Prof. Dr.

Szeberényi József

Molekuláris sejtbiológia
(2015)

Szerkesztette:

PÉCSI TUDOMÁNYEGYETEM
Általános Orvostudományi Kar

1
 Tartalom
Előszó a harmadik kiadáshoz ........................................................................................................................................4
1. A prokariota és eukariota sejt felépítése .............................................................................................................5
2. Nukleinsavak ................................................................................................................................................................ 10
3. Fehérjék.......................................................................................................................................................................... 16
4. Szénhidrátok és lipidek............................................................................................................................................ 20
5. Morfológiai vizsgáló módszerek I.: Fénymikroszkópia .............................................................................. 24
6. Morfológiai vizsgálómódszerek II.: Elektronmikroszkópia ...................................................................... 29
7. Molekulák nyomon követése a sejtben ............................................................................................................. 32
8. Szeparációs módszerek ........................................................................................................................................... 36
9. A génszerkezet vizsgálómódszerei I.: DNS-szakaszok in vivo és in vitro amplifikációja ............. 43
10. A génszerkezet vizsgálómódszerei II.: A DNS szekvencia-analizisének lehetőségei ................... 48
11. A génexpresszió vizsgálómódszerei I.: Idegen gének expressziója .................................................... 55
12. A génexpresszió vizsgálómódszerei II.: Az endogén génműködés gátlása ...................................... 59
13. A génexpresszió vizsgálómódszerei III.: Specifikus géntermékek azonosítása ............................. 62
14. A sejtmag felépítése ................................................................................................................................................ 66
15. Az eukariota genom organizációja ................................................................................................................... 71
16. A kromatin szerveződése ..................................................................................................................................... 76
17. A sejtciklus I.: Interfázis és sejtosztódás ........................................................................................................ 80
18. A sejtciklus II.: Szabályozás ................................................................................................................................. 83
19. A sejtosztódás ........................................................................................................................................................... 88
20. DNS-replikáció I.: A DNS-megkettőződés általános jellemzői............................................................... 93
21. DNS-replikáció II.: A DNS-szintézis mechanizmusa .................................................................................. 97
22. A DNS lánchibáinak kijavítása ......................................................................................................................... 102
23. Transzkripció I.: Az RNS-szintézis és -érés általános jellemzői ........................................................ 107
24. Transzkripció II.: Riboszóma-biogenezis eukariotákban .................................................................... 111
25. Transzkripció III.: Pre-mRNS-szintézis, cap-képződés és poliadeniláció...................................... 114
26. Transzkripció IV.: Pre-mRNS splicing eukariotákban ........................................................................... 119
27. Transzláció I.: mRNS-ek, tRNS-ek, riboszómák szerepe a fehérjeszintézisben .......................... 125
28. Transzláció II.: A genetikai kód ....................................................................................................................... 129
29. Transzláció III.: A fehérjeszintézis mechanizmusa ................................................................................. 133
30. A génműködés szabályozása I.: A prokariota operon modell ............................................................ 137
31. A génműködés szabályozása II.: A génreguláció mechanizmusai eukariotákban ..................... 140
32. A génműködés szabályozása III.: Transzkripciós faktorok ................................................................. 147
33. Vezikuláris transzport I.: Fehérjék és lipidek szintézise az endoplazmatikus retikulumban ........ 152
34. Vezikuláris transzport II.: A szekréciós út. Fehérje-glikoziláció és -szortírozás ........................ 156
35. Vezikuláris transzport III.: Az endocitotikus út ....................................................................................... 161

2
36. A sejt védekezési mechanizmusai.................................................................................................................. 166
37. Mitokondrium I.: Felépítés és működés ...................................................................................................... 171
38. Mitokondrium II.: A mitokondriális DNS és betegségei ........................................................................ 174
39. Citoszkeleton I.: Mikrofilamentumok ........................................................................................................... 179
40. Citoszkeleton II.: Intermedier filamentumok és mikrotubulusok .................................................... 184
41. Sejtmembrán I.: A lipoprotein membrán szerkezete. Sejt–sejt kapcsolatok................................ 188
42. Sejtmembrán II.: Transzport a sejthártyán keresztül............................................................................ 194
43. Sejtmembrán III.: A sejthártya és az extracelluláris mátrix kapcsolata ......................................... 199
44. Szignáltranszdukció I.: Jelátviteli molekulák és receptoraik .............................................................. 203
45. Szignáltranszdukció II.: Heterotrimer G-proteinek által közvetített jelátvitel ........................... 206
46. Szignáltranszdukció III.: Jelátvitel tirozin-proteinkináz receptorokról ......................................... 211
47. Szignáltranszdukció IV.: citokinek és egyéb mitogének jelátvitele ................................................. 218
48. Szignáltranszdukció V.: Stressz- és integrin-jelátvitel .......................................................................... 222
49. Szignáltranszdukció VI.: Általános következtetések és gyakorlati vonatkozások ..................... 226
50. Az egyedfejlődés celluláris és molekuláris alapjai .................................................................................. 231
51. Programozott sejthalál ....................................................................................................................................... 235
52. Daganatbiológia I.: A tumorsejt általános jellemzői ............................................................................... 240
53. Daganatbiológia II.: Onkogén DNS-vírusok................................................................................................ 244
54. Daganatbiológia III.: Onkogén RNS-vírusok .............................................................................................. 248
55. Daganatbiológia IV.: Celluláris onkogének................................................................................................. 254
56. Daganatbiológia V.: Tumor szuppresszor gének ..................................................................................... 261
57. Daganatbiológia VI.: A karcinogenezis többlépéses mechanizmusa ............................................... 269
58. Molekuláris medicina I.: Molekuláris diagnosztika ................................................................................ 275
59. Molekuláris medicina II.: Génterápia ........................................................................................................... 283

3
 Előszó a harmadik kiadáshoz
2009-ben a Johns Hopkins Egyetem Orvostudományi Karán - mely az Egyesült Államok legjobb
orvoskarai közé tartozik – radikális reformmal új orvosképzési stratégiát vezettek be. Ennek
hátterében az a frusztráló tapasztalat állt, hogy miközben a molekuláris biológia tudománya az
elmúlt évtizedekben lankadatlan sebességgel tört előre, az új eredmények következményei a
vártnál és a kívánatosnál lassabban jelennek meg a klinikai orvoslásban. A szakértők véleménye
szerint ennek fő oka, hogy a molekuláris genetika, genomika oktatása a graduális és
posztgraduális orvosképzésben nem elég hatékony, így a gyógyítás frontvonalában dolgozó
gyakorló orvosok többségének nincs esélye arra, hogy lépést tarthasson a tudomány fejlődésével,
az általa kínált diagnosztikai és terápiás lehetőségekkel. A Johns Hopkins reform lényege
a genomiális medicína(azaz a beteg DNS-e bázissorrendjéből nyerhető információk klinikai
felhasználásának tudománya)oktatásának előtérbehelyezése volt a klinikai oktatásban és a
továbbképzésben.
Hogy az orvosképzési reform milyen eredményt hoz, azt csak évek múlva tudjuk meg. Az azonban
biztos, hogy a sejtek és gének tudománya, a molekuláris sejtbiológia megérkezett a klinikai
orvoslásba. A molekuláris patológia nélkülözhetetlen a betegségek kialakulási mechanizmusának
tisztázásában, a molekuláris diagnosztika módszerei rutineljárásokká válnak és a génterápiával is
számolni kell már, mint kezelési alternatívával. A Pécsi Tudományegyetem általános orvos,
fogorvos és gyógyszerész képzésének Molekuláris sejtbiológia tárgya tankönyvének 3. kiadása
megkísérel lépést tartani az elmúlt évek fejleményeivel.
Az átdolgozott kiadás elkészítésében nagy segítséget kaptam lektoromtól, Molnár János
professzortól. Éles szemmel vett észre minden szakmai tévedést, hiányosságot, stiláris
gyarlóságot a készülő kéziratban. Lektori tevékenysége eredményeképpen javult a szöveg
minősége, tartalmi és érthetőségi szempontból egyaránt. Javaslatai közül csak azokat nem tudtam
figyelembe venni, melyek a könyv terjedelmét a kívánatosnál jobban megnövelték volna. Hálával
tartozom alapos és lelkiismeretes munkájáért, tanácsaiért.
A borítón látható, fibroblaszt sejtkultúrát ábrázoló összetett kép lézer pásztázó konfokális
fluoreszcencia mikroszkóppal készült. A sejtmagok kék színe DNS-festés eredménye, a vörös szín
az immuncitokémia segítségével jelölt foszfo-Erk 1 és 2 fehérjék elhelyezkedését mutatja. A
szürkés hátteret a mikroszkóp fáziskontraszt üzemmódjával, ugyanerről a látótérről készített
szürkeskálás kép adja (Berta Gergely felvétele).

2011. július
Szeberényi József

4
 1. A prokariota és eukariota sejt felépítése
A prokarioták elkülönült, önálló sejtmaggal nem rendelkező, egysejtű élőlények (baktériumok és
cianobaktériumok), elnevezésük a görög prokarion (primitív sejtmag) szóból származik. Az
élővilág összes többi élőlénye eukariota: sejtjeik a citoplazmától elkülönített sejtmagot
tartalmaznak (eukarion: valódi sejtmag). Az eukarioták között egysejtűek is vannak, döntő
többségük azonban többsejtű élőlény, bennük kialakult a sejtek közötti munkamegosztás
(differenciáció) és kommunikáció (jelátvitel) képessége.

Genetikai apparátus
A prokarioták egyetlen cirkuláris, kettős láncú kromoszomális DNS-t tartalmaznak, amely
néhány millió bázispárból áll. A DNS nagyobb része fehérjék szintézisét irányító mRNS-eket és
stabil RNS-eket (rRNS, tRNS) kódol, kisebb része nem kódoló. Erősen felcsavarodott,
szuperhelikális állapotban van jelen a sejtben, a membránnal nem határolt nukleoidot alkotva. A
prokariotákban a növekedő mRNS-láncokhoz már riboszómák kapcsolódnak: kromoszóma-
poliszóma komplexek képződnek, melyeken az RNS-szintézis (transzkripció) és fehérjeszintézis
(transzláció) egyidőben folyik. A DNS nagyrészt csupasz, kevés fehérjemolekulát köt. A
prokarioták extrakromoszomális DNS-t is tartalmazhatnak: a plazmidok a kromoszomális DNS-től
független replikációra képes, kisméretű, cirkuláris DNS-molekulák, több példányban is jelen
lehetnek a sejtben. Nem szükségesek a sejt életben maradásához, de a sejt számára hasznos
géneket hordozhatnak (pl. antibiotikum-rezisztencia géneket). A plazmidok egyik fajtája az F-
faktor (fertilitási faktor); az ezt hordozó F+-sejtek hím, míg az F– sejtek nőstény jellegűek.
Baktérium-konjugáció során az F-faktor egyik lánca átjut az F–-sejtbe, miközben mind a donor,
mind a recipiens sejt plazmidlánca megkettőződik. Az F-faktor celluláris géneket is vihet magával;
az F–-sejt új tulajdonságaiból a gének kromoszomális lokalizációjára lehet következtetni
(géntérképezés).
Eukariota sejtek több nagyméretű, lineáris DNS-molekulát tartalmaznak, ezek fehérjékkel
kapcsolódva a kromatinállományt alkotják. A DNS felcsavarása, tömörítése tehát fehérjék
(hisztonok és nem hiszton fehérjék) által történik. A genom mérete mintegy ezerszerese a
prokariotákénak, több milliárd bázispár. Ennek csak töredéke irányítja fehérjék és stabil RNS-ek
szintézisét, a genom 98–99 százaléka nem kódoló. Eukariota sejtekben a maghártya
megakadályozza az RNS- és fehérjeszintézis kapcsolódását, a transzkripció a sejtmagban, a
transzláció a citoplazmában folyik. Az RNS-ek intenzív érési folyamaton mennek keresztül.
Mindezek a jelenségek a génműködés komplex szabályozását teszik lehetővé.

Sejtalkotók
A prokarioták néhány
mikrométer átmérőjű
sejtek, melyeket sejthártya
és azon kívül elhelyezkedő
vékony sejtfal határol (1.1.
ábra).

1.1. ábra: A prokariota sejt

szerkezete

5
A sejtfal peptidoglikán természetű: poliszacharid láncok között rövid peptidek alkotnak
keresztkötést (ennek képződését gátolja a penicillin). A sejthártya általában sima, a sejtfal alakját
követi, betüremkedéseket csak elvétve tartalmaz (mezoszóma). Aerob baktériumokban a
sejtmembrán tartalmazza az energiametabolizmushoz szükséges apparátust: protongrádienst
tart fenn, respirációs enzimeket, ATP-szintázt tartalmaz. (Állati sejtekben ezek a mitokondrium
jellemzői [l. 37. fejezet].) A sejthártya belső felszínéhez riboszómák kapcsolódnak, ezek
membránfehérjéket és szekretált enzimeket szintetizálnak. A citoplazmában nagyszámú szabad
riboszóma látható, ezeken képződnek az intracelluláris fehérjék.
Az eukariota sejtek (1.2. ábra) átmérője 10–100 µm, ami a prokariota sejténél akár többezerszer
nagyobb térfogatot jelenthet. A sejt túlélése csak úgy biztosított, ha membránfelszínei is ennek
arányában növekednek. A sejthártyán létrejött betüremkedések, majd ezek leválása a felszínről és
a sejt belsejébe süllyedése membránnal határolt sejtorganellumokat hozott létre: maghártyát,
endoplazmatikus retikulumot, Golgi-apparátust, lizoszómákat. Más sejtalkotók (mitokondrium,
peroxiszóma, plasztiszok) kisméretű prokarioták bekebelézésével jöttek létre (l. később). Ez a
kompartmentalizáció az eukariota sejtek fontos jellemzője. A sejthártyához riboszómák nem
kötődnek, azok az endoplazmatikus retikulum felszínén és a citoplazmában szabadon láthatók. A
sejtmembránnak protongrádienst nem kell fenntartania (az a mitokondrium dolga), helyette
bonyolult iontranszport rendszerek és jelátviteli apparátusok alakultak ki benne, amelyek a
membránon keresztül, elektromos és kémiai szignáltranszdukciót biztosítanak.

1.2. ábra: Az eukariota sejt szerkezete

6
 Citoszkeleton, sejtosztódás
Sokáig azt hitték, hogy a prokarioták nem rendelkeznek fehérje rostokból álló sejtvázzal. Az
utóbbi időben azonban kiderült, hogy a baktériumokban jelen vannak aktinhoz, tubulinhoz,
intermedier filamentum proteinekhez hasonló fehérjék és ezek fonalakba rendeződve primitív
citoszkeletont alkotnak, amely segíti a sejtosztódást, a megkettőződött kromoszomális és plazmid-
DNS szétválását, a sejt alakjának meghatározását. Bonyolultabb feladatokat azonban ez a rendszer
nem tud ellátni: nem képes a sejthártya mozgatására (endocitózis, exocitózis), osztódási orsó
hiányában pedig a sejtek kettéhasadással szaporodnak. Baktériumokban motorfehérjéket (l. 39.
és 40. fejezet) sem mutattak ki eddig.
Eukariota sejtekben bonyolult citoszkeleton alakult ki, amelyet mikrofilamentumok, intermedier
filamentumok és mikrotubulusok alkotnak. A sejtváz szabja meg a sejt alakját, mozgatja a
sejtalkotórészeket és a membránt. A centriolumokból létrejövő osztódási orsó mikrotubulusai
irányítják a kromoszómavándorlást a mitózis és meiózis során.

Az eukariota sejtek kialakulása: az endoszimbiózis-elmélet

4,6 milliárd éves Földünkön az első élőlény – amely primitív prokariota egysejtű volt – mintegy
3,7 milliárd évvel ezelőtt jelent meg. Az eukariota sejtek kialakulása 3 milliárd éve kezdődhetett
és bár közvetlen kísérleti bizonyítékokkal természetesen nem rendelkezhetünk ennek
mechanizmusára vonatkozóan, a ma élő pro- és eukariota sejtek, sejtalkotók tüzetes vizsgálata
alapján felállított endoszimbiózis-elméletet a tudományos közösség széles körei fogadják el. Az
eukariota sejt kialakulásának fő állomásai a következők lehettek (1.3. ábra). (I) Az eukariota sejtek
őse kisméretű, heterotróf prokariota lehetett, amely szerves táplálékát a környezetébe szekretált
emésztőenzimekkel bontotta le, majd vette fel. (II) Ez a sejt elveszítette sejtfalát, csak rugalmas
sejthártyája maradt meg; az emésztés továbbra is extracellulárisan folyt. (III) A csupasz sejthártya
nagyobb sejtnövekedést tett lehetővé, és hogy az optimális felszín/tömeg arány megmaradjon, a
sejthártyán betüremkedések jelentek meg. (IV) Egyes membrán-invaginációk teljesen
lefűződhettek és mivel emésztőenzimeket tartalmaztak, a sejt belsejébe került vezikulumok
létrehozták a primitív lizoszómákat. (V) A membránlefűződésekkel fokozódott a
kompartmentalizáció: kialakult a maghártya és egyéb citomembránok is képződhettek; a
citoszólban citoszkeletonrostok jelentek meg, aktív organellum- és membránmozgást biztosítva a
sejtben. (VI) Az endocitózis és a lizoszómák már egy primitív fagocita jellemzői. (VII) A fagocita
egyszerű aerob prokariotát kebelezett be, amely peroxiszómaként működve megvédte a sejtet az
időközben a légkörben felszaporodott oxigén mérgező hatásától (a peroxiszóma a
hidrogénperoxidot és az oxigén szabadgyököket inaktiváló enzimeket tartalmaz). (VIII) Más
aerob baktériumok fagocitálásával a sejt mitokondriumokra tett szert, melyek nemcsak eloxidálni
tudták a szerves molekulákat, hanem a felszabaduló energiával ATP-t is termeltek. (IX)
Fotoszintetizáló cianobaktériumok bekebelezésével kloroplasztiszok jelentek meg a sejtben,
létrehozva az első növényi sejteket. Az endoszimbiózissal „szerzett” új sejtalkotók genomja
évmilliárdok alatt teljesen (peroxiszóma) vagy nagyrészt (mitokondrium, plasztiszok)
áthelyeződött a nukleáris genomba.

7
 1.3. ábra: Az eukariota sejtek kialakulása
Az 1.4. ábra az élővilág törzsfáján mutatja be a fent leírtakat. Az eukariota sejtek kialakulásának
első lépése a sejtmag megjelenése volt, ezt követte a mitokondrium, majd a kloroplasztisz
megszületése (utóbbiak később több élőlény-csoportból eltűntek).

8
 Vírusok
A vírusok nem sorolhatók a sejtes felépítésű élőlények közé. Obligát intracelluláris paraziták: csak
a fertőzött gazdasejtben képesek szaporodni, annak anyagcsere apparátusát felhasználva.
Legegyszerűbb képviselőik kisméretű nukleinsavgenomból ((DNS vagy RNS) és néhány
fehérjéből épülnek fel. Baktériumok, növények, állatok egyaránt szolgálhatnak gazdaként vírusok
számára.
A bakteriofágok értékes objektumai a molekuláris biológiai kutatásoknak. A fertőzött
baktériumban gyorsan elszaporodnak, elpusztítva azt (lítikus fertőzés), vagy DNS-ük beépülhet,
integrálódhat a gazdasejt genomjába, a továbbiakban azzal együtt replikálódva (lizogén fertőzés).
Az állati vírusok változatos fajtái ismertek, több példájukkal a későbbiekben foglalkozni fogunk.

1.4. ábra: Az élővilág evolúciója: A sejtmag valószínűleg a sejtmembrán betüremkedésével alakult

ki, ezt követte aerob baktériumok endoszimbiozisával a mitokondriumok megjelenése, majd
fotoszintetizáló cianobaktériumok endoszimbiózisával a kloroplasztiszok létrejötte. Több
eukariota-törzs (pl. gombák, állatok) később elveszítette kloroplasztiszait

9
 2. Nukleinsavak
A nukleinsavak általános jellemzői
A nukleinsavak (dezoxiribonukleinsav [DNS] és ribonukleinsav [RNS]) lineáris, el nem ágazó
polimerek, amelyek nukleotidokból épülnek fel. (Mint később látni fogjuk, az RNS-érés során
elágazó RNS-molekulák is megjelennek [l. 26. fejezet], kivételként erősítve a szabályt.) Az
alábbiakban leírt szerkezetük képessé teszi őket a genetikai információ tárolására, átvitelére és
kifejezésére (expressziójára).
A nukleotidok három komponensből épülnek fel. Heterociklusos bázisaik purinok (A és G) és
pirimidinek (C, RNS-ben U, DNS-ben T; 2.1. ábra). Pentózuk ribóz (RNS) vagy dezoxiribóz (DNS),
amely a nukleinsavakban 5 atomból álló gyűrű formában fordul elő (2.2. ábra). A cukormolekula
1’-szénatomjához kapcsolódik a bázis, nukleozidot alkotva (adenozin, guanozin, citidin, uridin,
timidin). A harmadik alkotóelem a foszforsav, amely szabad nukleotidok esetében általában az 5’-
OH csoportot észteresíti (5’-nukleozid-monofoszfát). A foszfátcsoporthoz nagy energiájú
savanhidrid kötéssel további foszfátcsoportok kötődhetnek, 5’-nukleozid-difoszfátokat és -
trifoszfátokat létrehozva. Neutrális pH mellett a nukleotidok bázisai protont nem kötnek, töltés
nélküliek, disszociált foszfátcsoportjaik negatív töltése dominál; ez a nukleinsavakra is jellemző.
A nukleotidok 3’, 5’-foszfodiészter-kötéssel összekapcsolódva néhány egységből álló
oligonukleotidokat, illetve nagyobb méretű polinukleotidokat alkotnak. Szabad állapotban
energiatároló (pl. ATP), reaktív csoportokat, molekulákat (pl. monoszacharidokat) szállító
nukleotidokként, koenzimek (pl. nikotinamidadenin-dinukleotid [NAD+] alkotórészeként,
jelátviteli molekulákként (pl. ciklikus AMP) működhetnek (2.3. ábra). Az egyes
nukleotidszármazékok biológiai jelentőségéről a megfelelő fejezetekben ejtünk szót.

2.2. ábra: A ribóz és a dezoxiribóz szerkezete

2.3. ábra: Az ATP és a ciklikus-AMP szerkezete

2.1.ábra: A nukleinsavak bázisai

10
 A dezoxiribonukleinsav (DNS)
DNS, az örökítő anyag
A DNS biológiai szerepét tisztázó kísérletek korszakalkotó jelentőségűek voltak a molekuláris
biológia történetében.
Baktériumtranszformáció. Bár a DNS-t Miescher már 1868-ban azonosította fehérvérsejtek
magjában, majd később a kromoszómákban is kimutatták, funkciójának tisztázására még hosszú
ideig várni kellett. Griffith 1928-ban a Pneumococcus baktériumok patogenitását vizsgálta. Az S-
variáns sejtek, amelyek vastag védőtokkal rendelkeznek, elpusztították a beoltott egereket; a tok
nélküli R-variáns sejtek hatástalannak bizonyultak. Amikor a kutató az R-törzsbeli sejteket hővel
elölt S-sejtekkel keverte össze, a beoltott állatok tüdőgyulladásban elhullottak és tüdejükből S-
törzsbeli sejteket tenyésztettek ki. A kísérletben tehát az S-sejtek egy hőrezisztens anyaga
öröklődő módon átalakította, virulenssé transzformálta az R-törzsbeli sejteket. A transzformációs
faktor kémiai azonosítását 1944-ben Avery és munkatársai végezték el: korszakalkotó
munkájukban tisztított DNS-sel sikerült megismételniük Griffith kísérletét, igazolva, hogy az
örökítő anyag nem fehérje – mint ahogy azt addig hitték –, hanem DNS.
Fágfertőzés. A DNS átörökítő szerepét 1952-ben Hershey és Chase colifágok vizsgálata során
erősítette meg. E. coli sejteket 32P- és 35S-atomokkal jelölt bakteriofágokkal fertőztek: a foszfor a
fág-DNS-be, a kén a kapszidfehérjékbe épült be. A sejtekbe csak a 32P-radioaktivitás jutott be, majd
az utódfágokban is megjelent; a 35S-radioaktivitást a sejtek nem vették fel. Mivel a fertőzött sejtben
több száz utódfág képződik és molekuláiknak szintézisét a fág örökítő anyaga irányítja, a kísérlet
igazolta, hogy a fág genetikai információját a DNS, nem pedig a fágfehérjék hordozzák.
Géntranszfer eukariota sejtekbe. A baktériumtranszformációval analóg génátviteli módszereket a
70-es években dolgoztak ki eukariota sejtekre. Örökletes tulajdonság tisztított DNS-sel átvihető
gerinces sejtekbe (a módszer neve transzfekció). Géntranszfer kísérletekkel azonosították az
emberi daganatképződésért felelős onkogéneket és ezek a módszerek képezik a kifejlesztés alatt
álló génterápiás eljárások alapját is (l. később).
A DNS szerkezete
A Watson–Crick modell. A molekuláris biológia tudományának születését jelentő felfedezéshez két
fontos kísérletsorozat vezetett. Röntgendiffrakciós vizsgálatokkal (Franklin és Wilkins)
információt gyűjtöttek a DNS molekuláris architektúrájára vonatkozóan: az eredmények a kettős
láncú szerkezetet valószínűsítették. Chargaff kísérletei a DNS kémiai összetételét analizálták: savas
hidrolízissel alkotórészeire bontott DNS-hidrolizátumból kromatográfiával szétválasztotta a
bázisokat és megállapította azok arányát. Különböző forrásokból származó DNS-
preparátumokban az egyes bázisok eltérő arányban fordulnak elő, bennük azonban az A és T,
illetve a C és G azonos moláris arányban van jelen.
A röntgendiffrakciós eredmények és a Chargaff-szabályok ismeretében 1953-ban Watson és Crick
felállította a kettős hélix modellt (2.4. ábra). Eszerint a DNS-t két polinukleotid lánc alkotja: a
láncok cukorfoszfát-gerince a hélix felszínén, a bázisok a tengely felé fordulva helyezkednek el. A
két láncszemben levő bázisai a komplementer bázispárosodás törvényének megfelelően
hidrogénkötésekkel kapcsolódnak egymáshoz: az A és T között két, a G és C között három H-híd
alakul ki. A két lánc gerincében a foszfodiészter-kötések ellentétes, antiparallel orientációjúak: a
2.4. ábrán a bal oldali lánc 3’→5’, a jobb oldali pedig 5’→3’ irányú. A komplementaritás és az
antiparallelitás minden nukleinsav–nukleinsav kapcsolódásra érvényes, általános
törvényszerűség. A láncok közötti H-kötések viszonylag könnyen felszakíthatók: hevítés, lúgos
közeg, kémiai anyagok (formamid, urea) denaturációt okoznak, ami együtt jár a DNS-oldat
ultraibolya abszorpciójának jellegzetes növekedésével (hiperkromicitás). Egy adott DNS
hődenaturációja az olvadásponttal (Tm) jellemezhető: azzal a hőmérséklettel, amelyen a DNS fele

11
egyes, másik fele kettős láncú (2.5. ábra). Egy DNS-molekula olvadáspontja egyenesen arányos a
GC-tartalommal. Hődenaturált DNS lassú hűtése során a komplementer láncok megtalálhatják
egymást, újra összekapcsolódnak (renaturáció). Ha a renaturáció során az elegyhez jelölt
nukleinsavat (ún. próbát) adnak, az megkeresi és így azonosítja a vele komplementer szakaszokat.
Ez képezi minden molekuláris hibridizáción alapuló módszer lényegét (l. később).

2.4. ábra: A DNS kettős hélix: a láncok

komplementer és antiparallel kapcsolódása 2.5. ábra: Hiperkromicitási görge

A DNS-szerkezet szintjei
Elsődleges szerkezet. A DNS-láncokat négyféle nukleotid építi fel. Ezek sorrendje tárolja a genetikai
információt, adja a lánc elsődleges szerkezetét.
Másodlagos szerkezet. Vizes közegben a DNS kétféle konformációt vesz fel. A stabil, természetes
B-forma jobbmenetes csavar, egy fordulatot 10 bázispár alkot, a cukorfoszfát-gerincek szabályos
hélixet képeznek (2.6. ábra). A kevésbé stabil, szabálytalan Z-forma balmenetes, cikkcakkos hélix,
olyan régiókban fordul elő, ahol purinok és pirimidinek váltakoznak. Fiziológiás szerepe nem
világos; valószínűleg fehérjék felismerési helye és ezáltal szabályozó funkciója lehet.
Harmadlagos szerkezet. Kinyújtott állapotban a sejt DNS-e nagyságrendekkel hosszabb lenne,
mint a sejt átmérője; a számára biztosított helyen így csak erősen felcsavarodott, szuperhelikális
formában fér el. Az egyik lánc átvágása a szuperhélix ellazulásához vezet. Alakját tekintve a DNS-
molekula cirkuláris (prokariota DNS-ek, egyes vírusok genomja, mitokondriális DNS) vagy lineáris
(egyes vírusok DNS-e, eukariota nukleáris DNS) lehet. Utóbbi esetben a DNS-molekula szabad
végeinek megkettőződése különleges problémát jelent a sejt számára (l. később).

12
 Negyedleges szerkezet. Prokariota
sejtekben a DNS nagyrészt csupasz
formában van jelen, csak kevés fehérje
kapcsolódik hozzá. Eukarioták
sejtmagjában viszont a DNS nagy
mennyiségű fehérjével komplexálódva
kromatinállományt alkot. A
dezoxiribonukleoprotein (DNP) fehérjéi
strukturális, katalitikus és szabályozó
funkciót töltenek be.

2.6. ábra: B-DNS és Z-DNS

A ribonukleinsav (RNS)
Az RNS szerkezete
A DNS-hez hasonlóan az RNS-t is nukleotidok alkotják, egymáshoz 3’,5’-foszfodiészter-kötéssel
kapcsolódva. A cukorfoszfát-gerinc pentóz komponense a ribóz, ennek 2’-OH csoportja csökkenti
a polinukleotidlánc stabilitását hidrolizáló hatásokkal (pl. lúg) szemben. Az RNS-ben a timint
uracil helyettesíti, amely ugyancsak adeninnel képes bázispárt alkotni két H-kötés kialakításával.
Az RNS-molekulák elsődleges szerkezetét is a nukleotidsorrend határozza meg. A legtöbb RNS
egyes láncú, másodlagos szerkezetüket azonban kettős láncú, hajtűszerű régiók teszik
változatossá. Ezek a szerkezetek olyan szakaszokon alakulnak ki, ahol a lánc önkomplementer,
visszahajolva bázispárosodás jöhet létre, akár távoli RNS-részek között is. A DNS-molekuláknál
már leírt antiparallel orientáció ezekre a hajtűszerű RNS-régiókra is érvényes. A kettős láncú
régiók kialakulása tehát nagymértékben specifikus az egyes RNS-molekulákra, hiszen a lánc
elsődleges szerkezetétől függ.
Különösen jellemző a tRNS-ekre és az rRNS-ekre (2.7. ábra). A másodlagos szerkezeti elemek
között nem kovalens egymásrahatások alakulnak ki, harmadlagos struktúrát, funkcionális
doméneket létrehozva. Az rRNS-ek esetében az erősen specifikus és konzervált doménszerkezet
biztosítja a riboszomális fehérjék régióspecifikus kötődését és a működőképes riboszóma
összeszerelését. A fehérjekomplexek kialakítása – a tRNS-ek kivételével, amelyek szabadon,
oldható formában vannak jelen a citoszólban – általános jellemzője az RNS-eknek: negyedleges
szerkezetükre az RNP-forma jellemző. Az utóbbi évek jelentős felismerése volt, hogy a
ribonukleoprotein (RNP) partikulumokban a biológiai funkciót általában az RNS látja el, a
fehérjéknek inkább csak módosító, segítő szerepük van.

13
 2.7. ábra: Az eukariota riboszóma 18S rRNS-ének másodlagos szerkezete

Az RNS szerepe. RNS-típusok

Az élő sejtek örökletes tulajdonságait a DNS-ükben levő génszakaszok bázissorrendje határozza
meg, megvalósításukért pedig a gének által kódolt fehérjék a felelősek. A DNS azonban közvetlenül
nem irányíthatja fehérjék szintézisét; ennek egyik nyilvánvaló bizonyítéka az a tény, hogy
eukariota sejtekben a DNS-t tartalmazó kromatin és a fehérjeszintézist végző riboszómák térben
is elkülönülnek egymástól. Hogy a gének és a fehérjék között RNS-ek közvetítenek, azt már
Watson és Crick is felvetette a kettős hélix modell megalkotásának idején. A későbbiek során
egyértelműen beigazolódott, hogy a sejtben levő különböző RNS-típusok a genetikai információ
kifejezésében, a génexpresszió egyes fázisaiban töltenek be fontos szerepet.
Ennek első bizonyítékát Brenner és munkatársai szolgáltatták 1961-ben. E. coli sejtek T2
bakteriofág fertőzését követően leáll a gazdasejt makromolekuláinak szintézise, a fertőzött sejt

14
fágpartikulumokat termel, majd elpusztul. Brennerék kísérletében a fágfertőzést követően a
baktérium riboszómáin újonnan szintetizált, rövid életidejű RNS-ek jelentek meg. Mivel a
gazdasejt RNS-einek képzése ebben a fázisban már megszűnt, ezek az RNS-ek csak a fág DNS-ének
irányításával képződhettek és a fág fehérjéinek szintézisét irányították. Később igazolódott, hogy
ezek a fágspecifikus RNS-ek messenger RNS-ek (mRNS-ek), amelyek a fehérjeszintézis templátjai:
bázissorrendjükkel meghatározzák a fehérjék aminosavsorrendjét. Prokariota, különösen pedig
eukariota sejtek nagyszámú, különböző mRNS-t tartalmaznak, méreteloszlásuk heterogén, hiszen
különböző nagyságú fehérjéket kódolnak.
A fehérjeszintézis gépezete számára felszínt biztosító riboszómák alkotórészei a riboszomális
RNS-ek (rRNS-ek) (prokariotákban 5S, 16S, 23S, magasabb rendű eukariotákban 5S, 5.8S, 18S, 28S
szedimentációs állandóval jellemezhetők). rRNS-ek teszik ki a citoplazmatikus RNS-ek 80–90%-
át. Stabilak, nagy fokban konzervált elsődleges szerkezettel és konformációval rendelkeznek.
A transzfer RNS-ek (tRNS-ek) a legkisebb méretű RNS-ek közé tartoznak (4S szedimentációs
állandó, kb. 80 nukleotid). Aminosavakat kovalensen kötnek és az mRNS nekik megfelelő
bázishármasához szállítják őket (adapter funkció).
A fehérjeszintézis folyamatához kapcsolódik az eukariota sejtek 7SL RNS-e is: RNP-partikulum
alkotórészeként segédkezik növekedő fehérjeláncoknak az endoplazmatikus retikulum
membránján történő átjuttatásában.
Más RNS-ek eukariota sejtmagokban a pre-mRNS-ek vagy a pre-rRNS-ek érési folyamataiban
működnek közre RNP-partikulumok formájában (snRNS-ek [small nuclear], illetve snoRNS-ek
[small nucleolar]). A fehérjeszintézis folyamatában közvetlenül részt nem vevő, ún. ncRNS-ek
(noncoding) száma folyamatosan nő. A telomeráz RNS a replikációban, az siRNS-ek (small
interfering) és az miRNS-ek (micro) a génműködés szabályozásában, az mRNS-ek lebontásában,
más ncRNS-fajták a kromatinszerkezet szabályozásában vesznek részt.
Az egyes RNS-fajták tulajdonságaival, szerepével a megfelelő fejezetekben foglalkozunk.
Katalítikus RNS-ek
Az 1980-as évek egyik legváratlanabb molekuláris biológiai felismerése Cech és Altman nevéhez
fűződik: RNS-ek enzimekként működhetnek. Ezek a ribozimek képesek lehetnek szakaszokat
kihasítani magukból és a megmaradt régiókat összekapcsolni (auto-splicing), RNS-molekulákat
meghatározott helyen hasítani (endonukleáz hatás), oligonukleotidokat összekapcsolni (ligáz
aktivitás), peptidkötést létrehozni (peptidiltranszferáz funkció) és egyéb reakciókat katalizálni.
RNS-világ
Az RNS-funkciók sokrétűsége megoldhatja a molekuláris evolúció kutatóinak régóta fennálló
dilemmáját: a mai élővilágban nukleinsavszintézis csak fehérjék közreműködésével folyhat,
fehérjék pedig csak a nekik megfelelő polinukleotid-szekvenciák irányításával képződhetnek.
Hogyan jöhetett létre az első élő sejtben ez az egymásra utalt, bonyolult nukleinsav-fehérje
rendszer?
Egy lehetséges válasz ez lehet: a legprimitívebb „sejtekben” RNS-molekulák működhettek
önreprodukcióra képes örökítő anyagként és a legfontosabb metabolikus reakciókat katalizáló
ribozimekként. Később közreműködésükkel lassan megjelentek a genetikai információt
stabilabban és hitelesebben őrző DNS-molekulák és a hatékonyabban katalizáló fehérjék, véget
vetve ezzel az „RNS-világnak”.

15
 3. Fehérjék
A fehérjék a sejt alapvető fontosságú makromolekulái. Sokféle funkciót tölthetnek be: lehetnek a
sejt szerkezeti komponensei (pl. citoszkeleton fehérjék), elláthatnak védőfunkciót (pl. antitestek,
stresszfehérjék), lehetnek transzportproteinek (pl. importin), extracelluláris (pl. hormonok) és
intracelluláris jelátviteli fehérjék (pl. adapter proteinek), szabályozó fehérjék (pl. transzkripciós
faktorok), receptorok (pl. hormonreceptorok), mindenekelőtt azonban enzimek, amelyek a sejt
több ezer metabolikus reakcióját katalizálják. A sokrétű funkciókat egységes elv alapján felépülő
molekulák látják el: a fehérjéket lineáris, el nem ágazó, aminosavakból felépülő polipeptidláncok
alkotják.

