hóa sự giải phóng
hạt nhân. Các mẫu đã đồng nhất một phần sau đó được lọc bằng các bộ lọc 30 μm và
được thu thập trong các vi ống 2 ml. 600 μl HG-GB khác được thêm vào ống nhỏ 1,5
ml, được lọc và thu thập lần lượt qua cùng một bộ lọc 30 μm và ống nhỏ 2 ml để tối
đa hóa việc thu hồi hạt nhân. Các mẫu đã lọc sau đó được ly tâm ở 1000 g ở 4 ° C
trong 10 phút. Phần nổi phía trên được loại bỏ cẩn thận mà không làm xáo trộn các
viên hạt nhân màu xám. Một phần nhỏ mới của 1 ml HG-GB và 1 μl 10 mg / ml DAPI đã
được thêm vào vi ống và viên nhỏ được lơ lửng lại nhẹ nhàng.
Sau đó, các mẫu được rửa năm lần, bao gồm ly tâm 10 phút ở 1000 g ở 4 ° C và thay
thế phần nổi phía trên bằng phần mẫu mới 1 ml 1 × đệm của Galbrath. Các hạt nhân
đã rửa sạch sau đó được tái lơ lửng trong 800 μl 1 × Galbraith đệm để phân loại.
Các hạt nhân cô lập được phân loại bằng Máy phân loại tế bào BD FACSAria ™ III
(BD Biosciences) với vòi phun 70 μm. Các cổng phân tán đã được điều chỉnh cho phù
hợp với hạt nhân Col-0. Tín hiệu DAPI được kích hoạt bằng tia laser 375 nm và
được thu thập bằng bộ lọc 450/40 nm. Tín hiệu GFP được kích hoạt bằng tia laser
488 nm và được thu thập bằng bộ lọc 530/30 nm. Để tối đa hóa độ tinh khiết, chỉ
những giọt chứa tín hiệu DAPI trong hai vùng đỉnh đại diện cho 2 hạt nhân không
đổi (2C) và 4 không đổi (4C) (Hình. S1A, C) mới được xem xét cho GFP. Đối với GFP
gating, một vùng có tín hiệu huỳnh quang tự động thấp và tín hiệu GFP cao được
chọn (Hình. S1B, D), vùng này có ít hơn ba sự kiện trong các mẫu Col-0 và trung
bình ≥200 sự kiện cho các mẫu pWOX2 :: NLS-GFP. Mỗi nhân đi qua cả quá trình tạo
gen DAPI và GFP được thu thập với cài đặt tế bào đơn trong 4 μl dung dịch đệm ly
giải tế bào (Picelli và cộng sự, 2014a) được bổ sung 25 mM DTT trong các giếng
đơn gồm 96 đĩa giếng.
Thư viện snRNA-
seq Smart-seq2 được chuẩn bị theo giao thức tế bào đơn SmartSeq2 đã xuất bản
(Picelli và cộng sự, 2014a, b) với thời gian ủ thêm 30 phút 37 ° C trước khi phiên
mã ngược. Các thư viện được sắp xếp theo trình tự trên Illumina Hi-Seq 2500 ở chế
độ một đầu 50 đế. Các lần đọc theo trình tự từ mỗi mẫu đã được xử lý trước bằng
cách cắt các bộ điều hợp bằng cách sử dụng cutadapt v2.6 (Martin, 2011) theo hai
bước. Đầu tiên, bộ điều hợp Nextera
Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589
(5′-CTGTCTCTTATACACATCTCCGAGCCCACGAGAC-3 ′) được cắt từ 3 ′ cuối của là
lần đọc, tiếp theo là cắt các ô sắp xếp chuyển đổi mẫu (TSO; 5′-
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTA CATGTCGG-3 ′) và bộ điều hợp oligo-dT (5TT′TT-ATTAGTT-
ATTAGTT-ATTAGTT-ATTAGTAG ′) Từ các lần đọc 5 được
′ và tạo
3 ′ từ
tương
tệp ứng.
FASTAChỉ
kếtmục
hợpKallisto
của
tất cả các mô hình bảng điểm trong EnsemblPlants TAIR10 v40 (ftp://
ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-40/gff3/ arabidopsis_thaliana/
Arabidopsis_thaliana.TAIR10.40.gff3.gz ), 96 bảng điểm tăng đột biến ERCC và sGFP.
Mỗi tệp FASTQ mẫu đã cắt xén được ký hiệu giả cho chỉ mục này bằng lệnh 'kallisto
quant' với các tùy chọn '–single –fragment-length 200 –sd 100' để tạo ra một bảng
điểm trên một triệu (TPM) cho mỗi mẫu.
Kiểm soát chất lượng và chuyển đổi số lượng điều tra
dân số Bảng TPM, dữ liệu tế bào và dữ liệu gen đã được nhập vào Monocle3 (Cao
và cộng sự, 2019). Các thư viện có ít hơn 100.000 lần đọc được căn chỉnh hoặc
1000 gen được phát hiện được coi là chất lượng thấp và bị loại khỏi các phân
tích tiếp theo. Các giá trị TPM sau đó được chuyển đổi thành số lượng điều tra
dân số bằng thuật toán chuyển đổi điều tra dân số (Qiu và cộng sự, 2017; Trapnell
và cộng sự, 2014). Số lượng điều tra dân số được sử dụng làm mức độ biểu hiện
gen trong các phân tích tiếp theo.
Các xét nghiệm loại bỏ ô nhiễm của mẹ và làm giàu mô Các giá trị biểu hiện
gen được sử dụng để thực hiện các xét nghiệm làm giàu mô với các cài đặt mặc định
như được mô tả (Schon và Nodine, 2017). Biểu thức đếm điều tra dân số và siêu dữ
liệu của thư viện snRNA-seq từ tám tấm (Bảng S1) được xây dựng như một tập dữ liệu
ô (CDS) trong Monocle3 với R phiên bản 3.6.3. Việc kiểm soát chất lượng được thực
hiện theo hướng dẫn Monocle3. Các gen đi qua hàm Det_genes của Monocle3 (CDS,
min_expr = 0,1) và được biểu hiện trong ít nhất ba hạt nhân đã được xem xét trong
các phân tích tiếp theo. Các bước kiểm tra chất lượng trên đã tạo ra một CDS có
534 hạt nhân và 24.591 gen. Phân nhóm và giảm thứ nguyên UMAP không được giám sát
(McInnes et al., 2018) được thực hiện trên CDS này đã dẫn đến 20 cụm. Hai trong
số các cụm (Cụm 12 và 13 trong Hình S2) bị chi phối bởi các hạt nhân giống với
lớp vỏ hạt tham chiếu theo các thử nghiệm làm giàu mô, và do đó các hạt nhân tương
ứng bị loại khỏi các phân tích tiếp theo. Sau khi loại bỏ ô nhiễm, một CDS chứa
486 nhân phôi hình cầu và 23.959 gen có thể phát hiện được sau đó được sử dụng để
tính toán điểm số loại tế bào và phân nhóm tiếp theo.
Tính toán điểm số của loại tế bào cho nhân hình cầu và sự phân nhóm Một bộ gồm
174 gen đánh dấu phôi dựa trên RNA ISH hoặc dung hợp phiên mã / dịch mã sang phóng
xạ huỳnh quang hoặc beta-glucuronidase (GUS) được thu thập từ tài liệu (Bảng S2).
Mức độ biểu hiện được ghi lại là (các) biểu hiện mạnh, biểu hiện yếu (w), không
biểu hiện (n) hoặc không thông tin (NA) cho mỗi loại trong số chín loại tế bào:
upd, lpd, smi, phía trên bên trong ngoại vi (uip), vas , tên viết tắt của mô đất
(grd), qc, col và sus. Ma trận 174 × 9 tương ứng được giao với các gen được biểu
hiện trong thư viện snRNA-seq hình cầu của chúng tôi, có ít nhất một số lượng điều
tra dân số trong ít nhất bảy hạt nhân. Kết quả 135 gen đánh dấu biểu hiện được
dùng làm tham chiếu cho các phép tính điểm loại tế bào, với 56, 52, 38, 43, 62,
43, 56, 51 và 29 dấu hiệu dương tính (tức là biểu hiện mạnh hoặc yếu) và 79, 83,
97 , 92, 73, 92, 79, 84 và 98 dấu âm (tức là không được biểu thị) cho upd, lpd,
smi, uip, vas, grd, qc, col và sus, tương ứng. Chúng tôi đã sử dụng các phép thử
siêu đo hai phía với giả định rằng một hạt nhân biểu hiện các dấu dương và dấu âm
của một loại tế bào ít nhiều có khả năng là từ loại tế bào đó. Các giá trị P kết
quả được chuyển đổi -log10 để tính điểm loại ô. Ma trận 486 × 9 của điểm loại ô
sau đó được sử dụng để giảm kích thước và phân nhóm. Nhận dạng cụm được dự đoán
dựa trên các nhãn loại ô trong mỗi cụm.
Xác thực danh tính cụm
Các giá trị biểu hiện trung bình của tất cả các hạt nhân trong mỗi cụm được sử
dụng để thực hiện các thử nghiệm làm giàu mô như đã mô tả trước đây (Schon và
Nodine, 2017) và để tính toán hệ số tương quan của Spearman với các mẫu phôi giai
đoạn hình cầu (32E) và mẫu huyền phù (32S) đã được công bố (Zhou
10
Machine Translated by Google
BÀI NGHIÊN CỨU Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589