Aminosavak
Az aminosavak általános jellemzői
A fehérjéket alkotó 20 aminosavra jellemző, hogy két fő funkciós csoportjuk, az amino- (-NH2) és
a karboxil- (-COOH) csoport, ugyanahhoz a szénatomhoz kapcsolódik (α-aminosavak; 3.1. ábra).
A Cα-atom maradék vegyértékeit egy H-atom és az aminosav minőségét meghatározó oldallánc (R-
csoport) foglalja le. A Cα-atom tehát aszimmetrikus (királis), a fehérjéket felépítő aminosavak L
sztereoizomérek. Fiziológiás pH-viszonyok mellett az aminosavak dipoláris ionokként
viselkednek: mindkét funkciós csoportjuk ionizált (-NH3+, -COO–).

3.1. ábra: Az aminosavak általános szerkezete és a peptidkötés kialakulása

Az aminosavak osztályozása
Oldalláncuk alapján az aminosavakat négy funkcionális kategóriába lehet sorolni. A bázikus
aminosavak (lizin, arginin, hisztidin) oldalláncukban proton megkötésére képes aminocsoportot,
a savasaminosavak (aszparaginsav, glutaminsav) pedig egy második karboxilcsoportot
tartalmaznak. Fehérjékben ezek az aminosavak molekulán belüli vagy molekulák közötti ionos
kötések kialakítására képesek. A töltés nélküli poláros aminosavak (szerin, treonin, tirozin,
aszparagin, glutamin) a fehérjék külső felszínén lokalizálódnak, a polipeptidlánc kémiai
módosulásának (foszforiláció, glikoziláció) gyakori célpontjai. Az apoláros aminosavak (alanin,
valin, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, triptofán, cisztein, glicin, prolin) vízzel nem érintkező
régiókban (a fehérjék belsejében, membránok belsejében) helyezkednek el, egyes fajtáik speciális
funkciót láthatnak el (pl. cisztein: diszulfidhíd kialakítása).
A peptidkötés
Az amionosavak amino- és karboxilcsoportja között vízkilépéssel alakul ki peptidkötés (3.1.
ábra). A CO-NH kötés atomjai és a hozzá kapcsolódó két Cα-atom egy síkban vannak, a Cα-atomok
kötései körül azonban rotáció lehetséges, lehetővé téve a polipeptidlánc felcsavarodását,
háromdimenziós fehérjeszerkezet kialakulását. A polipeptidlánc gerincét három csoport (-CO-
NH-CH-) monoton ismétlődése alkotja, ez előfeltétele a szabályos másodlagos struktúrák
létrejöttének.

16
Bármilyen hosszú egy fehérjelánc, egyik végén szabad aminocsoport (N-vég vagy N-terminális), a
másik végén szabad karboxilcsoport (C-vég vagy C-terminális) van. A polipeptidlánc tehát
polarizált. Ha egy fehérjelánc elsődleges szerkezetét kell leírnunk, azt mindig az N-terminális
végtől kezdjük.

A fehérjeszerkezet szintjei
Hasonlóan a nukleinsavakhoz, a fehérjék esetében is több, egymásra épülő strukturális szintet
különböztetünk meg.
Az elsődleges szerkezet a fehérjét felépítő aminosavak sorrendje, azaz a polipeptidlánchoz
kapcsolódó oldalláncok minősége határozza meg.

3.2. ábra: A fehérjék másodlagos szerkezeti elemei: α-helix és β-lemez

Másodlagos szerkezet alatt a polipeptidlánc gerincének térbeli elhelyezkedését értjük. Ez lehet
véletlenszerű felcsavarodás, amit kötések nem stabilizálnak. Szabályos szerkezet jellemző az α-
hélixre és a β-lemezre (3.2. ábra). Az α-hélixben a polipeptidlánc rugószerűen felcsavarodik, egy
menetre kb. 3.5 aminosav esik. A szerkezetet az egymáshoz közel kerülő -CO- és -NH- csoportok
között létesülő H-hidak stabilizálják. A β-lemezben enyhén hullámos polipeptidlánc-régiók futnak
egymással párhuzamosan, köztük H-kötések képződnek. Ezeket a szabályos, másodlagos
struktúrákat kanyarulatok, hurkok törik meg (3.3. ábra).
Harmadlagos szerkezet. Az előzőkben felsorolt másodlagos szerkezeti elemek térbeli
elrendeződését, további felcsavarodását nevezzük tercier struktúrának (3.3. ábra). A szerkezetet
az egymáshoz közel kerülő aminosav-oldalláncok között létesülő egymásrahatások (hidrofób, van
der Waals, ionos kölcsönhatások, diszulfid-hidak) stabilizálják. Ezek kialakulásának lehetősége
természetesen függ attól, milyen aminosavak vannak jelen a polipeptidlánc kritikus helyein.
Számos megfigyelés alátámasztja, hogy a fehérjék térszerkezetét, konformációját döntően
meghatározza elsődleges szerkezetük. Ez azt is jelenti, hogy különböző fehérjék hasonló
aminosavsorrendű régiói hasonló térszerkezetet vesznek fel (azonos pH, ionkoncentráció,
hőmérsékleti viszonyok között).

17
 A szekvenciahomológia ezen következménye
különböző fajok hasonló szerkezetű
fehérjéire, illetve egy egyed adott
fehérjecsaládjának tagjaira is érvényes. Ezt
az elvet használja fel egy új és gyorsan fejlődő
tudományág: a fehérjestruktúra molekuláris
modellezése számítógépes programokat
alkalmaz proteinek térszerkezetének
szimulálására primér szerkezetük alapján.
Ezeknek a vizsgálatoknak óriási jelentősége
van fehérje célpontú gyógyszerek
kifejlesztésében.
3.3. ábra: A ribonukleáz harmadlagos
szerkezete
Sok fehérje tömören felcsavarodott, harmadlagos szerkezeti modulokból, doménekből épül fel (pl.
katalítikus, transzmembrán, DNS-kötő domén). A 3.4. ábra egy sejtfelszíni receptor jellegzetes
doménszerkezetét mutatja.
Bár a fehérjék konformációja elsődleges szerkezetük irányításával spontán is kialakul, léteznek
olyan fehérjék, amelyek ezt a folyamatot a sejtben meggyorsítják. A chaperone fehérjék a sejt
minden részében megtalálhatók, és fontos szerepet játszanak a natív fehérjeszerkezet
kialakításában, multiprotein komplexek összeállításában, fehérjék transzportjában,
szortírozásában.
Negyedleges szerkezet azokat a fehérjéket jellemzi, amelyek több polipeptidláncból épülnek fel
(multimer proteinek). A láncokat nem-kovalens kötések, de diszulfidhidak is összetarthatják (3.4.
ábra).
A sejt működésében egyre kiemelkedőbb
szerepet tulajdonítanak időleges vagy tartós
fehérje–fehérjekapcsolatok kialakításának. A
bonyolult biokémiai folyamatok legtöbbjét
hatalmas méretű, gyakran több tucat
polipeptidláncból álló fehérjekomplexek
hajtják végre. Példaként említhető a DNS-
megkettőződést végző repliszóma, az RNS-
szintetizáló transzkriptoszóma, a fehérje-
szintézishez felszínt biztosító riboszóma, a
sejtmag és a citoplazma között közvetítő
magpórus-komplexum (l. részletesen későbbi
fejezetekben). Ezekben a fehérjegépezetekben
metabolikus energia befektetésével (ATP-
vagy GTP-hidrolízissel) rendezett konfor-
mációváltozások játszódnak le, melyek a
komplex által végrehajtandó reakciók
optimális feltételeit, nagyfokú koordinációját
biztosítják. A bonyolult fehérjekomplexek
működésének megértése a molekuláris
biológia, biokémia és biofizika közös
3.4. ábra: Az inzulinreceptor doménszerkezete
erőfeszítése eredményeképpen a következő
években várható.

18
 Enzimek
A sejtek életjelenségeit a bennük lezajló anyagcsere-folyamatok tartják fenn. A legtöbb élő sejtre
jellemző hőmérsékleten ezek a kémiai reakciók rendkívül lassan mennének végbe. A fehérjék
elsősorban azért létfontosak, mert katalizálják a sejtet életben tartó metabolikus reakciókat. Egy
átlagos állati sejtben több ezer különböző enzim működik.
Az enzimek mint biokatalizátorok csökkentik a kémiai reakciók lezajlásához szükséges aktiválási
energiát, anélkül, hogy a szubsztrátok és termékek energiaszintjét befolyásolnák (3.5. ábra).
Enzimhatásra a reakció sebessége többmilliószorosára növekedhet.

3.5. ábra: Az enzim csökkenti a katalizált reakció aktiválási energiáját

A reakció az enzim aktív helyén zajlik le. A szubsztrát és az aktív hely térszerkezete egymást
kiegészíti, kötődéskor a szubsztrátmolekula és az aktív centrum pontosan illeszkedő felületei
között gyenge kötések alakulnak ki, ezek mintázata biztosítja az enzim fajlagosságát (kulcs-zár
mechanizmus). Az is előfordulhat, hogy az optimális aktív hely konformációt a szubsztrát kötődése
hozza létre (indukált illeszkedés mechanizmus). A szubsztrátkötődést mindenesetre a kémiai
reakció lezajlása követi, majd a termékek felszabadulnak.
Az enzimműködést számos tényező befolyásolja. A molekulák hőmozgása és az enzim
térszerkezete is függ a hőmérséklettől. A környezet pH-ja és iontartalma elsősorban az enzim
konformációját befolyásolja. Sok enzim működéséhez van szükség koenzimekre. Ezek kis
molekulák, melyek az enzimreakció során irreverzibilis változást nem szenvednek (pl. NAD+,
koenzim A stb.).

19
 4. Szénhidrátok és lipidek
Szénhidrátok
A szénhidrátok általános jellemzése
A szénhidrátok szénből, hidrogénből és oxigénből álló szerves vegyületek, amelyekben a H és O
aránya általában 2:1; összetételük a (CH2O)n általános képlettel írható le. Mivel ez alól a szabály
alól számos kivétel létezik, ennél jellemzőbb tulajdonságuk, hogy több alkoholos
hidroxilcsoportot, illetve cukoregységenként egy oxocsoportot is tartalmaznak (polihidroxi
aldehidek, illetve ketonok). A szénhidrátok aszimmetrikus (királis) szénatomokat tartalmaznak, így
ugyanaz az összegképlet számos biológiailag is eltérő sztereoizomert takarhat. A szénhidrátok
energiaforrásként, struktúraalkotó molekulákként és makromolekulák, sejtek azonosítását
szolgáló markerekként is szolgálhatnak.
A szénhidrátok osztályozása
Monoszacharidok. Az egyszerű szénhid-
rátok vízben oldódnak, édes ízűek, ezért
cukroknak is nevezzük őket. Csopor-
tosításuk szénatomszámuk alapján
lehetséges. Biológiai fontossággal a triózok,
pentózok és hexózok rendelkeznek. A
triózok (3 szénatomos cukrok) közé
tartozó gliceraldehid és dioxiaceton fontos
anyagcserefolyamatok közti termékei. A
pentózok (5 szénatomos cukrok) közé
tartozó ribóz és dezoxiribóz a nukleozidok,
nukleotidok, nukleinsavak alkotórészei (l.
2. fejezet). A hexózok (6 szénatomos
cukrok) legjelentősebb képviselője a
glukóz (szőlőcukor), a sejtek legfontosabb
energiaforrása, számos összetett
szénhidrát alkotórésze. A glukózaldehid- 4.1. ábra: A glukóz lineáris és gyűrűs szerkezete:
cukor, amely lineáris formában is létezik, α és β konfiguráció
biológiai rendszerekben azonban inkább
hatatomos gyűrűs formájában van jelen, amelyben az 1. és 5. szénatomot oxigénhíd köti össze. Az
átrendeződés következtében az 1. szénatom is aszimmetrikussá válik, így a glukóznak kétféle
sztereoizomérje létezik: α és β (4.1. ábra). A gyűrűs szerkezet egyébként minden pentózra és
hexózra jellemző. A mannóz és agalaktóz a glukóz sztereoizomérjei, a fruktóz viszont ketohexóz.
Az élő rendszerekben nemcsak egyszerű cukrok, hanem azok különböző származékai is
előfordulnak (pl. glukuronsav, N-acetilglukózamin, N-acetilgalaktózamin, sziálsav stb.). Ezek
glikoproteinek, glikolipidek, glikózaminoglikánok alkotóelemei (l. később).
Diszacharidok. Cukrok hidroxilcsoportjai között
vízkilépéssel kovalens kötés (glikozidos kötés)
alakulhat ki. A diszacharidok legismertebb
képviselői a szacharóz (répacukor; glukóz α1 → 2
fruktóz), a maltóz (malátacukor; glukóz α1 → 4
glukóz, 4.2. ábra) és a laktóz (tejcukor; galaktóz β1
→ 4 glukóz).

4.2. ábra: A maltóz szerkezete

20
Oligoszacharidok. Néhány cukor, cukorszármazék egységből felépülő szénhidrátok, melyek
fehérjékhez, lipidekhez kapcsolódnak kovalens kötéssel. Fehérjék sejteken belüli lokalizációját,
illetve a sejtek identitását meghatározó markerekként működnek.
Poliszacharidok. Nagyszámú
hexóz egységből felépülő
makromolekulák. A cellulóz a
növényi sejtfal mechanikai
stabilitását biztosító összetett
szénhidrát. Poli (β1 → 4 glukóz)
láncai kinyújtott, el nem ágazó
rostok, melyek egymáshoz H-
hidakkal kapcsolódva kötegeket
alkotnak. A növényi tartalék
tápanyag keményítő ugyancsak
glukóz-poliszacharid, szerkezete
azonban nem hasonlít a celluló-
zéhoz (4.3. ábra). α1 → 4 kötései
helikális konformációt biztosí-
tanak a láncok számára, amilóz
alkotórésze elágazásokat nem
tartalmaz, az amilopektin
komponensben viszont egy-egy
α1→6 kötés elágazást hoz létre.
Az állati tartalék tápanyag
glikogén szerkezete az amilo-
pektinéhez hasonlít.
4.3. ábra: A cellulóz és a keményítő szerkezete
Speciális poliszacharidok a glikózaminoglikánok. Ismétlődő diszacharid egységekből épülnek fel,
amelyeket hexózszármazékok alkotnak. A legtöbb glikózaminoglikán (kondroitin-szulfát, heparin,
dermatán-szulfát stb.) egyes hidroxilcsoportjait kénsav észteresíti; a szulfátcsoportok erős
negatív töltést adnak a molekulának, ami vizet kötve gélt képez. Ez a hidratált, kocsonyás anyag
adja az extracelluláris mátrix alapállományát. A glikózaminoglikánok általában fehérjékhez kötve
hatalmas makromolekuláris komplexeket, proteoglikánokat alkotnak.

Lipidek
A lipidek általános jellemzése
A lipidek kémiai szerkezet szempontjából heterogén szerves vegyületcsoport. Tagjainak közös
jellemzője, hogy hidrofób jellegű molekulák: vízben rosszul, szerves oldószerekben (éter,
kloroform stb.) viszont jól oldódnak. Egyes lipidek (pl. trigliceridek) fő funkciója az
energiatárolás: lebontásuk során nagy mennyiségű energia szabadul fel, amit a sejt ATP-
szintézisre használ fel. A lipidek egy nagy csoportja (foszfolipidek, glikolipidek, koleszterin)
amfipatikus jellegű: molekulájuk hidrofób és hidrofil régiót is tartalmaz. Ezek a lipidek alkotják a
biológiai membránok lipid kettős rétegét. Számos lipid jelátvivő molekula: közvetítőként működik
a sejtek közötti (pl. szteroid hormonok, retinoidok) és a sejten belüli (pl. szteroidok, retinoidok,
foszfatidilinozitol származékok, ceramid) szignál transzdukciós folyamatokban.
A lipidek osztályozása
Trigliceridek. Ezek a lipidek a glicerinnek 3 hosszú szénláncú zsírsavval alkotott észterei (4.4.
ábra). A zsírsavak lehetnek telítettek (azaz nem tartalmaznak kettős kötéseket, pl. palmitinsav,

21
sztearinsav) és telítetlenek (egy vagy több kettős kötés van bennük, pl. olajsav). A trigliceridek
vízben gyakorlatilag oldhatatlanok, a sejtek citoplazmájában zsírcseppekként tárolódnak.

4.4. ábra: Triglicerid (A.) és foszfolipid (B.) szerkezete

A foszfolipidek közös jellemzője, hogy foszfátcsoportot tartalmaznak, amely hidrofil csoportot
alkot a molekulákban. A glicerinfoszfolipidekben a glicerin hidroxilcsoportjait két zsírsav és egy
foszforsav észteresíti, utóbbihoz észterkötéssel valamilyen alkohol kapcsolódhat. A
glicerinfoszfolipidek elnevezése az alkoholkomponens alapján történik (foszfatidilkolin, -
etanolamin, -szerin, -inozitol). A foszfolipidek másik csoportja a szfingomielinek: ezekben egy
hosszú szénláncú alkohol (szfingozin) zsírsavval kapcsolódva ceramidot hoz létre, amit foszfokolin
észteresít (4.5. ábra).
Glikolipidek. Szénhidráttartalmú membránlipidek, amelyek a membránok exoplazmatikus (azaz
a citoszóllal ellentétes oldali) lemezében helyezkednek el. A sejtfelszíni glikolipidek fontosak a
sejtek felismerésében (pl. vércsoportanyagok). A cerebrozidokban a cukorkomponens ceramidhoz
kötődik, a gangliozidok közös jellemzője pedig, hogy egy speciális cukorszármazékot, a sziálsavat
tartalmazzák.
A szteroidok szerkezete teljesen eltér az eddig leírt lipidekétől. Három hatszénatomos és egy
ötszénatomos gyűrűből álló szteránváz alkotja alapstruktúrájukat, a vázhoz kapcsolódó csoportok
szabják meg minőségüket (4.6. ábra). A szteroidok prototípusa a koleszterin, amely – amfipatikus
lipid lévén – eukariota membránok komponense, másrészt viszont egyéb szteroidok (pl. szteroid
hormonok) előanyaga.
A karotinoidok konjugált kettős kötéseket tartalmazó, színes molekulák. A β-karotin (4.7. ábra)
növényi sejtek fotoszintetikus pigmentje. A retinal a gerinces szem pálcikáiban a rodopszin
prosztetikus csoportja. A retinoidok (pl. retinsav) a gerincesek embrionális fejlődésében fontos
szerepet játszó A-vitamin származékok.

22
4.5. ábra: A szfingomielin szerkezete 4.6. A szteránváz szerkezete

4.7. ábra: A β-karotin szerkezete

23
 5. Morfológiai vizsgáló módszerek I.: Fénymikroszkópia
Mióta a XVII. század második felében Hooke angol tudós megszerkesztette az első több lencséből
álló összetett mikroszkópot, majd a holland Leeuwenhoek először figyelt meg élő sejteket, a
fénymikroszkóp a sejtbiológusok, szövettanászok, patológusok alapvető vizsgálóeszköze. Bár
egyes paraméterei (pl. feloldóképesség) javításának az optika törvényei határt szabnak,
számítógépes technikák segítségével a képalkotási eljárások újabb lehetőségei nyílnak meg.
Napjainkban ezért a fénymikroszkóp az informatika forradalmának köszönhetően újabb
aranykorát éli.

A közönséges fénymikroszkóp
A mikroszkóp felépítése
Az összetett mikroszkóp két, tandem elhelyezkedésű nagyító lencserendszerből, az objektívből
és az okulárból áll (5.1. ábra). A modern mikroszkóp optikai rendszerét járulékos
lencserendszerek és fényforrások egészítik ki. A megvilágítás lehet transzmissziós (a vizsgált
tárgyon átmenő) és reflexiós (az objektum által visszavert sugarakat adó). A közönséges
transzmissziós mikroszkóp fényforrásából származó fényt a kondenzor lencserendszer
összpontosítja a tárgyasztalon elhelyezett objektumra, annak a vizsgálat célját legjobban szolgáló
megvilágítását biztosítva. A mikroszkóp különböző nagyítású tárgylencséit (objektívjeit)
mozgatható revolverfoglalat tartja. Az objektívből a tubuson keresztül a szemlencsékbe
(okulárokba) vagy a mikroszkópra szerelhető fényképezőgépbe vagy videokamerába juthatnak a
fénysugarak. A megvilágítás erőssége, a lencserendszerek helyzete beállítócsavarokkal
változtatható. A különböző alkotórészeket a mikroszkóp állványára rögzítik.

5.1. ábra: A fénymikroszkóp felépítése. A: A mikroszkóp részei. B: A fény útja

24
A képalkotás elve
A mikroszkópban keletkező képet az objektív és okulár lencserendszer hozza létre (5.2. ábra). A
vizsgált objektum a tárgylencse fókuszpontján kívül helyezkedik el, róla az objektív fordított
állású, nagyított, valódi intermedier képet hoz létre. A mikroszkóp tubusát úgy tervezik meg,
hogy ez a kép az okulár fókuszpontján belülre essen. Az eredmény: a tárgyhoz képest fordított
állású, erősen nagyított, látszólagos kép.

5.2. ábra: A kép keletkezése a fénymikroszkópban (F1 és F2 a lencsék fókuszpontjai)

Nagyítás és feloldóképesség
A mikroszkóp nagyítását (a kép és a tárgy méretének hányadosát) az objektív és az okulár saját
nagyításának szorzata adja. A lefényképezett képet azután fototechnikai úton elvileg korlátlan
mértékben tovább lehetne nagyítani. Ennek azonban nem sok értelme lenne, mert a nagyítás
növelésével nem lehet további részleteket láthatóvá tenni a képen.
A mikroszkópok feloldóképességét (két közeli pont megkülönböztetésének a képességét) az
alkalmazott sugárzás hullámtermészete korlátozza. A vizsgált objektum optikai rácsként
viselkedik: a rajta átmenő hullámok elhajlást (diffrakciót) szenvednek és a fellépő
interferenciajelenségek összezavarják a képződő képet. A hatás annál kifejezettebb, minél
közelebb vannak egymáshoz a vizsgált tárgy diffrakciót előidéző elemei. A mikroszkóp feloldási
határa (az egymástól még megkülönböztethető pontok távolsága) nagyságrendben megfelel az
alkalmazott sugárzás hullámhosszának. Látható fénnyel (l = 400–700 nm) működő
fénymikroszkóp maximális feloldóképessége kb. 200 nm. A feloldási határ (d) az alábbi egyszerű
képlettel számítható:

ahol λ a fény hullámhossza, NA pedig a numerikus apertúra, amely az objektív fényösszegyűjtő

képességét fejezi ki; függ az objektív frontlencséjének erősségétől és a tárgy és az objektív közötti
közeg törésmutatójától (levegő: 1, immerziós olaj: 1.4).
Kontrasztfokozás
Hogy egy képlet megfigyelhető-e a mikroszkópban, két tényezőtől függ: a feloldóképességtől és a
kontraszthatásoktól, azaz attól, hogy fényabszorpciója eltér-e a környezetétől. A közönséges
fénymikroszkópban a látótér világos, a vizsgált objektumoknak jelentős fényabszorpciót kell

25
produkálniuk az érzékelhető kontrasztosság eléréséhez. Ezt leggyakrabban a vizsgált szövet
fixálásával, metszésével és festésével érik el. Élő sejtek tanulmányozására a közönséges
fénymikroszkóp általában nem alkalmas, ehhez speciális optikai rendszerekre van szükség.

Különleges mikroszkópok
Fáziskontraszt- és differenciális interferencia kontraszt mikroszkóp
A kontraszthatásokat a vizsgált metszet különböző részei között fellépő fényabszorpció-eltérések
okozzák. Élő sejtek esetében ezek a különbségek általában csekélyek. A transzparens és
abszorbeáló területeken áthaladó fénysugarak között létrejön ugyan kismértékű fáziseltolódás, az
interferencia azonban nem okoz jól érzékelhető fényamplitúdó-változást. A fáziskontraszt-
mikroszkópban, illetve a differenciális interferencia kontraszt mikroszkópban optikai
eszközökkel állítanak elő a sejten áthaladó fénysugarak között optimális mértékű fáziseltolódást,
mely erős amplitúdóváltozáshoz (erősítéshez vagy kioltáshoz) vezet.
A kapott kép videokamerával is rögzíthető, elektronikus formában tárolható. A
videomikroszkóppal nyert képet digitális úton, a háttér csökkentésével tovább lehet javítani. A
számítógépes kontrasztfokozás a fénymikroszkópia új, sokat ígérő módszere.
Sötétlátóterű mikroszkóp
Speciális kondenzor segítségével elérhető, hogy a vizsgált objektumot ne a mikroszkóp optikai
tengelyében, hanem oldalról világítsák meg. Ebben az esetben az objektívbe csak a tárgy által
szétszórt sugarak egy része jut be, a háttér sötét marad. A sötétlátóterű mikroszkópban a
vizsgált tárgy különböző részei között fellépő minimális fényintenzitásbeli eltérések is
érzékelhetők a fekete háttér előtt.
Polarizációs mikroszkóp
Az anizotróp (kettősen törő) struktúrákra
jellemző, hogy törésmutatójuk két egymásra
merőleges síkban eltérő. Ennek
következtében képesek arra, hogy – térbeli
orientációjuktól függően – a rájuk eső
poláros fénysugarak rezgési síkját
elforgassák. Az anizotróp anyagok (a
biológiai struktúrákban ilyenek például
bizonyos szervetlen kristályok, rendezett
struktúrák, fehérjerost-kötegek)
polarizációs mikroszkóppal jól
vizsgálhatók (5.3. ábra). A vizsgált minta két
polárszűrő (polarizátor és analizátor)
között helyezkedik el. Ha a két szűrő rezgési
síkja párhuzamos, a polarizátor által
létrehozott poláros fénysugár
akadálytalanul átjut az analizátoron és
megvilágítja a látóteret. A polárszűrők
keresztezett állása sötét látóteret
eredményez. Ha azonban a vizsgált
objektum kettősen törő struktúrákat
5.3. ábra: A polarizációs mikroszkóp működési elve tartalmaz, azok saját rezgési síkjai
(a: párhuzamos polárszűrők; b: keresztezett elforgathatják a polarizált fénysugár rezgési
polárszűrők; c: anizotróp képlet vizsgálata síkját és az az analizátoron áthatolva
keresztezett polárszűrők mellett) világossá teszi az anizotróp régiókat, míg a

26
tárgy többi, izotróp része és a látótér sötét marad. A polarizációs mikroszkóppal végzett
vizsgálatok így az objektum szubmikroszkópos, molekuláris szerkezetére is következtetni
engednek.
Fluoreszcencia-mikroszkóp
A vizsgált objektum fluoreszcens festékekkel
(fluorokrómokkal) is festhető. Ezek az anyagok
meghatározott hullámhosszú fénysugarakat
elnyelnek és kisebb energiájú (nagyobb
hullámhosszúságú) sugarakat bocsátanak ki. A
modern fluoreszcencia- mikroszkópban (5.4.
ábra) a fényforrás sugaraiból speciális filterrel
(elsődleges szűrő) állítják elő a kívánt
hullámhosszú megvilágító fényt. Ezt dikroikus
(sugárszétválasztó)tükör irányítja a tárgyra: a
tükör a kisebb hullámhosszú sugarakat
visszaveri, a nagyobb hullámhosszúakat (például
a tárgy által kibocsátottakat) viszont átengedi. A
megvilágító fény a vizsgálati objektumban
fluoreszcenciát kelt, az emittált sugarakat az
objektív gyűjti össze, majd, miután egy 5.4.ábra: A fluoreszcencia mikroszkóp
másodlagos filter kiszűri közülük a nemkívánatos felépítése és működési elve
sugarakat, az okulárba jutnak.
A fluoreszcencia-mikroszkóp alkalmazási lehetőségei egyre bővülnek. Fluorokrómokkal
meghatározható az intracelluláris Ca++-koncentráció, pH, fluoreszcens festékkel (pl.
fluoreszceinnel, rodaminnal) specifikus antitestek, nukleinsavpróbák jelölhetők meg. (Az ezeket
felhasználó immunfluoreszcencia-mikroszkópia, illetve in situ hibridizáció módszereivel későbbi
fejezetekben foglalkozunk.)
Konfokális mikroszkóp
A fluoreszcencia-mikroszkópok erénye a sötét háttér előtt elérhető nagy érzékenység és kitűnő
kontraszthatás. Hátrányuk azonban, hogy emittált sugarak a fókuszsík alatti és feletti
metszetrétegekből is érkezhetnek, elmosódóvá téve a képet. A konfokális mikroszkópban a
fluoreszcencia-mikroszkópia és az elektronikus képanalízis eszközeinek kombinálásával
megoldották ezt a problémát.
A konfokális mikroszkóp rendkívül bonyolult és drága műszer, működési elve azonban egyszerű
(5.5. ábra). Az áramforrásból érkező sugarakkal egy optikai rés segítségével a vizsgált
objektumban pontszerű megvilágítást alkalmaznak. A fluoreszcens festék által emittált sugarakat
egy, a megvilágító résnek megfelelő, azzal konfokális nyíláson keresztül továbbítják a mikroszkóp
detektorába. A fókuszált, pontszerű megvilágítás minimálissá teszi a „megcélzott” ponttól eltérő
helyen keltett fluoreszcenciát, az így keletkező gyenge sugárzást is kiszűri a második fényrekesz
(5.5.B. ábra). A detektorba jutott képet videokamera rögzíti, a kép további „tisztítása” digitális
úton történik. A megvilágított pont változtatásával a vizsgált sejt végigpásztázható, sőt, annak
különböző mélységű rétegeinek leképezéséből a komputer háromdimenziós képet tud
szerkeszteni (optikai metszetkészítés).

27
 5.5. ábra: A konfokális mikroszkóp működési elve (A: a fluoreszcens objektum megvilágítása; B: a
fókuszpontból és azon kívüli régióból származó fénysugarak sorsa)

Fénymikroszkópos vizsgálatok élő sejtekben

A fluoreszcens jelölés technológiájának fejlődése és a nagy teljesítményű fénymikroszkópok
kifejlesztése lehetővé tette a fixálatlan élő sejtek folyamatainak vizsgálatát, az élő sejt
mikroszkópia megjelenését. A sejtbe fluorokrómmal jelölt molekulákat (pl. lipideket, fehérjéket,
nukleinsavakat, organellum-specifikus festékeket stb.) juttatnak, majd azok sorsát konfokális
mikroszkópban kísérik figyelemmel. A sejtek életképességének fenntartására a tárgyasztal
speciális kamrájában optimális feltételeket (hőmérséklet, páratartalom, a levegő összetétele) kell
biztosítani és korlátozni kell a megvilágítás által kiváltott sejtkárosodást is.
Az élő sejt mikroszkópiát leggyakrabban fehérjék sejten belüli mozgásának, fehérje-
fehérjekapcsolatok kialakulásának tanulmányozására használják. A terület fejlődését nagy
mértékben meggyorsította egy medúzafajban azonosított autofluoreszcens fehérje, az ún. zöld
fluoreszcens protein bevezetése a mikroszkópiába. A rekombináns DNS technológia módszereinek
felhasználásával (l. 9. fejezet) a zöld fluoreszcens fehérjét bármilyen proteinhez hozzá lehet
kapcsolni és a fúziós fehérjét a vizsgálandó sejtben lehet termeltetni, fluoreszcenciáját pedig
konfokális mikroszkópiával lehet tanulmányozni az élő sejtben. Más élőlényekből újabb
fluoreszkáló fehérjéket izoláltak, illetve a zöld fluoreszcens fehérje génjének célzott mutációjával
számos, más színben fluoreszkáló fehérjét is előállítottak, tovább szélesítve ezen fehérjék
sejtbiológiai alkalmazásának lehetőségeit.
Az élő sejt mikroszkópia a sejtbiológia és a biofizika gyorsan fejlődő területe. Mivel nemcsak
sejtkultúrákban, hanem az élő szervezetben is alkalmazható, várhatóan az emberi betegségek
diagnosztikájában is jelentős jövő vár erre a tudományterületre.

28
 6. Morfológiai vizsgálómódszerek II.:
Elektronmikroszkópia
A mikroszkópokkal elérhető maximális feloldóképességet az alkalmazott sugár hullámhossza
szabja meg (l. 5. fejezet). A fénymikroszkóp esetében ezt a határt (kb. 200 nm) már a XIX. század
végén elérték. A mikroszkópia azóta végbement fejlődése a képminőséget, kontraszthatásokat,
festési és mintaelőkészítési eljárásokat tökéletesítette, a feloldóképességet azonban már nem
javíthatta. A felismerés, hogy az elektronsugarak hullámhossza nagyságrendekkel kisebb, mint a
fénysugaraké, így velük a fénymikroszkópnál sokkal jobb felbontás érhető el, az 1930-as években
az elektronmikroszkópok kifejlesztéséhez vezetett. A transzmissziós elektronmikroszkópban a
vizsgált mintán áthatoló, míg a pásztázó elektronmikroszkópban az objektum felületéről szétszórt
elektronok hozzák létre a képet.

Transzmissziós elektronmikroszkóp
Felépítés, működési elv
A transzmissziós elektronmikroszkópban (6.1. ábra) az
elektronsugár forrása az elektronágyú. A katódból a
gyorsítófeszültség hatására kilépő elektronok az anód
nyílásán keresztül jutnak a mikroszkóp képalkotó
rendszerébe. A vákuumban száguldó elektronokat a
fénymikroszkópban alkalmazott optikai lencse-
rendszerekkel analóg elektromágneses lencsék (kondenzor,
objektív és projektor lencsék) fókuszálják. A kondenzor és
az objektív között elhelyezett objektum különböző
elektronszórású régióin az áthaladó elektronok útja eltérő
mértékben változik meg. A szóródott elektronokat kiszűrik,
az irányváltozás nélkül áthaladó sugarakat pedig
fluoreszkáló ernyőn vagy fotolemezen képezik le.
A mikroszkóp feloldóképességét elsősorban a
gyorsítófeszültség határozza meg, hiszen ennek értéke
fordítottan arányos az elektronsugár hullámhosszával.
6.1. ábra: A transzmissziós Hagyományos elektronmikroszkóp esetében, biológiai
elektronmikroszkóp felépítési elve anyagok vizsgálatánál, 100 kV-os gyorsítófeszültséggel kb.
0.1 nm-es maximális feloldóképesség érhető el.
Nagyfeszültségű elektronmikroszkópban több millió voltos gyorsítófeszültség is alkalmazható. A
megnövelt feloldás mellett ennek előnye, hogy vastag metszetek, preparátumok vizsgálatára,
térhatású kép nyerésére is alkalmas.
A minta előkészítése
A nagy feloldóképesség miatt az elektronmikroszkópos mintapreparálás alapvető célja kell, hogy
legyen a vizsgálati anyag kíméletes, a finom szerkezetet minél jobban megőrző rögzítése.
Általában kettős fixálást alkalmaznak: aldehidekkel (formaldehid, glutáraldehid) a fehérjék között
hoznak létre keresztkötéseket, az ozmiumtetroxid pedig a telítetlen zsírsavakhoz kötődve
elsősorban a membránokat rögzíti. A kémiai fixatívumokon kívül kriofixálás is alkalmazható:
kisméretű objektumok hirtelen lehűtéssel a sejtszerkezet minimális károsodásával rögzíthetők. A
szövetblokkot beágyazással teszik alkalmassá a metszésre. Erre általában műgyantákat
(rezineket) használnak. Hátrányuk, hogy károsítják a magasabb rendű sejtek citoplazmatikus és
nukleáris fehérjefonal-hálózatait. A citoszkeleton és a magmátrix vizsgálatára újabban ún.
rezinmentes, ultravékony metszeteket használnak.

29
A beágyazott vizsgálati blokkból ultramikrotommal ultravékony (50–100 nm vastagságú)
metszeteket készítenek, melyeket fémrácsra (gridre) visznek fel. A vizsgálat során az elektronok
szóródása a mintában jelenlevő elemek rendszámától függ: a képalkotáshoz szükséges
elektronszórással csak nehézfémek rendelkeznek. A fixáláshoz használt ozmium a célnak
megfelel, a kontrasztfokozás érdekében azonban általában utófestésre van szükség.
Utókontrasztosításra leggyakrabban urán- vagy ólomsókat használnak. Az ilyen hagyományos
eljárással nyert képeken az elektronszóróvá tett organellumok (membránok, kromatin,
riboszómák stb.) sötét képletekként jelennek meg.
Speciális vizsgálati módszerek

Fémgőzölés (árnyékolás). A fémgőzölés egyenetlen

felszínek, izolált makromolekulák, partikulumok
vizsgálatára alkalmas. A vizsgálati anyagot zárt térben,
vákuumban elpárologtatott nehézfémmel (pl. platinával)
vonják be. A fémgőzölés történhet egy meghatározott
irányból (szögárnyékolás) vagy az objektum forgatása
közben (körárnyékolás). Előbbi esetben (6.2. ábra) a felszín
egyes részei „árnyékban maradhatnak”: nem rakódnak le
rájuk fémszemcsék. A fémréteget szilárdító karbonfilmmel
vonják be, majd a biológiai mintát speciális oldószerrel
eltávolítják alóla. Az elektronmikroszkópban a
karbonrétegből és platinabevonatból álló replika vizsgálata
történik. A szögárnyékolással kapott kép térhatású; az
árnyékok hosszának és a fémgőzölés szögének ismeretében
az egyes képletek (vírusok, RNP-szemcsék) magassága is
meghatározható. Körárnyékolást általában hosszú,
filamentózus képletek (DNS, RNS, kromatinfonalak)
vizsgálatára használnak; a kép nem térhatású, de
kontrasztos.