và cộng sự, 2020). Mức độ biểu hiện của các điểm đánh dấu được chọn và mô típ phong phú đã được kiểm tra mối tương quan với mô hình làm giàu họ
ba gen được báo cáo gần đây [PEAR1 (AT2G37590), DOF6 (AT3G45610) và mô típ cụ thể theo cụm, cũng như tất cả các gen không được đại diện
GATA20 (AT2G18380)] (Smit và cộng sự, 2020) không có trong bảng đánh trong cơ sở dữ liệu CIS-BP, nhưng trong cùng một phân họ TF như một gen
dấu tham chiếu của chúng tôi để tính điểm mô được vẽ bằng biểu đồ Hàm có mô típ quan trọng.
monocle3 'plot_genes_by_group ()'.
Chúng tôi đã chọn 33 ứng cử viên RNA ISH không có các mẫu biểu hiện Lời cảm ơn Chúng tôi

phôi được báo cáo trước đó theo các mẫu biểu hiện và tính đặc hiệu của rất biết ơn Daisuke Kurihara và Tetsuya Higashiyama đã hào phóng chia sẻ các dòng

mẫu dò của chúng (Bảng S6). Các đầu dò RNA tại chỗ được tạo ra từ DNA pWOX2 :: H2B-GFP, pWOX2 :: tdTomato-RCI2b. Đặc biệt cảm ơn Cơ sở cốt lõi IMP-IMBA-GMI

BioOptics, Cơ sở khoa học thực vật và Cơ sở giải trình tự thế hệ tiếp theo tại Cơ sở
sợi kép tổng hợp (Các đoạn gen gBlocks; Công nghệ DNA tích hợp) và được
chính trung tâm sinh học Vienna (VBCF) vì sự hỗ trợ kỹ thuật của họ. Chúng tôi cũng cảm
áp dụng như đã mô tả trước đây (Nodine và cộng sự, 2007). Đối với mỗi
ơn Ortrun Mittelsten Scheid và Dolf Weijers vì những ý kiến đóng góp quý báu cho bản
đầu dò, 21-122 phôi giai đoạn hình cầu (tức là các bản sao sinh học)
thảo. Cá nhân Ping Kao cũng cảm ơn Kotoha Tanaka và Kaori Sakuramori vì sự hỗ trợ của họ.
được kiểm tra từ hai đến tám lam kính hiển vi (tức là các bản sao kỹ
thuật) cho tổng số 1420 phôi từ 112 lam (Hình S4). Để giảm thiểu sự sai
lệch có thể xảy ra, tất cả các hình ảnh tại chỗ đã được kiểm tra và Các lợi ích cạnh tranh
phân loại bởi một người nào đó không thực hiện các thí nghiệm và không Các tác giả tuyên bố không có lợi ích cạnh tranh hoặc lợi ích tài chính.
biết danh tính của các mẫu.
Đóng góp của tác giả

Làm giàu gen được xếp hạng Khái niệm: PK, MAS, MDN; Phương pháp luận: PK, MAS; Điều tra: PK, MAS, MM, BE, MDN; Viết -

bản thảo gốc: PK, MAS, MDN; Viết - xem lại & chỉnh sửa: PK, MAS, MDN; Hình dung: PK, MAS, BE,
Đối với mỗi cụm nhân, chiến lược làm giàu gen được xếp hạng được xác định
MDN; Giám sát: MDN; Mua lại tài trợ: MDN
như sau: gọi G là tập hợp các gen 'biểu hiện', được định nghĩa là tất cả
các gen được mã hóa hạt nhân và được phiên mã RNA Polymerase II với ≥1
RNA-seq đọc đếm trong ≥10% hạt nhân trong cụm ≥1. Với mỗi gen i trong mỗi
Tài trợ
nhân j, CPMij ¼ 106 countsijhạt
= Pnhân
g [Gtrong
countsgj. GọivàC |làC một
một đám | sốtập hợp các
nuclêôtit Công việc này được tài trợ bởi Österreichischen Akademie der Wissenschaosystem.
trong cụm C. CPM trung bình của gen i ¼ P CPMij = jCj. Tỷ lệ được phát Dự án cơ sở hạ tầng nghiên cứu ở Áo và Cộng hòa Séc (RIAT-CZ) (ATCZ40) được tài trợ

trong mỗi cụm C là số lượng m

nhân hiện trong
iC trongmột cụm
1 nếu
được
cụm C
làđược
countsij
C xác xác
định0
một chođịnh
nếu
nhóm mỗi là
genj
cải[C
countsij
và tất p
,các
1 bởi Tổ chức Interreg VA Áo-Cộng hòa Séc, được biết ơn vì đã hỗ trợ tài chính cho các phép đo

cho các thí nghiệm snRNA-seq sơ bộ tại Cơ sở vật chất trung tâm sinh học Vienna Cơ sở giải
cụm khác là nhóm ngoài O, thay đổi lần lượt CPM log2 trung bình của mỗi
trình tự thế hệ tiếp theo GmbH (VBCF). Nguồn vốn tiếp cận mở do Trung tâm Nghiên cứu và Đại
gen i được tính 1iC = 1 þ P io
gen nào tôi đã được phát hiện: piC ¼ P = jCj. Sử dụng học Wageningen cung cấp. Đã gửi tiền vào PMC để phát hành ngay lập tức.
j [C = jOj, như FiC ¼ log2 1 þ và
chênh lệch tỷ lệ trung bình DiC ¼ piC P o [O pio. Cả hai tập hợp FC và
DC đều có tâm rằng F cC ¼ FC FC = và và Tính khả dụng của
m m dữ liệu Tất cả dữ liệu giải trình tự được tạo ra trong nghiên cứu này đã được gửi
o [O
vào GEO theo số gia nhập GSE169284.

quy mô trung bình vì thế S ðFCÞ,

Lịch sử đánh giá ngang
S là trong
D cC ¼ DC DC = ðDCÞ, đó chuẩn.
độ lệch x là giá
Mứctrị
độ trung bình EiC
tăng sinh và σcủa
(x)gen i trong hàng Lịch sử đánh giá ngang hàng có sẵn trực tuyến tại https://journals.biists.com/dev/
cụm C là độ lệch tổng hợp so với giá trị trung bình của FC và DC: article-lookup / doi / 10.1242 / dev.199589

Tài liệu tham

ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffch

khảo Abe, M., Katsumata, H., Komeda, Y. and Takahashi, T. (2003). Quy định phân hóa tế bào
2 2 1 nếu F ciC þ D diC .
EiC ¼ q F ciC þ D diC biểu bì chồi bởi một cặp protein homeodomain ở cây Arabidopsis. Phát triển 130, 635-643.

( 0 1 nếu F ciC þ D diC 0: doi: 10.1242 / dev.00292

Bai, S.-N. (2015). Khái niệm về chu kỳ sinh sản hữu tính và ý nghĩa tiến hóa của nó. Đổi diện.

Trong mỗi cụm, các gen được xếp hạng theo mức độ làm giàu cao nhất đến Khoa học thực vật. 6, 11.
Belmonte, MF, Kirkbride, RC, Stone, SL, Pelletier, JM, Bui, AQ, Yeung, EC, Hashimoto, M., Fei,
thấp nhất và 250 gen đầu tiên và 250 gen cuối cùng lần lượt được coi là
J., Harada, CM, Munoz, MD et al. (2013).
'các gen xếp hạng cao nhất' và 'các gen xếp hạng cuối cùng' (Bảng S3).
Hồ sơ phát triển toàn diện của hoạt động gen ở các vùng và tiểu vùng của hạt giống
Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 110, E435-E444. doi: 10.1073 / pnas.1222061110

Phân tích bản thể học gen ID Bouyer, D., Kramdi, A., Kassam, M., Heese, M., Schnittger, A., Roudier, F. and Colot, V.
(2017). Động lực methyl hóa DNA trong thời kỳ đầu của thực vật. Genome Biol. 18, 179. doi:
của 250 gen được xếp hạng hàng đầu cho mỗi cụm đã được đệ trình lên TAIR GO Kỳ
10.1186 / s13059-017-1313-0
làm giàu (https://www.arabidopsis.org/tools/go_term_ Richment.jsp) bằng cách sử
dụng hệ thống phân loại PANTHER (Mi et al. , 2021) để tính toán tỷ lệ phát hiện
Bray, NL, Pimentel, H., Melsted, P. và Pachter, L. (2016). Định lượng RNA-seq xác suất gần tối
sai với các thử nghiệm chính xác của Fisher. Tất cả các thuật ngữ đã được bổ sung ưu . Nat. Biotechnol. 34, 525-527. doi: 10.1038 / nbt.3519
chi tiết được trình bày trong Bảng S4. Năm thuật ngữ GO quan trọng nhất không
liên quan đến ribosome được đánh dấu trong Hình 3. Brennecke, P., Anders, S., Kim, J.K, Kołodziejczyk, AA, Zhang, X., Proserpio, V., Baying, B.,
Benes, V., Teichmann, SA, Marioni, JC và cộng sự.
(2013). Tính toán nhiễu kỹ thuật trong các thí nghiệm RNA-seq đơn bào. Nat.
Phân tích vị trí liên kết Phương pháp 10, 1093-1095. doi: 10.1038 / nmeth.2645
TF Thúc đẩy cho tất cả các gen được xác định là vùng từ 500 bp ngược dòng Breuninger, H., Rikirsch, E., Hermann, M., Ueda, M. và Laux, T. (2008).
đến 100 bp ở hạ lưu của đầu 5 ′ phổ biến nhất trong bộ dữ liệu nanoPARE của Sự biểu hiện khác biệt của các gen WOX làm trung gian cho sự hình thành trục đỉnh-đáy ở phôi

phôi giai đoạn hình cầu (Plotnikova và cộng sự, 2019). Đối với các gen không Arabidopsis. Nhà phát triển. Ô 14, 867-876. doi: 10.1016 / j.devcel.2008.03.008 Buenrostro,
JD, Wu, B., Litzenburger, UM, Ruff, D., Gonzales, ML, Snyder, MP, Chang, HY và Greenleaf, WJ
có tín hiệu nanoPARE, phần cuối 5 ′ ngược dòng nhất được chú thích trong
(2015). Khả năng tiếp cận của chất nhiễm sắc đơn bào cho thấy các nguyên tắc của sự biến
TAIR10 v.46 đã được sử dụng. Các mô-típ liên kết TF cho Arabidopsis thaliana
đổi điều hòa. Bản chất 523, 486-490. doi: 10.1038 / nature14590 Calarco, JP, Borges, F.,
được tải xuống từ CIS-BP (http://cisbp.ccbr.utoronto.ca) (Weirauch và cộng Donoghue, MTA, Van Ex, F., Jullien, PE, Lopes, T., Gardner, R., Berger, F., Feijó, JA,
sự, 2014). Tất cả các mô-típ được xác định trực tiếp đã được kiểm tra về sự Becker, JD et al. (2012).

đại diện thống kê bằng cách sử dụng Phân tích mức độ giàu động lực (AME;
http://meme-suite.org/doc/ame.html ) (McLeay và Bailey, 2010) trong mỗi cụm Sự tái lập trình của quá trình methyl hóa DNA trong phấn hoa hướng dẫn sự di truyền biểu
sinh thông qua RNA nhỏ. Ô 151, 194-205. doi: 10.1016 / j.cell.2012.09.001
bằng cách so sánh 250 gen được xếp hạng hàng đầu trình khởi động dựa trên
Cao, J., Spielmann, M., Qiu, X., Huang, X., Ibrahim, DM, Hill, AJ, Zhang, F., Mundlos, S.,
tập hợp nền gồm 250 trình khởi động gen được xếp hạng dưới cùng với các tham
Christiansen, L., Featmers, FJ et al. (2019). Cảnh quan phiên mã đơn bào của quá trình phát
số mặc định. Các mô típ đã được phong phú hóa đáng kể trong ít nhất một cụm sinh cơ quan của động vật có vú. Tính chất 566, 496-502. doi: 10.1038 / s41586-019-0969-x
được thu gọn thành các họ mô típ. Biểu hiện cụ thể theo cụm của tất cả các gen với một