6.2. ábra: Szögárnyékolással fémgőzölt replika készítése

6.3. ábra: A fagyasztva törés (A) és a fagyasztva maratás (B) elve

30
Fagyasztva törés/maratás. Ha a vizsgálandó sejteket folyékony nitrogénben –196 °C-on hirtelen
megfagyasztják, a víz apró kristályok formájában fagy meg, a sejten belüli struktúrák kevéssé
károsodnak. A megfagyott blokkot mikrotomkéssel ketté lehet „pattintani” (fagyasztva törés
[angol kifejezéssel freeze-fracture]). A törés síkja általában a membránfelszíneknél, gyakran egy
hártya két lipidrétege között halad. A preparátumról fémgőzöléses replika készíthető a törési
felszín vizsgálatára: a kettéhasított membránok transzmembránfehérjéi ilyenkor az egyik
felszínen intramembrán partikulumokként jelennek meg. Ha a replika elkészítése előtt vákuumban
a jeget szublimáltatják a törési felszínről, a kimaródott felszínről készült replika a
sejtorganellumok felszínéről, topográfiai viszonyairól ad térhatású kép formájában információt
(az eljárás neve: fagyasztva maratás [angolul freeze-etch]).
Negatív festés. Izolált organellumok, részecskék, makromolekulák olyan elektronszóró festékkel
is láthatóvá tehetők, mely a vizsgált anyaghoz nem kötődik, környezetét viszont elektronszóróvá
teszi. A karbonfilmen szélesztett partikulumokat lecseppentik a festék oldatával (pl.
uranilacetáttal), beszárítják és transzmissziós elektronmikroszkóppal vizsgálják a preparátumot.
A negatív kontrasztosítás a partikulumok felszíni viszonyainak tanulmányozására különösen
alkalmas.

Pásztázó elektronmikroszkóp
A pásztázó (angolul scanning) elektronmikroszkóp prototípusát már az 1930-as években
megalkották, a sejtbiológiai vizsgálatokra alkalmas készülékek azonban csak az 1960-as évektől
kezdtek elterjedni. Az árnyékolási technikákhoz hasonlóan a vizsgált objektum felszíni
viszonyairól ad háromdimenziós képet (6.4. ábra). A minta felszínét vékony nehézfémréteggel (pl.
platinával) vonják be, majd egy fókuszált elektronsugárral végigpásztázzák. A becsapodó
elektronok szóródnak, illetve másodlagos elektronok kibocsátását gerjesztik a fémbevonatban. A
felszínről visszaverődő szekunder elektronokat detektor gyűjti össze és TV-képernyőn hozza létre
a térhatású képet. A pásztázó elektronmikroszkópok hátránya, hogy feloldóképességük (néhány
nanométer) elmarad a hagyományos transzmissziós készülékekétől.

6.4. ábra: A pásztázó elektronmikroszkóp felépítési elve

31
 7. Molekulák nyomon követése a sejtben
Az élő sejt dinamikus struktúra: benne makromolekulák képződnek, módosulnak, esetleg
helyüket változtatják, végül lebomlanak. A hagyományos mikroszkópos vizsgálatok (de sok
biokémiai, molekuláris biológiai módszer is) a sejt egy adott pillanatra jellemző állapotáról
készítenek pillanatfelvételt, kevés információt szolgáltatnak az élő anyagban állandóan
végbemenő változásokról. Ebben a fejezetben azokról a sejtbiológiai módszerekről lesz szó,
melyek a sejt egyes molekuláinak képződését, érését, lebontását, a molekulák sorsát képesek
nyomon követni.

Radioaktív izotópok alkalmazása a sejtbiológiában

Az izotópok ugyanazon elemnek különböző tömegszámú variánsai: bennük a protonok (és
elektronok) száma azonos, a neutronok számában azonban különböznek. Az azonos rendszám
azonos kémiai viselkedést jelent, a sejt ezért ugyanazon elem különböző izotópjai között nem tud
különbséget tenni, egyformán építi be őket molekuláiba. A radioaktív izotópok (radioizotópok)
instabil atommaggal rendelkeznek: véletlenszerű elbomlásuk radioaktív sugárzást eredményez
(pl. β-sugárzást [elektronokat], γ-sugárzást), amely megfelelő műszerrel érzékelhető.
Az élő anyagot felépítő számos elem radioizotópja alkalmas intracelluláris folyamatok
tanulmányozására (a leggyakrabban alkalmazottak néhány jellemzőjét foglalja össze a 7.1.
táblázat). A radioizotópot olyan molekulában hozzák létre, mely a sejtbe bejutva a vizsgálat
tárgyát képező célmolekulába épül be. Az ilyen jelölt prekurzor sejten belüli sorsának követésére
többféle lehetőség adódik.
Autoradiográfia
A fény- és elektronmikroszkópos autoradiográfia alkalmas lágy β-sugárzó izotóppal (pl. 3H-
mal) jelölt prekurzor molekulák sejten belüli detektálására. Az in vivo vagy sejtkultúrában
végrehajtott jelölés után a vizsgálati anyagból mikroszkópos preparátumot készítenek, a
metszetet vékony fotoemulziós réteggel vonják be (7.1.A. ábra), majd megfelelő ideig expozíciót
végeznek. A vizsgált sejtekbe beépült radioaktív prekurzor molekulákból származó elektronok az
ezüstbromid kristályokban fotokémiai reakciót idéznek elő. Ezek előhívás után fekete
ezüstszemcsék (angol kifejezéssel grainek) formájában jelölik a metszet felett a radioaktívvá vált
régiókat. Az autoradiográfiával sokféle makromolekula szintézise vizsgálható: jelölt timidinnel
például a DNS-replikáció (7.1.B. ábra), uridinnel az RNS-szintézis, aminosavakkal a
fehérjeszintézis, monoszacharidokkal a fehérjeglikoziláció folyamata tanulmányozható.
Az autoradiográfia nemcsak mikroszkópos eljárás, bizonyos szeparációs módszerekkel
szétválasztott radioaktív, vagy az eljárás során radioaktívvá tett makromolekulák detektálására
is alkalmas. Vékony géllemezben, papíron vagy membránon végzett elektroforézist, vékonyréteg
kromatográfiát (l. 8. fejezet) követően a szétválasztott radioaktív molekulákat úgy mutatják ki,
hogy a gélre vagy lemezre röntgenfilmet helyeznek, expozíciót, majd előhívást végeznek. A
röntgenfilmen a radio-jelölt anyagok fekete foltokat, csíkokat eredményeznek, ezek
elhelyezkedéséből a jelölt molekulák tulajdonságaira (molekulatömeg, töltés, oldékonyság stb.),
erősségéből pedig a radioaktív jelöltség mértékére következtethetünk.
Tulajdonképpen az autoradiográfia speciális, továbbfejlesztett változata az ún. phosphor
imaging (foszfor-képalkotás). A radioaktív gélt vagy membránt nem röntgenfilmmel fedik be,
hanem egy foszforkristályokat tartalmazó réteggel bevont lemezzel. A kristályok elnyelik a
radioaktív sugárzást és később vörös lézerfénnyel történő megvilágítás során az energiát kék fény
formájában kisugározzák. A fénykibocsátás az erre a célra szolgáló műszerben (phosphor imager)
detektálható, megfelelő szoftver segítségével részletes analízis végezhető, az eredmények
digitálisan tárolhatók. A foszforkristályos lemezről a kép letörölhető, a lemez ismételten

32
használható. A phosphor imaging érzékenyebb, gyorsabb, sokoldalúbb, mint a röntgenfilmes
autoradiográfia, fokozatosan kiszorítja azt a molekuláris biológiai kutatásokból.

Radio- Kibocsátott Példa a felhasználásra

Féléletidő
izotóp sugárzás (jelölt prekurzor/vizsgált folyamat)
[3H]nukleozid/in vivo nukleinsavszintézis
3 H β részecske 12.35 év [3H]aminosav/fehérjeszintézis
[3H]cukor/glikoziláció
14 C β részecske 5730 év (hasonló a 3H-hoz)
35 S β részecske 87.5 nap [35S]metionin/fehérjeszintézis
[32P]ortofoszfát/in vivo fehérjefoszforiláció
32 P β részecske 14.3 nap [α-32P]nukleozidtrifoszfát/in vitronukleinsav-szintézis
[γ-32P]ATP/in vitro fehérje-foszforiláció
131 I γ részecske 8.1 nap in vitro fehérjejelölés

7.1. táblázat: A molekuláris sejtbiológiában általánosan használt radioaktív izotópok

7.1. ábra: Az autoradiográfia elve (A) és alkalmazása a DNS-replikáció kimutatására (B; a sejteket
[3H]timidinnel jelölték; a sémás ábra alsó sejtjében replikáció folyt a jelölés idején, a felső két sejt
viszont a sejtciklus más fázisában volt)

A radioaktívan jelölt makromolekulák izolálása és mennyiségi meghatározása

A morfológiai információt adó mikroszkópos autoradiográfia mellett egyéb módszerek is
rendelkezésre állnak a radioizotóp sejtbe épülésének tanulmányozására. A jelölt makromolekula
a feltárt sejtekből kinyerhető, különböző szeparációs módszerek (l. 8. fejezet) segítségével
tisztítható és biokémiailag jellemezhető. A radioaktivitás mennyiségi meghatározására többféle
lehetőség van. A Geiger-számláló a sugárzás ionizáló hatását méri. Folyadék-szintillációs
számlálóval az a fluoreszcencia határozható meg, amit a β- és γ-sugárzás speciális összetételű
szcintillációs folyadékban kelt.
Radioaktív jelölés biológiai folyamatok időbeli lefolyásának vizsgálatára
Ha egy kísérlet célja egy makromolekula sejten belüli útjának, átalakulásának, lebomlásának
vizsgálata, célszerű rövid, impulzusszerű jelölést (angolul pulse), majd izotóphigítást (chase)
alkalmazni. A 7.2. ábra szekretált fehérjék példáján mutatja be a pulse-chase jelölés lényegét. Ha

33
mirigysejteket rövid ideig radioaktív aminosavval jelölnek, a radioaktivitás a fehérjeszintézis
helyén (az endoplazmatikus retikulumban) mutatható ki autoradiográfiával. Ha ezután a jelölt
aminosavat eltávolítják a tenyésztőoldatból és jelöletlen prekurzorral helyettesítik, az ekkor
képződő fehérjék már nem lesznek radioaktívak. Az izotóphigítást követően különböző
időpontokban vett sejtek autoradiográfiás vizsgálatával a jelölt fehérjék útja nyomon követhető a
sejtben.

7.2. ábra: A szekréciós út vizsgálata pulse-chase jelöléssel. Hasnyálmirigy mirigyvégkamra sejteket

3 percig jelölt aminosavval kezeltek (A), majd 7 (B), illetve 120 percig (C) jelöletlen aminosav
jelenlétében folytatták az inkubációt. Az ezt követő elektronmikroszkópos autoradiográfia
kimutatta, hogy a fehérjék az endoplazmatikus retikulumban képződnek, innen a Golgi-
apparátusba kerülnek, majd szekréciós granulumok útján exocitózissal ürülnek ki a sejtből

Nem radioaktív jelölés

A radioizotópokkal végzett biológiai kísérletek legnagyobb előnye érzékenységük: a jelölt
molekulák olyan kis mennyisége is kimutatható, mely kémiai analízissel nem detektálható.
Bizonyos kísérleti szituációkban azonban a nem teljesen veszélytelen – hiszen a kísérletező
kutatónak sugárterhelést jelentő – radioizotópos módszer nem radioaktív jelöléssel
helyettesíthető. Ezek a törekvések megfelelnek a társadalomban a radioaktív szennyezéssel
szemben egyre növekvő ellenérzéseknek is.
Sűrűségjelölés
Speciális, a vizsgálandó makromolekulákba beépülő prekurzor molekulákkal azok sűrűsége
megnövelhető. Baktériumok esetében ez viszonylag egyszerűen elérhető, ha táptalajukba 15N-
izotópot tartalmazó ammóniumkloridot kevernek. A N-tartalmú makromolekulák (nukleinsavak,
fehérjék) sűrűsége nagyobb lesz mint a közönséges 14N-izotópot tartalmazóké. Az izolált
makromolekulák, partikulumok sűrűsége speciális centrifugálási módszerrel (izopiknikus
grádiens centrifugálással; l. a következő fejezetet) meghatározható. Hasonló hatás érhető el
nukleinsavak halogénezett nukleozid-származékokkal (pl. bromodezoxiuridinnel [BrdU],
bromouridinnel [BrU]), végzett jelölésével. A sűrűségjelölés felhasználási területe sokkal
szűkebb mint a radioizotóp módszereké, néhány mérföldkövet jelentő kísérletben azonban mégis
ezt a megközelítést választották: a DNS-szintézis mechanizmusának tisztázására (l. 20. fejezet), a
riboszómák transzlációs viselkedésének vizsgálatára.

34
Immunjelölés
A sejtek makromolekuláiba olyan prekurzorokat is be lehet építeni, melyek antigén hatásúak: a
jelölt makromolekula azután a prekurzor elleni antitest segítségével kimutatható. Mivel az
immuncitokémiai módszerek (melyekkel részletesen később foglalkozunk) a fény- és
elektronmikroszkópia érzékeny, elegáns és egyre népszerűbb technikái, a nem radioaktív jelölés
ezen fajtája várhatóan a jövőben mind szélesebb körben fog elterjedni. Antigén hatású
prekurzorként használhatók például a már említett BrdU és BrU vagy biotinmolekulákkal jelölt
prekurzurok. A detektálás azután anti-BrU, antibiotin antitestekkel végezhető. Autoradiográfiás
vizsgálat esetén az ezüstszemcse nem feltétlenül a radioizotópot tartalmazó metszetrész felett jön
létre (l. a 7.1. ábrát), így a lokalizáció pontatlan. Mivel az immunkomplexek valóban ott
keletkeznek a vizsgált objektumban, ahol a specifikus antigén jelen van, detektálásuk nemcsak
pontos lokalizációt tesz lehetővé, hanem – megfelelő modern képanalizáló eljárás segítségével –
akár térhatású kép is készíthető a vizsgált makromolekulák eloszlásáról.

35
 8. Szeparációs módszerek
A modern sejtbiológia és a molekuláris biológia kialakulását és fejlődését nagymértékben
felgyorsította azoknak a módszereknek a kifejlesztése, melyekkel a sejtek organellumait és
makromolekuláit egymástól szétválasztották, tiszta formában izolálták. A szeparációs
módszerek segítségével lehetővé vált az élő anyag kémiai összetételének, a sejtorganellumok
működésének vizsgálata, sejtmentes rendszerek létrehozása, biokémiai folyamatok analízise.
Ebben a fejezetben röviden foglalkozunk a molekuláris sejtbiológiában leggyakrabban használt
szeparációs eljárásokkal, a centrifugálási, kromatográfiás és elektroforetikus módszerekkel.

Centrifugálás
A nehézségi gyorsulás (g) sokszorosának kitett sejtorganellum-szuszpenzióban vagy
makromolekula-oldatokban a diszpergált részecskék méretüktől, alakjuktól és sűrűségüktől
függően különböző mértékben ülepednek. A centrifugákban ezt úgy érik el, hogy
nagyteljesítményű motorral fémrotort forgatnak, melyben a centrifugacsövek rögzített
helyzetben (szögrotor) vagy a centrifugálás alatt vízszintes pozíciót felvéve (kilendülő-poharas
rotor) forognak (8.1. ábra). A legnagyobb teljesítményű ultracentrifugákban 600 000 × g
gyorsulás is elérhető. Biológiai célra a centrifugálás különböző típusai használhatók.

8.1. ábra: A centrifugákban használt szögrotor (A) és kilendülő-poharas rotor (B)

Differenciál centrifugálás
A módszer célja az eukariota sejtek organellumainak izolálása, tisztítása: a sejtek frakcionálása.
A vizsgált sejteket, szövetet először vizes közegben homogenizálják: a sejthártyát ozmotikus
sokkal, ultrahanggal vagy más mechanikai behatással roncsolják. A homogenátumot ezután
ismételt, mind nagyobb sebességű centrifugálással frakcionálják (8.2. ábra): először a
sejtmagokat, azután a mitokondriumokat, majd az endoplazmatikus retikulum összetöredezéséből
képződő vezikulákat (mikroszómákat), végül a szabad riboszómákat ülepítik ki. Az utolsó
centrifugálással nyert felülúszó a sejt oldódó anyagait tartalmazó citoszól.

8.2. ábra: Sejtfrakcionálás differenciál centrifugálással

36
Hipopiknikus grádiens centrifugálás
A módszer eltérő tömegű, szedimentációs állandójú makromolekulák, partikulumok
szétválasztására alkalmas. A centrifugacsőben a cső alja felé fokozatosan növekvő töménységű
szacharóz oldatot helyeznek el (kontinuus grádienst alkalmaznak), a szétválasztandó mintát a
grádiens tetejére rétegezik, majd mindaddig centrifugálják, amíg a kívánt szeparációt el nem érik.
(A hipopiknikus elnevezés arra utal, hogy a grádiens sűrűsége kisebb mint a szétválasztott
részecskéké.) A centrifugálás után a műanyag cső alját kiszúrják, a grádienst lecsepegtetve
kémcsövekbe frakciókat gyűjtenek és meghatározzák bennük a vizsgált anyagok koncentrációját,
fehérjék, nukleinsavak esetén az ultraibolya fény abszorpciójával, jelölt anyag esetén
radioaktivitás-méréssel stb. (8.3. ábra). A kapott értékek grafikonon ábrázolva adják a
szedimentogrammot. Vírusok, sejtmagok, más sejtalkotórészek nagy tisztaságú preparátumának
előállítására diszkontinuus grádiens centrifugálást alkalmaznak. Két-három eltérő sűrűségű
oldatot rétegeznek egymásra, a szennyeződések ezeken a réteghatárokon „akadnak fenn”.

8.3. ábra: Bakteriális riboszóma alegységek szétválasztása szacharóz grádiens centrifugálással

Izopiknikus grádiens centrifugálás

Makromolekulák, részecskék sűrűség szerinti szétválasztására nagy sűrűségű oldatból (pl.
céziumkloridból) készült grádiens alkalmas. A szétválasztandó mintát belekeverik a
céziumklorid-oldatba (8.4. ábra), majd az ezt követő nagy sebességű ultracentrifugálás során a
sóoldatban sűrűséggrádiens alakul ki, a minta molekulái pedig a nekik megfelelő sűrűségű rétegbe
vándorolnak. (Innen származik az elnevezés: izopiknikus, vagyis azonos sűrűségű.) A frakciók
gyűjtése, a szétválasztott anyagok kimutatása a frakciókban és a szedimentogramm megrajzolása
a hipopiknikus centrifugálásnál ismertetett módon történik.

8.4. ábra: DNS és RNS szétválasztása céziumklorid grádiens centrifugálással

37
 Kromatográfia
A kromatográfiás szeparálás során a szétválasztandó molekulák oldatát (a mozgó fázist) szilárd
mátrixon (az álló fázison) bocsátják át; ha az oldott molekulák eltérő kölcsönhatást alakítanak ki
a mátrixszal, szétválaszthatók egymástól. A szilárd fázistól függően a kromatográfia különböző
technikákkal hajtható végre (pl. papír-, vékonyréteg-kromatográfia stb.); a biológiában leginkább
az oszlopkromatográfia terjedt el (8.5. ábra). A mátrixot üveg- vagy műanyag oszlopba töltik, a
mintát a tetejére rétegezik, majd az oszlop alsó végének kinyitásával kémcsövekbe frakciókat
gyűjtenek. A mátrixra felülről elúciós oldatot töltenek: ezzel mossák át a mintát az oszlopon. Ha a
szétválasztandó molekulák eltérő sebességgel haladnak át az oszlopon, külön frakciókban
foghatók fel. A frakciók vizsgálatával nyerhető grafikon a kromatogramm.

8.5. ábra: Két makromolekula (a és b) szétválasztása oszlopkromatográfiával

Biológiai makromolekulák szétválasztására elsősorban a gélszűrés, az ioncserélő és az affinitás-
kromatográfia használatos (8.6. ábra).

8.6. ábra: A gélszűrés (A), az ioncserélő kromatográfia (B) és az affinitás kromatográfia (C) elve

Gélszűrés (gélkromatográfia)
A gélkromatográfiás oszlopok kisméretű, porózus gélszemcsékből állnak (8.6.A. ábra). A
mátrixgyöngyök készülhetnek agarózból, poliakrilamidból, dextránból, ezek az anyagok térhálót
alkotnak, meghatározott méretű pórusokat hoznak létre. Az oszlopra felvitt minta nagy molekulái
kizáródnak a gélszemcsék pórusaiból és a szemcsék között gyorsan áthaladnak az oszlopon; a kis
molekulák viszont behatolnak a szemcsék belsejébe is, nagyobb folyadéktérben oszlanak meg és
ezért késve jelennek meg a kromatográfiás frakciókban. A gélek különböző pórusnagyságú

38
szemcsékkel készíthetők, így a gélszűrés széles molekulasúly-tartományban alkalmas molekulák
(pl. fehérjék) méret szerinti frakcionálására.
Ioncserélő kromatográfia
Az ioncserélő oszlopokat olyan gélgyöngyökkel töltik meg, melyek felszíne pozitív vagy negatív
töltésű (8.6.B. ábra): a szétválasztandó molekulák közül az ellentétes töltéssel rendelkezők
megkötődnek az ioncserélőn, a többi pedig gyorsan áthalad az oszlopon. A gélszemcséken
adszorbeálódott molekulák a mosófolyadék ionerősségének (sókoncentrációjának) növelésével
vagy pH-jának változtatásával eluálhatók. Az ioncserélő kromatográfiát elsősorban fehérjék töltés
szerinti szeparálására használják, de más molekulák frakcionálására is alkalmas (pl. a
hidroxilapatit kromatográfia egyes és kettős láncú nukleinsavak szétválasztására).
Affinitás-kromatográfia
A kromatográfiás mátrix és az izolálandó molekulák között biológiailag specifikus kötés is
kialakulhat (8.6.C. ábra). Ha a gélszemcsékhez olyan ligandot kapcsolnak kovalens kötéssel,
melyet a tisztítandó makromolekula képes felismerni és vele specifikus kölcsönhatást kialakítani,
a mátrixon csak az a molekula fog megkötődni, az elegy többi komponense szabadon
keresztülhalad az oszlopon. A kötés jellegétől függően azután az oszlopon maradt anyag eluálható.
A kapcsolat fajlagos jellege következtében az affinitás-kromatográfia a tisztítás leghatékonyabb
módszere: a kiszemelt molekula egyetlen kromatográfiás lépéssel nagymértékben feldúsítható a
mintában. Az affinitás-kromatográfia rendkívül széles körben alkalmazható: enzimek tisztítására
szubsztrát molekulák, antigénekére antitestek, DNS-kötő fehérjékére oligonukleotidok, poli(A)+
mRNS-ekére oligo(dT) használható ligandként és a sort sokáig lehetne folytatni.

Elektroforézis
Az elektroforetikus módszerek a fehérjék és nukleinsavak frakcionálásában mára minden
egyéb szeparációs technikát felülmúltak érzékenységben, sokféleségben és népszerűségben.
Lényegük, hogy vizes közegben létrehozott elektromos térben a töltéssel rendelkező molekulák
elmozdulnak az ellentétes töltésű elektród felé és ha vándorlásuk iránya vagy sebessége
különböző, egymástól fizikailag elválaszthatók. A szeparáció javítására különböző szilárd
mátrixokat használnak (pl. papírt, speciális membránokat, keményítőt), molekuláris biológiai
szempontból azonban a legfontosabbak a gélelektroforetikus módszerek: az agaróz és
poliakrilamid gélelektroforézis.
Agaróz gélelektroforézis
Az agaróz poliszacharid, melynek vizes szuszpenziója hevítés, majd lehűtés után géllé dermed. Az
agarózláncok egymással hidrogénhidakkal kapcsolódva térhálót hoznak létre, melynek sűrűsége
az agarózkoncentrációtól függ. Az agaróz géleket nukleinsavak frakcionálására használják, a
futtatás vízszintes géllemezben történik. Elektroforézis során a gél szűrőhatást gyakorol: a
pórusokon keresztül mozogva a nukleinsav-molekulák szétválnak, hiszen a kicsik gyorsabban, a
nagyok lassabban vándorolnak. RNS-ek esetében formaldehid tartalmú gélt használnak, hogy a
molekulák denaturált, kinyújtott állapotban vándoroljanak és a szeparálás a méret szerint
történjen (8.7. ábra). Az agaróz gélelektroforézis DNS-fragmentumok frakcionálásának is
rutinmódszere (l. 10.2. ábrát). A futtatást követően etídiumbromiddal vagy más fluoreszcens
festékkel teszik láthatóvá a nukleinsavakat a gélben.

39
 8.7. ábra: Emlős sejtből izolált rRNS-ek és mRNS-ek frakcionálása formaldehid/agaróz
gélelektroforézissel

Poliakrilamid gélelektroforézis
Akrilamid és biszakrilamid polimerizációjával kovalens kötésekkel térhálósított, kítűnő fizikai
tulajdonságokkal rendelkező elektroforetikus mátrix készíthető. A monomerek koncentrációjával
szabályozható a gél pórusnagysága. A poliakrilamid géleket általában két üveglap között,
géllemez formájában polimerizálják, az elektroforézis függőleges helyzetben történik. Számos
alkalmazási lehetőséget dolgoztak ki.
SDS-poliakrilamid gélelektroforézis. Ez a módszer a leghatékonyabb, rutinszerűen alkalmazott
fehérje-szeparációs módszer (8.8. ábra). A mintát nátrium-dodecil-szulfát (angol nevének
rövidítése: SDS) és merkaptoetanol jelenlétében forralják. Az SDS erős ionos detergens: hosszú
szénláncú alkohol és kénsav észtere. Apoláros láncával a fehérjék hidrofób aminosavaihoz
kapcsolódik, a kötődő nagyszámú SDS-molekula szulfátcsoportjai pedig erős negatív töltést adnak
a proteinmolekulának. A töltések taszító hatása következtében a fehérjelánc kiterül, más
molekulákkal létrehozott nem kovalens kötései felszakadnak. A polipeptidláncokon belüli vagy
azok közötti diszulfidhidakat a merkaptoetanol redukálja. Az egységesen negatív töltésű fehérjék
az elektroforézis során méretüktől függő sebességgel vándorolnak. Az SDS-poliakrilamid
géleketroforézis nemcsak molekulasúly szerinti szétválasztásra, de a fehérjék molekulasúlyának
meghatározására is alkalmas.

40
8.8. ábra: Fehérjék szétválasztása SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel

Fehérje-elektroforézis nem denaturáló gélben.

Poliakrilamid géleketroforézis SDS-mentes gélben is
végezhető. Ilyen körülmények között a fehérjék
megőrzik saját nettó töltésüket, méretük és alakjuk
mellett ez is meghatározza elektroforetikus
mobilitásukat. Az izoelektromos fókuszálás (8.9.
ábra) során a fehérjék szétválasztása kizárólag eltérő
töltésük, pontosabban izoelektromos pontjuk alapján
történik. Vékony csőben polimerizált gélben pH-
grádienst hoznak létre, majd a szétválasztandó
fehérjekeveréket ebben elektroforetizálják. A fehérjék
addig vándorolnak, amíg a csőben el nem érik az
izoelektromos pontjuknak megfelelő pH-t: ekkor netto
töltésük megszűnik és így mozdulatlanná válnak.

8.9. ábra: pH 7 izoelektromos pontú fehérje viselkedése

izoelektromos fókuszálás során

41
 Kétdimenziós elektroforézis. A hagyományos,
egyirányban végzett elektroforetikus módszerek
feloldóképessége korlátozott: optimális esetben
talán 80–100 protein választható szét. A
kétdimenziós poliakrilamid gélelektro-
forézis feloldása nagyságrenddel jobb ennél. A
módszer lényege, hogy a fehérjekeveréket két,
egymástól eltérő, egymásra merőleges irányú
futtatással frakcionálják (8.10. ábra). Az 1.
dimenzióban a szétválasztás izoelektromos
fókuszálással, töltés szerint történik. A gélcsíkot
ezután SDS-tartalmú géllemezbe építik be, és a 2.
dimenzióban SDS-poliakrilamid gélelektro-
forézissel molekulasúly szerinti szeparálást
végeznek. A fehérjék vizualizálás (festés,
autoradiográfia) után foltokként jelennek meg a
gél képén. Specifikus fehérjéket immunológiai
módszerekkel tesznek láthatóvá (l. 13. fejezet)

8.10 ábra: Fehérjék frakcionálása két-

dimenziós gélelektroforézissel
(1D: 1. dimenzió, 2D: 2. dimenzió)

Nukleinsavak elektroforézise. Poliakrilamid gélelektroforézissel RNS-, DNS-molekulák,

nukleoprotein komplexek is frakcionálhatók. Ezek közül a módszerek közül említésre leginkább a
szekvencia-analízisre használt denaturáló gélelektroforézis méltó. A hosszú, ureát tartalmazó, nagy
feszültséggel futtatott gélekben 1 nukleotidnyi hosszkülönbségek is feloldhatók (l. 10. fejezet és
10.4. ábra). A géllemezben történő elektroforézis nagyfeloldású alternatívája a kapilláris
gélelektroforézis: a DNS-molekulák szétválasztása hosszú, igen vékony üvegcsőbe töltött
poliakrilamid gélben történik. A miniatürizált elektroforetikus eljárás kidolgozása
nagymértékben hozzájárult a DNS-szekvenciázó automaták kifejlesztéséhez (l. 10. fejezet).

42
 9. A génszerkezet vizsgálómódszerei I.: DNS-szakaszok in
vivo és in vitro amplifikációja
A molekuláris biológia az örökletes információ tárolásának és kifejezésének mechanizmusait
vizsgáló tudomány, módszereinek célmolekulái tehát a nukleinsavak és a fehérjék. Fejlődésének
hosszú ideig gátja volt, hogy ezen makromolekulák elsődleges szerkezetének megállapítása a
molekulák mérete miatt rendkívül nehézkesnek (fehérjék, RNS-ek) vagy teljesen lehetetlennek
(DNS) bizonyult. Az 1970-es évek elején kirobbanó metodikai forradalom azután a DNS
vizsgálómódszereinek rohamos fejlődéséhez vezetett és ez paradox módon egy csapásra
megoldotta a kisebb információs molekulák szerkezetvizsgálatát is: a DNS-régió bázissorendjéből
ugyanis egyértelműen megállapítható az általa kódolt RNS, illetve fehérjemolekula elsődleges
szerkezete. A DNS-metodikák tökéletesítése lehetővé tette hasznos fehérjék (pl. inzulin)
nagyüzemi termelését, a molekuláris genetika mind több jelenségének megértését, öröklődő és
szerzett genetikai betegségek molekuláris szintű tanulmányozását, molekuláris diagnosztikai és
génterápiás eljárások kidolgozását, egy új tudományág, a molekuláris medicina megjelenését. Ez
az áttörés 1968-ban a restrikciós endonukleázok felfedezésével kezdődött.

Restrikciós endonukleázok
Restrikció és modifikáció
1953-ban Luria megfigyelte, hogy ha E. coli sejteket egy másik E. coli törzsben honos λ-
bakteriofágokkal fertőz, a fágpartikulumok döntő többsége nem jár sikerrel: a fertőzött sejtek
kivédik, korlátozzák (restrikció) a támadó fág szaporodását. Ha a kevés sikeres fág által
elpusztított baktériumokból (melyek a lemezen plakkot, tarfoltot alkotnak) izolált
fágpreparátummal ismételte meg a kísérletet, a fertőzés sikeres volt, nagyszámú tarfolt jelent
meg. Az első fertőzést túlélő fágok tehát a gazdasejtre specifikus módosuláson mentek keresztül,
ami az újabb fertőzés során már megvédte őket (modifikáció). Később bebizonyosodott, hogy a
restrikció feladata a gazdasejt védelme idegen DNS támadásától, a modifikáció pedig a sejt DNS-
ét védi saját restrikciós rendszerével szemben.
Restrikciós endonukleázok és modifikációs metilázok
Az első restrikciós enzimet a 60-as évek végén izolálták E. coliból, majd a következő években
tucatjával azonosítottak új enzimeket különböző baktériumokból. Ezek közös jellemzője, hogy
szekvencia-specifikus endonukleázok: 4–8 bázispár hosszúságú régiót ismernek fel, melyben
(vagy annak környezetében) mindkét láncot elhasítják. A restrikciós enzimfelismerő helyek
palindroma szerkezetek: a két lánc szekvenciája 5’ → 3’ irányban olvasva azonos. Példaként
szerepeljen itt a EcoRI és AluI enzimek felismerőhelye (a nyilak a hasított foszfodiészter-kötéseket
jelölik).

A példákból az is kitűnik, hogy kétféle hasítás lehetséges: az egyik esetben az enzim egymással
szemközti foszfodiészter-kötéseket hidrolizál (direkt hasítás, pl. AluI), ilyenkor tompa végek
jönnek létre; más enzimekkel a hasítás lépcsőzetes és egyláncú, ragadós vagy kohezív végek
képződnek (pl. EcoRI). Az utóbbi esetben létrejövő valamennyi DNS-darab mindkét végén
ugyanaz a kohezív vég van jelen (ez a palindroma szerkezet eredménye), a DNS-darabok tehát
egymáshoz korlátlanul kapcsolódhatnak bázispárosodással. A sejt saját DNS-ének restrikciós

43
helyeit úgy védi meg, hogy egy modifikációs metilázzal mindkét lánc egyik nukleotidját
metilálja. Az EcoRI metiláz esetében:

A metilcsoport megvéd a restrikciós enzim hasításától. A metilálatlan, idegen DNS darabolódik,

majd gyorsan degradálódik.

DNS-fragmentumok klónozása
A fentiekből következik, hogy két, különböző DNS-preparátumból ugyanazon restrikciós
enzimmel nyert ragadós végű DNS-darab bázispárosodással összekapcsolódhat. A kapcsolat DNS-
ligázzal kovalenssé tehető: foszfodiészter-kötésekkel stabilizált DNS-kimera, rekombináns DNS
hozható létre (9.1. ábra).

9.1. ábra: Rekombináns plazmid létrehozása

A klónozás alapja a rekombináns DNS-technológia. DNS-klónozás során egy DNS-fragmentumot
megfelelő gazdasejtben sokszorosítanak, amplifikálnak. Ez azonban csak úgy lehetséges, ha a DNS-
darab a gazdasejtben autonóm replikációra képes vektor DNS-hez kapcsolódik. Baktériumokban
vektorként leggyakrabban plazmidokat vagy λ-fág DNS-t használnak. A plazmidok (l. 1. fejezet és
9.1. ábra) kisméretű, cirkuláris DNS-molekulák, tartalmazzák az önálló replikációhoz szükséges
origot (l. később). A bennük levő antibiotikum rezisztencia gének (pl. ampR, ampicillin-
rezisztencia gén) szelekciós markerként használhatók: a rekombináns plazmiddal végzett
transzformáció után az antibiotikum jelenlétében csak azok a sejtek maradnak életben, melyek
felvették a plazmidot. (Az eljárás részleteit a gyakorlatos jegyzet tartalmazza.) Ezek a sejtek
elszaporíthatók, belőlük nagymennyiségű plazmid, abból pedig DNS-fragmentum nyerhető. A
rekombináns λ-fágokkal végzett fertőzés nagyon hatékony módja a génklónozásnak. A kozmidok
mesterséges vektorok, melyek egyesítik a plazmidok és fágok előnyeit. Emlős sejtekben vírusokat
(pl. adenovírusok, retrovírusok) használnak vektorként. Igen nagyméretű DNS-darabok
klónozására (megabázis klónozás) mesterséges kromoszómákat fejlesztenek ki, ezek közül az
élesztő mesterséges kromoszómát (YAC, yeast artificialchromosome) már használják a

44
gyakorlatban. Bíztató kísérletek folynak mesterséges emlős kromoszómavektorok kifejlesztésére
is. A fentiekben leírt ún. inszerciós vektorokban gyakorlatilag bármilyen DNS-fragmentum
tetszőleges mennyiségben szaporítható.

Genomtárak konstrukciója
A genomtár egy sejt teljes DNS-állományát tartalmazza megfelelő méretű DNS-fragmentumokra
darabolva, vektormolekulákba beépítve. Erre a célra az előző fejezetben tárgyalt inszerciós
vektorok bármelyike használható, a λ-fág különösen népszerű (9.2. ábra). A λ-DNS középső
harmada celluláris DNS-sel helyettesíthető: az EcoRI hasítással nyert λ-karokat EcoRI enzimmel
darabolt genomiális DNS-sel keverik össze, ligálást végeznek, majd a rekombináns DNS-
molekulákat fágfehérjékkel becsomagolják és fertőzéssel bejuttatják az E. coli sejtekbe. Ha a
genomtárból egy meghatározott szekvenciával rendelkező DNS-darabot akarnak „kihalászni”, a
bakteriológiai lemezen létrejött tarfoltok DNS-ét egy filterre viszik át, majd molekuláris
hibridizációval választják ki a kívánt klónt. (A hibridizációval meghatározott szekvenciájú DNS-
darabokat lehet azonosítani; a módszer részleteivel a következő fejezetekben foglalkozunk.) A
rekombináns fág elszaporítható és a kinyert DNS-inszerttel további vizsgálatok végezhetők.
Genomtárakból génrészletek, szabályozó szekvenciák (pl. fehérjekötő régiók) egyaránt
izolálhatók.

9.2. ábra: λ-fág genomtár létrehozása (A.) és

a kívánt klón kiválasztása molekuláris hibridizációval (B.)