11
Machine Translated by Google
BÀI NGHIÊN CỨU
Casson, S., Spencer, M., Walker, K. và Lindsey, K. (2005). Phát hiện vi mô bằng tia
laser để phân tích biểu hiện gen trong quá trình hình thành phôi của Arabidopsis.
Nhà máy J. 42, 111-123. doi: 10.1111 / j.1365-313X.2005.02355.x Chandler, JW,
Cole, M., Flier, A., Grewe, B. và Werr, W. (2007). Các yếu tố phiên mã AP2
DORNRÖSCHEN và DORNRÖSCHEN-LIKE kiểm soát dư thừa việc tạo hình phôi Arabidopsis
thông qua tương tác với PHAVOLUTA.
Phát triển 134, 1653-1662. doi: 10.1242 / dev.001016
Chen, G., Ning, B. và Shi, T. (2019). Công nghệ RNA-seq tế bào đơn và phân tích dữ liệu
tính toán liên quan. Đổi diện. Genet. 10, 317. doi: 10.3389 / fgene. 2019.00317
Chen, M., Lin, J.-Y., Wu, X., Apuya, NR, Henry, KF, Le, BH, Bui, AQ, Pelletier, JM, Cokus,
S., Pellegrini, M. et al. (Năm 2021). Phân tích so sánh các phiên mã thích hợp và huyền
phù của phôi trong phôi thực vật có hình thái khác nhau. Proc. Natl. Acad. Khoa học. Hoa
Kỳ 118, e2024704118. doi: 10.1073 / pnas. 2024704118
Cheng, C.-Y., Krishnakumar, V., Chan, AP, Thibaud-Nissen, F., Schobel, S. và Town, CD
(2017). Araport11: chú thích lại đầy đủ của bộ gen tham chiếu Arabidopsis thaliana. Thực
vật J. 89, 789-804. doi: 10.1111 / tpj.13415 Choi, Y., Gehring, M., Johnson, L., Hannon,
M., Harada, JJ, Goldberg, RB, Jacobsen, SE and Fischer, RL (2002). DEMETER, một protein
miền DNA glycosylase, cần thiết để in dấu gen nội nhũ và khả năng sống của hạt ở
arabidopsis. Ô 110, 33-42. doi: 10.1016 / S0092-8674 (02) 00807-3
Clark, NL, Aagaard, JE và Swanson, WJ (2006). Sự tiến hóa của protein sinh sản từ động vật
và thực vật. Sinh sản 131, 11-22. doi: 10.1530 / rep.1. 00357
Cusanovich, DA, Daza, R., Adey, A., Pliner, HA, Christiansen, L., Gunderson, KL,
Regimers, FJ, Trapnell, C. và Shendure, J. (2015).
Cấu hình đa tế bào đơn về khả năng tiếp cận nhiễm sắc bằng cách lập chỉ mục tế bào tổ
hợp. Khoa học 348, 910-914. doi: 10.1126 / science.aab1601
DeYoung, BJ, Bickle, KL, Schrage, KJ, Muskett, P., Patel, K. và Clark, SE (2006).
Các kinase giống như protein kinase của thụ thể BAM1, BAM2 và BAM3 liên quan đến
CLAVATA1 được yêu cầu cho chức năng mô phân sinh ở cây Arabidopsis. Thực vật J.
45, 1-16. doi: 10.1111 / j.1365-313X.2005.02592.x Dresselhaus, T. và Jürgens, G.
(2021). Sự phát sinh phôi so sánh ở thực vật hạt kín: kích hoạt và tạo mẫu của các
dòng tế bào phôi. Annu. Rev.
Thực vật Biol. 72, 1-36. doi: 10.1146 / annurev-arplant-082520-094112
Efroni, I. và Birnbaum, KD (2016). Tiềm năng của cấu hình đơn bào ở thực vật.
Genome Biol. 17, 65. doi: 10.1186 / s13059-016-0931-2
Eklund, DM, Cierlik, I., Ståldal, V., Claes, AR, Vestman, D., Chandler, J. và Sundberg, E.
(2011). Sự biểu hiện của các gen họ Arabidopsis SHORT INTERNODES / STYLISH trong vùng
sinh tổng hợp auxin của các cơ quan trên không phụ thuộc vào yếu tố điều hòa giống hộp
GCC. Thực vật Physiol. 157, 2069-2080. doi: 10.1104 / pp.111.182253 Erdmann, RM và
Picard, CL (2020). Sự metyl hóa DNA hướng RNA. PLoS
Genet. 16, e1009034. doi: 10.1371 / journal.pgen.1009034
Fan, P., Aguilar, E., Bradai, M., Xue, H., Wang, H., Rosas-Diaz, T., Tang, W., Wolf, S.,
Zhang, H., Xu, L . et al. (Năm 2021). Các kinase giống thụ thể BAM1 và BAM2 cần thiết
cho việc tạo kiểu xylem gốc. Proc. Natl. Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 118, e2022547118. doi:
10.1073 / pnas.2022547118
Farmer, A., Thibivilliers, S., Ryu, KH, Schiefelbein, J. và Libault, M. (2021).
Trình tự RNA đơn nhân và ATAC cho thấy tác động của khả năng tiếp cận chất nhiễm
sắc đối với sự biểu hiện gen ở rễ cây Arabidopsis ở cấp độ tế bào đơn. Mol
Thực vật. 14, 372-383. doi: 10.1016 / j.molp.2021.01.001
Feng, X., Zilberman, D. và Dickinson, H. (2013). Một cuộc trò chuyện giữa các thế hệ:
nhiễu xuyên âm tế bào mầm ở thực vật. Nhà phát triển. Ô 24, 215-225. doi: 10. 1016 /
j.devcel.2013.01.014
Gehring, M. (2019). Động thái biểu sinh trong quá trình sinh sản của thực vật có hoa: bằng
chứng cho quá trình tái lập trình? Phytol mới. 224, 91-96. doi: 10.1111 / nph.15856
Geist, KS, Strassmann, JE and Queller, DC (2019). Những cuộc cãi vã gia đình trong hạt
giống và sự tiến hóa thích nghi nhanh chóng ở Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Khoa học.
Hoa Kỳ 116, 9463-9468. doi: 10.1073 / pnas.1817733116
Gerri, C., Menchero, S., Mahadevaiah, SK, Turner, JMA và Niakan, KK
(Năm 2020). Phát sinh phôi người: một quan điểm so sánh. Annu. Rev. Cell Dev.
Biol. 36, 411-440. doi: 10.1146 / annurev-cellbio-022020-024900
Gong, Z., Morales-Ruiz, T., Ariza, RR, Roldán-Arjona, T., David, L. và Zhu, J.- K.
(2002). ROS1, một chất ức chế gen phiên mã im lặng trong Arabidopsis, mã hóa một
glycosylase / lyase DNA. Ô 111, 803-814. doi: 10.1016 / S0092- 8674 (02) 01133-9
Gooh, K., Ueda, M., Aruga, K., Park, J., Arata, H., Higashiyama, T. and Kurihara,
D. (2015) . Hình ảnh tế bào sống và thao tác quang học đối với sự hình thành phôi
sớm của Arabidopsis. Nhà phát triển. Ô 34, 242-251. doi: 10.1016 /
j.devcel.2015.06.008 Gutzat, R., Rembart, K., Nussbaumer, T., Hofmann, F.,
Pisupati, R., Bradamante, G., Daubel, N., Gaidora, A. , Lettner, ̀ N., Dona, M. và
cộng sự. (Năm 2020).
Tế bào gốc chồi Arabidopsis hiển thị các kiểu phiên mã động và methyl hóa DNA . EMBO J.
39, e103667. doi: 10.15252 / embj.2019103667
Habib, N., Li, Y., Heidenreich, M., Swiech, L., Avraham-Davidi, I., Trombetta, JJ, Hession,
C., Zhang, F. và Regev, A. (2016). Div-seq: RNA-Seq đơn nhân tiết lộ động lực của các tế
bào thần kinh mới sinh hiếm gặp. Khoa học 353, 925-928. doi: 10.1126 / science.aad7038
Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589
Haecker, A., Groß-Hardt, R., Geiges, B., Sarkar, A., Breuninger, H., Herrmann, M. và Laux,
T. (2004). Động lực biểu hiện của gen WOX đánh dấu các quyết định số phận tế bào trong
quá trình hình thành phôi sớm ở Arabidopsis thaliana. Phát triển 131, 657-668. doi:
10.1242 / dev.00963 Haga, N., Kato, K., Murase, M., Araki, S., Kubo, M., Demura, T.,
Suzuki, K., Müller, I., Voß, U ., Jürgens, G. và cộng sự. (2007). Protein R1R2R3-Myb điều
hòa tích cực hoạt động tế bào thông qua hoạt hóa phiên mã KNOLLE ở cây Arabidopsis
thaliana. Phát triển 134, 1101-1110. doi: 10.1242 / dev.02801
Haudry, A., Platts, AE, Vello, E., Hoen, DR, Leclercq, M., Williamson, RJ, Forczek, E.,
Joly-Lopez, Z., Steffen, JG, Hazzouri, KM và cộng sự. (2013). Tập bản đồ gồm hơn 90.000
trình tự không mã hóa được bảo tồn cung cấp thông tin chi tiết về các vùng quy định của
cây thập tự. Nat. Genet. 45, 891-898. doi: 10.1038 / ng.2684
Hecker, A., Brand, LH, Peter, S., Simoncello, N., Kilian, J., Harter, K., Gaudin,
V. và Wanke, D. (2015). Yếu tố liên kết Arabidopsis GAGA PENTACYSTEINE6 CƠ BẢN
Thu nhận thành phần POLYCOMB-REPRESSIVE COMPLEX1 giống như HETEROCHROMATIN
PROTEIN1 cho GAGA DNA Motifs.
Thực vật Physiol. 168, 1013-1024. doi: 10.1104 / pp.15.00409
Hofmann, F., Schon, MA và Nodine, MD (2019). Phiên mã phôi của Arabidopsis thaliana. Thực
vật Reprod. 32, 77-91. doi: 10.1007 / s00497-018-00357-2
Hsieh, T.-F., Ibarra, CA, Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, RL và
Zilberman, D. (2009). Quá trình khử methyl trên toàn bộ bộ gen của nội nhũ Arabidopsis .
Khoa học 324, 1451-1454. doi: 10.1126 / science.1172417 Hwang, B., Lee, JH and Bang, D.
(2018). Công nghệ giải trình tự RNA đơn bào và đường ống tin sinh học. Hết hạn. Mol Med.
50, 1-14. doi: 10. 1038 / s12276-018-0071-8 Ibarra, CA, Feng, X., Schoft, VK, Hsieh, T.-
F., Uzawa, R., Rodrigues, JA, Zemach, A., Chumak, N., Machlicova , A., Nishimura, T. và
cộng sự. (2012). Quá trình khử methyl DNA tích cực trong tế bào đồng hành của thực vật
củng cố quá trình methyl hóa transposon trong giao tử. Khoa học 337, 1360-1364. doi:
10.1126 / khoa học.1224839
Ingouff, M., Rademacher, S., Holec, S., Šoljić, L., Xin, N., Readshaw, A., Foo, SH,
Lahouze, B., Sprunck, S. và Berger, F. (2010 ). Việc thiết lập lại hợp tử của biến thể
HISTONE 3 tham gia vào quá trình tái lập trình biểu sinh ở Arabidopsis. Curr. Biol. 20,
2137-2143. doi: 10.1016 / j.cub.2010.11.012 Iwase, A., Harashima, H., Ikeuchi, M.,
Rymen, B., Ohnuma, M., Komaki, S., Morohashi, K., Kurata, T. , Nakata, M., Ohme-Takagi, M.
và cộng sự. (2017). WIND1 thúc đẩy quá trình tái sinh chồi thông qua kích hoạt phiên mã
của ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1 ở Arabidopsis. Tế bào Thực vật 29, 54-69. doi:
10.1105 / tpc. 16,00623
Jean-Baptiste, K., McFaline-Figueroa, JL, Alexandre, CM, Dorrity, MW, Saunders, L.,
Bubb, KL, Trapnell, C., Fields, S., Queitsch, C. và Cuperus, JT (2019 ). Động
thái biểu hiện gen trong tế bào rễ đơn của cây Arabidopsis thaliana. Ô thực vật
31, 993-1011. doi: 10.1105 / tpc.18.00785 Jeong, S., Palmer, TM and Lukowitz, W.
(2011). Yếu tố RWP-RK GROUNDED thúc đẩy sự phân cực của phôi thai bằng cách tạo điều
kiện cho tín hiệu kinase YODA MAP . Curr. Biol. 21, 1268-1276. doi: 10.1016 /
j.cub.2011.06.049 Jullien, PE, Susaki, D., Yelagandula, R., Higashiyama, T. và
Berger, F.
(2012). Động lực methyl hóa DNA trong quá trình sinh sản hữu tính ở Arabidopsis thaliana.
Curr. Biol. 22, 1825-1830. doi: 10.1016 / j.cub.2012.07.061
Jullien, PE, Bonnet, DMV, Pumplin, N., Schröeder, JA và Voinnet, O.
(Năm 2020). Biểu hiện không đối xứng của argonautes trong các mô sinh sản Arabidopsis.
bioRxiv. doi: 10.1101 / 2020.05.18.102863
Kao, P. và Nodine, MD (2019). Hoạt động phiên mã của hợp tử arabidopsis là cần thiết cho
các lần phân chia tế bào ban đầu. Khoa học. Đại diện 9, 17159. doi: 10.1038 / s41598-019-
53704-2
Kirch, T., Simon, R., Grünewald, M. và Werr, W. (2003). Gen DORNRÖSCHEN / ENHANCER OF
SHOOT REGENERATION1 của arabidopsis hoạt động trong việc kiểm soát số phận tế bào mô
phân sinh và sự phát triển cơ quan bên. Ô thực vật 15, 694-705. doi: 10.1105 / tpc.009480
Koi, S., Hisanaga, T., Sato, K., Shimamura, M., Yamato, KT, Ishizaki, K., Kohchi, T. và
Nakajima, K. (2016). Yếu tố RKD thực vật được bảo tồn tiến hóa kiểm soát sự phân hóa tế
bào mầm. Curr. Biol. 26, 1775-1781. doi: 10.1016 / j. cub.2016.05.013
Kőszegi, D., Johnston, AJ, Rutten, T., Czihal, A., Altschmied, L., Kumlehn, J.,
Wüst, SEJ, Kirioukhova, O., Gheyselinck, J., Grossniklaus, U. và cộng sự. (2011).
Các thành viên của họ nhân tố phiên mã RKD tạo ra chương trình biểu hiện gen giống tế
bào trứng: RKD kiểm soát chương trình phiên mã tế bào trứng. Nhà máy J. 67, 280-291.
doi: 10.1111 / j.1365-313X.2011.04592.x Luật, JA và Jacobsen, SE (2010). Thiết lập, duy
trì và sửa đổi các mô hình methyl hóa DNA ở thực vật và động vật. Nat. Rev. Genet. 11,
204-220. doi: 10.1038 / nrg2719
Lee, MT, Bonneau, AR và Giraldez, AJ (2014). Kích hoạt bộ gen hợp tử trong quá trình
chuyển đổi từ mẹ sang hợp tử. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 581-613. doi: 10.1146 /
annurev-cellbio-100913-013027
Lin, W., Sun, L., Huang, R.-Z., Liang, W., Liu, X., He, H., Fukuda, H., He, X.-Q. và Qian,
W. (2020). Quá trình khử methyl DNA hoạt động điều chỉnh sự khác biệt của yếu tố khí
quản ở cây Arabidopsis. Khoa học. Tiến lên 6, eaaz2963. doi: 10.1126 / sciadv.aaz2963
Long, Y., Liu, Z., Jia, J., Mo, W., Fang, L., Lu, D., Liu, B., Zhang, H., Chen, W và Zhai,
J. (2021). FlsnRNA-seq: cấu hình RNA đơn nhân dài đầy đủ không có nguyên sinh chất ở
thực vật. Genome Biol. 22, 66. doi: 10.1186 / s13059-021-02288-0
12
Machine Translated by Google
BÀI NGHIÊN CỨU
Lotan, T., Ohto, M.-a., Yee, KM, West, MAL, Lo, R., Kwong, RW, Yamagishi, K., Fischer, RL,
Goldberg, RB và Harada, JJ (1998).
Arabidopsis LEAFY COTYLEDON1 đủ để gây ra sự phát triển phôi trong tế bào sinh dưỡng. Ô
93, 1195-1205. doi: 10.1016 / S0092-8674 (00) 81463-4 Lukowitz, W., Roeder, A.,
Parmenter, D. and Somerville, C. (2004). Một gen MAPKK Kinase quy định số phận tế bào
ngoài phôi ở cây Arabidopsis. Ô 116, 109-119. doi: 10.1016 / S0092-8674 (03) 01067-5
Mansfield, SG và Briarty, LG (1991). Sự phát sinh phôi sớm ở Arabidopsis thaliana. II. Phôi
thai đang phát triển. Có thể. J.Bốt. 69, 461-476. doi: 10.1139 / b91- 063
Martin, M. (2011). Cutadapt loại bỏ các chuỗi bộ điều hợp khỏi thông lượng cao
đọc trình tự. Mạng điện tử. J. 17, 10-12. doi: 10.14806 / ej.17.1.200
Mayer, KFX, Schoof, H., Haecker, A., Lenhard, M., Jürgens, G. và Laux, T.
(1998). Vai trò của WUSCHEL trong việc điều chỉnh số phận tế bào gốc ở mô phân sinh chồi
cây Arabidopsis . Ô 95, 805-815. doi: 10.1016 / S0092-8674 (00) 81703-1
McInnes, L., Healy, J. và Melville, J. (2018). UMAP: xấp xỉ đa tạp đồng nhất và phép chiếu
để giảm kích thước. arXiv [stat.ML].
McLeay, RC và Bailey, TL (2010). Phân tích làm giàu động cơ: một khuôn khổ thống nhất và
đánh giá trên dữ liệu ChIP. BMC Bioinform. 11, 165. doi: 10.1186 / 1471-2105-11-165
Meinke, DW (2020). Nhận dạng toàn bộ bộ gen của các gen EMBRYO-DEFECTIVE (EMB) cần thiết
cho sự tăng trưởng và phát triển ở Arabidopsis. Phytol mới. 226, 306-325.
Menges, M., Hennig, L., Gruissem, W. và Murray, JAH (2003). Biểu hiện gen trên toàn bộ hệ gen
trong huyền phù tế bào Arabidopsis. Mol thực vật. Biol. 53, 423-442. doi: 10.1023 / B:
PLAN.0000019059.56489.ca
Meyerowitz, EM (2002). Thực vật so với động vật: nghiên cứu so sánh rộng nhất về sự phát
triển. Khoa học 295, 1482-1485. doi: 10.1126 / science.1066609 Mi, H., Ebert, D.,
Muruganujan, A., Mills, C., Albou, L.-P., Mushayamaha, T. and Thomas, PD (2021). PANTHER
phiên bản 16: phân loại họ sửa đổi, công cụ phân loại dựa trên cây, các vùng tăng cường
và API mở rộng. Axit nucleic Res.
49, D394-D403. doi: 10.1093 / nar / gkaa1106
Mosher, RA và Melnyk, CW (2010). siRNA và sự methyl hóa DNA: biểu sinh hạt giống. Xu hướng
Thực vật Khoa học. 15, 204-210. doi: 10.1016 / j.tplants.2010.01.002 Muralla, R., Lloyd,
J. and Meinke, D. (2011). Cơ sở phân tử của khả năng gây chết khi sinh sản ở Arabidopsis
thaliana. PLoS ONE 6, e28398. doi: 10.1371 / journal.pone. 0028398
Nagasaki, H., Itoh, J.-I., Hayashi, K., Hibara, K.-I., Satoh-Nagasawa, N., Nosaka, M.,
Mukouhata, M., Ashikari, M., Kitano, H., Matsuoka, M. et al. (2007). Con đường sản xuất RNA
can thiệp nhỏ cần thiết cho sự khởi đầu mô phân sinh chồi ở lúa. Proc. Natl. Acad. Khoa
học. Hoa Kỳ 104, 14867-14871. doi: 10.1073 / pnas. 0704339104
Nagl, W. (1990). Chuyển vị của Putrescine trong noãn, thể treo và phôi của Phaseolus coccineus.
J. Thực vật Physiol. 136, 587-591. doi: 10.1016 / S0176- 1617 (11) 80218-X Nodine, MD and
Bartel, DP (2012). Bộ gen của bà và mẹ đóng góp như nhau vào quá trình phiên mã của phôi
thực vật ban đầu. Bản chất 482, 94-97. doi: 10. 1038 / nature10756 Nodine, MD, Yadegari, R.
and Tax, FE (2007). RPK1 và TOAD2 là hai kinase giống thụ thể cần thiết cho quá trình hình
thành mẫu phôi arabidopsis . Nhà phát triển. Ô 12, 943-956. doi: 10.1016 /
j.devcel.2007.04.003 Ogawa, E., Yamada, Y., Sezaki, N., Kosaka, S., Kondo, H., Kamata, N.,
Abe, M., Komeda, Y. và Takahashi, T. (2015). ATML1 và PDF2 đóng một vai trò quan trọng và
dư thừa trong quá trình phát triển phôi Arabidopsis. Vật lý tế bào thực vật. 56, 1183-1192.
doi: 10.1093 / pcp / pcv045 Palovaara, J., de Zeeuw, T. and Weijers, D. (2016). Khởi đầu mô
và cơ quan trong phôi thực vật: lần đầu tiên cho mọi thứ. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 32,
47-75. doi: 10.1146 / annurev-cellbio-111315-124929
Palovaara, J., Saiga, S., Wendrich, JR, van 't Wout Hofland, N., van Schayck, JP, Hater,
F., Mutte, S., Sjollema, J., Boekschoten, M., Hooiveld, GJ và cộng sự.
(2017). Động lực học phiên mã được tiết lộ bởi tập bản đồ biểu hiện gen của phôi
Arabidopsis ban đầu. Nat. Thực vật 3, 894-904. doi: 10.1038 / s41477-017-0035-3
Papareddy, RK, Páldi, K., Paulraj, S., Kao, P., Lutzmayer, S. and Nodine, MD
(Năm 2020). Chất nhiễm sắc điều chỉnh sự biểu hiện của các RNA nhỏ để giúp duy trì cân bằng
nội môi transposon methylome ở Arabidopsis. Genome Biol. 21, 251. doi: 10.1186 /
s13059-020-02163-4
Penterman, J., Zilberman, D., Huh, JH, Ballinger, T., Henikoff, S. và Fischer, RL (2007).
Sự khử methyl DNA trong bộ gen Arabidopsis. Proc. Natl. Acad.
Khoa học. Hoa Kỳ 104, 6752-6757. doi: 10.1073 / pnas.0701861104
Picard, CL, Povilus, RA, Williams, BP và Gehring, M. (2021).
Sự phức tạp trong phiên mã và in dấu trong hạt Arabidopsis ở độ phân giải hạt nhân đơn
lẻ. Nat. Cây 7, 730-738. doi: 10.1038 / s41477-021-00922-0 Picelli, S., Faridani, OR,
Björklund, Å. K., Winberg, G., Sagasser, S. và Sandberg, R. (2014a). RNA-seq có chiều dài
đầy đủ từ các tế bào đơn bằng cách sử dụng Smart-seq2.
Nat. Protoc. 9, 171-181. doi: 10.1038 / nprot.2014.006
Picelli, S., Björklund, Å. K., Reinius, B., Sagasser, S., Winberg, G. và Sandberg, R. (2014b).
Các thủ tục phân đoạn và chuyển vị Tn5 cho các dự án giải trình tự được mở rộng quy mô lớn.
Hệ gen Res. 24, 2033-2040. doi: 10. 1101 / gr.177881.114
Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589
Pikaard, CS và Mittelsten Scheid, O. (2014). Điều hòa biểu sinh ở thực vật.
Lạnh mùa xuân Harb. Sự tôn trọng. Biol. 6, a019315. doi: 10.1101 / cshperspect.a019315
Plotnikova, A., Kellner, MJ, Schon, MA, Mosiolek, M. and Nodine, MD
(2019). Động lực học và chức năng của microRNA trong quá trình hình thành phôi Arabidopsis.
Tế bào thực vật 31, 2929-2946. doi: 10.1105 / tpc.19.00395
Qiu, X., Hill, A., Packer, J., Lin, D., Ma, Y.-A. và Trapnell, C. (2017). Định lượng mRNA đơn