45
 Polimeráz láncreakció
A kissé nehézkes, hosszadalmas in vivo DNS-amplifikáció helyettesítésére Mullis 1985-ben in vitro
DNS-szintetizáló módszert dolgozott ki, mellyel rövid DNS-szakaszok néhány óra alatt
láncreakciószerűen milliós példányszámban termelhetők. A módszer neve polimeráz
láncreakció, közkeletű rövidítéssel: PCR (polymerase chain reaction). A reakcióelegyben jelen
van az a DNS-preparátum, amely az amplifikálandó szakaszt tartalmazza. A szakasz két végéhez
denaturációt követően egy-egy rövid komplementer szintetikus oligonukleotidot kapcsolnak
bázispárosodással. Ezek a DNS-szintézis során primerként fognak működni: a DNS-polimeráz az
oligonukleotidok 3’-végéhez kapcsolja a szintézis során a templátlánc által meghatározott,
komplementer nukleotidokat. (A DNS-szintézis részleteivel később foglakozunk.) Mindkét
láncnak meg kell kettőződnie, az egyik primer tehát az egyik, a másik pedig a másik DNS-lánccal
bázispárosodik. A primerek 3’-vége egymás felé néz, ez biztosítja, hogy a közöttük levő régió
amplifikálódjon. Az elegy a 4 dezoxiribonukleozid-trifoszfátot (a szintézis szubsztrátjai) és DNS-
polimerázt is tartalmaz. A PCR-reakció három lépés ciklikus ismétlődéséből áll (9.3. ábra): 1.
denaturáció (95 °C); 2. primerkötődés (55 °C); 3. DNS-szintézis (72 °C). A ciklusok ismétlődését
komputervezérelt PCR-készülék (thermocycler) biztosítja. Az extrém körülményekhez
hőforrásokban élő baktériumokból izolálnak DNS-polimerázt (pl. Taq polimeráz). Sikeres
amplifikáció esetén a célszekvencia kópiaszáma az inkubáció során exponenciálisan nő: 20–30
ciklus (néhány órás inkubáció) milliós-milliárdos nagyságrendben sokszoroz.

9.3. ábra: A polimeráz láncreakció elve

46
A módszer különböző módozatai elárasztották az alap- és alkalmazott kutatást, beleértve a
diagnosztikát is. Az amplifikált DNS-termék mennyiségének pontos meghatározására kidolgozott
eljárás a valós-idejű (real-time) PCR. A módszer lényege, hogy a reakcióelegyekben az amplifikáció
előrehaladásával arányosan erősödő fluoreszcenciát idéznek elő és ezt a speciális thermocycler
folyamatosan méri. A valós-idejű PCR egyik változatát mutatja be a 9.4. ábra. A reakcióelegy a
szokásos alkotórészeken kívül tartalmaz egy, az amplifikálandó régió közepéhez
bázispárosodással kapcsolódni képes próbát is, ennek 5’-végéhez fluoreszcens festéket, 3’-
végéhez pedig egy olyan molekulát kapcsolnak, mely kioltja a közelében levő festék
fluoreszcenciáját. Működése során a Taq polimeráz (mely rendelkezik 5’ → 3’ exonukleáz
aktivitással is [l. 21. fejezet]) lehasítja a fluoreszcens festéket, majd a próbát is lebontja. A PCR-
ciklusok során így mind több festékmolekula szabadul fel, a fluoreszcencia növekedéséből a
műszer folyamatosan regisztrálni képes az amplifikált DNS mennyiségét.
A PCR-eljárás ma már a nagyobb klinikai laboratóriumokban rutin diagnosztikai módszernek
számít. A polimeráz láncreakció elvének, alkalmazási területeinek ismerete ezért a gyakorló
orvostól is elvárható.

9.4. ábra: A valós-idejű kvantitatív PCR reakció elve. 1. lépés: polimerizáció; 2. lépés: a fluoreszcens
festék lehasítása; 3. lépés: a próba lebontása, a polimerizáció befejezése (részleteket l. a szövegben)

47
 10. A génszerkezet vizsgálómódszerei II.: A DNS
szekvencia-analizisének lehetőségei
Molekuláris hibridizáció
A DNS direkt szekvencia-vizsgálatát a restrikciós endonukleázok felfedezése és a DNS-klónozás
módszerének kidolgozása tette lehetővé: ezek a technikák a nagyméretű DNS-molekulák rövid,
specifikus restrikciós enzim hasítási helyek által határolt fragmentumainak izolálását és
analizálható mennyiségben történő kinyerését eredményezték. Közvetett szekvencia-analizáló
módszert azonban már a restrikciós enzimek használata előtt kifejlesztettek: ez a molekuláris
hibridizáció (10.1. ábra).
Ha denaturált nukleinsavat valamilyen módon
(pl. radioaktív atommal vagy fluoreszcens
festékkel) jelölt nukleinsavpróba jelenlétében
renaturálnak, a jelölt próba bázispárosodni
képes a vizsgált mintában esetleg jelen levő
komplementer láncokkal, azaz hibrid képződik,
ami kimutatható. A nukleinsav-hibridizáció
segítségével tehát megvizsgálható, hogy két
nukleinsavlánc komplementer-e és ha igen,
milyen mértékben (erre a hibrid olvadás-
pontjából lehet következtetni).
A hibridképződés detektálására különböző
lehetőségek adódnak, a hibridizáció így számos
molekuláris biológiai technika alapját képezi. A
legegyszerűbb esetben (filter-hibridizáció) a
denaturált vizsgálandó nukleinsavat speciális
membrán felszínéhez kötik, a radioaktív próbát
ehhez adják hozzá. A renaturáció után a nem
kötődött próbamolekulákat lemossák, majd a
filter radioaktivitásának meghatározásával
megállapítják a hibridképződés mértékét (10.1.
ábra). In situ hibridizáció során fixált sejtekben
lúgos denaturációt végeznek, majd radioaktív
vagy fluoreszcens próbával hibridizálnak;
előbbit autoradiográfiával, utóbbit pedig
fluoreszcencia-mikroszkóppal teszik láthatóvá.
A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) mint
genetikai betegségek diagnosztikai eljárása,
már a klinikumban is létjogosultságot nyert

10.1. ábra: A nukleinsav hibridizáció elve

(filter-hibridizáció)

48
Ha denaturált nukleinsavat valamilyen módon (pl. radioaktív atommal vagy fluoreszcens
festékkel) jelölt nukleinsavpróba jelenlétében renaturálnak, a jelölt próba bázispárosodni képes a
vizsgált mintában esetleg jelen levő komplementer láncokkal, azaz hibrid képződik, ami
kimutatható. A nukleinsav-hibridizáció segítségével tehát megvizsgálható, hogy két
nukleinsavlánc komplementer-e és ha igen, milyen mértékben (erre a hibrid olvadáspontjából
lehet következtetni).
A hibridképződés detektálására különböző lehetőségek adódnak, a hibridizáció így számos
molekuláris biológiai technika alapját képezi. A legegyszerűbb esetben (filter-hibridizáció) a
denaturált vizsgálandó nukleinsavat speciális membrán felszínéhez kötik, a radioaktív próbát
ehhez adják hozzá. A renaturáció után a nem kötődött próbamolekulákat lemossák, majd a filter
radioaktivitásának meghatározásával megállapítják a hibridképződés mértékét (10.1. ábra). In
situ hibridizáció során fixált sejtekben lúgos denaturációt végeznek, majd radioaktív vagy
fluoreszcens próbával hibridizálnak; előbbit autoradiográfiával, utóbbit pedig fluoreszcencia-
mikroszkóppal teszik láthatóvá. A fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) mint genetikai
betegségek diagnosztikai eljárása, már a klinikumban is létjogosultságot nyert.

Restrikciós térképezés
Mivel a restrikciós enzimek által felismert nukleotidszakaszok már a „valódi” szekvencia-analizáló
módszerek kifejlesztése előtt ismertek voltak, korlátozott szekvencia-információt szolgáltathatott
a restrikciós térképezés is. Ennek célja, hogy a vizsgált DNS-fragmentumban meghatározzák
különböző restrikciós endonukleázok hasítási helyeit és azok egymástól való távolságát. A
módszer lényege (10.2. ábra): a tisztított DNS-molekula preparátumot in vitro körülmények
között különböző enzimekkel és azok kombinációjával hasítják, majd a képződött
fragmentumokat gélelektroforézissel szétválasztják, és etídiumbromid festéssel láthatóvá teszik.
A csíkok pozíciójából következtetnek a fragmentumok méretére, abból pedig a hasítási helyekre.
A módszer kisméretű DNS-ek (plazmidok, vírus-DNS-ek, klónozott DNS-fragmentumok)
vizsgálatára alkalmas.

10.2. ábra: Restrikciós térképezés: a fragmentumok elektroforetikus képe (A.) és

a cirkuláris DNS térképe (B.)

49
 Southern blot
Nagy genomok (pl. humán DNS) restrikciós térképezése az előző fejezetben leírt módon nem
végezhető el, mert egyetlen restrikciós enzimmel emésztve is több százezer különböző méretű
fragmentumot adnak, amelyek egymástól gélelektroforézissel szét sem választhatók. A probléma
megoldására dolgozott ki 1975-ben Southern egy olyan módszert, melyben a restrikciós
térképezés és a molekuláris hibridizáció módszerét kombinálta. A Southern blot technika célja,
hogy nagy molekulasúlyú DNS-ből azonosítson olyan restrikciós fragmentumokat, amelyek a
kísérlet szempontjából érdekes DNS-régiót hordoznak. A DNS-preparátumot restrikciós
enzimmel hasítják (10.3. ábra), majd a fragmentumokat agaróz gélelektroforézissel
szétválasztják, lúgos közegben denaturációt végeznek és a DNS-darabokat a gélből nitrocellulóz
vagy nylon membránra viszik át (innen származik az elnevezés: blotting, azaz átitatás). A
radioaktív próbával a hibridizációt a membránon végzik el: a keresett szekvenciát tartalmazó
DNS-fragmentumok az autoradiogrammon csíkok formájában fognak megjeleni. A Southern blot
kiterjedten alkalmazott módszer specifikus génszakaszok, a bennük keletkezett mutációk
kimutatására.

10.3. ábra: A Southern blot elve

Szekvencia-meghatározás
Néhány száz bázispár méretű DNS-darabok elsődleges szerkezetének meghatározására Maxam és
Gilbert, illetve Sanger 1975-ben dolgoztak ki módszereket.
A Maxam-Gilbert-féle kémiai módszer lényege, hogy a DNS-molekulákat bázisspecifikus
ágensekkel elhasítják, a létrejövő láncok méretét gélelektroforézissel megállapítják és ebből
következtetnek a nukleotid szekvenciára.
Az általánosan használt és automatizálásra is alkalmas szekvencia-analizáló módszer Sanger
láncterminációs eljárása (10.4. ábra). Alapja egy in vitro DNS-szintetizáló rendszer, amely
tartalmazza a DNS-fragmentum molekuláit, 5’-végen radioaktívan jelölt szintetikus primer
molekulákat, a 4 dezoxiribonukleozid-trifoszfátot és DNS-polimerázt. A primerkapcsolódás után
a reakcióelegyet 4 egyenlő részre osztják, majd didezoxiribonukleozid-trifoszfátokat adnak
hozzájuk, mindegyikhez másikat. (A didezoxinukleotidok pentózában nemcsak a 2’-, hanem a 3’-
pozícióból is hiányzik az oxigén [a dezoxiribóz képletét l. a 2.2. ábrán].) Inkubálás során a
reakcióelegyekben DNS szintetizálódik a templátként használt DNS-lánc irányításával: a DNS-
polimeráz a növekedő lánc 3’-végéhez nukleozid-monofoszfátokat kapcsol. Véletlenszerűen a

50
reakcióelegyekben kis koncentrációban jelen lévő didezoxinukleotid is beépülhet és mivel 3’-OH-
csoporttal nem rendelkezik, az a lánc szintézisének végét jelenti. Az egyes reakcióelegyekben
különböző hosszúságú láncok szintetizálódnak, az egy elegyben levő valamennyi termék 3’-végén
ugyanaz a didezoxinukleotid van. A négy mintát ureát tartalmazó denaturáló poliakrilamid gélben
egymás mellett elektroforetizálják, autoradiográfiát végeznek, majd az egyes csíkok pozíciója
alapján leolvassák a szekvenciát: az autoradiogramm aljáról indulva a szintetizált lánc
bázissorrendje 5’→ 3’ irányban olvasható le. Egy primer segítségével néhány száz bázis
szekvenciája állapítható meg, ennek alapján új primer szintetizálható és a DNS-szakasz
szekvencia-meghatározása folytatható.

10.4. ábra: Sanger láncterminációs szekvencia-meghatározó módszerének elve

A Sanger-módszer alapján több szekvencia-meghatározó automatát fejlesztettek ki, amelyek napi
hozama sokszorosa a fent leírt hagyományos módszerének. Az egyik bevált eljárás, hogy a primert
nem radioaktívan, hanem fluoreszcens festékkel jelölik, mind a 4 reakcióelegyben más színűvel
(10.5. ábra). Az eljárás egyébként teljesen megegyezik a manuális módszerrel, de DNS-szintézis
után a 4 mintát összekeverik, együtt futtatják a gélben. A gél alját lézersugárral világítják meg,
amely az egyes csíkokban eltérő színű fluoreszcenciát kelt, azt egy detektor regisztrálja és a hozzá
csatlakoztatott számítógép, ahogy a csíkok elérik a gél alját, folyamatosan kiírja a szekvenciát.

51
 10.5. ábra: A DNS-szekvenciázó automata működési elve
Az automatizált szekvencia-meghatározásnak számos újabb változata ismeretes. A
didezoxinukleotidok is jelölhetők 4 különböző fluorokrómmal, ilyenkor a DNS-szintézisre
egyetlen reakcióelegy használható, melyben mind a négy láncterminátor jelen van. Nagy haladást
jelentett a szekvencia-analízisben a kapilláris gélelektroforézis bevezetése: a jelenlegi legjobb
automatákban egyszerre 96 kapillárisban folyik szeparálás. A mintafelvitel, elektroforézis és
szekvencia-leolvasás is teljesen automatizált.

Szekvencia-meghatározás hibridizációval
A molekuláris hibridizáció elvén alapuló szekvencia-meghatározó mikrochipek (DNS-chipek
széles körben használt másik angol nevükön microarray-k) forradalmian új lehetőségeket
teremthetnek gyors és teljesen automatizált bázissorrend-analízisre. A módszer lényege, hogy az
ismeretlen szekvenciájú DNS-t (vagy RNS-t) fluoreszcens festékkel jelölik, majd hibridizáltatják egy
szilárd felszínen meghatározott sorrendben rögzített, ismert bázissorrendű oligonukleotid-
kollekcióval végzett hibridizációs reakcióban (10.6. ábra).
A chipek esetén a jelöletlen oligonukleotidot nevezzük próbának, a fluoreszcens DNS-molekulákat
pedig cél-DNS-nek. A jelölt nukleinsav azokkal az oligonukleotidokkal képez stabil hibridet,

52
melyek tökéletesen komplementerek valamely régiójával. Ha a mikrochip minden lehetséges
szekvencia-kombinációt tartalmaz, a fluoreszcens próba hibridizációs mintázatából szekvenciája
meghatározható. Ha oktamér oligonukleotidokat használnak, a 48= 65 536 kombináció elfér egy 3
× 3 cm-es lemezen (10.7. ábra), hosszabb próba-molekulákat tartalmazó chipeken azonban a
szekvencia-kombinációk száma többmillió is lehet. A fluoreszcens cél-DNS-sel a hibridizációt egy
speciális kamrában hajtják végre, majd a mikrochip hibridizációs mintázatát fluoreszcencia-
mikroszkópban analízálják. Az információ videokamera közvetítésével számítógépbe jut, mely a
fluoreszcens kép alapján rekonstruálja a szekvenciát.

10.6. ábra: Szekvencia-meghatározás oligonukleotid-chippel. A. A mikrochip képe; B. A chip egy

részlete felnagyítva. Minden mező ugyanazon oligonukleotid számos példányát tartalmazza (a rajz
csak 1 példányt ábrázol), a különböző mezők különböző oligonukleotidokat; C. Hibridizáció a
fluoroforral jelölt cél-DNS; D. A mikrochip képe a fluoreszcencia-mikroszkóban

10.7. ábra: A hibridizáción alapuló szekvencia-analizáló berendezés működési elve

Az oligonukleotid-chipek egyre szélesebb körben terjednek. Ha a technikai nehézségeket
lekűzdik, gyors, viszonylag olcsó szekvencia-meghatározó módszer áll rendelkezésre. A jelenleg
kereskedelmi forgalomban levő chipek orvosi szempontból fontos gének mutációinak
kimutatására, illetve a genomunkban nagy számban előforduló egyedi nukleotidvariációk (single

53
nucleotide polymorphism, SNP) azonosítására szolgálnak. A sejtjeinkben képződő mRNS-ekkel
komplementer DNS-szekvenciákat (cDNS-eket) hordozó chipek alkalmazásával a normális és
kóros sejtek génműködése vizsgálható (l. 13. fejezet). Az oligonukleotid- és DNS-chipek már ma is
népszerűek és a közeli jövőben fontos, rutinszerűen alkalmazott diagnosztikai eszközökké fognak
válni.

Humán genomprogram
A technikai fejlődés (PCR, szekvenciázó automaták kifejlesztése, informatikai forradalom)
nagyszabású program elindítását tette lehetővé 1990-ben: a teljes emberi genom szekvenciájának
meghatározását. A James Watson irányításával elkezdett humán genom program időtartamát 15
évre, költségeit mintegy 3 milliárd dollárra tervezték. A bioinformatika gyors fejlődésének és a
kapilláris szekvenátorok kifejlesztésének köszönhetően azonban a programot 5 évvel korábban
fejezték be, és az eredetileg becsült összegnek csak a tizedét költötték rá. A humán genom
szekvenciájának meghatározása egy nemzetközi konzorcium (melyben az USA, Anglia,
Franciaország, Japán, Németország és Kína laboratóriumai vettek részt) és egy magáncég, a Celera
Genomics közös erőfeszítéseinek eredménye. A program tudományos jelentőségét
hangsúlyozandó, befejezését 2000 nyarán a Fehér Házban jelentették be, majd az elkészült
szekvenciát 2001 februárjában a legnevesebb folyóiratokban publikálták: a konzorcium a Nature-
ben, a Celera pedig a Science-ben. (A teljes szekvencia valójában csak adatbázisokban elérhető,
kinyomtatva ugyanis mintegy fél millió oldal terjedelmű lenne.)
A genom szekvencia-analízise és a belőle nyerhető információk (struktúrális genomika) nagy
jelentőségű, néha meglepő eredményeket hoztak. Jelenleg valójában nem a teljes genom, hanem
az aktív régió (eukromatin) nagy részének bázissorrendje ismert; a heterokromatikus, jórészt
ismétlődő szekvenciákból álló régiók szekvencia-meghatározása technikailag nehezebb (és a
gének hiánya miatt kevésbé érdekes is). Génjeink száma lényegesen kisebb (20–25 000-re tehető)
mint korábban hitték (80–100 000), szerkezetük viszont sokkal bonyolultabb, komplexebb, mint
az alacsonyabbrendű élőlényeké. (A komplexitás a mRNS-ek és a fehérjék szintjén érvényesül. A
mechanizmusokkal később foglalkozunk [l. 26. és 31. fejezet].) Az egyéni eltérések nagyon kis
mértékűek: a 3.2 milliárd bázispárnyi genomban csak mintegy 1.4 millió SNP-t, nukleotidvariációt
azonosítottak. Közülük 60 000 helyezkedik el kódoló régióban. Ezek vizsgálata különösen jelentős
lesz az öröklődő betegségek patomechanizmusának tisztázása szempontjából.
A humán genom program jövőbeni gyakorlati hozadéka szinte felmérhetetlen: a legszerényebb
jóslások szerint is újabb forradalmat fog jelenteni az élettudományok, különösen pedig az
orvostudomány területén. Az oligonukleotid-chipekkel végrehajtott SNP-analízissel rutin
szűrővizsgálatok állnak majd rendelkezésre nemcsak az egyetlen génpár által örökített
(monogénikus) betegségek, hanem a sokgénes, multifaktorális kórképek (hipertonia, skizofrénia,
cukorbetegség stb.) diagnózisában is. Lehetővé válik majd az egyes betegségekre való hajlam,
prediszpozíció megállapítása is. A farmakogenomika tudománya lehetővé fogja tenni az egyes
gyógyszerekkel szembeni egyéni érzékenység genetikai hátterének vizsgálatát, a
személyreszabott gyógyszerrendelés megvalósítását.
Bár, a szerkezeti genomika eredményeinek hatásait már most is érezzük, általánosan elfogadott
nézet, hogy „a szekvencia csak a kezdet”. Az igazán lényeges kérdés az, hogy a gének, melyek
bázissorrendjét ismerjük, hogyan működnek, hogyan szabályozódnak, termékeik, RNS-ek és
fehérjék, hogyan hajtják végre mindazokat a folyamatokat, melyek eredménye az élő sejt. Ezekkel
a tudományos problémákkal a funkcionális genomika foglalkozik (l. 13. fejezet).

54
 11. A génexpresszió vizsgálómódszerei I.: Idegen gének
expressziója
A génexpresszió vizsgálatának lehetőségei
A génexpresszió (génkifejeződés, génműködés)
fogalma – tágabb értelemben – magában foglalja
mindazokat a folyamatokat, jelenségeket, amelyek egy
génben foglalt örökletes információnak fenotípusos
tulajdonság formájában történő megjelenését
eredményezik (11.1. ábra). Egy gén, illetve termékei
fiziológiás szerepének vizsgálatára elvileg kétféle
lehetőség adódik: (I) a gén (vagy termékei) bejuttatása
megfelelő gazdasejtbe vagy gazdaszervezetbe és az
előidézett fenotípusos változások tanulmányozása
(ezekkel a módszerekkel foglalkozik a jelen fejezet);
(II) a sejt vagy szervezet saját, endogén génjének vagy
a gén termékeinek megsemmisítése vagy
hatástalanítása és a gén normális funkciójának
megállapítása az észlelt működéskiesések alapján (ez
a következő fejezet témája).

11.1. ábra: A molekuláris biológia információ-

áramlásának centrális dogmája

cDNS-klónozás
Magasabb rendű eukariota szervezetek fehérjekódoló génjeire jellemző, hogy kiterjedt nem
kódoló szekvenciákat (intronokat) tartalmaznak, amelyek RNS-be ugyan átíródnak, de az RNS-
érés során kihasadnak, így az érett mRNS-ben már nincsenek jelen (l. 26. fejezet). Az intronok léte
különleges problémát jelent a génátviteli kísérletekben. Egyrészt a sokszor óriási méretű, a teljes
gént hordozó genomiális DNS-fragmentumok bejuttatása a gazdasejtbe nehézkes vagy lehetetlen.
Másrészt a kiszemelt célsejt (pl. baktérium) nem mindig rendelkezik azzal az apparátussal, ami az
intronok eltávolítását végzi, a bejuttatott gén tehát fehérje szintézisét nem fogja irányítani.
Az említett nehézségek leküzdésére dolgozták ki a cDNS-klónozás módszerét, amelynek lényege,
hogy a vizsgált gén által kódolt mRNS bázissorrendjében tárolt információt DNS-be (cDNS,
complementer DNS) írják át és ezt a DNS-darabot klónozzák. A klónozás menete a következő (11.2.
ábra): a tisztított mRNS-en, mint templáton, a reverz transzkriptáz enzim segítségével kettős láncú
cDNS-t szintetizálnak, majd ennek végeihez restrikciós endonukleáz „ragadós” végeket kötnek és
DNS-ligáz enzimmel megfelelő vektor molekulába építik. Inszerciós vektort is lehet használni,
azonban ha azt akarják, hogy a cDNS génként működjön a gazdasejtben, a klónozást expressziós
vektorban kell elvégezni: az ilyen vektor tartalmazza mindazokat a szignálokat, amelyek az inszert
átírásához (pl. promóter) és fehérjeszintézishez (pl. riboszóma-kötőhely) szükségesek. (A
promóter az RNS-polimeráz enzimet specifikusan megkötő DNS-régió, mely szükséges a génátírás
megindításához. A prokariota mRNS-ek 5’-végéhez közel található egy riboszóma-kötőhely, amely
viszont a fehérjeszintézis elkezdésében játszik szerepet [l. 29. fejezet].) A rekombináns vektort
ezután bejuttatják a gazdasejtbe.

55
 11.2. ábra: A cDNS klónozás menete (A.) és a klónozott gén expressziója E. coli sejtekben (B.)
E. coli sejtekben végzett cDNS-klónozás célja általában az, hogy a cDNS által kódolt fehérjét nagy
mennyiségben termeljék, tudományos vagy gyakorlati felhasználásra (pl. inzulin, interferon,
növekedési hormon gyártása gyógyászati célra). Mint egyszerű eukarioták, élesztősejtek is
alkalmazhatók gazdasejtként. Kiterjedten használt rendszer a rekombináns bakulovírus-vektorral
fertőzött rovarsejt tenyészet: nagy mennyiségben termeli a cDNS fehérjetermékét és az eukariota
sejtekre jellemző fehérjemódosításokat (pl. oligoszacharidok kötése) is végre tudja hajtani. Más
vírusvektorok (pl. SV40 vírus, adenovírus, stb.) gerinces sejtekben teszik lehetővé a cDNS-
klónozást.

Géntranszfer szövettenyészeti sejtekbe

A magasabb rendű eukariota sejtekbe történő génbevitelre számos módszert dolgoztak ki, ezen a
területen érthető módon ma is komoly erőfeszítések történnek: a géntranszfer eljárások képezik
ugyanis a humán génterápia alapját (l. 58. fejezet). A fizikai génbeviteli módszerek közül
megemlítendő a mikroinjekció (a DNS bevitele célsejtbe mikroszkóp alatt, finom kapillárissal) és
az elektroporáció (elektromos impulzus hatására a sejthártyán képződő pórusokon keresztül). A
génbevitel új, hatékony eszköze a génpuska: a DNS-molekulákat finom aranyszemcsék felszínéhez
adszorbeáltatják, majd nagy sebességű gázárammal „belelövik” a sejtekbe. A módszer in vitro
(szövettenyészeti sejteken) és in vivo (pl. a bőr sejtjein) is alkalmazható. A kémiai géntranszfer
során tisztított, valamilyen hordozóanyaghoz kötött (transzfekció) vagy mesterséges foszfolipid
hártyával (liposzóma) körülvett DNS jut be a kezelt sejtbe. A biológiai módszert vírusvektorok
alkalmazása jelenti. Ezekkel részletesebben a génterápia kapcsán foglalkozunk (l. 59. fejezet).

56
A rekombináns DNS-t felvett sejtekben a bevitt gén működése napokig vizsgálható, majd az ilyen
DNS lebomlik (átmeneti, tranziens expresszió). A sejtek kis részében az idegen DNS beépül,
integrálódik a celluláris genomba, azzal együtt kettőződve az utódsejtekbe is eljut (stabil
traszfektáns). Az ilyen sejtek sejtvonal formájában fenntarthatók, bennük az idegen gén működése
korlátlan ideig tanulmányozható.

Transzgénikus élőlények
A génműködés vizsgálata annál hitelesebb eredményeket ad, minél természetesebb,
fiziológiásabb körülmények között történik. Génbevitel szövettenyészeti sejtekbe értékes
megfigyeléseket eredményezhet, de nem helyettesítheti a soksejtű szervezetben in vivo végzett
kísérleteket. A géntranszfer in vivo változatát 1982-ben dolgozták ki: ekkor hozták létre az első
transzgénikus egereket, melyekben a növekedési hormon génjét expresszálva óriásnövést
idéztek elő. Transzgénikus élőlényekben az idegen gén jelen van minden testi sejtben és az
ivarsejtek közvetítésével az utódok is örökölhetik.
A transzgén bevitelének egyik módja a megtermékenyített petesejt mikroinjekciója. Ha a gén
integrálódik a genomba és a sejt túléli a manipulációt, az embrió fejlődni kezd és valamennyi testi
sejtjében jelen lesz az idegen gén. Az éretlen embriót anyaállatba viszik be, az újszülött egerek
DNS-ét pedig molekuláris biológiai módszerrel (PCR, Southern blot) tesztelik az idegen génre.
A másik lehetőség korai embrióból származó őssejtek manipulálása (11.3. ábra). A módszer előnye,
hogy a géntranszfer szövettenyészeti körülmények között végezhető el és kiválaszthatják a
legmegfelelőbb transzfektánsokat. A manipulált sejteket fiatal embriókba (blasztocisztákba)
fecskendezik be, ahol azok megtapadnak és részt vesznek az embrió fejlődésében. A blasztociszta-
kimérákat anyaállatban nevelik fel. Az újszülöttek kiméra-állatok lesznek, hiszen szöveteik
kialakulásához az eredeti blasztocisztasejtek és a manipulált embrionális őssejtek is
hozzájárultak. A kimérákat normális egyedekkel pároztatják: ha a transzgén jelen van a kiméra
csírasejtvonalában, az utódok között lesznek valódi transzgénikus állatok. Ha a manipulált
embrionális őssejtek és a fogadó blasztociszta eltérő színű állattörzsekből származtak, a kimérák
és a transzgénikus állatok bundájuk színe alapján is felismerhetők (11.3. ábra).

11.3. ábra: Transzgénikus egerek létrehozása embrionális őssejtek manipulálásával

57
Az expressziós vektor megválasztásával az is szabályozható, hogy a transzgén mely szövetekben
expresszálódjon. Az átírás elindításáért felelős promóter lehet általános expressziójú (pl. aktin-
promóter), de lehet szövetspecifikus is. Az inzulin promótere például a transzgén átírását – bár
minden testi sejtben jelen van – a Langerhans szigetek β-sejtjeire fogja korlátozni.
Transzgénikus élőlényeket nemcsak kutatási, hanem – egyre elterjedtebben – gyakorlati célra is
előállítanak. Idegen gének beépítésével nagyobb terméshozamú, ellenállóbb haszonnövényeket,
előnyös tulajdonságú háziállatokat is létrehoztak. Ezek a genetikailag manipulált organizmusok
(GMO) számos környezetvédelmi, etikai, gazdasági, jogi problémát is felvetnek, melyekkel a
természettudományon kívüli szervezeteknek (törvényhozás, kormány, politikai szervezetek) is
foglalkozniuk kell. Genetikailag manipulált emlősök új perspektívákat nyitnak meg a
gyógyszergyártásban is: léteznek már olyan transzgénikus sertések, kecskék, szarvasmarhák,
melyek tejükben nagy mennyiségben termelnek terápiás szerként felhasználható emberi
fehérjéket (pl. alvadási faktorokat).

58
 12. A génexpresszió vizsgálómódszerei II.: Az endogén
génműködés gátlása
Egy gén működését legkézenfekvőbb módon úgy vizsgálhatjuk, ha a gént mutációval inaktiváljuk
vagy expressziójának folyamatát megszakítjuk és tanulmányozzuk a fenotípusban jelentkező
következményeket. Mutáns baktériumok és egyszerű eukarioták (pl. élesztő) régóta kedvelt
kísérleti objektumai a molekuláris genetikusoknak. Magasabbrendű eukariota sejtek esetében
azonban a genom nagy mérete sokáig gátat jelentett a genetikai vizsgálatok számára. A célzott
gén- és génexpresszió-manipulációs technikákat a 80-as években fejlesztették ki és ez nagy
haladást jelentett az eukariota génműködés megértésében.

Célzott génroncsolás
Az eljárást, amely egy meghatározott gén inaktiválásához, „kiütéséhez” vezet (innen származik a
beavatkozás népszerű elnevezése: K.O. mutáció), 1989-ben Capecchi dolgozta ki. Alapjául egy
régóta ismert genetikai jelenség, a homológ rekombináció szolgál: ha két, egymáshoz hasonló
szekvenciájú DNS-régió egymással érintkezésbe kerül, közöttük a DNS-láncok kicserélődése,
rekombináció történhet.

12.1. ábra: A célzott génroncsolás elve. A K.O. vektorral kezelt sejtek sorsa háromféle lehet: 1. ha a
plazmid nem jut be a sejtbe vagy nem épül be a genomba, a sejt neomicinszármazékkal
elpusztítható; 2. a véletlenszerűen integrálódott plazmidot tartalmazó sejteket a ganciklovír öli
meg; 3. a kettős szelekciót csak azon a sejtek élik túl, melyekben homológ rekombinációval kerül a
neor-gén a célgénbe

A módszerhez ún. K.O. vektort használnak (12.1. ábra). Ez tartalmazza annak a génnek egy régióját,
amelyet manipulálni akarnak, benne egy rezisztenciagént (pl. a neor gént), amely kettős funkciót
lát el: egyrészt megszakítja a megcélzott gén kódoló régióját, inaktiválva azt, másrészt pedig
pozitív szelekciós markerként fog funkcionálni, hiszen neomicin-származék jelenlétében csak azok
a sejtek maradnak életben, amelyek a neor gént genomjukba építették. Ez azonban nemcsak
homológ rekombinációval történhet, hanem véletlenszerű beépüléssel, integrációval is (12.1.
ábra), ami a kísérlet céljának nem felel meg, hiszen a célgént épen hagyja. Ezért szükség van egy

59
másik szelekciós markerre is, melynek segítségével a véletlenszerű inszercióval szemben negatív
szelekció alkalmazható. Erre a herpeszvírus timidinkináz génjét (tkHSV) használják: azok a sejtek,
amelyek ezt a gént genomjukban hordozzák, egy antivirális szerrel, ganciklovirrel elpusztíthatók.
Mint a 12.1. ábrán látható, homológ rekombináció esetén a tkHSV gén a szabad vektorban marad és
így gyorsan eltűnik a sejtekből; plazmid-integráció után viszont a genom részévé válik. Ha tehát a
plazmidbevitel után a sejteket neomicin és ganciklovir jelenlétében tenyésztik, csak azok a sejtek
maradnak életben, melyekben megtörtént a megcélzott gén inaktiválása.
A génroncsolást embrionális őssejteken is el lehet végezni és a transzgénikus eljárás segítségével
(l. 11. fejezet) K.O. egereket lehet létrehozni. Ezek a megcélzott génre nézve heterozigóták (+/–),
pároztatásukkal homozigóta (–/–) állatok is nyerhetők, feltéve hogy túlélik a kérdéses gén
hiányát. A 2000-es évtized végéig az egér emberéhez hasonló méretű genomjából a gének mintegy
felét sikerült célzottan inaktiválni, többszáz K.O. egér szolgál közülük emberi betegségek
modelljéül. A célzott génkiirtás rendkívül fontos módszere a kutatásnak és a jövőben bizonyos
génterápiás eljárások alapját is képezheti majd (l. 60. fejezet).

Antisense technika. Ribozimek. RNS interferencia

12.2. ábra: mRNS molekula hasítása ribozimmel
A funkcionális RNS-sel vagy annak egy
szakaszával komplementer polinukleo-
tidokat antisense nukleinsavaknak
nevezzük; ha ezek bázispárosodással
kapcsolódnak célmolekulájukhoz,
gátolhatják annak működését. Egy
meghatározott mRNS-re specifikus
antisense oligonukleotid sejtbe
juttatásával gátolható az azt kódoló gén
expressziója: az oligonukleotid
akadályozhatja az mRNS érését,
transzportját, transzlációját, esetleg
annak gyors degradációjához vezethet.
Az antisense megközelítés speciális
lehetőségét adják bizonyos katalitikus
aktivitással rendelkező RNS-molekulák.
Egyes ribozimek képesek arra, hogy
helyspecifikusan hasítsanak más RNS-
molekulákat (12.2. ábra). A szubsztrát
megkötése komplementer bázispároso-
dással történik, így a ribozim RNS-kötő
helyének megtervezésével elvileg
bármilyen mRNS hasítható, a sejten
belül is. A ribozim előnye a közönséges
oligonukleotiddal szemben, hogy míg az
utóbbi sztöchiometrikusan hat, azaz 1
oligonukleotid 1 mRNS molekulát képes
hatástalanítani, addig a ribozim a
hasítás után új „áldozat” után nézhet, így
nagyszámú mRNS-molekulát képes
elpusztítani.

Antisense oligonukleotidok és ribozimek is génspecifikus módon gátolnak, így érthető módon

mindkét módszer már a klinikai kipróbálás stádiumában van bizonyos betegségek kezelésében (l.
60. fejezet).

60
A fentiekhez hasonló elven működő, de sokkal hatékonyabb, forradalmian új technológiát
dolgoztak ki az 1990-es évek végén. A módszer az RNS-interferencia jelenségén alapul (12.3.
ábra). Valószínűleg minden eukariota sejt magjában képződnek hajtűszerű kettősláncú RNS-
molekulák. Ezek kijutnak a citoplazmába és specifikus endonukleáz enzim hatására 21-23
bázispár hosszúságú kettősláncú RNS-darabokra hasadnak (siRNS, l. 2. fejezet). Ezek fehérjékkel
kapcsolódva ún. géncsillapító komplexet hoznak létre: az siRNS egyik lánca komplementer mRNS-
szakaszhoz kapcsolódik és a komplex nukleázai az mRNS-t lebontják. Az RNS-interferencia, más
néven géncsillapítás (gene silencing) jelensége arra is használható, hogy a sejtekbe kívülről bevitt,
a megcélzott mRNS-sel homológ siRNS segítségével meghatározott gén működését gátolják (l. 59.
fejezet). A módszer jelentőségét sokan a polimeráz láncreakcióéhoz hasonlítják.

12.3. ábra: Az RNS-interferencia elve; specifikus mRNS degradációja a sejtmagban természetes

módon képződő (A.) és a sejtbe kívülről bejutott siRNS felhasználásával (B.)