bào và phân tích khác biệt với điều tra dân số. Nat. Phương pháp 14, 309-315. doi: 10.1038 /
nmeth.4150
Riechmann, JL (2002). Điều hòa phiên mã: tổng quan về hệ gen.
Sách Arabidopsis 2002, e0085. doi: 10.1199 / tab.0085
̀ ́
HS, Park, C., Gutierrez, CL, Wo Chen, J., Grunewald,
́jcikowska,
W., Dresselhaus,
B., Pěnčık,
T .,
A.,Friml,
Nova ́kJ.
, O.,
vàRobert,
cộng
sự. (2018). Nguồn cung cấp auxin của người mẹ góp phần vào việc hình thành phôi sớm ở
Arabidopsis. Nat. Thực vật 4, 548-553. doi: 10.1038 / s41477-018-0204-z
Ryu, KH, Huang, L., Kang, HM và Schiefelbein, J. (2019). Trình tự RNA đơn bào giải quyết các
mối quan hệ phân tử giữa các tế bào thực vật riêng lẻ. Thực vật Physiol. 179, 1444-1456.
doi: 10.1104 / pp.18.01482 Satterlee, JW, Strable, J. và Scanlon, MJ (2020). Tổ chức tế bào
gốc thực vật và sự biệt hóa ở phân giải đơn bào. Proc. Natl. Acad. Khoa học. Hoa Kỳ 117,
33689-33699. doi: 10.1073 / pnas.2018788117
Schon, MA và Nodine, MD (2017). Sự ô nhiễm trên diện rộng phôi Arabidopsis và bộ dữ liệu phiên
mã nội nhũ. Tế bào thực vật 29, 608-617. doi: 10. 1105 / tpc.16.00845 Shi, C., Luo, P., Du,
Y.-T., Chen, H., Huang, X., Cheng, T.-H., Luo, A., Li, H. -J., Yang, W.-C., Zhao, P. et al.
(2019). Sự kiểm soát của người mẹ đối với sự chết của tế bào được lập trình huyền phù thông
qua tín hiệu gibberellin. Nat. Commun. 10, 3484. doi: 10.1038 / s41467- 019-11476-3
Shulse, CN, Cole, BJ, Ciobanu, D., Lin, J., Yoshinaga, Y., Gouran, M., Turco, GM, Zhu, Y.,
O'Malley, RC, Brady, SM và cộng sự. (2019). Cấu hình bản mã tế bào đơn có thông lượng cao
của các loại tế bào thực vật. Đại diện ô 27, 2241-2247.e4. doi: 10. 1016 /
j.celrep.2019.04.054 Slane, D., Kong, J., Berendzen, KW, Kilian, J., Henschen, A., Kolb,
M., Schmid, M., Harter, K., Mayer, U., De Smet, I. và cộng sự. (2014). Phân tích bộ phiên mã
đặc trưng cho loại tế bào ở phôi Arabidopsis thaliana ban đầu. Phát triển 141, 4831-4840.
doi: 10.1242 / dev.116459
Slotkin, RK, Vaughn, M., Borges, F., Tanurdžić, M., Becker, JD, Feijó, JA và Martienssen, RA
(2009). Tái lập trình biểu sinh và RNA nhỏ làm im lặng các yếu tố có thể chuyển vị trong
phấn hoa. Ô 136, 461-472. doi: 10.1016 / j.cell. 2008.12.038
Smit, ME, Llavata-Peris, CI, Roosjen, M., van Beijnum, H., Novikova, D., Levitsky, V.,
Sevilem, I., Roszak, P., Slane, D., Jürgens, G. et al. (Năm 2020).
Đặc điểm kỹ thuật và quy định nhận dạng mô mạch máu trong phôi Arabidopsis.
Phát triển 147, dev186130. doi: 10.1242 / dev.186130
Smyth, DR, Bowman, JL và Meyerowitz, EM (1990). Sự phát triển hoa sớm ở Arabidopsis. Tế bào
thực vật 2, 755-767. doi: 10.1105 / tpc.2.8.755 Song, Q., Ando, A., Jiang, N., Ikeda, Y.
and Chen, ZJ (2020). Phân tích seq RNA tế bào đơn cho thấy những thay đổi về gen phiên mã đặc
hiệu và phụ thuộc vào thể đơn bội trong giao tử cái Arabidopsis. Genome Biol. 21, 178. doi:
10.1186 / s13059- 020-02094-0
Stadler, R., Lauterbach, C. và Sauer, N. (2005). Sự di chuyển giữa các tế bào của protein
huỳnh quang màu xanh lá cây cho thấy sự vận chuyển sau phloem ở lớp vỏ ngoài và xác định
các vùng giao hưởng trong hạt và phôi Arabidopsis. Thực vật Physiol. 139, 701-712. doi:
10.1104 / pp.105.065607
Tadros, W. và Lipshitz, HD (2009). Quá trình chuyển đổi từ mẹ sang hợp tử: một cuộc chơi trong
hai hành vi. Phát triển 136, 3033-3042. doi: 10.1242 / dev.033183
Tian, F., Yang, D.-C., Meng, Y.-Q., Jin, J. và Gao, G. (2020). PlantRegMap: lập biểu đồ
các bản đồ quy định chức năng ở thực vật. Axit nucleic Res. 48, D1104-D1113. doi:
10.1093 / nar / gkz1020 Trapnell, C., Cacchiarelli, D., Grimsby, J., Pokharel, P., Li,
S., Morse, M., Lennon, NJ, Livak, KJ, Mikkelsen, TS and Rinn , JL (2014). Các động lực và
cơ quan điều hòa quyết định số phận tế bào được tiết lộ bởi trật tự giả tế bào của các
tế bào đơn lẻ. Nat. Biotechnol. 32, 381-386. doi: 10.1038 / nbt.2859 Tucker, MR, Hinze,
A., Tucker, EJ, Takada, S., Jürgens, G. và Laux, T.
(2008). Tín hiệu mạch máu do ZWILLE làm trung gian tăng cường chức năng WUSCHEL trong
quá trình phát triển tế bào gốc mô phân sinh chồi ở Arabidopsisembryo.
Phát triển 135, 2839-2843. doi: 10.1242 / dev.023648
Ueda, M., Zhang, Z. và Laux, T. (2011). Sự kích hoạt phiên mã của các gen mô hình trục
Arabidopsis WOX8 / 9 liên kết các cực của hợp tử với sự phát triển của phôi. Nhà phát triển.
Ô 20, 264-270. doi: 10.1016 / j.devcel.2011.01.009 Ueda,
M., Aichinger, E., Gong, W., Groot, E., Verstraeten, I., Vu, LD, De Smet, I., Higashiyama,
T. , Umeda, M. và Laux, T. (2017). Sự tích hợp phiên mã của các yếu tố cha và mẹ trong
hợp tử Arabidopsis. Genes Dev. 31, 617-627. doi: 10.1101 / gad.292409.116 Vatén, A.,
Dettmer, J., Wu, S., Stierhof, Y.-D., Miyashima, S., Yadav, SR, Roberts, CJ, Campilho,
A., Bulone, V., Lichtenberger, R. và cộng sự. (2011).
Quá trình sinh tổng hợp callose điều chỉnh quá trình buôn bán giao hưởng trong quá trình phát triển của rễ.
Nhà phát triển. Ô 21, 1144-1155. doi: 10.1016 / j.devcel.2011.10.006
Waki, T., Hiki, T., Watanabe, R., Hashimoto, T. and Nakajima, K. (2011). Protein Arabidopsis
RWP-RK RKD4 kích hoạt biểu hiện và kiểu gen
13
Machine Translated by Google
BÀI NGHIÊN CỨU
hình thành trong quá trình phát sinh phôi sớm. Curr. Biol. 21, 1277-1281. doi: 10.1016 /
j.cub. 2011.07.001
Weirauch, MT, Yang, A., Albu, M., Cote, AG, Montenegro-Montero, A., Drewe, P., Najafabadi,
HS, Lambert, SA, Mann, I., Cook, K. et al. (2014).
Xác định và suy luận về tính đặc hiệu của trình tự nhân tố phiên mã ở sinh vật nhân
thực. Ô 158, 1431-1443. doi: 10.1016 / j.cell.2014.08.009
Welch, D., Hassan, H., Blilou, I., Immink, R., Heidstra, R. và Scheres, B. (2007).
Protein ngón tay kẽm Arabidopsis JACKDAW và MAGPIE phân định sự phân chia tế bào không
đối xứng và ổn định ranh giới mô bằng cách hạn chế hành động NGẮN GỌN.
Genes Dev. 21, 2196-2204. doi: 10.1101 / gad.440307
Xiang, D., Venglat, P., Tibiche, C., Yang, H., Risseeuw, E., Cao, Y., Babic, V.,
Cloutier, M., Keller, W ., Wang, E. và cộng sự. (2011). Phân tích toàn bộ bộ gen cho
thấy sự biểu hiện gen và động lực của mạng lưới trao đổi chất trong quá trình phát
triển phôi ở Arabidopsis. Thực vật Physiol. 156, 346-356. doi: 10.1104 / pp.110.171702
Xiao, J., Jin, R., Yu, X., Shen, M., Wagner, JD, Pai, A., Song, C., Zhuang, M., Klasfeld,
S. , He, C. và cộng sự. (2017). Các yếu tố quyết định cis và trans của sự im lặng
biểu sinh bởi phức hợp đàn áp Polycomb 2 ở Arabidopsis. Nat. Genet. 49, 1546-1552.
doi: 10.1038 / ng.3937
Xu, X., Crow, M., Rice, BR, Li, F., Harris, B., Liu, L., Demesa-Arevalo, E., Lu, Z., Wang,
L., Fox, N. et al. (Năm 2021). Trình tự RNA đơn bào của các tai ngô đang phát triển tạo
điều kiện thuận lợi cho việc phân tích chức năng và phát hiện ra gen ứng viên tính trạng.
Nhà phát triển. Tế bào. 56, 557-568.e6. doi: 10.1016 / j.devcel.2020.12.015 Yeung, EC
(1980). Embryogeny of Phaseolus: vai trò của chất huyền phù.
Z. Pflanzenphysiol. 96, 17-28. doi: 10.1016 / S0044-328X (80) 80096-1
Phát triển (2021) 148, dev199589. doi: 10.1242 / dev.199589
Zhang, T.-Q., Xu, Z.-G., Shang, G.-D. và Wang, J.-W. (2019). Giải trình tự RNA đơn bào mô
tả cảnh quan phát triển của rễ arabidopsis. Mol Thực vật 12, 648-660. doi: 10.1016 /
j.molp.2019.04.004
Zhao, J., Xin, H., Qu, L., Ning, J., Peng, X., Yan, T., Ma, L., Li, S. và Sun, M.-X.
(2011). Những thay đổi động của cấu hình phiên mã sau khi thụ tinh có liên quan đến
phiên mã de novo và loại bỏ mẹ trong hợp tử thuốc lá, và đánh dấu sự khởi đầu của quá
trình chuyển đổi từ mẹ sang hợp tử. Nhà máy J. 65, 131-145. doi: 10.1111 /
j.1365-313X.2010.04403.x
Zhao, P., Zhou, X., Shen, K., Liu, Z., Cheng, T., Liu, D., Cheng, Y., Peng, X. và Sun,
M.-X. (2019). Quá trình chuyển đổi từ mẹ sang hợp tử hai bước với sự đóng góp của bộ
gen cha mẹ hai giai đoạn . Nhà phát triển. Ô 49, 882-893.e5. doi: 10.1016 / j.devcel.
2019.04.016
Zhou, Y., Hartwig, B., James, GV, Schneeberger, K. và Turck, F. (2016).
Các hoạt động bổ sung của protein VI SINH VẬT LẶP LẠI và phức hợp nhóm polycomb trong
quá trình điều hòa phiên mã của các gen mục tiêu. Tế bào thực vật 28, 87-101. doi:
10.1105 / tpc.15.00787
Zhou, Y., Wang, Y., Krause, K., Yang, T., Dongus, JA, Zhang, Y. và Turck, F.
(2018). Các mô típ Telobox tuyển dụng CLF / SWN – PRC2 để lắng đọng H3K27me3 thông
qua các yếu tố TRB trong Arabidopsis. Nat. Genet. 50, 638-644. doi: 10.1038 /
s41588-018- 0109-9
Zhou, X., Liu, Z., Shen, K., Zhao, P. và Sun, M.-X. (Năm 2020). Phân tích bảng phiên mã đặc
trưng cho dòng tế bào để giải thích đặc điểm số phận tế bào của proembryos.
Nat. Commun. 11, 1366. doi: 10.1038 / s41467-020-15189-w
14
Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