A fehérjefunkció gátlása
A génexpresszió folyamata nemcsak a DNS és az RNS, hanem a fehérjék szintjén is
megszakítható. A kiszemelt fehérjére specifikus antitestmikroinjekciója a sejtbe hatásos, de
nehézkes eljárás. Az 1990-es évek elején fejlesztették ki az intracelluláris antitestek technikáját.
Ennek lényege, hogy molekuláris biológiai módszerekkel olyan cDNS-t hoznak létre, amely
egyetlen polipeptidlánc formájában expresszálja azokat az antitestdoméneket, amelyek egy
meghatározott fehérjéhez specifikusan, nagy affinitással kapcsolódni képesek. A cDNS a sejtben
expresszálható és az antitest eljuttatható abba az organellumba, ahol a célfehérje működik. Kóros
működésű fehérjék gátlásával az intracelluláris antitestek a jövőben orvosi jelentőségre is szert
tehetnek.
A fehérjeműködés gátlásának egyre elterjedtebb módszere a domináns gátló proteinek
expressziója a sejtben. Ezek a mutáns fehérjék nemcsak inaktívak, hanem a megfelelő endogén
proteinnel vetélkedve megakadályozzák annak kötődését valamilyen biológiailag fontos
molekulához (szubsztrát, szabályozó fehérje, nukleinsav stb.), így jelenlétükben a normális
fehérje sem működik. Lényegében hasonló mechanizmussal gátolnak a peptidomimetikumok: ezek
oligopeptid molekulák, melyek aminosavsorrendje megegyezik a célfehérje biológiailag fontos
régiójával, ezért a fehérjeműködést kompetitív módon, nagymértékben specifikusan gátolni
képesek.

61
 13. A génexpresszió vizsgálómódszerei III.: Specifikus
géntermékek azonosítása
A gének expressziója során irányításukkal mRNS-ek, majd fehérjék képződnek (11.1. ábra); a
génműködés mértéke az RNS- és fehérjetermék mennyiségének megmérésével is
meghatározható. Egy magasabbrendű eukariota sejtben azonban több ezer, több tízezer gén is
aktív lehet egyidőben; egyes gének expressziójának vizsgálatához tehát olyan módszerekre van
szükség, amelyek specifikus mRNS-ek, illetve specifikus fehérjék azonosítására alkalmasak.

cDNS-tár készítése
Bizonyos kísérleteknél szükség lehet arra, hogy egy adott sejtben, szövetben kifejeződő összes
mRNS-szekvenciát számba vegyék. Az RNS-ek molekuláris biológiai manipulációja azonban
nehézkes: egyrészt ebben a formában nem klónozhatók, másrészt sokkal érzékenyebbek
degradációs hatásokra mint a DNS. Ezért ilyenkor a bennük levő információt kettős láncú cDNS-
be írják át, majd a cDNS-populáció klónozásával cDNS-tárat hoznak létre. A cDNS-tár tehát,
szemben a genomtárral (l. 9. fejezet), csak kódoló génszakaszokat tartalmaz és mivel különböző
sejtekben különböző génpopuláció aktív, ugyanazon szervezet különböző szöveteiből előállított
cDNS-tárak egymástól eltérnek, szövetspecifikusak.
A cDNS-tár konstrukciójánál a cDNS-klónozásnál leírt módszert követik (l. 11.2. ábra), azzal a
különbséggel, hogy a szövetből oligo(dT)-cellulóz affinitás kromatográfiával izolált össz-mRNS
preparátumból indulnak ki (eukariota sejtek legtöbb mRNS-ének 3’-végén poli(A)-szekvencia van,
így könnyen elkülöníthető a tRNS-ektől és rRNS-ektől). A poli(A)+ mRNS-eket reverz
transzkriptázzal cDNS-be írják át. A reverz transzkriptáz különleges DNS-polimeráz: RNS
templáton dezoxiribonukleozid-trifoszfátok felhasználásával komplementer DNS-láncot
szintetizál. Primerként a poli(A)-hoz kötődő oligo(dT)-t használnak. A kettős láncú cDNS-ek
mindkét végéhez ragadós végeket eredményező restrikciós endonukleáz felismerő helyeket
kapcsolnak, plazmid, λ-fág vagy vírusvektorba építik be őket, majd a genomtáraknál már
ismertetett módon gazdasejtbe juttatják a rekombináns vektorokat. A kívánt klón megkeresése
történhet hibridizációs módszerrel (l. 9. fejezet), de expressziós cDNS-tár esetén (azaz, ha a
klónozás expressziós vektorban történt) a keresett klón azonosítása a cDNS-inzert
fehérjeterméke alapján immunológiai módszerrel is történhet. (Ilyenkor a bakteriológiai lemezről
készített filterlenyomat vizsgálata a Western blotnál leírt módon folyik; l. később.)

Northern blot
Ezt a technikailag a Southern blothoz hasonló kivitelezésű módszert egy specifikus RNS-nek
komplex RNS-keverékben történő kimutatására használják. Az RNS-mintát formaldehid-tartalmú
agarózgélben elektroforetizálják (13.1. ábra): a formaldehid mint denaturáló ágens felbontja az
RNS-ek másodlagos szerkezetű régióit és a kinyújtott RNS-molekulák méretüknek megfelelően
vándorolnak. Az RNS-eket a gélből filterre viszik át, a kívánt RNS-re specifikus radioaktív próbával
hibridizálják, majd autoradiográfiát végeznek. Ha a keresett RNS jelen volt a mintában, a
méretének megfelelő helyen fekete csíkot ad az autoradiogrammon. A csík erősségéből az
expresszió mértékére következtethetünk.

62
 13.1 ábra: A Northern blot módszer elve

Immunológiai módszerek
Specifikus fehérjék kimutatására immunológiai módszerek alkalmasak: a fehérje elleni antitest
az antigénnel immunkomplexet alkot, ami kimutatható.
Immuncitokémia
A fénymikroszkópos immuncitokémia legelterjedtebben alkalmazott változata az
immunfluoreszcencia mikroszkópia. A metszetet vagy a detergens kezeléssel permeabilizált
sejtet a vizsgálandó fehérje elleni antitesttel kezelik, amelyet fluoreszcens festékkel jelöltek meg. Ha
a készítményt ezután fluoreszcencia-mikroszkópban vizsgálják, csak a specifikus fehérjét
tartalmazó, antitestet kötő régiók fognak fluoreszkálni. Különböző színű festékek alkalmazásával
ugyanazon metszetben, sejtben különböző fehérjék expressziója, lokalizációja vizsgálható. A leírt
módszer a direkt immunfluoreszcencia. Az indirekt eljárás során a vizsgált anyagot először
jelöletlen, a célfehérjére specifikus első antitesttel kezelik, majd fluorokrómmal jelölt, az első
antitest elleni második ellenanyaggal. A két antitest alkalmazásával növelhető az
immuncitokémiai kimutatás fajlagossága és érzékenysége is.
Modern konfokális mikroszkópok segítségével a fluoreszcens antitesttel festett sejtről
„rétegfelvételek” készíthetők és számítógép segítségével megalkotható a fehérjelokalizáció
háromdimenziós képe. A módszer különösen népszerű a citoszkeleton-kutatásban: aktin, tubulin
vagy intermedier filamentum fehérjék elleni antitestekkel láthatóvá tehetők a sejtváz különböző
elemei (l. 39. és 40. fejezet).
Az antigén–antitest reakció az elektronmikroszkópiában is felhasználható. Finom nehézfém
szemcsékhez (pl. aranyhoz, immunogold technika) kötött antitest segítségével a vizsgált fehérje
sejten belüli lokalizációja pontosan megállapítható.
Immunprecipitáció
A módszert általában akkor alkalmazzák, ha fehérjekeverékből egy specifikus proteint akarnak
elkülöníteni, azonosítani (13.2. ábra). Az antitestet hozzáadják az elegyhez, majd a létrejövő
immunkomplexeket speciális agarózgyöngyök felszínén kötik meg. A gyöngyök centrifugálással
könnyen elkülöníthetők a többi fehérjétől, a hozzájuk kötődő fehérjéket SDS-poliakrilamid
gélelektroforézissel frakcionálják. Ha a fehérjekeverék radioaktívan jelölt volt, a célfehérjét
autoradiográfiával mutatják ki. A fehérjék radioaktív jelölésének módjától függően az
immunprecipitáció alkalmas specifikus fehérjék szintézisének, kémiai módosulásának (pl.
foszforiláció, glikoziláció) tanulmányozására.

63
 13.2. ábra: Az immunprecipitáció menete (az autoradiogrammon az 1. minta a teljes
fehérjekeverék a 2. pedig az immunprecipitátum képét mutatja)

Immunoblot (Western blot) módszer

Az eljárás specifikus fehérje detektálására és mennyiségének meghatározására alkalmas
jelöletlen fehérjekeverékben (13.3. ábra). Az elegyet egy- vagy kétdimenziós poliakrilamid
gélelektroforézissel frakcionálják, majd a fehérjéket a már ismert blotting technikával nitrocellulóz
filterre viszik át. A membránt ezután a keresett fehérje elleni antitesttel kezelik, majd az
immunkomplexeket egy második, az első antitesttel szemben termelt ellenanyaggal reagáltatják.
A második antitest speciális enzimmel konjugált vagy radioaktív. Előbbi esetben színreakcióval,
az utóbbiban autoradiográfiával detektálhatók. A reakció intenzitása alapján a mennyiség
meghatározható.

13.3. ábra: Az immunoblot (Western blot) módszer elve

Funkcionális genomika
A Humán Genom Program eredményei (l. 10. fejezet) genomunk működésének vizsgálatát is
felgyorsították. A funkcionális genomika a sejtekben képződő RNS-ek és fehérjék globális
vizsgálatára, egyidejű kimutatására és minőségi és mennyiségi analízisére ad lehetőséget. Ez az új
tudományág új, mind jobban terjedő szakkifejezéseket is szült: a transzkriptom vagy RNom (egy
sejtben képződő illetve jelen levő RNS-ek összessége), a proteom (a sejtben expresszálódó
fehérjék összessége), az interaktom (a sejt fehérjéi között kialakuló kölcsönhatások térképe), a
foszfoproteom (a sejt fehérjefoszforilációs mintázatának egésze) fogalma egyre gyakrabban
szerepel a szakirodalomban.

64
A génexpresszió vizsgálata cDNS-chipekkel
A Northern blot módszerrel egy kísérletben egy (esetleg néhány) specifikus mRNS expresszióját
vizsgálhatják. A cDNS-tárak ugyan tartalmazzák az adott sejtben kifejeződő valamennyi gén
információját, de az összes cDNS azonosításához számos kísérletre van szükség. A 10. fejezetben
ismertetett DNS-mikrochip technológia alkalmazható a génműködés vizsgálatára is: egyetlen
DNS-chip segítségével néhány órás munkával meghatározható az adott sejtre adott körülmények
között jellemző génexpressziós profil.
A vizsgált sejtekből össz-mRNS-t izolálnak, majd reverz transzkripcióval fluorokrómmal jelölt
cDNS-kollekciót készítenek. A fluoreszcens cDNS-ekkel azután olyan DNS-chipen végeznek
hibridizációt, melyhez nagyszámú, az illető fajra jellemző génfragmentumot vagy génspecifikus
oligonukleotidot kapcsoltak hozzá, ismert elrendezésben (l. 10.6. és 10.7. ábra). A mikrochipet
ezután komputervezérelt fluoreszcencia-mikroszkóppal vizsgálják át és a fluoreszcencia-
mintázat alapján a számítógép megállapítja az egyes gének expressziós szintjét. Számos
biotechnológiai cég dolgozik gyakorlati célra (pl. gyógyszerek hatásának vizsgálatára, betegségek
diagnosztizálására) használható DNS-chipek kifejlesztésén, ezek közül egyre több jelenik meg az
egészségipar piacán is. A génexpressziós mintázatok diagnosztikai célú alkalmazására az 58.
fejezet mutat be egy példát.
Proteomika
A fenotípusos tualjdonságok kialakításáért – így a sejtben lejátszódó patológiás biológiai
folyamatokért is – közvetlenül a fehérjék felelősek. Ezért a fehérjék széleskörű vizsgálata, a
proteomkutatás (proteomika) orvosi szempontból a nukleinsavak analízisénél is fontosabb. A
proteom tanulmányozása ugyanakkor technikailag sokkal nehezebb, mint a nukleinsavaké: a
fehérjék amplifikálására szolgáló PCR-jellegű módszer nem létezik; egyes fehérjék igen alacsony
szinten expresszálódnak sejtjeinkben; működésüket nemcsak mennyiségük, hanem
térszerkezetük, kovalens módosulásaik (foszforiláció, glikoziláció, acetiláció stb.) is befolyásolják.
Mindezek a tényezők rendkívüli módon megnehezítik a proteomkutatásokat. A sejtek
fehérjeprofiljának vizsgálata azonban orvosi szempontból felbecsülhetetlen értékű információkat
szolgáltathat: betegség-specifikus fehérjemarkerek (pl. tumorfehérjék) kimutatása, gyógyszerek
támadáspontjának azonosítása, molekuláris diagnosztikai eljárások kidolgozása.
Új, ismeretlen fehérjék azonosítására már ma is rendelkezésre áll a technológia. A sejtkivonat
fehérjéit kétdimenziós gélelektroforézissel frakcionálják, a kívánt fehérjefoltot kinyerik a gélből,
kisebb peptidekre hasítják, majd a peptideket tömegspektrometriával azonosítják. (A módszer
tárgyalása a biofizika tárgykörébe tartozik.)
A fehérjék specifikus kötődési tulajdonságait a DNS-chipekhez hasonló protein-chipekkel
vizsgálják. A chip-lemezen többszáz specifikus fehérjét rögzítenek, majd a vizsgálandó, jelölt
fehérjekeverékkel végzett kezelés után a lemez egyes régióin meghatározzák a fehérjekötődést.
Fehérjekeverékek kötődési tulajdonságainak analízisére antitest-, peptid- és szénhidrát-chipek is
rendelkezésre állnak már. A technológia a következő években forradalmasítani fogja a
sejtbiológiai kutatásokat, a betegségek patomechanizmusának elemzését és a diagnosztikát.

65
 14. A sejtmag felépítése
A sejtmag elektronmikroszkópos szerkezete
A sejtmag (nukleusz, karion) az eukariota sejt életét irányító organellum: itt történik a genetikai
információ tárolása és megkettőződése, átírása RNS-molekulákba, az RNS-ek érése és transzportja
a citoplazmába. Transzmissziós elektronmikroszkópos felvételen (14.1. ábra) jól elkülönült
képletek figyelhetők meg a sejtmagban: a maghártya, a kromatinállomány és a nukleolusz;
speciális technikával láthatóvá tehető a magmátrix. Ebben a fejezetben a felsorolt alkotórészek
jellemzőit tárgyaljuk (kivéve a nukleoluszt, melyről az rRNS-szintézissel kapcsolatban lesz szó).

14.1. ábra: A sejtmag elektronmikroszkópos felépítése

A maghártya
A maghártya felépítése
A sejtmagot két membránból álló maghártya választja el a citoplazmától. A külső membrán
közvetlenül kapcsolatban áll a durva felszínű endoplazmatikus retikulummal, citoszól felőli
felszínéhez riboszómák is kötődnek. A belső membrán egy vékony fehérjerétegen, a nukleáris
laminán keresztül a kromatin széli rétegéhez kapcsolódik. A lamin fehérjék egyik típusa (lamin B)
a hozzá kötődő lipidlánc és a belső membránban elhelyezkedő fehérjék (pl. a lamin B receptor)
segítségével a belső maghártyába van kihorgonyozva, míg a lamin A és C molekulák a kromatinnal
létesítenek kapcsolatot. Ezek a fibrilláris fehérjék a citoszkeleton intermedier filamentumaival
mutatnak rokonságot (l. 40. fejezet): fonálszerűen felcsavarodva rosthálózatot hoznak létre, mely
hozzájárul a sejtmag alakjának meghatározásához. Az 1990-es években több ritka öröklődő
betegség hátterében találtak olyan mutációt, mely lamin-gént vagy a belső membrán egyes
fehérjéinek génjét érinti. A laminopathiák közé tartoznak a myopathiák (izomsorvadással, gyakran
szívritmuszavarokkal járó kórképek), lipodystrophiák (zsírsejtdegenerációval, diabetesszel
jellemezhető betegségek), neuropathiák (idegrendszeri elváltozások) bizonyos típusai. A lamin A
génjében bekövetkező mutációk okozzák a korai öregedéssel járó Hutchinson-Gilford progeriát.
A kórképek pathomechanizmusa még nem tisztázott; a génszabályozás zavara, a laminháló
szerkezetének megbomlása lehet a tünetek okozója.

66
A külső és belső hártya közötti üreg a perinukleáris tér. A membránokon keresztül folyó transzport
korlátozott: kisméretű hidrofób anyagok juthatnak itt be a sejtmagba. A nukleocitoplazmatikus
transzport döntő része a maghártya felszínén elhelyezkedő több ezer magpóruson keresztül
történik.
Magpóruskomplexum
A pórusok mintegy 100 különböző nukleoporin fehérjéből álló, bonyolult szerkezetű képletek
(14.2.ábra). Alapstruktúrájukat 8 nagyméretű fehérjekomplex alkotja, melyek a citoszól és a
sejtmag felé néző oldalon is gyűrűszerű képződményt hoznak létre (citoplazmatikus és nukleáris
gyűrű), a maghártya középső síkjában pedig „küllőket” képeznek. A pórus közepén gyakran
figyelhető meg egy központi komplex („dugó”), melynek szerepe vitatott; valószínűleg
csatornaként működik, melyen nyugalmi állapotban csak ionok és kis molekulák juthatnak át,
kitágulva azonban nagyobb partikulumok transzportját is lehetővé teszi. A gyűrűkhöz
citoplazmatikus filamentumok, illetve nukleáris kosár formájában fehérjefonalak kapcsolódnak.

14.2. ábra: A magpórus komplexum szerkezete (A. felülnézeti kép; B. keresztmetszet)

Nukleocitoplazmatikus transzport
A pórusok ionok, kisméretű molekulák, kisebb fehérjék számára szabadon átjárhatók, ezek
transzportja mindkét irányban passzív diffúzióval történhet. Nagyobb fehérjék, RNS-ek, RNP-
komplexek szállítása a maghártyapórusokon keresztül szelektív, energiát igénylő folyamat: a
specificitást szállítófehérjék és nukleoporinok egymásrahatása biztosítja, az energiát pedig GTP és
ATP szolgáltatja.
A nukleocitoplazmatikus transzportra azért van szükség, mert az RNS-ek a sejtmagban, a
fehérjék viszont csak a citoplazmában szintetizálódnak. A szállítófehérjék családját
karioferineknek nevezzük. Ezek a citoplazma és a sejtmag között ingáznak, feladatuk fehérjék
sejtmagba történő transzportja (importinok), illetve egyes proteinek visszaszállítása a
citoplazmába (exportinok). A transzportban fontos szerepe van a Ran-fehérjének is, amely az ún.
Ras-fehérje szupercsalád (l. 46. fejezet) sokrétű funkciót ellátó nukleáris képviselője. A család
tagjai egyetlen polipeptidláncból álló guaninnukleotid-kötő fehérjék (monomer G-proteinek):
GDP-kötő és GTP-kötő formában léteznek a sejten belül. A Ran ugyancsak ingázó fehérje: Ran•GTP
formája a sejtmagban, Ran•GDP formája pedig a citoplazmában dominál. Az aktív Ran•GTP
komplex fő feladata, hogy a karioferin és a szállított fehérje közötti kapcsolatot szabályozza.
Valószínűleg szerepet játszik a mitózis egyes folyamataiban (az osztódási orsó kialakulásában, a
maghártya felépülésében) is.
A nukleocitoplazmatikus transzport a sejtbiológiai kutatások egyik divatos témája, így
mechanizmusa elég jól ismert. A 14.3. ábra leegyszerűsítve mutatja be a magfehérjék importjának

67
(14.3.A. ábra) és exportjának lépéseit. A legtöbb magfehérje tartalmaz egy olyan, bázikus
aminosavakban gazdag régiót (nukleáris lokalizációs szignál, NLS), amely jelként szolgál a
sejtmagba történő szállítására. Ezt a régiót importin molekula ismeri fel, hozzákötődik (1. lépés a
14.3. ábrán), a komplex dokkol a pórus-komplexum citoplazmatikus filamentumain (2. lépés),
majd újabb és újabb nukleoporinokkal létesítve kapcsolatot, fokozatosan átjut a póruson és
transzlokálódik a sejtmagba (3. lépés). Itt Ran•GTP hatására az importin/NLS-fehérje komplex
disszociál (4. lépés) és az importált magfehérje megkezdheti sejtmagon belüli tevékenységét.
Egyes magfehérjék (riboszomális fehérjék, bizonyos inaktívvá vált transzkripciós faktorok stb.)
szelektíven exportálódnak is a sejtmagból (14.3.B. ábra), feltéve, hogy nukleáris export szignált
(NES) tartalmaznak (NES-fehérjék). Ran•GTP hatására ezek a fehérjék exportin molekulával
képeznek komplexet (5. lépés), amely a pórus-komplexumhoz kötődik (6. lépés), majd
transzlokálódik a citoplazmába (7. lépés). Itt a Ran•GTP a fehérje saját GTPáz aktivitásával a GTP-
ről egy foszfátcsoportot lehasítva Ran•GDP-vé alakul át, a fehérjekomplex pedig alkotóira esik szét
(8. lépés).
Az RNS-ek exportjának mechanizmusa sokkal kevésbé ismert, de valószínű, hogy ugyancsak
karioferinek közvetítésével zajlik, a fehérje-exportnál már ismertetett módon. A riboszóma
alegységek nukleocitoplazmatikus transzportjában bizonyos riboszómafehérjék, az mRNS-
ekében pedig hnRNP-fehérjék látják el a szállítófunkciót. Az érett mRNP-partikulum exportjának
valószínű mechanizmusát mutatja be a 14.4. ábra. A szintézist, majd RNS-érést (l. 25. és 26.
fejezet) követően az mRNS-molekula fehérjéhez kötött, kompakt partikulum formájában
felszabadul a kromatinból és a nukleoplazmán keresztül éri el a póruskomplexumot (14.4. ábra,
1. lépés). Miközben áthalad a kosárszerű filamentumhálón, kezd fellazulni és kitágítva a központi
dugó csatornáját, megkezdi a transzlokációt a póruson keresztül (2. lépés). Az elöl haladó 5’-vég
teljesen szétcsavarodik és miközben folytatódik az mRNP átjutása a póruson, a hozzá kapcsolódó
riboszómákon megindul a fehérjeszintézis (3. lépés).

14.3. ábra: A magfehérjék importjának (A.) és exportjának (B.) mechanizmusa

68
 14.4. ábra: mRNP-export a magpóruson keresztül
A fehérjék és RNS-ek nukleocitoplazmatikus transzportja a sejt igényeinek megfelelően
szabályozható, a génműködés így ezen folyamatok útján is regulálható. Egyre több bizonyíték van
arra, hogy a magpórusok működésének orvosi jelentősége is lehet. Az AIDS-kórokozó humán
immundeficiencia vírus (HIV) egyik fehérjéje például szállítószerepet lát el a vírus-RNS
transzportjában. A fehérje szelektív gátlása megszakíthatná a vírus életciklusát a fertőzött
sejtekben.

A kromatinállomány
Nem osztódó, interfázikus sejtben a sejt DNS-e kromatin formában van jelen. Ebből alakulnak ki
a kromoszómák a sejtosztódás kezdetén. A kromatin dezoxiribonukleoprotein (DNP):
hozzávetőlegesen egyenlő arányban tartalmaz DNS-t, hiszton és nem hiszton fehérjéket (l. 16.
fejezet). Funkcionális morfológiai szempontból a kromatinállományt két típusra lehet
elkülöníteni. A heterokromatin erősen kondenzált, génekben viszonylag szegény, elektronszóró
képlet a sejtmagban, amely a maghártya közelében (marginális kromatin), a sejtmagvacska körül
(nukleoluszhoz asszociált kromatin) és a nukleoplazmában elszórtan helyezkedik el. Ez a
kromatinfajta funkcionálisan inaktív: RNS-szintézisre vagy teljesen képtelen (konstitutív
heterokromatin) vagy csak bizonyos körülmények között, bizonyos szövetekben folyik benne
transzkripció (fakultatív heterokromatin). Az eukromatin laza szerkezetű, kevéssé elektronszóró,
a sejtmagban elszórtan elhelyezkedő kromatinfajta, amely tartalmaz aktívan átírt géneket. A
kromoszómák interfázikus elhelyezkedése a sejtmagon belül nem véletlenszerű. Teljes
kromoszómákra specifikus próbával végzett in situ hibridizációs kísérletek tanúsága szerint az
egyes kromoszómák az interfázisban is jól körülhatárolható magterületeket, kromoszóma-
territóriumokat foglalnak el, amelyeket interkromoszomális régiók választanak el egymástól. A
kromoszóma-territóriumok belseje általában heterokromatin, széli részeik azonban
transzkripcionálisan aktívak, az itt képződő transzkriptumok RNS komplexei az
interkromoszomális térbe jutnak, ott érési folyamatokon esnek át, és a magpórusok felé
transzportálódnak.
A kromatin kis mennyiségben ribonukleoproteint (RNP-t) is tartalmaz. Az
elektronmikroszkóposan a heterokromatin széli területein megjelenő perikromatikus granulumok
és fibrillumok, illetve a kromatinmentes területekre lokalizálódó, gyöngyfüzérszerű
interkromatikus granulumok RNP-tartalmú képletek. Pontos jelentőségük nem ismert, de
valószínűleg az mRNS-szintézis, -érés és -transzport morfológiai megjelenési formáinak
tekinthetők.

69
 Magmátrix
Ha izolált sejtmagokat nem ionos detergenssel, DNáz enzimmel és sóoldattal kezelnek, a magból
a kromatin és a nukleoplazma nagy része eltávolítható. A megmaradó, fehérjefonalakból álló
hálózatot nevezik magmátrixnak. Fiziológiás jelentősége ma még bizonytalan: lehet, hogy a
citoszkeletonhoz hasonló strukturális vázat biztosít a magban lezajló biokémiai folyamatokhoz
(DNS-replikáció, RNS-szintézis, érés, -transzport); nem zárható ki azonban, hogy a magmátrix
preparálási műtermék.

70
 15. Az eukariota genom organizációja
Az emlős sejtek genomjának mérete mintegy ezerszeresen múlja felül a baktériumokét (több
milliárd bázispár a néhány millióval szemben), ugyanakkor a genomban jelenlevő gének
számában csak ötszörös a különbség (a humán gének száma: kb. 20–25 000, az E. coli gének
száma: kb. 4300). Már ezek a számszerű adatok is arra utalnak, hogy a pro- és eukariota genom
organizációja jelentősen eltér egymástól. A DNS-vizsgáló módszerek fejlődése a részletekre is
fényt derített.

A genomorganizáció vizsgálata DNS-renaturációs kísérletekkel

A genom szerkezetének feltárása már jóval a DNS-szekvenciázó módszerek kifejlesztése előtt, az
1960-as években megkezdődött. Britten és Kohne különböző fajok DNS-ének renaturációs
tulajdonságait vizsgálta. A DNS-mintákat vizes oldatban ultrahanggal kisebb darabokra tördelték,
hődenaturálták, majd lassú hűtéssel renaturációt végeztek és ennek különböző időpontjaiban
meghatározták a mintákban az egyes és kettős láncú DNS arányát (15.1. ábra). Az E. coli DNS
renaturációs kinetikája olyan genomnak felelt meg, amelyben a legtöbb szekvencia egy
példányban fordul elő. Ezzel szemben a borjú tímuszból izolált DNS egy része (kb. 40%-a) igen
gyorsan renaturálódott, míg a fragmentumok nagyobb hányadának bázispárosodásához hetekre,
hónapokra volt szükség. Az alkalmazott vizsgálati körülmények között a renaturáció sebességét
elsősorban az határozza meg, hogy az egyes szekvenciák hány példányban vannak jelen a
genomban. A kísérletből levonható következtetés tehát, hogy a borjú genom kb. 60%-át olyan
szekvenciák alkotják, melyek csak egy vagy néhány példányban vannak jelen (egyedi
szekvenciák), míg 40%-a különböző mértékben ismétlődő szekvenciákból áll. A molekuláris
biológiai módszerek fejlődésével ezen szekvenciák különböző típusait írták le.

15.1. ábra: E. coli és borjú DNS renaturációs görbéje

Szatellit-DNS
A leggyorsabban renaturálódó genomrégiókra jellemző, hogy rövid DNS-szakaszok egymás
mellett, tandemmódon több ezer, több tízezer példányban ismétlődve alkotják. Ezeknek a
szekvenciáknak a bázisösszetétele eltérhet a DNS többi részének bázisarányától, így eltérő
sűrűségük alapján izopiknikus grádiens centrifugálással izolálhatók (15.2. ábra).

71
 A szedimentogrammon ezek a nagy
fokban ismétlődő szekvenciák kis
csúcsokat (szatellitcsúcsokat)
alkotnak, innen származik
elnevezésük. In situ hibridizációs
kísérletek tanúsága szerint a
szatellit-DNS nagy része a
kromoszómák centromér régiójában
lokalizálódik, valószínűleg a
mikrotubulusok kötődésében és a
kromatidák összetartásában játszik
szerepet. Működő gént nem
tartalmaz, át sem íródik.

15.2. ábra: Szatellit-DNS izolálása céziumklorid

grádiens centrifugálással

Az utóbbi években gyakorlati jelentőségre tettek szert a szatellit-DNS speciális típusai. A

miniszatelliták viszonylag kisméretű tandem ismétlődések, melyekben az ismétlődések
számában nagyfokú egyedi variációk, genetikai polimorfizmus tapasztalható. Ez a sokféleség
(VNTR, variable number of tandem repeats) Southern blot vagy PCR-módszerrel kimutatható és
felhasználható az igazságügyi orvostanban személyazonosság vagy családi kapcsolatok
megállapítására (a módszer neve: DNS fingerprint vizsgálat; 15.3. ábra). Orvosi jelentőséggel
bírnak a mikroszatelliták is: ezekben igen rövid, 2–4
bázispárnyi szakaszok néhány példányban
ismétlődnek. Az ilyen régiók genetikailag instabilak:
bennük az ismétlődések száma egyik generációról a
másikra hirtelen megnőhet. Funkcionális génekben
vagy környezetükben jelenlevő trinukleotid-
ismétlődések expanziója olyan öröklődő betegségekhez
vezethet, melyek generációról generációra súlyosabbá
válhatnak. A trinukleotid-ismétlődések amplifikációját
mint dinamikus mutációt néhány éve, 1991-ben
fedezték fel. Az emberi öröklődő betegségek közül
többek között a szellemi visszamaradottságot okozó
fragilis X szindróma és a halálos Huntington-kór alapja
mikroszatellit-amplifikáció. Az utóbbi betegség egy
nagyobb öröklődő neurodegeneratív kórképcsoport, az
ún. poliglutamin-betegségek egyik képviselője. Ezeknél
a betegségeknél a tripletismétlődés expanziója
neuronokban expresszálódó gének kódoló régiójában
CAG-ismétlődéseket érint. A kódolt fehérjék
poliglutamin régiója (a CAG glutamint kódol)
előszeretettel hoz létre kapcsolatot más fehérjékkel.
Toxikus fehérje-aggregátumok képződése, létfontos
15.3. ábra: Southern blot alapú DNS- proteinek megkötése egyaránt vezethet az érintett
fingerprint vizsgálat miniszatellit idegsejtek pusztulásához. A kóros fehérje-
próbával rokonsági kapcsolatok fehérjekapcsolatok gyógyszeres gátlása jótékony
tisztázására hatása lehetne ezekben a betegségekben.

72
 Szétszórtan ismétlődő szekvenciák
Szemben a szatellit-DNS-sel, más repetitív DNS-szakaszok nem tandem elhelyezkedésűek, hanem
szétszórtan ismétlődnek a genomban. Ezek lehetnek hosszabb (több ezer bázispárnyi) és
rövidebb (néhány száz bázispárnyi) régiók. Legjobban ismert képviselőjük az Alu család: tagjai
150–300 bp hosszúak, tartalmaznak egy AluI hasítási helyet és a genomban kb. 5000
bázispáronként fordulnak elő a gének között, sőt gének belsejében, az intronokban is. Funkciójuk
valószínűleg nincs a sejtben.

Tandem ismétlődésű gének

Az ismétlődő szekvenciák közé tartoznak azok a gének is, melyek termékére a sejtnek nagy
mennyiségben van szüksége: a 45S pre-rRNS, 5S rRNS (l. később), tRNS-ek, hiszton fehérjék
génjei. Ezek tandem módon ismétlődnek: az azonos szekvenciájú génszakaszokat inaktív, át
nem írt DNS-régiók, spacerek választják el egymástól (15.4. ábra). Bizonyos esetekben előfordul
az, hogy az igényeknek megfelelően a gének kópiaszáma tovább nő. Génamplifikációval
szaporodnak meg például a riboszomális gének a békapetesejtekben. Máskor kóros jelenség a
génsokszorozódás: gyógyszerrezisztenciához, daganatképződéshez vezethet (l. 42. és 54. fejezet).

15.4. ábra: Tandem ismétlődésű gének

Géncsaládok
Szemben a tandem ismétlődésű génsorozatokkal, a géncsaládok tagjai hasonló, de nem azonos
elsődleges szerkezetűek, így termékeik fiziológiai jellemzőiben is finom különbségek észlelhetők.
Ezek a gének egy közös génősből fejlődtek megkettőződéssel majd mutációkkal, egymás közelében
is maradhattak, de áthelyeződhettek más kromoszómára is. Részletesen tanulmányozott példája
a géncsaládoknak a globin géncsalád: az emberi α-globin génsorozat a 16., a β-globin génsorozat
pedig a 11. kromoszómára lokalizálódik. Egyes génjeik embrionális, magzati, felnőtt globinokat
kódolnak, melyek élettani tulajdonságai megfelelnek az eltérő oxigenáltsági viszonyoknak. A
génsorozatok olyan „géneket” is tartalmaznak, melyek mutáció következtében
működésképtelenné váltak (pszeudogének). (A humán genom program egyik nem várt
felfedezése: az emberi genom kb. ugyanannyi pszeudogént tartalmaz, mint működőképes valódi
gént. Ezek egy része át is íródik és szabályozó funkciója lehet.) Számos egyéb géncsaládot
ismerünk: citoszkeleton fehérjéket, sejtfelszíni receptorokat, proteinkinázokat, transzkripciós
faktorokat stb. kódolnak. A géncsaládok megjelenése az eukariota evolúció során minőségi ugrást
jelentett: hasonló, de nem azonos funkciójú fehérjék nagyfokú alkalmazkodóképességet,
kifinomult regulációt biztosítanak az eukariota szervezetekben. A fehérjecsaládok komplexitását
tovább növeli, hogy ugyanarról a génről többféle fehérje is expresszálódhat (l. 26. és 31. fejezet).

Egyedi szekvenciák
A genom jelentős részét képező, lassan renaturálódó egyedi szekvenciák a haploid genomban
egyetlen példányban fordulnak elő. Ezek nagy része – az ismétlődő szekvenciákhoz hasonlóan –
ugyancsak nem kódoló DNS: gének közötti spacereket, intronok egyedi régióit alkotja. Számos
fehérjekódoló gén (pl. a poliszacharidbontó lizozim enzim génje) ugyancsak egyedi szekvencia. A
gerincesek evolúciójának egyik fontos jellemzője az intronok méretének növekedése. A legtöbb
emberi génben az intronok mérete jóval meghaladja az exonokét. Míg a humán genomnak alig
több mint 1 százaléka fehérjekódoló szekvencia, az intronok a genom 20 százalékát teszik ki.

73
 Mobilis genetikai elemek
A genomszerkezettel kapcsolatban sokáig
tartotta magát az a tévhit, hogy a gének, egyes
szekvenciák helye végleges a genomban. Ma
már tudjuk, hogy génátrendeződés a sejtek
normális differenciálódása, működése során is
történhet. (Legjobban ismert példája az
immunglobulin-gének átrendeződése a B
limfociták differenciálódása során, ami
előfeltétele a szervezet idegen antigénekkel
szembeni hatékony immunválaszának.) A
génátrendeződés speciális esetét fedezte fel
McClintock: kukoricával végzett genetikai
vizsgálatai során megfigyelte, hogy bizonyos
DNS-szakaszok a genom egyik helyéről egy
másikra vándorolhatnak. Később kiderült,
hogy ilyen mobilis genetikai elemek
prokariotákban és eukariotákban egyaránt
léteznek, a transzpozíció tehát az élővilág
általános jelensége. Furcsa módon igen
gyakran a transzpozonok egyetlen celluláris
funkciója az, hogy vándorolnak a genomban,
ezért önző DNS-nek is nevezik őket. A
mozgékony DNS-elemek különböző típusai
ismertek.
15.5. ábra: A transzpozíció mechanizmusai (A: nonreplikatív transzpozíció; B: replikatív
transzpozíció; C: retrotranszpozíció)

Transzpozonok
A transzpozonoknak nevezett mobilis genetikai elemek vándorlása DNS formájában zajlik. Ez
történhet úgy, hogy a DNS-szakasz kihasad a genomból és egy másik helyen integrálódik
(nonreplikatív transzpozíció, 15.5.A. ábra). Ekkor a mobilis elem az eredeti helyéről természetesen
eltűnik. Replikatív transzpozíció (15.5.B. ábra) során a DNS-régió megkettőződik, az egyik kópia
marad a helyén, a másik máshol integrálódik. Egyes transzpozonok annak az enzimnek
(transzpozáz) a génjét is tartalmazzák, amely áthelyeződésükhöz szükséges.
Retrotranszpozonok
A transzpozíció másik fő típusa RNS-intermedier közvetítésével történik (15.5.C. ábra): a donor
DNS-régió RNS-be íródik át, majd azon mint templáton reverz transzkriptáz segítségével kettős
láncú DNS szintetizálódik és az beépül a cél-DNS-be. A retrotranszpozonok egyik csoportja
hasonlít a retrovírus genom DNS-másolatára, provírusára, ezek a virális retrotranszpozonok. (A
retrovírusok reverz transzkriptázzal rendelkező RNS-vírusok; számos fajtájuk onkogén
képességgel rendelkezik, ezért részletes leírásukkal később, a daganatbiológiai fejezetekben
foglalkozunk.) A nonvirális retrotranszpozonok inkább celluláris mRNS-ekre hasonlítanak, 3’-
végükön például poli(A)-szekvenciát tartalmazhatnak. Egyik képviselőjük az Alu-család (l. előbb),
amely retrotranszpozícióval szóródott szét a genomban. Az Alu-szekvenciák tulajdonképpen az
endoplazmatikus retikulumba történő fehérjetranszlokációhoz szükséges 7SL RNS (l. 33. fejezet)
pszeudogénjeinek tekinthetők.

74
A mobilis genetikai elemek a sejt számára hasznos funkciót nem látnak el, fontos szerepet
játszhatnak azonban az eukariota genom evolúciójában. (Ezt támasztja alá az a tény, hogy
becslések szerint az emberi genom 40 százaléka retrotranszpozíció eredménye!) A 15.6. ábrán
bemutatott mechanizmus az Alu-szekvenciák jelentőségét illusztrálja a géncsaládok
kialakulásához vezető génduplikációs eseményekben. A homológ kromoszómák hasonló DNS-
szekvenciái között végbemenő génkicserélődés (crossing over) a meiózis fontos eseménye. Ha
azonban a folyamat a kromoszómapár tagjainak nem egymásnak pontosan megfelelő régiói
között, hanem oldalirányú „elcsúszással” megy végbe, az egyik kromoszómában DNS-többletet, a
másikban DNS-hiányt eredményezhet. A genomban szétszórt Alu-szekvenciák elősegíthetik az
ilyen egyenlőtlen crossing overt.

15.6. ábra: Alu-szekvenciák szerepe a génduplikáció folyamatában

A transzpozíció során a mobilis elem integrációja általában véletlenszerűen történik,
szerencsétlen esetben tehát géninaktivációt eredményezhet. A transzpozonok mutagén hatása
öröklődő betegséget (haemophilia, muscularis dystrophia stb.) okozhat.

75
 16. A kromatin szerveződése
Míg a prokariota sejtek genomja szuperspiralizált DNS, melyhez struktúrális és szabályozó
fehérjék, enzimek csak korlátozott mennyiségben kapcsolódnak, az eukariota genom bonyolult
szerkezetű és összetételű nukleoprotein, amely az ugyancsak erősen felcsavarodott kromatin
formájában szerveződik a sejtmagban.

A kromatin morfológiai szerveződése

A szerveződés szintjei
Egy humán testi sejtben jelenlevő DNS hossza kiterített állapotban 2 m lenne, ennek a DNS-nek
azonban a sejtben néhány mikrométer átmérőjű sejtmagban kell elférnie. Ez az aránytalanság a
sejttől két, egymással nagyon nehezen összeegyeztethető feladat megoldását követeli meg: a DNS-
t egyrészt rendkívüli mértékben tömöríteni kell, hogy elférjen a sejtmagban, másrészt viszont
ebben a szorosan csomagolt állományban végre kell hajtani azokat a biokémiai folyamatokat
(replikáció, transzkripció stb), amelyek a sejt életben maradásához és szaporodásához
szükségesek. A probléma megoldását a kromatinállomány többszintű organizációja jelenti (16.1.
ábra): a funkcionálisan eltérő régiókra (eukromatin, illetve heterokromatin) a szerveződés eltérő
típusai jellemzőek.

16.1. ábra: A kromatin morfológiai szerveződésének szintjei

Kiterjedt csupasz DNS-szakaszok az eukariota sejtmagban csak kivételesen fordulnak elő, olyan
génszakaszokon, amelyek rendkívül aktívan íródnak át. A genom döntő része fehérjékhez kapcsolt
állapotban létezik.

76
 A DNP szerveződés legegyszerűbb formája a
„gyöngyfüzér” szerkezet. Ezt a DNS-hez
kapcsolódó 10 nm átmérőjű partikulumok,
nukleoszómák hozzák létre, amelyek 8
hiszton molekulából (oktamer) és a körülöttük
2 csavarulatot alkotó, 145 bázispár hosszú
DNS-szakaszból állnak. A nukleoszómák
egymástól egyenlő távolságban helyezkednek
el, kb. 60 bázispár hosszú linker-DNS köti
össze őket. Az oktamerben 4 hisztontípus
(H2A, H2B, H3, H4) 2–2 molekulája
korongszerű képletet alkot, a nukleoszómából
kilépő linker-DNS-ekhez pedig a H1 hiszton
kötődik; a nukleoszóma és a H1 molekula
együtt hozza létre a kromatoszómát (16.2.
16.2. ábra: A kromatoszóma szerkezete ábra).
A H1 hiszton kapcsolódása a gyöngyfüzér felcsavarodásához vezet, tekercsszerű szolenoid fonal
jön létre. Ennek átmérője mintegy 30 nm, egy csavarulatát 6 nukleoszóma alkotja. A gyöngyfüzér-
szolenoid átalakulás a kromatinfonal transzkripciós aktivitásának csökkenésével jár.
A szolenoid fonal további felcsavarodása nagyméretű hurokdoméneket eredményez. A
transzkripciós egységek ezekben a hurkokban lokalizálódnak, az alapjuknál elhelyezkedő spacer
régiók pedig strukturális nem hiszton fehérjékből álló köteghez, a kromoszómavázhoz
kapcsolódnak.
A metafázikus kromoszómában a kromatinfonal felcsavarodása, kondenzálódása tovább folyik,
ezzel párhuzamosan a transzkripciós aktivitás megszűnik.
A kromatin speciális funkciójú régiói
Centromérek. A metafázikus kromoszómák (16.3. ábra) két testvérkromatidból épülnek fel:
ezek 1-1 hosszú, lineáris, kettősláncú DNS-molekulát tartalmaznak, melyek a DNS-replikáció
során képződnek, így bázisszekvenciájuk azonos. A centromér régió a metafázikus kromoszómán
található befűződés, a kromatidák DNS-ének egy szakaszát tartalmazza. Kettős funkciót lát el:
egyrészt a kromatidok egymáshoz kapcsolódásának helye, másrészt specifikus fehérjék
kötődésével rajta alakul ki a kinetochor, melyhez a sejtosztódás során a kinetochor
mikrotubulusok kapcsolódnak (l. 19. fejezet). Bár a centromér funkciója minden eukariotában
ugyanaz, a különböző fajok centromér-DNS-ének elsődleges szerkezete nagyon eltérő.
Magasabbrendű eukarioták centromérjétszatellit-DNS alkotja. Az emberi kromoszómák
centromérje ún. α-szatellit DNS-t tartalmaz, ez 171 bázispár hosszú ismétlődésekből álló, AT-
gazdag, több millió bázispárnyi régió. Minden eukariota centromérjének közös jellemzője viszont,
hogy a H3 hiszton helyett annak egy variánsát (CenH3) tartalmazza, mely feltétlenül szükséges a
kinetochor kialakulásához.
Telomérek. A kromatidok lineáris DNS-ének két végespeciális szatellit-DNS-ből áll, mely
különböző eukariotákban hasonló szerkezetű. Emberben a telomér régiókat több ezer TTAGGG
hexanukleotid ismétlődés alkotja. A DNS-molekula 3’-vége valamivel hosszabb, bázispárosodással
hurkot alkot, melyhez fehérjekomplexek kapcsolódnak (16.4. ábra) és védik a DNS-véget a
degradációtól.

77
 16.4. ábra: A telomér-hurok szerkezete
16.3. ábra: Egy emberi metafázikus
kromoszóma szerkezete

A kromatin kémiai összetétele

A kromatinállomány nagyjából egyenlő arányban tartalmaz DNS-t, hiszton és nem hiszton
fehérjéket. A kisebb mennyiségben jelenlevő RNS-ek részben újonnan szintetizálódott
transzkriptumok (pre-mRNS, pre-rRNS stb.), másrészt érett, a citoplazma felé tartó RNS-ek
(mRNS, rRNS, tRNS stb.), illetve a sejtmag saját RNS-ei (snRNS, snoRNS). A kromatin anorganikus
ionokat is tartalmaz (Mg++, Ca++, Zn++ stb.), amelyek a kromatin szerkezetének kialakításához,
egyes fehérjéinek működéséhez szükségesek.
Hisztonok és nem hiszton fehérjék
Szerkezeti jellemzők. A hisztonok kisméretű, lizinben és argininben gazdag, bázikus jellegű
fehérjék. A nukleoszomális hisztonok (H2A, H2B, H3, H4) a különböző élőlényekben nagyon
hasonló elsődleges szerkezettel rendelkező, erősen konzervált fehérjék. Globuláris szerkezetű
régiójukkal alkotják az oktamert, lizinben gazdag N-végük pedig farok formában lép ki a
nukleoszómából, a DNS-sel, szomszédos nukleoszómákkal, nem hiszton fehérjékkel képes ionos
kötéseket létesíteni. A nukleoszomális hisztonok stabilan kapcsolódnak a DNS-hez, minden más
fehérje viszont rövid életű, átmeneti kötéseket létesít a kromatin egyéb alkotórészeivel. A képződő
és felbomló kötések dinamikus kromatinszerkezetet eredményeznek, ami elősegíti a sejtmagban
lejátszódó biokémiai folyamatokat. A H1 linker-hiszton a nukleoszóma alapjához kapcsolódik,
befolyásolva a kromatin kondenzáltságát (l. előbb és a 16.2. ábrát). A nem hiszton fehérjék több
száz tagból álló, méret és izoelektromos pont szempontjából is rendkívül heterogén
fehérjepopuláció. Szétválasztásuk, vizsgálatuk ennek megfelelően kétdimenziós gél-
elektroforézissel történik. Míg egy szervezet különböző sejtjeinek hisztonjai azonosak, a nem
hiszton proteinek expressziójában jelentős szöveti specificitás tapasztalható.
Kémiai módosulás. A fehérjék modifikációja fontos eszköze működésük szabályozásának. A
hisztonok a legnagyobb mértékben módosított fehérjék közé tartoznak: foszforilálódnak,
acetilálódnak, metilálódnak, glikozilálódnak, más modifikációk is történhetnek rajtuk.
A H1 hiszton foszforilációja kromatinkondenzációhoz vezet, a sejtosztódás profázisában a
kromoszómák kialakulását eredményezve (l. 19. fejezet). A nukleoszomális hisztonok esetében az
N-terminális lizin oldalláncok acetilációja jelentős: az aminocsoportokhoz kötődő acetilcsoportok
csökkentik a hisztonfarkak pozitív töltését, kötődésüket a DNS-hez, így a nukleoszómaszerkezet
fellazul (16.5. ábra). Az acetilált hisztonokat tartalmazó kromatinrégiók transzkripcionálisan
aktívak.

78
16.5. ábra: A nukleoszomális hisztonok acetilációjának következménye: a nukleoszóma fellazulása
A nem hisztonfehérjék kémiai módosulásának legfontosabb módja a foszforiláció. A nagyszámú
fehérjét sokféle fehérjekináz foszforilálhatja. A kifinomult és bonyolult szabályozási folyamatokkal
több fejezetben is találkozni fogunk (l. később).
Funkció. A kromatoszómák alkotóelemeiként a hisztonok a kromatin alapvető strukturális
elemei. Ezen túlmenően szabályozó szerepet is játszanak: a DNS-hez erősen kötődő nukleoszómák
akadályt jelentenek az RNS-szintetikus apparátus számára: a hisztonok a transzkripció nem
specifikus gátlói. Hasonlóan a szerkezetbeli heterogenitáshoz, a nem hiszton fehérjék
funkcionális szempontból is sokfélék. Vannak közöttük struktúraalkotó fehérjék (pl. laminok,
magmátrix fehérjék stb.), enzimek (pl. DNS-, RNS-polimerázok stb.), a gének működését
szabályozó transzkripciós faktorok, kisméretű anyagok hatását közvetítő receptor fehérjék (pl.
szteroid receptorok), a magfehérjék és RNS-ek szállítását irányító transzport fehérjék (pl.
importin, Ran), fehérje chaperonok (pl. az új nukleoszómák összeszerelését segítő nukleoplazmin),
DNS chaperonok, amelyek az optimális kromatinszerkezet kialakításához szükséges DNS-
hajlításokat végzik.

79
 17. A sejtciklus I.: Interfázis és sejtosztódás
Az önreprodukció képessége a sejtek alapvető jellemzője; ennek során a sejt növekszik, anyagait
és genetikai információit megkettőzi és a sejtosztódás eredményeképpen ezeket két utódsejt
között osztja el. Mivel az utódsejtek is képesek önreprodukcióra, a folyamat ciklusosan
ismétlődhet, nagyszámú sejtet hozva létre. A sejtosztódás végétől a következő osztódás
befejeződéséig tartó szakaszt sejtciklusnak nevezzük.

A sejtciklus fázisai
Eukarioták esetében a sejtciklus két fő szakaszra osztható: a sejtosztódás (M-fázis; mitózis
illetve meiózis) és az interfázis szakaszára (17.1. ábra). Az interfázis során a sejt növekszik és
megkettőzi DNS-állományát. A DNS-replikáció (S-fázis) a nyugalmi szakaszt további fázisokra
osztja. A G1-fázis (gap, a mitózis és a replikáció közti „rés”) jellemzője, hogy a sejtosztódásból
éppen csak kilépett sejt valamennyi kromoszómának csak egyik kromatidját tartalmazza (emberi
sejteknél 46 kromatidot); a sejt diploid, 2n DNS-tartalom jellemzi. A sejt metabolikusan aktív,
tömegében folyamatosan növekszik. A G1-fázis időtartama sejttípustól és a sejt életkörülményeitől
függően igen változó. Gyorsan osztódó sejtek G1-fázisa rövid (korai embrionális sejteknél
hiányozhat is). A felnőtt szervezet legtöbb szövetére a hosszú G1-fázis jellemző: a sejtek tartósan
kilépnek a sejtciklusból, G0-fázisba kerülnek. Bizonyos sejttípusoknál ez végleges állapot (pl.
idegsejtek), más szövetek sejtjei pedig akkor kezdenek újra osztódni, ha sejtveszteséget kell
pótolniuk (pl. a máj regenerációja során).

Az S-fázis során a sejtmag valamennyi DNS-e

17.1. ábra: A sejtciklus fázisai
egyszer, és csakis egyszer replikálódik. Ezzel
egyidőben egyéb folyamatok is zajlanak a
sejtben, melyek hozzájárulnak a replikáció
zökkenőmentességéhez: a DNS-polimeráz
molekulák az S-fázis elején transzlokálódnak a
magba; a hisztonok szintézise és transzportja
a sejtmagba a DNS-megkettőződéssel
párhuzamosan folyik. A centriólumok
megkettőződése is az S-fázisban történik. A G2-
fázis a DNS-replikáció és az osztódás kezdete
közötti szakasz: a sejt metabolikusan aktív és
készül a sejtosztódásra. DNS-tartalma: 4n
(tetraploid), minden kromoszómája 2
kromatidból áll.

A normálisan végbemenő sejtciklus tehát biztosítja a sejt önreprodukcióját. Többsejtű

szervezetekben azonban a szervezet egészének igényei előbbrevalóak mint az egyes sejtekéi: a
sejteknek ott és akkor kell osztódniuk, ahogyan ez a szervezet számára a legelőnyösebb. Orvosi
szempontból a sejtciklus szabályozásának megértése azért fontos, mert ennek a regulációnak a
zavara okozza legrettegettebb betegségeinket, a rosszindulatúdaganatokat. A sejtciklus
vizsgálatának modern módszerei jelentős haladást eredményeztek az elmúlt 20 évben ezen a
területen.

Sejttenyészetek szinkronizálása
A sejtciklust tanulmányozó kísérletekben gyakori követelmény, hogy a vizsgált sejtpopuláció
sejtjei ugyanabban a fázisban legyenek, a tenyészet szinkronizált legyen. Ennek elérésére számos
módszer ismert.

80

17.2. ábra: A FACS működési elve
17.3. ábra: Szinkronizálatlan tenyészet
áramlási citometriás képe DNS-festést
követően
A fázisok hosszának meghatározása
A sejtciklus vizsgálatánál szükség lehet arra is, hogy a sejttenyészetben meghatározzák az egyes
fázisok időtartamát.
Generációs idő. A sejtciklus teljes időtartamának meghatározásához a tenyészetből
időközönként mintát vesznek és sejtszámolást végeznek. A generációs idő a sejtszám
megduplázódásához szükséges időtartam.
81
A szinkronizálás legegyszerűbb módja a
széruméheztetés. A szérum növekedési
faktorokat tartalmaz, melyek sejtfelszíni
receptorok útján serkentik a sejtek
progresszióját a sejtcikluson keresztül (l. 46.
fejezet). A szérum megvonása után előbb-
utóbb G0-fázisba kerülnek, a szérum
visszaadásakor pedig egyszerre lépnek vissza
a G1-fázisba.
Az interfázikus sejtek általában laposak,
letapadnak a tenyésztőedény aljára, az
osztódó sejtek viszont gömbölyűek, gyengén
tapadnak. Ha a lemosott sejteket új edényben
tenyésztik, azok a G1-fázisban folytatják a
sejtciklust. Ez a mitotikus szelekció módszere.
Kolhicinnel az osztódási orsó működése, 5-
fluorodezoxiuridinnal (timidinanalóg
nukleozidszármazék) a replikáció gátolható
reverzibilisen. Eltávolításuk után a tenyészet a
megfelelő fázisban szinkronizáltan folytatja
életét.
A szinkronizáció legelegánsabb módszere a
FACS (fluorescence-activated cell sorter)
alkalmazása. Ennek alapja az áramlási
citometria: ha egy sejtpopulációt valamilyen
fluoreszcens festékkel festenek és a sejtek a
festéket eltérő mértékben kötik, áramlási
citométerrel megállapítható a festődés-
eloszlás a populációban. A különbözően
festődő sejtek egymástól el is választhatók. A
FACS működési elve a következő (17.2. ábra).
A festett sejteket lézersugárral világítják meg
és a műszer minden sejt fluoreszcenciáját
regisztrálja. A sejtszuszpenzió porlasztón
halad át, a képződő cseppek egy-egy sejtet
tartalmaznak és a gép a cseppeknek a bennük
lévő sejt fluoreszcenciájától függő töltést ad,
az eltérő töltésű cseppeket pedig elektromos
térben választják szét. Ha az áramlási
citometriához DNS-hez kötődő fluoreszcens
festéket használnak, jellegzetes görbét kapnak
(17.3. ábra). A csúcsok magasságából
következtetni lehet az egyes fázisokban levő
sejtek arányára.
S-fázis. Szinkronizálatlan sejttenyészetben meghatározzák az adott pillanatban az S-fázisban
tartózkodó sejtek arányát. Ennek egyszerű módja, hogy a sejteket rövid ideig [3H]timidinnel
jelölik: a radioaktív nukleozid bejut a sejtbe és beépül az újonnan szintetizált DNS-be.
Fénymikroszkópos autoradiográfiát követően az interfázikus sejtek egy részének magja felett
nagyszámú ezüstszemcse (grain) jelenik meg, ezek a jelölés idején S-fázisban voltak (l. 7.1.B.
ábra). Belátható, hogy a jelölt sejtek aránya azonos az S-fázis és a generációs idő hányadosával.
(Példa: ha a tenyészet generációs ideje 30 óra és a timidinnel jelölhető sejtek aránya 30%, az S-
fázis időtartama 9 óra.)
M-fázis. A meghatározás elve hasonló: a tenyészetben lévő osztódó sejtek arányából (mitotikus
index) az M-fázis időtartama kiszámítható. (A fenti példában: 5%-os mitotikus index 1,5 órás M-
fázisnak felel meg.)
G1-fázis. Mitotikus szelekcióval szinkronizált tenyészetet [3H]timidin jelenlétében inkubálnak,
időnként mintát vesznek és autoradiográfiát végeznek. Az az idő, ami az első jelölt interfázikus
sejt megjelenéséig eltelik, megfelel a G1 időtartamának.
G2-fázis. Szinkronizálatlan tenyészetben rövid [3H]timidin jelölést végeznek, időközönként
mintát vesznek és autoradiogrammon jelölt kromoszómaszerelvényeket keresnek. Az első
graineket mutató osztódó sejt a jelölés pillanatában az S-fázis legvégén volt, az eltelt idő tehát a
G2-fázisnak felel meg.

82
 18. A sejtciklus II.: Szabályozás
A sejtciklus szabályozásának végső célja annak meghatározása, hogy az érintett sejt milyen
gyakorisággal osztódjon. A folyamat rendkívül bonyolult, amelyben számos intracelluláris és
extracelluláris tényező játszik szerepet. Ebben a fejezetben a sejtciklus regulációjának sejten belüli
mechanizmusaira koncentrálunk, a külső környezeti tényezők és jelátviteli folyamatok
jelentőségére, a sejtosztódás szabályozásának kóros vonatkozásaira később térünk vissza.

Vizsgálómódszerek
Genetikai vizsgálatok élesztősejtekben
Ezek a primitív eukariota egysejtűek viszonylag kis genommal rendelkeznek, gyorsan
szaporodnak, genetikai kutatásokra igen alkalmasak. Számos hőérzékeny sejtciklus-mutáns
törzset (cdc [cell division cycle] mutánsok) izoláltak, melyekben az érintett fehérje normális
körülmények között (a permisszív hőmérsékleten) működőképes, nonpermisszív hőmérsékleteken
azonban inaktiválódik. A cdc-mutánsok a nonpermisszív hőmérsékleten a sejtciklus azon
fázisában ragadnak meg, amelyben a továbbhaladáshoz a fehérje működésére lenne szükség.
Mivel a sejtciklus szabályozása erősen konzervált mechanizmus, az élesztőmutánsok
tanulmányozásából a magasabb rendű sejtekben zajló folyamatokra is következtetni lehet.
Sejtfúzió
Magasabb rendű eukariota sejteket szövettenyészeti körülmények között rá lehet bírni arra (pl.
speciális vírusokkal, kémiai ágensekkel), hogy sejtmembránjaikat összeolvasztva egymással
egyesüljenek, fuzionáljanak. Ha a hibrid sejt a sejtciklus különböző fázisaiban levő sejtekből jött
létre, annak vizsgálatából következtetni lehet arra, hogy milyen diffúzibilis citoplazmatikus
faktorok vesznek részt a sejtmag viselkedésének szabályozásában.
Béka oociták mikroinjekciója
A béka oociták, mielőtt belépnének a meiózisba, tartósan a sejtciklus G2-fázisában vannak.
Fiziológiásan ez progeszteron hatására történik: a sejtmagban a kromatin kondenzálódik és
végbemegy az 1. meiotikus osztódás. A nagyméretű oocitába mikroinjekcióval különböző ágensek
(fehérjék, mRNS-ek, antisense oligonukleotidok) juttathatók be, lehetővé téve a G2/M átmenet
szabályozásának vizsgálatát.
Béka oocita extraktumok in vitro alkalmazása
A meiózis megkezdésére kész béka oocitákból izolált citoplazma-kivonat tartalmaz minden
olyan faktort, ami ahhoz szükséges, hogy a hozzáadott sejtmagokban több sejtciklus is
végbemenjen. Az is elérhető, hogy az extraktumban jelenlevő vagy ahhoz hozzáadott mRNS-eken
új fehérjék szintetizálódjanak. Az extraktumokban sokféle manipuláció végezhető (enzimek
gátlása, mRNS-ek lebontása, mutáns fehérjék expresszálása), így ez az in vitro rendszer kitűnő
modell a sejtciklus szabályozásának tanulmányozására.

Különböző fázisú sejtek fúziója

Az 1960-as évek végén végzett sejthibridizációs kísérletek fontos mérföldkövei voltak a
sejtcikluskutatásnak. Ezekben a kísérletekben lényegében azt vizsgálták, hogy milyen hatással
vannak a fúziós partnerek citoplazmái egymás sejtmagjaira: történik-e DNS-replikáció (ezt
timidinjelölést követő autoradiográfiával mutatták ki), illetve belép-e a sejtmag az M-fázisba (azaz
megfigyelhető-e kromatinkondenzáció).
Ha S-fázisú sejtet G1-fázisban levővel fuzionáltak, az utóbbi magjában hamarosan DNS-szintézis
kezdődött; elmaradt viszont a replikáció megindulása, ha a fúziós partnerek G1- és G2-fázisú sejtek
voltak. S-fázisú sejtekben tehát van egy diffúzióra képes anyag, amely a G1-fázisú sejtben DNS-

83
replikációt indukál; ez az S-fázis promóciós faktor (SPF) a G1- és G2-fázisban nincs jelen a
sejtben.
S-fázisú sejt citoplazmája a G2-fázisú magban viszont nem képes DNS-szintézist előidézni: ez a re-
replikációs blokknak nevezett jelenség megakadályozza, hogy a genom vagy egy része
ugyanabban az interfázisban ismételten megkettőződjön.
M-fázisú sejt fúziója bármilyen interfázikus sejttel kromatinkondenzációt idéz elő az utóbbi
magjában. Az M-fázis promóciós faktor (MPF), amelyet egyébként béka petesejtekben fedeztek
fel eredetileg, a mitotikus és meiotikus folyamatok fő irányítója.

Ciklin/Cdk komplexek: a sejtciklus endogén regulátorai

A sejtfúziós, mikroinjekciós és genetikai vizsgálatok alapján bebizonyosodott, hogy a sejtciklus
meghatározott pontjain intracelluláris, endogén szabályozó faktorok segítik át a sejtet. Ezek
biokémiai azonosítása és jellemzése az 1980-as évek végén kezdődött meg. Kiderült, hogy a
sejtciklus fő szabályozói heterodimer fehérjekomplexek, amelyek egy katalitikus és egy regulátor
alegységből épülnek fel. A katalitikus alegységek fehérjekinázok, amelyek célfehérjéiken
meghatározott szerin és treonin aminosavakhoz kapcsolnak foszfátcsoportot, megváltoztatva
azok aktivitását. Monomer formában ezek a proteinkinázok alig működnek, a regulátor alegység
kötődése több tízezerszeresre növeli enzimaktivitásukat. A regulátor alegységek mennyisége a
sejtciklus során jellegzetes változásokon megy keresztül, elnevezésük (ciklinek), illetve a
katalitikus alegységeké (ciklin-dependens kinázok, Cdk-k) is innen származik.
Magasabb rendű eukariota sejtekben a ciklinek (ciklin A-H) és a Cdk-enzimek (Cdk 1-7) is
többtagú fehérjecsaládot alkotnak. Ezek sokféle kombinációban kapcsolódhatnak egymással, és
bár a komplexek felépítése hasonló, az egyes ciklin/Cdk heterodimerek eltérő funkcióval
rendelkeznek, a sejtciklus különböző pontjain fejtik ki hatásukat (18.1. ábra).
A G1 [S átmenet] szabályozása
Magasabb rendű sejtekben a sejtosztódás regulációjának legfontosabb eleme a G1-fázis
hosszának szabályozása. Ennek kritikus szakasza a restrikciós pont: ha a sejtek elérik ezt a pontot,
elkötelezik magukat a sejtosztódásra. A restrikciós ponton a sejtek mitogén ágensek (pl. a
szérumban levő növekedési faktorok) hatására jutnak túl és a ciklust akkor is folytatják, ha a
stimuláló anyagot megvonják tőlük. Növekedési faktorok hatására ugyanis a sejtben ún. G1-
ciklinek jelennek meg (18.1. ábra), amelyek specifikus Cdk izoenzimeket aktiválva az S-fázis
megindulásához szükséges biokémiai folyamatokat indítanak el (pl. nukleotidszintetizáló
enzimek, DNS-polimerázok, hisztonok
képzése és transzlokációja a sejtmagba). A
restrikciós pont elérése után néhány
órával a sejtben megindul a DNS-
replikáció. Az S-fázis promóciós faktor
elnevezés tehát végeredményben olyan
ciklin/Cdk-komplexeket takar, amelyek
az S-fázis elindítását és zavartalan
lebonyolítását „felügyelik”.

18.1. ábra: Ciklin/Cdk komplexek expressziója

emlős sejtciklus során (R= restrikciós pont)

84
Re-replikációs blokk
Az eukariota genom replikációja nagyszámú ponton kezdődik: ezek az origók meghatározott DNS-
régiók megkettőződését biztosítják (l. 21. fejezet). Nagyon lényeges, hogy egy sejtciklusban a teljes
genom replikálódjon, de csak egyszer. Ha ez nem így történne, az utódsejtekben génhiány vagy
géntöbblet alakulna ki, mindkettő genetikai katasztrófához vezet. A replikációs origók egyszeri és
csak egyszeri használatát speciális „engedélyező” fehérjék (angol szakkifejezéssel licensing
faktorok) biztosítják: ezek hozzákötődnek az origón felépülő komplexekhez, megindítják a
replikációt, majd egy Cdk által foszforilálva leválnak (18.2. ábra). A licensing faktorok tehát azért
tudják ellátni funkciójukat, mert szükségesek a DNS-replikációhoz, a folyamat során azonban
inaktiválódnak.

18.2. ábra: A re-replikációs blokk megvalósítása a licensing faktor teória szerint

A G2 [M átmenet] és az M-fázis szabályozása

Az M-fázis promóciós faktor mitotikus ciklinből és specifikus Cdk-enzimből álló komplex (18.1.
ábra). Az interfázis során képződő mitotikus ciklin felhalmozódva a G2-fázisban kritikus
mennyiséget ér el és Cdk-aktivációt okoz. A bekövetkező fehérjefoszforiláció mitózist elindító
biokémiai és morfológiai változásokat (kromatinkondenzáció, a maghártya szétesése,
citoszkeleton-átalakulás) eredményez. Ezután a ciklinmolekulák hirtelen degradálódnak; ez
szükséges ahhoz, hogy a sejt be tudja fejezni a mitózist. Egyben az MPF-aktivitás is megszűnik és
a sejt interfázist kezd meg (18.3. ábra). Újabb vizsgálatok szerint az osztódásnak ehhez a végső
szakaszához egy bonyolult proteolítikus gépezet, az anafázis promóciós komplex (másnéven
cikloszóma) működése szükséges. Az anafázis promóciós komplex ubikvitináló enzim: a
célfehérjéhez kisméretű ubikvitin-fehérjéket kapcsol, melyet azután proteaszómák bontanak le. (A
folyamat részleteivel a 31. fejezetben foglalkozunk.) A sejtosztódás során a proteaszóma nemcsak
a mitotikus ciklint bontja le, hanem proteáz aktivitásával a testvérkromatidok szétválását, majd
az osztódási orsó eltűnését is elősegíti.

85
 18.3. ábra: Az MPF-aktivitás és a ciklinszint változása a sejtciklus során

A Cdk-aktivitás szabályozása
Bár a Cdk-család egyes tagjai eltérő funkciót látnak el az emlős sejtciklus szabályozásában, az
őket reguláló mechanizmusok hasonlóak. A legfontosabb serkentő (+) és gátló (-) tényezőket a
18.4. ábra foglalja össze. A Cdk-aktivitás előfeltétele a megfelelő ciklin jelenléte és kötődése. A
ciklin-expresszió szabályozása két szinten történhet: (I) egyes G1-ciklinek génjének átírását
mitogén anyagok serkentik; (II) a mitotikus ciklinek szintjének drámai zuhanása az osztódás
során gyors lebomlásuk eredménye. A Cdk-enzimek szabályozó régiójában bekövetkező serkentő
foszforiláció, illetve az aktív centrumban végrehajtott gátló foszforiláció ugyancsak fontos
regulációs események. Az utóbbi időben kerültek az érdeklődés középpontjába a Cdk-inhibitor
fehérjék, melyek működészavara szerepet játszhat az emberi daganatképződésben (l. 55. fejezet).
A Cdk-szabályozás részletesen tanulmányozott példája az MPF regulációja (18.5. ábra). A
mitotikus ciklin B az S- és G2-fázisban halmozódik fel, komplexet képezve a Cdk1 enzimmel (1.
lépés). A Cdk1-en bekövetkezik a gátló és serkentő foszforiláció is, az enzim ekkor még inaktív (2.
lépés). Aktivációját egy foszfatáz enzim hajtja végre, amely a gátló foszfátcsoportokat eltávolítja
(3. lépés). Az aktív MPF megindítja az M-fázist, majd a ciklin B degradálódik (4. lépés), a Cdk
defoszforilálódik és a G1-fázisnak megfelelő alapállapotba kerül (5. lépés).

18.4. ábra: A Cdk-szabályozás mechanizmusai

86
 18.5. ábra: Az MPF-aktivitás szabályozása a sejtciklus során

Ellenőrzőpontok a sejtciklus szabályozásában

A sejtciklus fontos jellemzője, hogy eseményeinek szigorúan meghatározott sorrendben kell
bekövetkeznie: egy fázis csak akkor kezdődhet meg, ha az előző folyamatai már befejeződtek. Ha
ez a koordináció felborul, az utódsejteket súlyos genetikai károsodás érheti. Eukariota sejtekben
minőségi kontrollmechanizmusok fejlődtek ki, amelyek meghatározott pontokon leállítják a
sejtciklust mindaddig, amíg az előző fázis eseményei normálisan végbe nem mentek (18.6. ábra).
DNS-károsodást ellenőrző pontok. A
mutagén hatásokra (sugárzás, kémiai
ágensek) vagy esetleg spontán (hibák a DNS-
replikáció során) fellépő DNS-károsodás a
sejtciklus leállásához vezet. Ez időt ad a sejt
számára a károsodott DNS kijavítására és
megakadályozza, hogy a sejtosztódás során
olyan utódsejtek jöjjenek létre, melyekben
mutációk halmozódnak fel. A DNS-
károsodás (lánctörések, replikálatlan régiók
stb.) G1-, S- és G2-ellenőrzési pontokon is
leállíthatja a ciklust. A károsodást felismerő
fehérjekomplex fehérjefoszforilációs lánco-
latot indít el, mely inaktiválja azt a foszfatáz
enzimet, mely a Cdk-aktivációhoz szükséges
defoszforilációt katalizálja (l. 18.5. ábra 3.
lépése). A Cdk2 enzim gátlása így a G1- vagy
S-fázisban, a Cdk1 inaktiválása pedig a G2-
fázisban állítja le a sejtciklust (l. 18.1 ábra).
A G1-blokkhoz ezenkívül egy Cdk-inhibitor
indukciója is hozzájárul.
18.6. ábra: Ellenőrzési pontok a sejtciklusban
Ennek mechanizmusára még visszatérünk.
Osztódási orsót ellenőrző pont. Ha az osztódási orsó kialakulásába vagy a kromoszómák
mikrotubulusokhoz kötődésébe hiba csúszik, a sejtosztódás leáll, ezáltal megakadályozva
abnormális kromoszómaszerelvényű utódsejtek képződését. Ezekben a sejtekben a mitotikus
ciklin nem degradálódik, az MPF-szint magas marad és a sejt nem tudja befejezni az osztódást.

87
 19. A sejtosztódás
Míg a prokarioták genomjuk megkettőződését követően egyszerűen két sejtre hasadnak,
eukariota sejtekben a sejtosztódást mélyreható morfológiai változások kísérik: a replikálódott
örökítő anyag kromoszómákba rendeződik, majd bonyolult folyamatok eredményeképpen
eloszlik az utódsejtek között. A mitózis során genetikailag azonos szomatikus utódsejtek
képződnek, a meiózis pedig haploid ivarsejteket eredményez. A sejtosztódás során a
mikroszkópban jól megfigyelhető, drámai változások zajlanak a sejtben (kromoszómák
kialakulása, egyes sejtalkotórészek eltűnése stb.). A sejtosztódás szempontjából lényeges
folyamatok azonban már az interfázisban is lejátszódnak.

Interfázis: felkészülés a sejtosztódásra

A sejtciklus nyugalmi szakaszában a sejtek saját életüket élik: életben tartásukhoz és jellegzetes
tulajdonságaik kialakításához szükséges anyagcsere-folyamatok zajlanak bennük. Az interfázikus
sejtekben azonban – hacsak nincsenek G0-fázisban – mindazoknak a jelenségeknek is le kell
játszódniuk, amelyek előkészítik a sejtet az osztódásra. Az interfázis folyamán a sejt tömege
növekszik, az S-fázisban pedig végbemegy a DNS megkettőződése. Az interfázis eseménye a
kromoszómák későbbi vándorlását lebonyolító mitotikus apparátus részét képező centriolumok
duplikációja is.
A mitotikus apparátus az interfázikus sejt mikrotubuláris rendszerének (l. 40. fejezet)
átrendeződésével jön létre. Ennek központja a sejtmag közelében elhelyezkedő mikrotubulus
organizáló centrum (MTOC) vagy centroszóma, amely a legtöbb állati sejtben egy pár
centriolumból és az azt körülvevő pericentrioláris állományból áll. A centriolumok henger alakú
képződmények, falukat 9 mikrotubulushármas alkotja. A centroszóma két centrioluma egymásra
merőlegesen helyezkedik el. A sejtciklus során a centriolumok jellemző változássorozaton
mennek keresztül (centriolumciklus, 19.1. ábra), melyek eredményeképpen kialakul és működik a
mitotikus apparátus. A centriolum-replikáció az interfázisban történik: a szülő centriolumokból
az utódok „bimbózással” képződnek. A megkettőződött centroszóma 4 centriolumot tartalmaz
egészen a sejtosztódás megindulásáig.