Hình S1. Làm giàu hạt nhân phôi với FACS và chất lượng của thư viện snRNA-seq.

(A và C) Cấu hình DAPI đại diện (trên cùng) và GFP (dưới cùng) cho pWOX2 :: NLS-GFP

dòng chuyển gen (A) và Col-0 (C). Cường độ DAPI và số lượng sự kiện, bao gồm

hạt nhân lần lượt được biểu diễn trên các trục x và y. Các cổng lựa chọn tập trung vào 2C và 4C

các đỉnh đã được áp dụng để giảm các mảnh vụn hoặc kết tụ. (B và D) Huỳnh quang đại diện

biểu đồ phân tán cho dòng chuyển gen pWOX2 :: NLS-GFP (B) và Col-0 (D), trong đó x và y

các trục đại diện cho sự phát xạ GFP và sự phát huỳnh quang tự động 800 nm, tương ứng. Mỗi dấu chấm đại diện cho

một sự kiện (ví dụ: một hạt nhân) đã đi qua cổng DAPI 2C / 4C. Hai vùng đại diện cho GFP cao

và huỳnh quang hồng ngoại thấp đã được rút ra, và vòng tròn bên trong nghiêm ngặt hơn được sử dụng để

làm giàu hạt nhân dương tính với GFP. (E và F) Số lượng gen được phát hiện (E) và đọc được liên kết với

bảng sao tham chiếu (F) trong các thư viện hạt nhân đơn lẻ từ mỗi đĩa 96 giếng.
Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

Hình S2. Đánh giá và giảm thiểu ô nhiễm RNA của mẹ. (A) Một kết quả đại diện của các thử nghiệm làm giàu

mô trên thư viện snRNA-seq từ một đĩa 96 giếng. Từng hàng

đại diện cho một trong các loại mô hạt và mỗi cột đại diện cho một snRNA-seq

hệ Phiên mã. Hầu hết các hạt nhân được làm giàu cho một loại mô, cho thấy rằng nguồn chính của

sự ô nhiễm của mẹ là các hạt nhân mẹ được phân loại dương tính giả thay vì RNA của môi trường xung quanh.