A mitózis szakaszai
Profázis
Mint ahogy erről az előző fejezetekben már szó volt, a mitózis eseményei az M-fázis promóciós
faktor (MPF) hatására indulnak meg. Az MPF aktivált Cdk-komponense számos fehérjét foszforilál.
A H1 hiszton és más magfehérjék (elsősorban a nem-hiszton fehérjék közé tartozó kondenzinek)
foszforilációjának következtében a kromatin kondenzálódik (l. 16.1. ábra), megszűnik a
transzkripció és kialakulnak belőle a kromoszómák; ezzel egyidőben eltűnik a nukleolusz. A lamin
fehérjék foszforilációja a hálózatos szerkezetű nukleáris lamina megbomlásához vezet, a képződő
lamindimerek egy része felszabadul, a lamin B viszont a vezikulákká töredező maghártyához kötve
marad. A póruskomplexumok alegységeikre disszociálnak. A mikrotubulusokhoz kapcsolódó
fehérjék foszforilációja a citoszkeleton átrendeződéséhez vezet: a centroszómák szétválnak és a
sejt két pólusához vándorolnak, megkezdődik közöttük az osztódási orsó kialakulása. A
maghártyával egyidőben az endoplazmatikus retikulum és a Golgi-apparátus is fragmentálódik.

88
 19.1. ábra: A mitózis szakaszai

Metafázis
Az interfázikus mikrotubuláris rendszer osztódási orsóvá rendeződése a metafázisban fejeződik
be (19.2. ábra). A mikrotubulusok polaritással rendelkező citoszkeleton elemek (l. 40. fejezet):
mínusz végük a centroszóma felé néz, gyorsan növő plusz végük pedig a mikrotubulus másik végét
alkotja. A mikrotubulusok nem állandó képződmények, végeiken polimerizáció és depolimerizáció
történhet: fontos jellemzőjük ez a dinamikus instabilitás. Az osztódási orsó négy mikrotubulus-
típust tartalmaz. A kinetochor mikrotubulusok a kromoszómák centromér régiójában a
kromatidokon felépülő, lemezes szerkezetű fehérjekorongokhoz, a kinetochorokhoz
kapcsolódnak. Magasabb rendű eukariota sejtekben a kinetochorokon nagyszámú mikrotubulus
plusz vége tapad. A két pólus felől kapcsolódó mikrotubulusok húzóereje a kromoszómákat a sejt
ekvatoriális síkjába tereli, kialakul a metafázikus lemez. A kromoszomális mikrotubulusok plusz
végeikkel a kromoszómák végeihez kapcsolódnak. Kromokinezin motorfehérjék segítségével a
kromoszómákat a sejt közepe felé „tuszkolják”, ugyancsak hozzájárulva a metafázikus lemez
kialakulásához. (Ezt a mechanizmust szemléletes hasonlattal „sarki szélnek” is szokták nevezni.)
A poláris mikrotubulusok ellentétes pólusokból érkezve plusz végeikkel az egyenlítői síkban
átfedésbe kerülnek és egymással létesítenek kapcsolatot. Az asztrális mikrotubulusok a
centroszómák körül sugárszerű szerkezetet alkotnak, plusz végükkel a sejtmembrán alatti
rétegekben végződnek.

89

19.2. ábra: Az interfázikus és mitotikus
mikrotubulus-rendszer felépítése
 19.3. ábra: Testvérkromatid kohézió és
szétválás
19.4. ábra: Az osztódási orsó megnyúlása az 
anafázis B. szakaszban
90
Anafázis
A kromoszómák testvérkromatidjai a DNS-
replikáció során képződött utód DNS-
molekulákat tartalmazzák fehérjékhez kötött
formában. Mivel a mitózis eredményeképpen
minden kromoszóma egyik kromatidjának az
egyik, a másiknak pedig a másik utódsejtbe
kell kerülnie, nagyon fontos, hogy a
testvérkromatidok a szétválásig együtt
maradjanak. A testvérkromatid kohéziót egy
multiprotein komplex, a kohezin-komplex
biztosítja, mely már a replikáció során
összeragasztja az utód DNS-molekulákat
(19.4. ábra), egészen az anafázis kezdetéig.
Ebben a szakaszban történik a kromatidok
szétválása és vándorlása a pólusok felé. Az
anafázisnak két szakaszát különböztetjük
meg.
Anafázis A. A metafázis és az anafázis határán
egy proteolítikus enzim, a szeparáz
aktiválódik, mely elhasítja a kromatidok
közötti kohezin-komplexeket (19.3. ábra). A
kromatidok a centromér régióban elválnak
egymástól és a kinetochor mikrotubulusok
rövidülése eredményeképpen a pólusok felé
vándorolnak. A folyamat fő, hajtóereje a
mikrotubulusok dinamikus instabilitása: a
kromatidvándorlást a kinetochor és
kromoszomális mikrotubulusok plusz
végének depolimerizációja okozza.
Anafázis B. A kromatidvándorlással
egyidőben a pólusok távolodnak egymástól, a
sejt megnyúlik. Ezt elsősorban a poláris
mikrotubulusok elongációja és egymás mellett
történő elcsúszása eredményezi. Az asztrális
mikrotubulusok ugyanakkor a sejthártya felé
húzzák a centroszómákat. A leírt folyamatok
ATP-igényesek: kinezin- és dineinszerű
motorproteinek (l. 40. fejezet) játszanak
szerepet bennük (19.4. ábra).
Telofázis
A sejtosztódás az MPF gyors degradációja után fejeződhet be (l. előző fejezet). A profázis elején az
MPF-hatásra foszforilálódott fehérjék a mitózis végén elveszítik foszfátcsoportjaikat. A
kromatinfehérjék defoszforilációja a kromoszómák dekondenzációját eredményezi, újra
megjelenik a kromatinállomány és a sejtmagvacska. A maghártya-vezikulák laminrétegük
segítségével megkötődnek a kromoszómák felszínén és fuzionálva kialakítják a maghártyát a
kromatinállomány körül. Újra képződik az endoplazmatikus retikulum és a Golgi-komplex is. A
sejtben két sejtmag jelenik meg, lezárva a kariokinézis folyamatát.
Citokinézis
A citoplazma kettéosztódása, a citokinézis is az MPF lebomlásának
a következménye. Az osztódás végéhez közeledő sejtben az
ekvatoriális síknak megfelelően a sejthártya alatt
mikrofilamentumokból álló kontraktilis gyűrű képződik, amely
összehúzódva mély befűződést hoz létre a két utódsejt határán
(19.5. ábra). A két sejt végül is elválik egymástól, ezzel a
sejtosztódás befejeződik.
 19.5. ábra: Citokinézis osztódó állati sejtben

A meiózis
A meiózis redukciós sejtosztódás, melynek során diploid (a DNS-megkettőződést követően
átmenetileg tetraploid) sejtekből haploid hím és női ivarsejtek jönnek létre. Ember esetében a 23
kromoszómapárt tartalmazó ősivarsejtekből 23 kromatiddal rendelkező gaméták képződnek.
A meiózis két egymást követő osztódási szakaszra oszlik (19.6. ábra). Az I. meiotikus osztódást
megelőző interfázisban a DNS megkettőződik: minden kromatid magával azonos
testvérkromatidot hoz létre. Az I. osztódás több alszakaszból álló profázisában a kromatin
kondenzációjával kialakulnak a kromoszómák, majd az egy párba tartozó, anyai és apai eredetű
homológ kromoszómák egymáshoz tapadnak. A kapcsolat a hasonló DNS-szekvenciák közötti
bázispárosodással történik. A homológ kromoszómák közötti intim kontaktus lánctörések, majd
homológ rekombináció eredményeképpen kromoszómarészletek (DNS-szakaszok)
kicserélődéséhez vezet (crossing over). Ennek mechanizmusát a 19.7. ábra mutatja be, erősen
leegyszerűsítve. A két DNS-régióban az egymáshoz hasonló láncokban lánctörés következik be, az
eltörött láncvégek helyet cserélnek és bázispárosodnak a másik DNS-molekula komplementer
láncával. DNS-ligáz egyesíti a láncvégeket. Keresztezett láncú intermedier keletkezik, melyből
újabb lánctöréssel és ligálással jönnek létre a rekombinálódott DNS-szakaszok.

19.6. ábra: A meiózis folyamata. (Az egyszerűség kedvéért az ábra csak egyetlen kromoszómapár
sorsát mutatja.)

91
 19.7. ábra: Homológ rekombináció. A
kiindulási, hasonló szekvenciájú DNS-
régiókban egyesláncú lánctörések
történnek (A.; nyílhegyek). A láncvégek
helyet cserélnek és a másik láncvéggel
egyesülnek. A lánckeresztezésben ismét
törések történnek (B.; nyílhegyek), az
újabb láncvégeket is DNS-ligáz egyesíti
(C).

A crossing overt követő I. metafázisban a kromoszómapárok a sejt ekvatoriális síkjában

rendeződnek, majd az I. anafázisban a közben kialakult osztódási orsó mikrotubulusainak
irányításával a homológ kromoszómák szétválnak és a sejt két pólusába vándorolnak. A
kromoszóma-szegregáció véletlenszerű, az egyes kromoszómapárok anyai és apai eredetű
tagjainak szétválása összesen 223 utódsejtkombinációt eredményezhet. (A megelőző crossing
over ezt a számot tovább növeli.) Az I. telofázisban két utódsejt alakul ki, mindkettő 23
kétkromatidos kromoszómát tartalmaz.
Az ezt követő rövid interfázisban nincs DNS-
replikáció, sőt a kromoszómák nem is
dekondenzálódnak teljesen. A II. meiotikus
osztódás metafázisában a 23 kromoszóma az
egyenlítői síkban rendeződik, az anafázisban a
kromatidok szeparálódnak, az osztódás tehát
mitózisra emlékeztetően fejeződik be. A
végeredmény: 4 haploid, 23 kromatidos sejt.
Gerincesek petefészkében az oociták meiózisa
az I. profázisban megakad, a sejtek hosszú
ideig (akár évtizedekig) ebben a fázisban
vannak. Kromoszómáik dekondenzáltak, az
aktív génexpresszió az oocita növekedését
idézi elő illetve lehetővé teszi olyan RNS-ek és
fehérjék felhalmozódását, melyek majd a korai
egyedfejlődéshez szükségesek. Hormon-
hatásra az oocita befejezi az I. meiotikus
osztódást (19.8. ábra), melyet aszimmetrikus
citokinézis jellemez, így egy kisméretű, ún.
sarki testet is eredményez. Az osztódás ezután
a II. metafázisban ismét leáll és csak a
megtermékenyítés után fejeződik be (l. 50.
fejezet).

19.8. ábra: A gerinces oociták meiózisa

92
 20. DNS-replikáció I.: A DNS-megkettőződés általános
jellemzői
A sejtben tárolt genetikai információ utódsejtekbe történő átvitelének előfeltétele a DNS
megkettőződése, replikációja. A replikációnak a teljes genomra ki kell terjednie, ellenkező
esetben a sejtosztódás az utódsejtekben génveszteséget okozna; hatékonynak kell lennie, hogy
nagyméretű genomok is viszonylag rövid idő alatt megkettőződhessenek; megbízhatónak kell
lennie, hogy az utódsejtekben az elviselhető mértéken felül ne jöjjenek létre mutációk. Ezeknek a
követelményeknek több tucat fehérjéből álló, bonyolult replikációs gépezet tesz eleget, amely az
evolúció során nagymértékben konzerválódott: a prokariota és eukariota replikációra – a
részletekben tapasztalható különbségek mellett – közös alapelvek, mechanizmusok jellemzők.

A replikáció vizsgálómódszerei
In vitro módszerek
A DNS-szintézis sejtmentes rendszerben történő vizsgálatát 1956-ban Kornberg dolgozta ki. A
Kornberg-rendszer az alábbi alkotórészeket tartalmazta:
• templát DNS-t (mintául szolgált a szintézis során);
• DNS-polimerázt (amelyet E. coli sejtekből izolált Kornberg);
• a 4 dezoxiribonukleozid-trifoszfátot (dATP, dGTP, dTTP, dCTP, ezek szubsztrátként
szolgáltak a szintézishez és az energiát is biztosították; az egyik nukleotid radioaktív
izotóppal jelölt volt [[a-32P]dCTP], hogy a szintézis terméke könnyen kimutatható legyen);
• Mg++ (a DNS-polimeráz aktivátora), optimális pH.
A reakcióelegyet megfelelő hőmérsékleten inkubálta, majd az újonnan képződött DNS-t
filterprecipitációval mutatta ki. Ennek lényege, hogy a makromolekulákká felépült nukleotidok
triklórecetsavval kicsaphatók és filterkorongon összegyűjthetők, míg a be nem épült nukleotidok
(savoldékony frakció) oldatban maradnak és a szűrőpapírról lemoshatók. A filter radioaktivitása
folyadékszcintillációs számlálóval meghatározható és arányos a rendszer replikációs aktivitásával.
A Kornberg-rendszerben képződött DNS bázisaránya megegyezik a rendszerhez adott DNS-ével,
ami arra utal, hogy a DNS komplementer bázispárosodással, valóban templátként irányította a
replikációt. Ebben a kísérletben ugyanakkor valójában nem replikáció, hanem repair-szintézis
(DNS-reparáció, l. 22. fejezet) folyt. A DNS-polimeráz a templát lánctöréseihez kapcsolódott, az
eltört láncot 5’ → 3’ irányban lebontotta, miközben a keletkező résbe a templáttal komplementer
új DNS-t szintetizált (20.1. ábra).

20.1. ábra: A DNS-szintézis mechanizmusa a Kornberg-rendszerben

A Kornberg-rendszer továbbfejlesztésével, a replikációhoz szükséges egyéb fehérjék
hozzáadásával olyan in vitro elegyeket hoztak létre, melyekkel nemcsak a prokariota, hanem az
eukariota DNS-szintézis is kitűnően modellezhető sejtmentes körülmények között. Ezekben a
bonyolult reakcióelegyekben valódi, az in vivo DNS-szintézishez hasonló replikáció történik.

93
A DNS-szintézis in vivo vizsgálata
Az in vivo módszerek lényege, hogy a sejtbe olyan prekurzort juttatnak, amely beépül az újonnan
képződött DNS-be és könnyen megkülönböztethető a természetes DNS-alkotóktól. A
sűrűségjelölés esetén a nehéz izotóppal (l. a Meselson–Stahl-kísérletet később ebben a fejezetben)
vagy a timidin-analóg brómdezoxiuridinnel (BrdU) jelölt DNS sűrűsége nagyobb mint a
természetes DNS-é, így izopiknikus grádiens centrifugálással egymástól elválaszthatók.
Radioaktív jelölésre általában [3H]timidint használnak. BrdU jelölés, majd anti-BrdU antitest
alkalmazásával az újonnan képződött DNS immunhisztokémiával, áramlási citometriával is
kimutatható.

A DNS-replikáció szemikonzervatív
A kettős hélix modell felállításakor Watson és Crick – akkor még kísérleti bizonyíték nélkül –
feltételezte, hogy a DNS megkettőződése úgy történik, hogy a két lánc szétcsavarodik és mindkettő
komplementer bázispárosodással irányítja új láncpárjának a szintézisét. A két utódmolekulában
tehát az egyik lánc az eredeti templátból származik, a másik pedig újonnan képződik. A
replikációnak ezt a szemikonzervatív mechanizmusát Meselson és Stahl igazolta kísérletesen
1958-ban (20.2. ábra).
E. coli sejteket hosszú ideig olyan táptalajon
tenyésztettek, melyben a nitrogénforrás 15N-
izotópot tartalmazó ammoniumklorid volt. A
sejtek DNS-e így csak nehéz N-izotópot
tartalmazott, amely nagyobb sűrűsége miatt
a 14N-tartalmú DNS-től céziumklorid grádiens
centrifugálással elkülöníthető (20.2. ábra). A
sejteket ezután 14NH4Cl-tartalmú médiumba
vitték át, majd generációs időnként mintát
vettek és meghatározták a DNS sűrűségét. Az
1. osztódás után átmeneti sűrűségű, a 2. után
pedig átmeneti és könnyű DNS képződött. Ha
az átmeneti sűrűségű DNS-t denaturáció
után centrifugálták, belőle könnyű és nehéz
DNS-láncok váltak szét. Mint ahogy ezt a
20.2. ábra bemutatja, a kísérlet egyértelműen
bizonyította, hogy az E. coli DNS-replikációja
szemikonzervatív. Elvileg hasonló kísérlettel
igazolták a szemikonzervatív mechanizmust
eukariota sejtekben is. Gyorsan osztódó
sejteket rövid ideig [3H]timidinnel jelöltek,
majd az 1. és 2. osztódás metafázikus sejtjeit
20.2. ábra: A Meselson-Stahl kísérlet autoradiografálták: az 1. osztódás
kromoszómáinak mindkét kromatidja jelölt
volt, míg a 2. osztódás után a grainek az egyik
kromatid felett halmozódtak.

A DNS-replikáció templát- és primerfüggő

Valamennyi ismert DNS-polimeráz fontos jellemzője, hogy katalitikus aktivitásához templát és
primer is szükséges (20.3. ábra). A templát komplementer bázispárosodással irányítja az új
nukleotidok beépítését. A primer a templátlánchoz kapcsolódó, azzal komplementer
nukleinsavszakasz, amelynek 3’-végén szabad OH-csoport van. Azért van rá szükség, mert a DNS-
polimerázok csupasz templátláncon nem képesek szintézist kezdeni: az első nukleotidot a primer
3’-OH csoportjához kapcsolják, miután a nukleozidtrifoszfát két szélső foszfátcsoportja

94
pirofoszfát alakjában lehasad. A vázolt mechanizmusból az is következik, hogy a láncnövekedés
mindig 5’ → 3’ irányban folyik (20.3. ábra). A DNS-szintézis abszolút primerfüggése adott
lehetőséget nagyjelentőségű molekuláris biológiai módszerek (DNS szekvenciameghatározás,
polimeráz láncreakció) kidolgozására (l. 9. és 10. fejezet).

20.3. ábra: A templát-primer komplex szerepe a DNS-szintézisben

A DNS replikációja kétirányú

In vivo a DNS-szintézis meghatározott helyeken, origókon kezdődik, majd a templát mentén
mindkét irányban azonos sebességgel halad. Ezt úgy igazolták, hogy S-fázisú sejteket rövid ideig
előbb nagy, majd kis aktivitású [3H]timidinnel jelöltek, DNS-t izoláltak, majd a DNS-rostokat
fénymikroszkópos autoradiográfiával vizsgálták (20.4. ábra). Az ilyen rost-autoradiogrammon a
vékony DNS-molekula nem látszik, de a beépült [3H]timidinből származó grainek igen. A
grainmentes origo mindkét oldalán erősen, majd azokon kívül gyengén jelölt régiók figyelhetők
meg; ez a kép megfelel a szintézis kétirányú jellegének: az origónak megfelelően a templátláncok
szétválnak és a szintézis során mindkét irányban növekvő replikációs buborék képződik.

20.4. ábra: A replikáció kétirányú jellegének bizonyítása rost-autoradiográfiával (Or = origo)

95
 A DNS-replikáció szemidiszkontinuus
A DNS-szerkezet és -replikáció eddig ismertetett jellemzőiből (antiparallelitás; mindkét láncnak
meg kell kettőződnie; a replikáció egy pontból mindkét irányban halad; a láncnövekedés csak 5’
→ 3’ irányú lehet) nehezen megválaszolható kérdés merül fel: hogyan replikálódhat az origo
„mögötti” terület, hogy a felsorolt kívánalmaknak maradéktalanul megfeleljen (ezt a régiót a
20.5.A ábrán kérdőjelek jelölik). A választ [3H]timidin jelöléses kísérletek adták meg. Ha E. coli
sejteket rövid ideig jelöltek, a sejtekből izolált DNS-ben a radioaktivitás egy része kisméretű DNS-
fragmentumokban volt kimutatható, amelyek azután idővel nagy molekulasúlyú DNS-sé
kapcsolódtak össze. Az ún. Okazaki-fragmentumok léte arra utalt, hogy a DNS egy része nem
folyamatosan, hanem szakaszokban, diszkontinuusan replikálódik. A replikációs buborékok két
replikációs villát tartalmaznak; a replikációs villákban az egyik templátláncon 5’ → 3’ irányban
folyamatosan szintetizálódik a vezető lánc; a másikon Okazaki-fragmentumok képződnek,
amelyek azután késlekedő lánccá kapcsolódnak össze (a folyamat részleteit a következő fejezetben
mutatjuk be). A DNS-szintézisnek ezt a pro- és eukariotákban is általános mechanizmusát
szemidiszkontinuus replikációnak nevezzük.

20.5. ábra: A replikációs szemidiszkontinuus jellege. A. a szimmetrikus replikáció problémája; B. a

vezető és késlekedő láncok szintézise

96
 21. DNS-replikáció II.: A DNS-szintézis mechanizmusa
A DNS-megkettőződés folyamata az evolúció során erősen konzerválódott, prokariotákban és
eukariotákban az alapvető mechanizmusok azonosak. Ez a fejezet részletesen a prokariota
replikáció eseményeit ismerteti, majd azokkal a jellemzőkkel foglalkozik, amelyek az eukariota
genom bonyolultabb szerveződéséből adódnak.

A replikáció mechanizmusa E. coli sejtekben

A DNS-megkettőződés bonyolult folyamat, amely egy több tucat fehérjét tartalmazó multienzim
komplexben, a repliszómában megy végbe. Az alábbiakban a replikációs gépezet legfontosabb
alkotórészeinek jellemzőivel és szerepével foglalkozunk.
Origo-felismerő komplex
A prokariota kromoszóma replikációja egyetlen ponton, az origón kezdődik. Erre a DNS-szakaszra
jellemző, hogy rövid ismétlődő szekvenciák alkotják. AT-gazdag régió lévén, könnyen
denaturálódik és specifikus fehérjék megkötésére képes. (Az eukarioták origói
szekvenciarokonságot nem mutatnak az E. coli origóval, a fenti tulajdonságok azonban minden
ismert replikációs kezdőrégióra jellemzőek.) Az origót iniciátor fehérjék ismerik fel és elősegítik
egy multimer prereplikációs fehérjekomplex felépülését.
Topoizomeráz I
A szintézis megindulásához a DNS két láncának el kell válnia egymástól ahhoz, hogy
templátfunkciójukat el tudják látni. Ez ellen hat a DNS szuperhelikális szerkezete, az abból adódó
feszülést oldani kell. Ez a topoizomerázok funkciója, amelyek reverzibilisen elmetszik a DNS-
lánco(ka)t (az 5’-végen levő foszfátcsoporttal egy tirozin oldalláncon keresztül kovalens kötést
létesítenek), a szuperhelix fellazul, majd a láncvégek között újraképződik a foszfodiészter-kötés.
A topoizomeráz I. csak az egyik láncot vágja el, főszerepet játszva a szuperhelix relaxációjában: a
replikációs villák előtt haladva folyamatosan megszünteti a replikációs buborék növekedése által
okozott feszülést. A topoizomeráz II. kettőslánc-specifikus endonukleáz és fő funkciója az
összegabalyodott utódmolekulák szétválasztása a replikációt követően (l. később).
Replikatív DNS-helikáz
Az iniciációs komplex kialakulása után az origónak megfelelően a két lánc elválik egymástól. Ezt
egy szétcsavaró fehérje, a helikáz katalizálja: a gyűrű alakú enzimkomplex ATP felhasználásával
feltépi a H-hidakat és a replikációs villákban mozogva egy-egy helikáz komplex mindkét irányban
tágítja a replikációs buborékot (21.1. ábra). A helikázok pro- és eukariota sejtekben is létfontos
enzimek: nem csak a replikációban, hanem a DNS-reparációban és a transzkripcióban is részt
vesznek.

97
 21.1. ábra: A prokariota replikáció mechanizmusa. A: A replikációs buborék kialakulása az ori-
régióban. B: Egy replikációs villa működése és alkotórészei

Ssb-fehérjék
A helikáz továbbhaladása során a szétválasztott láncok az enzim mögött komplementer
bázispárosodással ismét összekapcsolódnának, ez természetesen megakadályozná
replikációjukat. A replikációs villában a templátláncokhoz ssb (single-strand binding) proteinek
kötődnek: kimerevítik a láncokat és megakadályozzák renaturációjukat, egyben kialakítják a DNS-
szintézishez optimális templát konformációt.
Primáz
A leírt folyamatok a templátot alkalmassá teszik a tényleges szintézis elkezdésére. A DNS-
polimerázok közös tulajdonsága azonban, hogy nem képesek csupasz láncon megindítani a
szintézist. Primerként először rövid (néhány nukleotidból álló) RNS-láncok szintetizálódnak; a
folyamatot speciális RNS-polimeráz, a primáz katalizálja. Az első primert a vezető láncon
szintetizálja, majd a késlekedő láncon meghatározott szakaszonként képezi a primereket (21.1.
ábra). Az utóbbi funkcióját megkönnyíti, hogy a helikázzal (és más fehérjékkel) primoszóma
komplexet hoz létre, így a replikációs villa mozgása és a primerszintézis összehangoltan folyik.
DNS-polimeráz III
E. coliban a replikáció fő elongációs enzime a DNS-polimeráz III: ez szintetizálja a vezető és a
késlekedő láncot is. Szubsztrátjai dezoxiribonukleozid-trifoszfátok, az enzim pirofoszfát
lehasításával hozza létre a növekedő lánc foszfodiészter-kötéseit (l. 20. fejezet). A DNS-polimeráz
III nagyméretű komplex: a holoenzim mintegy 20 polipeptidláncból áll. A katalitikus helyeket
hordozó core enzim dimer szerkezetű: a replikációs villában mozogva egyik fele a vezető, másik
része a késlekedő láncot építi fel. (Az utóbbi templátlánca által alkotott hurok teszi lehetővé, hogy
– az antiparallelitás ellenére – az enzim képes legyen mindkét lánc egyidejű replikációjára; 21.2.
ábra.) A DNS-polimeráz III fontos jellemzője a processzivítás: többezer nukleotidnyi DNS-lánc
szintézisére képes anélkül, hogy az enzim közben leválna a templátláncról. A processzivitást

98
járulékos alegységek biztosítják: a γ-alegység a templát-primer régióhoz kötődik a vezető láncon,
elősegítve a β-alegység kapcsolódását. Ez a gyűrű alakú fehérje körülfogja a replikálódó vezető
láncot és tartósan a templáthoz rögzíti a core polimerázt. Az 5’ → 3’ elongációs aktivitás mellett a
DNS-polimeráz III 3’ → 5’ exonukleáz aktivitással is rendelkezik. Ennek jelentőségét az adja, hogy
az elongáció során viszonylag nagy gyakorisággal épülnek be nem komplementer nukleotidok a
növekedő DNS-láncba. Ilyenkor a szintézis leáll, az enzim 3’ → 5’ exonukleázként lehasítja a hibás
nukleotidot és folytatja a polimerizációt. Ezt a jelenséget proofreadinnek nevezzük (angol
kifejezés, a kefelenyomat kijavítását jelenti), nagymértékben csökkenti a mutációs rátát.
Proofreading exonukleázok nélkül nagyméretű genommal rendelkező élőlények ki sem
alakulhattak volna.

21.2. ábra: A DNS-polimeráz III működési modellje

DNS-polimeráz I
A késlekedő láncon a DNS-polimeráz III feladata addig tart, amíg el nem éri az előtte képződött
Okazaki-fragmentum 5’-végi primerszakaszát. Funkcióját ekkor a Kornberg által felfedezett DNS-
polimeráz I veszi át. (A DNS-polimeráz II a replikációban nem vesz részt, repair-enzim.) A DNS-
polimeráz I 5’ → 3’ exonukleáz aktivitásával lebontja a primert, 5’ → 3’ elongációs aktivitásával
pedig kitölti a képződött rést.
DNS-ligáz
Az Okazaki-fragmentumok közötti 3’ – 5’ foszfodiészter-kötést a DNS-ligáz hozza létre,
folyamatossá téve a késlekedő láncot is.
Topoizomeráz II
A replikáció terminációja eredményeképpen, láncszemekként egymásba kapcsolódó DNS-gyűrűk
keletkeznek. A replikálódott cirkuláris DNS-ek szétválasztását (dekatenáció) a topoizomeráz II
végzi (21.3. ábra). Ennek az enzimnek szerepe van a baktérium-kromoszóma replikációt követő
szuperspiralizációjában is.

99
 21.3. ábra: Cirkuláris DNS-ek szétválasztása

Az eukariota replikáció speciális jellemzői

Az alapvetően a prokariotákéhoz hasonló mechanizmus mellett az eukariota genom mérete,
lineáris DNS-molekulái és fehérjéhez kötött állapota különleges problémákat jelentenek a
replikációs gépezet számára.

Nagyméretű DNS-molekulák replikációja

Ha minden kromatid DNS-molekulája egyetlen origóról
kettőződne meg, egy emberi sejt DNS-ének replikációja
hónapokig tartana. Mivel az S-fázis időtartama 6–8 óra,
ez csak úgy lehetséges, hogy a replikáció számos origóról
indul, emberi sejtekben ezek száma több tízezer. Az egy
origóról megkettőződő DNS-régiót replikonnak
nevezzük. Az eukariota genom nagy mérete további
problémákat okoz: a replikálódott DNS-láncok – melyek
majd a testvér kromatidokat fogják alkotni – óhatatlanul
egymásba gabalyodnak. Szétválasztásukat már a
replikáció, illetve kromatinkondenzáció közben, végül
közvetlenül az anafázist megelőzően topoizomeráz II
enzimek végzik (21.4. ábra). Ha ezek működése nem
tökéletes, kromoszómatörés, vagy szét nem válás
(nondiszjunkció) következik be, melyek következményei
az utódsejtekre nézve katasztrofálisak lehetnek.

21.4. ábra:
A testvérkromatidok szétválasztása az anafázisban

Eukariota DNS-polimerázok
A prokariotákhoz hasonlóan eukariota sejtekben is többféle DNS-polimeráz mutatható ki. A
nukleáris genomot az ún. replikatív DNS-polimerázok (α, δ és ε) kettőzik meg: a DNS-polimeráz
δ szintetizálja a vezető láncot és az Okazaki-fragmentumok nagy részét; a DNS-polimeráz α
primázzal komplexet képezve megkezdi a késlekedő lánc darabjainak felépítését; az ε-enzim az
Okazaki-fragmentumok szintézisét fejezi be. Az eukariota DNS-polimerázokhoz számos egyéb
járulékos fehérje is kapcsolódik. Ezek közül feltétlenül megemlítendő a PCNA fehérje (proliferating
cell nuclear antigen). Ugyanolyan szerepe van a DNS-polimeráz δ működésében, mint a bakteriális
DNS polimeráz III β-alegységének: rögzíti az enzimet a vezető templátláncon. Anti-PCNA
autoantitestek is okozhatják a systemás lupus erythematosus nevű autoimmun betegséget, mellyel
később még foglalkozunk (l. 26. fejezet). A replikatív DNS-polimerázok a károsodott DNS-t nem
képesek megkettőzni: a sérülés helyén megállnak. Léteznek specializált DNS-polimerázok,
melyek képesek a károsodott DNS-szakasz megkettőzésére (transzléziós DNS-szintézis).
Segítségükkel a sejt életben marad és osztódhat is, de mutációk halmozódhatnak fel benne. A DNS-
polimeráz β reparációs enzim, a DNS-polimeráz γ pedig a mitokondriális genomot replikálja. Az
eukariota DNS-polimerázok 5’ → 3’ exonukleáz aktivitással nem rendelkeznek, így a primerek
lebontását járulékos enzimek végzik.

100
Replikáció a kromatinállományban
Az eukariota replikációt bonyolítja (és lassítja), hogy nem csupasz, hanem fehérjéket kötő DNS-
en, a kromatinban történik. A frissen replikálódott DNS-hez azonnal hisztonok kapcsolódnak
(ezek az S-fázisban szintetizálódnak), kialakítva a nukleoszomális szerkezetet. A kromatin
állapota befolyásolja a replikáció idejét: az eukromatin az S-fázisban korán, a heterokromatin
pedig később kettőződik meg. Az eukariota replikáció a kromatinban nem diffúz módon folyik,
hanem meghatározott régiókban, ún. replikációs üzemekben. Ezek egy replikációs buborékot és
a benne dolgozó két repliszómát tartalmaznak. A fehérjekomplexek a magszkeletonhoz
rögzülnek: valójában a templát-DNS mozog, nem a repliszómák.
Telomérreplikáció
A DNS-megkettőződés szemidiszkontinuus jellegéből következik, hogy a lineáris DNS-molekulák
végein a késlekedő láncok utolsó primere „mögötti” szakasz a hagyományos módon nem
replikálható (21.5. ábra). A kromoszómák telomérjeit tandem ismétlődésű, néhány nukleotidból
álló szakaszok alkotják (l. 16. fejezet). A telomérrövidülést egy speciális enzim, a telomeráz
gátolhatja meg: ez telomérismétlődéseket ad a kromoszómavégekhez. A telomeráz
ribonukleoprotein: fehérje része celluláris reverz transzkriptáz, amely az enzim RNS-komponensét
használva templátként ismétlődéseket szintetizál a késlekedő templátlánc végére, majd a másik
láncot hagyományos módon primáz/ DNS-polimeráz a komplexek hozzák létre (21.6. ábra). Az
ivarsejteket produkáló csírasejtvonalakban magas a telomerázaktivitás; ez biztosítja a
kromoszómák épségét és azt, hogy az utódokba intakt genom kerülhessen. Az egyedfejlődés során
a legtöbb szomatikus sejt azonban elveszíti telomerázaktivitását: kromoszómáik telomérje
osztódásról osztódásra rövidül, majd gének is elvesznek. Ez a jelenség fontos szerepet játszik a
sejtek fiziológiás öregedésében és pusztulásában. A telomeráz gének mutációja áll a
koraiöregedéssel járó kórképek bizonyos típusainak hátterében. A dyskeratosis congenita
öröklődő betegség, melynek egyes formáit a telomeráz-RNS csökkent expressziója okozza. A
kórkép fő tünetei: bőrelváltozások (pigmentáció, korai őszülés), a csontvelő működészavarai
(anaemia, thrombocytopenia), korai öregedés és halál. Kimutatták, hogy a rosszindulatú
daganatok legtöbbjében a telomeráz reaktiválódik: ezek a sejtek, bár gyorsabban osztódnak, nem
veszítik el, hanem stabilizálják telomérjeiket, halhatatlanná válnak (immortalizáció). Érthető
módon komoly erőfeszítések folynak telomerázgátló anyagok mint daganatellenes gyógyszerek
kifejlesztésére.

21.5. ábra: A vég-replikáció problémája 21.6. ábra: A telomeráz-reakció mechanizmusa

101
 22. A DNS lánchibáinak kijavítása
Az örökítő anyaggal szemben támasztott fontos követelmény az állandóság; a DNS
nukleotidszekvenciájának hiteles megkettőzése és megőrzése két replikáció között biztosítja az
utódsejtek genetikai azonosságát, illetve az öröklődő tulajdonságok átadását az
utódszervezeteknek. A DNS-reparáció zavarai következtében az örökítőanyagban létrejövő
változások, mutációk öröklődő betegségek, rosszindulatú daganatok kialakulásához vezethetnek,
problémákat okozhatnak az embrionális fejlődésben és a szövetek működésében, illetve
hozzájárulnak az öregedés folyamatához.

DNS-károsodás
Mutációt sokféle hatás okozhat. A replikáció hibája esetén a szintetizálódó DNS-láncba nem
komplementer bázisok épülnek be. Ezek egy része a proofreading mechanizmust (l. 21. fejezet) is
kikerüli. Spontán kémiai folyamatok is okozhatnak DNS-károsodást. Bázisok dezaminációval
aminocsoportot veszíthetnek, abnormális bázissá alakulva át (pl. citozin átalakulása uracillá).
Hőhatásra depurináció történhet: a purinbázisok leszakadnak a dezoxiribózról és ún. AP (apurin)-
helyet hoznak létre a DNS-ben. (A depurináció nagyon általános jelenség: egy emberi sejt genomja
kb. 10 000 purinbázisát veszíti el naponta!) A kémiai mutagének közül egyesek bázismetilációt
okoznak (alkiláló ágensek), mások kovalens kötéssel a DNS-hez kapcsolódnak (pl.
benzpirénszármazékok) vagy kémiai keresztkötést hoznak létre a komplementer láncok között.
Reakcióképes oxigén szabad gyökök (l. 36. fejezet) a bázisok oxidált származékait hozhatják létre.
Erős mutagén hatása van az ultraibolya sugárzásnak: a DNS-láncok szomszédos pirimidin bázisai
között kovalens kötéssel dimereket hoz létre, ezek a replikációt és a transzkripciót is gátolják. Az
ionizáló sugárzások lánctöréseket és ezáltal kromoszóma-rendellenességeket idézhetnek elő.
Kijavítatlanul ezeknek a DNS-károsodásoknak a felhalmozódása nem csak az átörökítés
folyamatát befolyásolja, de a sejt életét is veszélyeztetheti, hiszen az abnormális kémiai
módosulások gátolhatják a DNS templátfunkcióját. A DNS-károsodás kiküszöbölésére a sejtekben
DNS-reparációs rendszerek alakultak ki, amelyek hatékonyságára jellemző: egy emberi sejt több
milliárd bázispárnyi genomjában sejtciklusonként átlagosan csak 3 pontmutáció marad meg. A
DNS-repair jelenségét fél évszázada ismerjük, molekuláris mechanizmusainak tisztázásában
azonban csak az 1990-es évek hoztak jelentős haladást.