EP, phôi thích hợp; SUS, hệ thống treo; MCE, nội nhũ vi hạt; PEN, nội nhũ ngoại vi;

KÍCH THƯỚC, nội nhũ chalazal; CZSC, vỏ hạt chalazal; GSC, vỏ hạt chung.
Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

(B, C) Phân nhóm không được giám sát và xác định các hạt nhân bị ô nhiễm. Tất cả thư viện snRNA-seq

với ≥100.000 lần đọc được căn chỉnh và ≥1.000 gen biểu hiện đã được nhóm lại và kết quả là

Các ô UMAP được mã hóa màu theo cụm (B) hoặc loại mô được làm giàu đáng kể theo

đến thử nghiệm làm giàu mô (C). Nếu thư viện snRNA-seq không có loại mô được làm giàu đáng kể hoặc

được làm giàu đáng kể cho nhiều loại mô, nó được dán nhãn là không có ý nghĩa

làm giàu hoặc mơ hồ, tương ứng. (D) Bản đồ nhiệt minh họa mối tương quan của Spearman

các hệ số trong số các thư viện snRNA-seq được phân loại là phôi (emb) hoặc vỏ hạt chung (gsc) và

được nhóm theo mảng như trong Hình 1C và bộ dữ liệu phôi được xuất bản (Hofmann và cộng sự, 2019;

Nodine và Bartel, 2012).

Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

Hình S3. Phân giải các loại tế bào bằng cách phân cụm. (A) UMAP lập biểu đồ dựa trên không giám sát

(trái) và phân nhóm dựa trên biểu hiện của gen đánh dấu (phải). Các loại tế bào phôi như trong Hình

2A. Mỗi chấm đại diện cho một hạt nhân và được tô màu theo điểm loại ô (trên cùng) hoặc cụm (dưới

cùng). (B) Biểu hiện tích lũy của các điểm đánh dấu được làm giàu tế bào trên các cụm được xác định trong
Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

Hình 2A và B. Mỗi dấu chấm đại diện cho một hạt nhân và được tô màu theo mức độ biểu hiện (tức là số

lượng điều tra dân số tích lũy) dựa trên các phím. Các loại ô được chỉ ra trong mỗi đồ thị và các chữ

viết tắt như trong Hình 2A. (C) Biểu đồ chấm minh họa các kiểu biểu hiện trên các cụm được xác định

trong Hình 2A và B cho ba gen cụ thể về mạch (Smit và cộng sự, 2020), không có trong danh sách đánh

dấu được sử dụng để hướng dẫn phân nhóm. Kích thước của các chấm biểu thị phần trăm hạt nhân mà bản

sao được phát hiện trong mỗi cụm và màu sắc đại diện cho các mức biểu hiện trung bình được biến đổi

theo log10 của mỗi cụm. (D) Điểm phong phú của

bảng điểm được trình bày trong Hình 2C (trên) và Hình 2E (dưới). Nhận dạng cụm được chỉ ra ở dưới cùng

và như trong Hình 2G. (E) Biểu đồ chấm của các mẫu biểu hiện (trái) và bản đồ nhiệt của điểm làm giàu

(phải) tương ứng với 13 ứng cử viên RNA ISH còn lại không được hiển thị trong Hình 2. (F) Hình ảnh RNA

ISH đại diện của 13 ứng viên còn lại không được hiển thị trong Hình 2.

Các thanh tỷ lệ thể hiện 20 μm. (G) Sự phong phú và suy giảm của các gen liên quan đến chu kỳ tế bào

trong số 250 gen được xếp hạng cao nhất cho mỗi cụm. Nhận dạng cụm như trong Hình 1G.
Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

Hình S4. Định lượng các mẫu RNA tại chỗ. Biểu đồ thanh minh họa tỷ lệ của

phôi giai đoạn hình cầu với tín hiệu RNA tại chỗ trong các loại tế bào khác nhau. Mỗi bảng tóm tắt

các mẫu quan sát được đối với bảng điểm cá nhân. Số nhận dạng gen duy nhất tương ứng (tức là

Các dấu hiệu nhận dạng Sáng kiến Bộ gen Arabidopsis; AGI) và, nếu được chú thích, các tên thông dụng được hiển thị trong

góc trên bên trái của mỗi bảng điều khiển. Các nhóm mà bảng điểm nằm trong top 250 được xếp hạng
Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

các gen được chỉ ra ở đầu mỗi biểu đồ (ví dụ: c1, c2, v.v.) theo thứ tự tăng dần dựa trên

bảng xếp hạng. Tỷ lệ tín hiệu được hiển thị cho các trang trình bày riêng lẻ (tức là các bản sao kỹ thuật),

là tổng cho mỗi bảng điểm và số lượng phôi được kiểm tra (tức là các bản sao sinh học) là

ghi chú trong ngoặc đơn. Huyền thoại trong mỗi bảng được hiển thị cho các mẫu xảy ra ở> 33%

phôi và chú thích đầy đủ ở góc dưới bên phải.

Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

Hình S5. Phân bổ điểm bảo tồn giữa các cụm.

(A và B) Điểm bảo tồn PhastCons (A) và PhyloP (B) (Tian et al., 2020) trong số 250

xếp hạng gen cho mỗi cụm. Điểm số trung bình của tất cả các gen biểu hiện được biểu thị bằng

các đường đứt nét, độ lệch so với phương tiện được trình bày ở hàng trên dưới dạng điểm z. Các

dấu hoa thị cho biết giá trị p ≤ 0,05 (*), ≤ 0,01 (**) hoặc ≤ 0,001 (***) dựa trên hai mặt

Kolmogorov – Smirnov kiểm tra với giả thuyết thay thế rằng điểm bảo tồn cụm

sự phân bố của 250 gen đứng đầu không bằng tất cả các gen được biểu hiện ở

phôi thai. Nhận dạng cụm như trong Hình 2G.

Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

Hình S6. Biểu hiện ứng cử viên mục tiêu RDD trên các loại tế bào phôi.

Bản đồ nhiệt của điểm làm giàu cho 50 mục tiêu ROS1 / DML2 / DML3 (RDD) được phát hiện trong ≥10%

hạt nhân trong cụm ≥1 và có điểm làm giàu ≥2 trong cụm ≥1. Điểm tăng cường được tô màu

theo chính. Tên gen được chỉ ra và danh tính cụm được đánh dấu và

mã màu ở dưới cùng. Nhận dạng cụm như trong Hình 2G.
Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

Hình S7. Đặc điểm kiểu hình của phôi đột biến bậc 1 và biểu hiện DME trên các loại tế bào phôi.

(A) PCR định kiểu gen của các dòng chèn T-DNA đặc trưng loại bỏ các dòng ROS1, DML2 và DML3 trong

thể đột biến gen ba ros1-3 dml2-1 dml3-1 (rdd) (Penterman et al., 2007). Các đoạn mồi “F” thuận

và ngược “R” cụ thể cho gen được chỉ định, cũng như các đoạn mồi JL202 và SynLB3 được sử dụng để

phát hiện các đoạn chèn T-DNA. (BE) Hình ảnh đại diện của Nomarski về phôi hình cầu đột biến Col-0

và bậc nhất (B, C) và phôi giai đoạn tim (D, E). Tổng cộng, 84 và 76 phôi đã được kiểm tra các

kiểu gen Col-0 và rdd , tương ứng. Thang chia vạch = 20 µm. (F) Biểu đồ thanh minh họa điểm làm

giàu của bảng điểm DME trong 12 cụm tương ứng với các loại tế bào phôi khác nhau. Nhận dạng cụm

được đánh dấu và mã hóa màu ở dưới cùng theo Hình 2G. (G) Biểu diễn giản đồ của bản sao DME dựa

trên mRNA-seq đã được công bố từ các dòng đỉnh và dòng cơ bản trong phôi giai đoạn 1 tế bào và 32

tế bào (Zhou và cộng sự, 2020). Mức độ bản ghi (FPKM; các đoạn trên mỗi kilobase của bản ghi trên

một triệu bản đồ được ánh xạ

đọc) được tô màu theo các phím.

Machine Translated by Google
Phát triển: doi: 10.1242 / dev.199589: Thông tin bổ sung

Bảng S1. Thông tin chung về thư viện snRNA-seq và gen được phát hiện.

Nhấp vào đây để tải Bảng S1

Bảng S2. Các gen đánh dấu đã được tuyển chọn được sử dụng để tính điểm loại tế bào.

Nhấp vào đây để tải xuống Bảng S2

Bảng S3. Dữ liệu biểu hiện gen và xếp hạng.

Nhấp vào đây để tải xuống Bảng S3

Bảng S4. Bản thể học gen phân tích kết quả.

Nhấp vào đây để tải xuống Bảng S4

Bảng S5. Tương quan các yếu tố phiên mã.

Bấm vào đây để tải xuống Bảng S5

Bảng S6. Oligonucleotide được sử dụng trong nghiên cứu này.

Bấm vào đây để tải xuống Bảng S6