DNS-károsodások direkt kiküszöbölése

Elvileg ez a repair legegyszerűbb lehetősége: megfordítani a károsodáshoz vezető reakciót és
helyreállítani a DNS eredeti állapotát. A DNS-reparáció közvetlen formája azonban ritkán fordul
elő. Baktériumokban például fotoliáz enzimek hasítják el az UV-hatásra képződött timin-
dimereket. Emberi sejtekből ezek az enzimek hiányoznak, a károsodás kijavítására bonyolultabb
mechanizmus alakult ki.

Excíziós repair
A DNS-károsodások kiküszöbölésének legáltalánosabb mechanizmusa során bonyolult
fehérjekomplexek felismerik és kimetszik a sérült régiót és új DNS-szakaszt szintetizálnak
helyette. Az excíziós repairnek három fő típusát különböztetjük meg.
Bázisexcíziós repair
A folyamat célja a dezaminálással, alkilálással, oxidatív úton károsított bázisok eltávolítása és
pótlása. Az abnormális bázist DNS-glikoziláz enzim ismeri fel és hasítja le a dezoxiribózról (22.1.
ábra). Az AP-hely (apurin, ill. apirimidin hely) mellett AP-endonukleáz bemetszést végez, majd a
dezoxiribóz is lehasad. A hiányzó nukleotidot a DNS-polimeráz b pótolja, majd DNS-ligáz egyesíti

102

22.1. ábra: A bázis-excíziós repair
mechanizmusa
22.2. ábra: A nukleotid-excíziós repair
mechanizmusa
103
a láncvégeket. Jellemző ennek a reparációs
mechanizmusnak a fontosságára, hogy a
bázisexcíciós repairre defektív K.O. egerek még
a méhen belül elpusztulnak.
Nukleotid-excíziós repair
Ha a károsodás több nukleotidot érint (pl.
pirimidin-dimer képződés) vagy a DNS-régió
térszerkezetét komolyan deformálja (pl.
nagyméretű nukleotid-adduktumok
képződése), a repair folyamat is kiterjedtebb
szakaszon történik. A nukleotid-excíziós
repair általánosan alkalmazott, evolúciósan
konzervált mechanizmus az élővilágban. A
folyamatban több, különböző biokémiai
aktivitással rendelkező fehérje vesz részt (22.2.
ábra), ezek egy multiprotein komplexet
(repairszóma) alkotva hajtják végre a hiba
kijavítását. Első lépésként specifikus DNS-kötő
fehérjék felismerik a károsodás által okozott
DNS-konformációváltozást. Ezt követi a léziót
tartalmazó DNS-lánc bemetszése (incízió):
endonukleázok (melyeket excinukleázoknak
nevezünk) a károsodás két oldalán, attól
meghatározott távolságban elhasítják a
kijavítandó láncot, majd a kimetszett
oligonukleotidot helikáz enzimek leválasztják
(excízió). Az így kialakuló rést DNS-polimeráz
tölti ki a 3’-végi csonkot használva primerként,
majd a láncvégeket ligáz egyesíti (repair-
szintézis).
Az emberi sejtek nukleotid-excíziós repair
mechanizmusára vonatkozó ismereteink döntő
részben öröklődő repair-defektusokban
szenvedő betegek sejtjeinek vizsgálatából
származnak. Ezek közül a legismertebb a
xeroderma pigmentosum. Ezt a ritka,
autoszomális recesszív öröklődésű betegséget
a bőr szárazsága, fényérzékenysége jellemzi,
valamint a bőrrák kialakulása kockázatának
óriási mértékű (többezerszeres!)
megnövekedése. A betegségre az UV-
besugárzás által okozott timin-dimerek
kijavításának örökletes zavara jellemző. Ez
egyszerű kísérlettel kimutatható: ha
xeroderma pigmentosumban szenvedő
betegek sejtjeit UV-besugárzásnak teszik ki,
majd [3H]timidin jelölést végeznek, a
radioaktivitás nem épül be a genomba, jelezve,
hogy az excíziós repair nem működik.
Különböző betegekből származó sejtek fúziója gyakran eredményez normális repair aktivitású
hibrid sejteket: ez arra utal, hogy a xeroderma pigmentosum fenotípusát különböző gének
mutációja idézheti elő. Eddig 7 gént azonosítottak (XPA-XPG), egyesek timin-dimer kötő
fehérjéket, mások helikázokat vagy excinukleázokat kódolnak.
Az UV-fény okozta DNS-károsodás vizsgálata érdekes és nem várt megfigyelésekhez vezetett: az
aktívan átíródó génekben okozott károsodás kijavítása gyorsabban történik, mint a
transzkripcionálisan inaktív DNS-régióké. A transzkripció és repair összekapcsolódásának
elsősorban az embrionális fejlődés és differenciáció során van jelentősége. Ismertek olyan
öröklődő betegségek, amelyekben az excíziós repair zavara fejlődési zavarokat, szomatikus és
mentális retardációt idéznek elő. A jelenség molekuláris alapja, hogy egyes XP-fehérjék egyben
egy, az RNS-polimeráz II (l. 23. fejezet) működéséhez szükséges transzkripciós faktor
komponensei is. Mivel a fejlődő szöveteket fokozott génaktivitás jellemzi, a transzkripcióhoz
kapcsolt repair elégtelensége érthető módon fejlődési rendellenességekhez vezet.
Hibás bázispárok korrekciója (mismatch repair)
A DNS-polimerázok proofreading aktivitása nem tudja megakadályozni, hogy a replikálódott DNS-
be bizonyos gyakorisággal hibás, nem komplementer nukleotidok épüljenek be. A mikroszatellita
régiókban (l. 15. fejezet) pedig előfordul, hogy néhány nukleotidból álló, a másik DNS-lánccal nem
kapcsolódó kis hurkok képződnek. Ha ezeknek a látszólag kis hibáknak a kijavítása nem történik
meg, a következő replikációs ciklusban elkerülhetetlen, hogy pontmutáció, illetve mikroszatellit
expanzió jöjjön létre. A mismatch (angol szó, hibás bázispárosodást jelent) jellegű DNS-hibák
korrekciójára evolúciósan erősen konzervált repair mechanizmus alakult ki (22.3. ábra). A hibás
nukleotid(ok) felismeréséhez a repair apparátusnak először azt kell eldöntenie, hogy a két lánc
közül melyik szekvenciája helyes. E. coliban (22.3.A. ábra) erre az ad lehetőséget, hogy a
replikációt követően a DNS átmenetileg félig metilált: a templátlánchoz metilcsoportok
kapcsolódnak, az újonnan képződött, így a hibás bázist tartalmazó szálhoz viszont nem. A hibás
bázispárt specifikus fehérjék ismerik fel, majd a metilálatlan láncban egy endonukleáz bemetszést
hajt végre. Helikáz és exonukleáz eltávolítja a hibás nukleotidot is tartalmazó szakaszt, majd DNS-
polimeráz és ligáz befoltozza a rést.
Eukariota sejtekből hiányzik az a fehérje, mely a metilálatlan DNS-láncot felismeri. A mismatch
repair az újonnan szintetizálódó DNS-láncokon megy végbe, melyeket a templátláncoktól az
különböztet meg, hogy szabad láncvégeket tartalmaznak (22.3.B. ábra; a vezető láncon ez a 3’-vég,
a késlekedő láncon pedig az Okazaki-fragmentumok végei). A bemetszés a nem komplementer
módon beépült nukleotidnál történik, a közte és a lánc-vég közötti szakasz eltávolítása és pótlása
pedig már ugyanígy zajlik, mint baktériumokban.
A mismatch repair kutatás területén jelentős áttörés következett be 1994-ben: emberi sejtekben
több olyan fehérjét fedeztek fel, amelyek szerepet játszanak a folyamatban. A vastagbéldaganatok
egyik gyakori, örökletes formájában, a herediter nonpolyposis colon carcinomában (HNPCC)
igen gyakori ezen gének valamelyikének inaktiváló, funkcióvesztőmutációja. A működőképes
géntermék elvesztése ún. mutátor fenotípust alakít ki: az érintett sejtekben felszaporodnak a
pontmutációk, mikroszatellit instabilitás jelenik meg, megnő annak a veszélye, hogy
daganatképződést indukáló onkogének aktiválódnak (l. 54. fejezet) vagy a sejtszaporodást
kordában tartó tumor szuppresszor gének (l. 55. fejezet) inaktiválódnak. Mivel a
vastagbéldaganatra hajlamosító defektusok öröklődnek, nagyon fontos a mutációt hordozó
egyének felderítése a molekuláris diagnosztika módszereivel és rendszeres kontrollvizsgálatuk a
daganat korai stádiumban történő kimutatására és gyógyítására.

104
 22.3. ábra: A mismatch repair mechanizmusa (A. E. coliban; B. eukariota sejtekben)

Kettős láncú DNS-törések kijavítása

Endogén szabadgyökök, a sejtet ért ionizáló sugárzás a DNS mindkét láncának eltörését okozhatja.
A kettős láncú DNS-törések súlyos köveztkezménnyel járhatnak: a kromoszómák kisebb
darabokra fragmentálódhatnak, a törvégek nukleázemésztése deléciót, más kromoszómákhoz
kapcsolódása transzlokációt eredményezhet. A szomatikus sejteket ezek a mutációk
daganatsejtekké alakíthatják át, a csírasejtek mutációja viszont az utódokban kromoszóma-
rendellenességet válthat ki (l. később).
A kettős láncú DNS-törések reparációjához számos fehérje közreműködése szükséges, a láncvégek
egyesítését multiprotein komplexek végzik. Az egyik lehetséges mechanizmus a láncvégek direkt
egyesítése (nem-homológ láncvégegyesítés; 22.4.A. ábra). Mivel a ligálásig a szabad láncvégek
exonukleáz hatásnak lehetnek kitéve, ez a repair mechanizmus általában kisebb-nagyobb deléciót
eredményez a DNS-törés helyén. Sokkal bonyolultabb a kettősláncú DNS-törések homológ
rekombinációval történő kijavítása (22.4.B. ábra), eredményeképpen azonban az eredeti helyzet
áll helyre. A láncvégekről 5’ → 3’ exonukleáz néhány nukleotidot eltávolít, majd a sérült láncok a
testvérkromatid ép komplementer láncaival bázispárosodnak. A réseket DNS-polimeráz tölti ki, a
láncvégeket DNS-ligáz egyesíti. A javítás a lánckeresztezés feloldásával ér véget.

105
22.4. ábra: Kettősláncú DNS-törések kijavítása. A. Nem-homológ láncvégegyesítés. B. Repair
homológ rekombináció által

106
 23. Transzkripció I.: Az RNS-szintézis és -érés általános
jellemzői
A molekuláris biológia centrális dogmája szerint a DNS-ben tárolt genetikai információ
kifejezése RNS-ek, majd fehérjék szintézise útján történik (l. 11.1. ábra). Az információ átvitele
DNS-ről RNS-re két lépésben zajlik: a DNS-templáton végrehajtott RNS-szintézis során a DNS
bázissorrendjében rögzített információ specifikus RNS-szekvenciákba íródik át (transzkripció),
majd ezekből a primer transzkriptumokból kémiai átalakulásokból álló érési folyamatok (gyakran
használt angol kifejezéssel: processing) során jönnek létre a működőképes, érett RNS-ek.

A transzkripció vizsgálómódszerei
Az RNS-szintézis in vitro vizsgálata
A transzkripció tanulmányozására az első egyszerű sejtmentes módszert az 50-es években
dolgozták ki. Elve megegyezik a Kornberg-rendszerével (l. 20. fejezet). Kémcsőben templát DNS-
t, a 4 ribonukleozid-trifoszfátot (ATP, CTP, UTP, GTP; egyikük radioaktívan jelölt) és RNS-polimeráz
enzimet tartalmazó kivonatot kevertek össze, megfelelő körülmények között (pH, ionok,
hőmérséklet) inkubálták, majd a reakció végén filterprecipitációval határozták meg az RNS-be
épült radioaktivitást. Ebben az egyszerű rendszerben ugyan nem folyt az in vivohoz hasonló,
hiteles transzkripció (a szintézis a templáton nem specifikus kezdőhelyeken, hanem
véletlenszerűen kezdődött), ám az in vitro rendszerek lehetővé tették az RNS-polimerázok
tisztítását és jellemzését. A ma használatos transzkripciós rendszerekben, járulékos fehérje
faktorok hozzáadásával, nagymértékben specifikus RNS-szintézis érhető el.
Az RNS-szintézis in vivo vizsgálata
Radioaktív prekurzorokkal (pl. [3H]uridin) végzett jelölés, majd a radioaktivitás nyomon követése
autoradiográfiával, vagy izolált RNS-ek analízisével, elterjedt módszere a transzkripció és RNS-
metabolizmus vizsgálatának. Nem izotópos jelölés is alkalmazható: bromouridinnal (BrU) jelölt
RNS-molekulák anti-BrU antitesttel, immuncitokémiai módszerekkel detektálhatók. Látványos
módszerek a génműködés vizualizálására kidolgozott eljárások: sejtből izolált transzkripciós
komplexeket vizsgálnak elektronmikroszkópban (l. 24. fejezet).

Transzkripció és RNS-érés prokariotákban

A prokariota RNS-szintézis általános jellemzői
Az RNS-szintézis (mint eukariotákban is) transzkripciós egységekről történik: ezeket egyik
végükön promóter (a szintézis kezdőhelye), a másikon terminátor (a befejezés helye) határolja, a
köztük levő DNS-szakasz teljes egészében átíródva adja a primer transzkriptumot.
(Prokariotákban a transzkripciós egységeket operonoknak nevezzük, ezek felépítésével,
szabályozásával később foglalkozunk [l. 30. fejezet].) A transzkripció aszimmetrikus jellegét az
biztosítja, hogy lánckezdés csak a promóteren van, a szintézis pedig csak 5’ → 3’ irányban folyhat,
így az egységen belül csak az egyik lánc szolgálhat templátként. A prokariota RNS-szintézis fontos,
az eukariotáétól megkülönböztető jellemzője, hogy a fehérjeszintézissel kapcsoltan folyik: a
növekedő mRNS-hez riboszómák kapcsolódnak és a transzláció már az mRNS-lánc terminációja
előtt megkezdődik. A kromoszóma-poliszóma komplex (23.1. ábra) kialakulását több tényező
teszi lehetővé: a transzkripció és transzláció iránya az mRNS szempontjából nézve azonos (5’ →
3’); prokariotákban nincs mRNS-érés, a primer transzkriptum már funkcióképes RNS; nincs
maghártya, amely térben és időben elválasztaná a transzkripciót és a transzlációt.

107
23.1. ábra: Kapcsolt transzkripció-transzláció prokariotákban: a kromoszóma-poliszóma komplex

A prokariota RNS-szintézis mechanizmusa

Prokariotákban valamennyi gén átírását ugyanaz az RNS-polimeráz végzi. Az RNS-polimeráz
holoenzimek két, funkcionálisan eltérő alkotórészből épülnek fel: a σ-faktor biztosítja az enzim
specifikus kötődését az átírandó gén promóteréhez, a core polimeráz pedig (alegységszerkezete:
α2ββ’ω) a foszfodiészter-kötések kialakulását katalizálja a szintézis során. Az enzim aktív
centruma a β-alegységeken helyezkedik el.
A gén transzkripciója három fő lépésben történik (23.2. ábra). Az iniciáció során az RNS-polimeráz
holoenzim specifikus szekvenciákat ismer fel a promóter-régióban (23.3. ábra): a kötődés először
a szintézis kezdőpontjától (+1-gyel jelöljük) kb. 35 bázispárnyira „felfelé” elhelyezkedő
hexanukleotid-régióban történik (ún. -35 szekvencia), itt zárt iniciációs komplex jön létre. A
holoenzim ezután közelebb csúszik a kezdőponthoz és újabb stabil kötést hoz létre egy AT-gazdag
régióban (-10 szekvencia vagy Pribnow-box). A DNS két lánca itt könnyen szétválik, nyitott
iniciációs komplex jön létre és megtörténhet az első nukleotidok beépítése. A -35 és a -10 régió
felismerése a σ-faktor feladata. A szintézis megkezdése után a faktor leválik a holoenzimről, az
elongációt már a core polimeráz végzi. E.coli sejtek egyféle core enzimet tartalmaznak, a σ-
faktornak azonban különböző variánsai léteznek, amelyek eltérő promóter-típusokat ismernek
fel.

23.2. ábra: A prokariota transzkripció fő lépései

108
 23.3. ábra: A prokariota promóter és a hozzá kapcsolódó RNS-polimeráz szerkezete
A láncnövekedés (elongáció) során komplementer ribonukleozid-trifoszfátok kötődnek a
templátlánchoz, róluk pirofoszfát hasad le és foszfodiészter-kötéssel kapcsolódnak a növekedő
RNS-lánc 3’-végéhez. A leírt mechanizmusból következik, hogy a legelső nukleotid nem veszíti el
a foszfátjait, az RNS-lánc 5’-végét ezért trifoszfátvégnek nevezik. Az elongáció során a DNS 10-12
nukleotidnyi szakasza denaturált állapotban van, ez a kis „buborék” fut végig a transzkripciós
egységen. A növekedő lánc 3’-végén kb. 10 nukleotidnyi szakasz bázispárosodással kötődik a
templát szálhoz.
A szintézis akkor fejeződik be, amikor az RNS-polimeráz eléri a terminátort. E. coli sejtek kétféle
mechanizmussal rendelkeznek a terminációra. ρ-függő termináció során egy fehérjefaktor (ρ-
faktor) kötődik az RNS-polimerázhoz, felismeri a terminátor régió bázossorrendjét és DNS-RNS
helikázként hatva leválasztja a transzkriptumot a templátról. A ρ-független terminátorokban egy
GC-gazdag hajtűszerű hurok kialakulása az RNS-lánc 3’-végén szinte letépi a transzkriptumot a
templátláncról. A terminációt elősegíti, hogy a transzkriptum U-nukleotidok sorozatával
végződik, így az RNS-lánc vége viszonylag gyenge kötést létesít a templáttal. A termináció során
felszabaduló core enzim ismét σ-faktort kötve új transzkripciós ciklust kezdhet.
RNS-érés prokariotákban
Prokariotákban a stabil RNS-ekre (rRNS-ek, tRNS-ek) jellemző az érés, mRNS-eknél ritkán fordul
elő. A primer transzkriptumok érésük során többféle kémiai módosuláson esnek át:
hasításukban endonukleáz és exonukleáz enzimek egyaránt részt vesznek, a nagyméretű
prekurzor-RNS-ekből alakítják ki a kisebb termékeket; a nukleotid-addíció az RNS-molekula végén
történik, templáttól függetlenül (pl. a 3’-végi CCA-szekvencia szintézise tRNS-eknél); a nukleozid-
modifikáció legáltalánosabb típusa a metiláció.

Az eukariota transzkripció általános jellemzői

Eukariota sejtekben a transzkripció templátja nem csupasz DNS, hanem kromatinfonal: a
nukleoszomális szerkezet általában az átírt géneknél is megfigyelhető. A nukleoszómákon
keresztül végrehajtott transzkripció pontos mechanizmusa ismeretlen, nyilvánvaló azonban, hogy
a hiszton-DNS kapcsolatnak legalább az RNS-polimeráz továbbhaladásának idejére fel kell
lazulnia.
Szemben a baktériumokkal, melyekben valamennyi RNS-fajta szintézisét ugyanaz az RNS-
polimeráz típus végzi, eukariota sejtmagokban három fő RNS-polimerázt különböztetünk meg:
ezek különböző géneket írnak át, ennek megfelelő sejtmagon belüli lokalizációjuk, biokémiai
megkülönböztetésükre pedig a gyilkos galóca mérgével, az α-amanitinnal szemben eltérő
érzékenységük szolgál (23.1. táblázat). Mindhárom RNS-polimerázra jellemző, hogy nagyméretű,
10–15 alegységből álló fehérjekomplexek. Eltérően a prokariota RNS-polimeráztól,

109
promóterükhöz nem kapcsolódnak közvetlenül: a promóter-régióhoz kötődő specifikus
transzkripciós faktorokat ismernek fel, ezek segítségével történik meg az iniciáció.
Az RNS-polimeráz I és II működésével a következő fejezetekben részletesen foglalkozunk. Az RNS-
polimeráz III a kisméretű RNS-ek nagy részét szintetizálja. Az 5S rRNS és a tRNS gének szokatlan
tulajdonsága, hogy az RNS-polimeráz promóterhez kapcsolódásához szükséges transzkripciós
faktorok a +1 helytől disztálisan, a génen belül kötődnek a templáthoz. Ezek a gének tehát intragén
promóterrel rendelkeznek.

RNS-polimeráz
I II III
pre-mRNS-ek egyes 5S rRNS tRNS-ek egyes
termékek pre-rRNS
snRNS-ek snRNS-ek

lokalizáció nukleolusz extranukleoláris kromatin

α-amanitin
nincs nagyfokú gyenge
érzékenység

23.1. táblázat: Az eukariota RNS-polimerázok jellemzői

Sejtmaggal rendelkező sejtekben az RNS-ek a kromatinban szintetizálódnak, működésüket, a
fehérjék szintézisét viszont a citoplazmában látják el: a transzkripció és transzláció tehát időben és
térben elkülönítve zajlik. Ez a mechanizmus a fehérjeszintézis RNS- és RNP-komponenseinek
hatékony nukleocitoplazmatikus transzportját feltételezi. Szemben a prokariota mRNS-ekkel, az
eukariota pre-mRNS-ek rendkívül bonyolult érési folyamatok eredményeképpen válnak
működőképessé. Az eukariota RNS-szintézis és -érés részleteivel a következő fejezetek
foglalkoznak.

110
24. Transzkripció II.: Riboszóma-biogenezis eukariotákban
A sejt fehérjéinek szintézise a citoplazma riboszómáinak felszínén történik. Aktív anyagcserét
folytató eukariota sejtek több millió riboszómát is tartalmazhatnak, és számuk az interfázis alatt
meg kell, hogy kétszereződjön, hogy az osztódás során képződő utódsejtek is rendelkezzenek a
normális működésüket biztosító transzlációs kapacitással. A riboszómák folyamatos
termelésének ezt a hatalmas feladatát a sejt legnagyobb RNS-tartalmú alkotórésze, a
sejtmagvacska (nukleolusz) látja el.

A nukleolusz
A sejtmagvacska az rRNS-szintézis, -érés és a riboszómák összeszerelésének organelluma, a
sejtmag erősen elektronszóró, jellegzetes szerkezetű, membránnal nem határolt alkotórésze. A
legtöbb sejt egy nukleoluszt tartalmaz, de számuk nagyobb is lehet. (Extrém példaként a kétéltűek
oocitája említhető. Bennük az rRNS-gének nagyfokú amplifikációja következik be: ezek a sejtek
több százezer rRNS-gént tartalmazhatnak, melyek több ezer nukleolusz formájában jelennek
meg.)
A nukleoluszt eltérő megjelenésű régiók alkotják (24.1. ábra). A hagyományos transzmissziós
elektronmikroszkópos felvételen a legvilágosabb régiók felelnek meg a fibrilláris centrumoknak.
Ezeket a sejtmagvacskát körülvevő perinukleoláris kromatinból benyúló, az rRNS-géneket
tartalmazó kromatinhurkok alkotják. A nukleoláris organizátor régióknak is nevezett
képződmények széli részein szintetizált pre-rRNS molekulák fehérjékkel kapcsolódva alkotják az
erősen elektronszóró fibrilláris állományt. A nukleoluszban lejátszódó érési folyamatok során
preriboszómális partikulumok képződnek, ezek alkotják a granuláris állományt.

Emberi sejtekben a nukleolusz mintegy

200 rRNS-gént tartalmaz, ezek a tíz
akrocentrikus kromoszóma rövid
karjához kapcsolódó kromoszóma-
függelékeken alkotnak tandem
elhelyezkedésű génsorozatokat. A
sejtosztódást követően a nukleolusz
ebből a tíz nukleoláris organizátor
központból alakul újjá.
24.1. ábra: A nukleolusz elektron
mikroszkópos szerkezete

Riboszóma-biogenezis a nukleoluszban
Az rRNS-szintézis vizualizálása
Az eukariota génműködés elektronmikroszkópos megjelenítésére a kromatinszélesztés
technikáját dolgozták ki. A vizsgálandó sejtszuszpenziót detergenst is tartalmazó, megfelelő
összetételű pufferrel kezelik. Ennek hatására a membránok feloldódnak, a kromatin fellazul,
szacharózpárnán keresztül elektronmikroszkópos gridre centrifugálható, majd fémárnyékolás
után vizsgálható. Az így készült felvételen a nukleolusz felszínén nagy számban figyelhetők meg
karácsonyfaszerű képződmények, melyek a működő rRNS-gének elektronmikroszkópos
megjelenési formái (24.2. ábra).

111
 24.2. ábra: Aktívan átíródó rRNS transzkripciós egység
A „karácsonyfák” részletes vizsgálatából számos következtetést vontak le az rRNS-szintézisre
vonatkozóan. Egy „karácsonyfát” egy rRNS transzkripciós egység és a róla képződő
transzkriptumok alkotnak. A „fa” csúcsa az iniciációs helynek, alapja a terminációs pontnak, ágai
pedig a növekvő RNS-termékeknek felelnek meg (24.2. ábra). Minden „ág” tövében szemcse
látható; a működő RNS-polimeráz I. Minden enzim egy transzkriptumláncot szintetizál. Az RNS-
polimeráz molekulák a lehetséges legnagyobb sűrűséggel zsúfolódnak egymás mellett, ami azt
jelenti, hogy az rRNS-gén maximális intenzitással íródik át. A „karácsonyfák” a DNS-molekula
mentén bizonyos távolságban tandem módon követik egymást: a köztük lévő szakaszok az át nem
írt spacerek. (A spacer angol kifejezés, összekötő, szétválasztó szakaszt jelent.) Valamennyi „fa”
csúcsa ugyanabba az irányba mutat, tehát az egyes transzkripciós egységeken belül ugyanaz a lánc
szolgál templátként, a szintézis iránya azonos, azaz a gének polaritása megegyezik. Megfigyelhető
az is, hogy a növekvő RNS-láncokon már másodlagos–harmadlagos struktúrák kezdenek
kialakulni, fehérjék is kötődnek hozzájuk. A transzkripcióval párhuzamosan tehát megkezdődik a
riboszómák érése és összeszerelése is.
A riboszomális gének szerkezete
Az rRNS transzkripciós egységek (24.3. ábra) promótere a fehérjekódoló génekétől eltérő
szekvenciájú, igen erős promóter. A transzkripciós egység három érett rRNS-t, a 18S, 5.8S és 28S
rRNS-t kódolja, előttük, köztük és utánuk átírt spacerek helyezkednek el. A génsorozat átírása a
nagyméretű 45S pre-rRNS-t eredményezi.

24.3. ábra: Tandem rRNS-gének

112
Az emlős sejtek riboszómáinak negyedik RNS-komponense az 5S rRNS. Ennek génjei a
nukleoluszon kívül helyezkednek el, nagyszámú tandem ismétlődés formájában. Az 5S rRNS-
géneket az RNS-polimeráz III írja át, az 5S rRNS-molekulák érés nélkül, funkcióképes állapotban
szintetizálódnak és transzportálódnak a nukleoluszba.
SnoRNS-ek
Hasonlóan a pre-mRNS-ek éréséhez (l. 26. fejezet), eukariota sejtekben a pre-rRNS érett rRNS-
ekké alakításában alapvető szerepet játszanak kisméretű RNS-molekulák, az snoRNSek (az angol
small nucleolar RNA kifejezésből), fehérjékhez kötött, snoRNP-k formájában. A naszcens pre-
rRNS-t nagyszámú, különböző régióihoz komplementer bázispárosodással kötődő snoRNP lepi el.
Ezek egy része érési hasításokat hajt végre a pre-rRNS-en, más snoRNS-ek RNS-chaperonokként
működnek: elősegítik az rRNS-ek térszerkezetének kialakulását, fehérjék kötődését, nukleozidok
módosulását. Az emlős rRNS-ekben nagy számban történik ribóz- illetve bázis-metiláció, sok
uridin nukleozid pedig pszeudouridinná alakul át. (Az uridinban a bázis 1. N-atomja, a
pszeudouridinban viszont az 5. C-atom kapcsolódik a ribózhoz [l. 2.1. ábra].) Ezek a módosulások
szükségesek az rRNS-ek normális térszerkezetének kialakulásához, működéséhez. Az snoRNS-ek
létfontosak a sejt számára. Mivel nukleozidmodifikációk más RNS-típusokban is előfordulnak (pl.
tRNS-ek, 7SL RNS), lehetséges, hogy a nukleolusznak ezek érési folyamataiban is van szerepe.
A riboszóma képződésének mechanizmusa
A nukleoláris organizátor régióba benyúló DNS-hurkokon 45S pre-rRNS molekulák
szintetizálódnak (24.4. ábra). A transzkriptumokhoz már szintézisük közben snoRNS-ek,
riboszomális fehérjék és az RNS érésében részt vevő enzimek (metilázok, nukleázok)
kapcsolódnak. Nagyméretű, 80S szedimentációs állandójú RNP-komplex jön létre, melyben
végbemennek az érett rRNS-eket kialakító érési hasítások. A nukleoplazmából a sejtmagvacskába
kerülő 5S rRNS-ek beépülésével éretlen 60S riboszóma-alegységek jönnek létre, ezzel
párhuzamosan éretlen 40S alegységek is képződnek. Ezek a preriboszomális partikulumok még
működésképtelenek, végső érésük csak a citoplazmába érve történik meg, miután aktív
nukleocitoplazmatikus transzporttal átpréselődnek a maghártyapórusokon. Ekkor alkalmassá
válnak arra, hogy mRNS-hez kapcsolódva fehérjeszintézist kezdjenek.

24.4. ábra: A riboszóma-biogenezis folyamata

113
 25. Transzkripció III.: Pre-mRNS-szintézis, cap-képződés
és poliadeniláció
Míg prokariotákban a fehérjéket kódoló gének transzkripciójának terméke működőképes mRNS,
melyen már elongációja közben megkezdődik a polipeptidlánc szintézise (l. 23. fejezet), eukariota
sejtekben az mRNS prekurzorok (pre-mRNS-ek) szintézise, érése és nukleocitoplazmatikus
transzportja is rendkívül bonyolult folyamat. A primer transzkriptumok képződését, két végük
poszttranszkripciós módosulását (capképződés, illetve poliadeniláció), belőlük a gyakran
nagyméretű nem kódoló intronok eltávolítását (splicing) és transzportjukat a magpórusokon
keresztül számos fehérjealegységből felépülő multiprotein komplexek végzik. A folyamatok
komplexitását növeli, hogy jórészt a bonyolult szerveződésű kromatinállományban kell
végbemenniük. Az eukariota transzkripció is iniciációs, elongációs és terminációs lépésekből (25.1.
ábra) áll. Az érés már a szintézis közben megkezdődik és poszttranszkripcionálisan fejeződik be.

25.1. ábra: Eukariota fehérjekódoló gének transzkripciójának lépései

A pre-mRNS-szintézis iniciációja
Eukariotákban az RNS-polimeráz II (röviden pol II) által átírt gének promóterének általános
szerkezetére jellemző, hogy az iniciációs komplex felépüléséhez szükséges mintegy 50
bázispárnyi régión (ún. core promóter elemeken) kívül nagyobb kiterjedésű, a transzkripció
kezdőpontjától távolabb elhelyezkedő szabályozó régiót (ún. enhancer elemeket) is tartalmaznak

114
(25.2. ábra). A core promóter feladata, hogy általános transzkripciós faktorokat és az RNS-
polimeráz II enzimet megkötve biztosítsa a gén alaptranszkripcióját. Szemben az általános
transzkripciós faktorokkal, melyek valamennyi Pol II promóteren folyó iniciációban részt
vesznek, az enhancer régió elemeit gén-specifikus szabályozó transzkripciós faktorok ismerik fel
és kötődésükkel befolyásolják az RNS-polimeráz II iniciációs aktivitását (ezekkel később
foglalkozunk).

25.2. ábra: Az RNS-polimeráz II promóterek szerkezete

A core promóterek fehérjekötő helyei, elsősorban a TATA-box és az iniciátor (Inr) régió szabják
meg a promóter erősségét és szövetspecifitását. A TATA-boksz a prokariota Pribnow-boxhoz
hasonló, könnyen denaturálható régió. A hozzá kapcsolódó TATA-kötő fehérje és egyéb
transzkripciós faktorok stabil RNS-polimeráz kötődést biztosítanak. Az iniciátor régió a
transzkripció kezdőpontja környékére lokalizálódó elem. A mindkét szekvenciát tartalmazó
promóterek (TATA+ Inr+) különösen erősek, egyes vírusgének (pl. HIV, adenovírus) aktív átírását
biztosítják. A TATA+ Inr– promóterek is aktívak (pl. hiszton-, globin-gének), a TATA-boxot nem
tartalmazó promóterek (TATA– Inr+, TATA– Inr–) viszont gyengébbek. TATA-boxon és az
iniciátoron kívül a Pol II promóterek egyéb, az iniciációs komplex kialakulásában szerepet játszó
fehérjekötő helyeket is tartalmazhatnak (25.2. ábra).
Bár az iniciáció folyamatában fajtól, sőt sejttípustól függően is finom különbségek figyelhetők
meg, egy tipikus eukariota fehérjekódoló génen a folyamat a következőképpen zajlik le (25.3.
ábra). A core promóterhez meghatározott sorrendben általános transzkripciós faktorok (pl. a
TATA-kötő fehérje) kapcsolódnak, ez előfeltétele az RNS-polimeráz II kötődésének. Az így
kialakult iniciációs komplexhez egy további multiprotein komplex, a mediátor kapcsolódik. Nevét
onnan kapta, hogy különböző jelátviteli utak (l. később) végállomásaként közvetíti azok hatásait
a transzkripciós apparátusnak. A leírt módon felépülő, mintegy 60 polipetidláncból álló hatalmas
transzkriptoszóma (25.3. ábra) RNS-szintetizáló gépezetként működik. Az RNS-szintézis
megindulásában különleges szerepet játszik az RNS-polimeráz egyik alegységének C-terminális
doménje (CTD). Ez a különleges fehérjerégió heptapeptidek tandem ismétlődéséből áll, az
iniciációs komplexben erősen rögzül a mediátor komplexhez. Az egyik transzkripciós faktor
fehérjekináz és helikáz aktivitással is rendelkezik: foszforilálja az RNS-polimeráz II CTD-farkát,
mely ezáltal leválik a mediátor komplexről és elindul a gén belseje felé. Ezzel egyidőben a helikáz
szétcsavarja a templát két láncát, kisméretű transzkripciós buborékot hoz létre, melyen
megindulhat az RNS-szintézis.

115
 25.3. ábra: A pre-mRNS-szintézis iniciációja

Elongáció
Az RNS-polimeráz II foszforilált CTD-régiójához elongációs faktorok kapcsolódnak, az enzim
elmozdul az iniciáció helyéről (promóter kiürítés) és foszfodiészter-kötések szintézisével
megindul a láncnövekedés. A pol IIelongációs komplex helikáz aktivitása biztosítja a denaturált
régió mozgását a gén terminátorának irányában. A növekedő RNS-lánc 3’-vége bázispárosodással
kapcsolódik a templátlánchoz, miközben az 5’-végen megindul az RNS-érés folyamata.

Az 5’-cap képződése
A pre-mRNS-érés időben első lépése az 5’-vég módosulása, a capstruktúra képződése. A
prokariota RNS-szintézishez hasonlóan a transzkriptum képződése trifoszfátvég kialakulásával
indul, majd többlépéses reakció eredményeképpen egy szokatlan nukleotidszerkezet jön létre a
pre-mRNS 5’-végén (25.4. ábra). Egy foszfohidroláz enzim lehasítja a trifoszfátvég γ-helyzetű
foszfátját, majd guanililtranszferáz hatására GTP-ből származó guanilmonofoszfát kapcsolódik
egy 5’-5’ trifoszfáthídon keresztül a transzkriptum végéhez. Végül metiltranszferázok metilálják
az 5’-cap nukleotidjait (25.5. ábra). Az 5’-cap szintézisét végző enzimek ugyancsak az RNS-
polimeráz II CTD-farkához kapcsolódnak, így a cap már az elongáció kezdeti szakaszában
elkészülhet a primer transzkriptum 5’-végén. Az 5’-végi szerkezet – nevéhez híven – sapkaszerűen
védi a transzkriptumokat nukleázok hatásától és fontos szerepet játszik a transzláció során a
riboszóma kötődésében is.

116
 25.4. ábra: Az 5’-cap képződésének reakciói 25.5. ábra: A cap szerkezete

Termináció és poliadeniláció
A gén terminátorához közeledve az RNS-polimeráz II átír egy poliadenilációs elemnek nevezett,
specifikus szekvenciával (AAUAAA) rendelkező régiót. A transzkriptum ezen szakasza fontos
fehérjekötő hely: több polipeptidláncból álló komplex épül fel rajta, ennek egyik tagja
endonukleáz, mely a poliadenilációs elemtől disztálisan elhasítja a növekedő RNS-láncot (25.6.
ábra). A pre-mRNS felszabadul, az RNS-polimeráz pedig a terminátorig folytatja a transzkripciót,
terméke azonban – 5’-cap hiányában – nukleázok áldozatául esik.

25.6. ábra: Az eukariota pre-mRNS-ek 3’-végi érése

117
A 3’-vég érését lebonyolító komplex egyik alkotórésze a poli(A)-polimeráz: templáttól függetlenül
működő nukleotid-transzferáz, mely ATP-szubsztrát felhasználásával 100–250 nukleotidból álló
poli(A)-farkot szintetizál a pre-mRNS 3’-végére. (Ez alól csak a hiszton-mRNS-ek kivételek:
poli(A)-szekvenciát nem tartalmaznak.) A citoplazmában a poli(A)-farok rövidül, de teljes
lebontásáig stabilizája az mRNS-t, védelmet jelent nukleázok degradáló hatásával szemben. A
poli(A)-faroknak gyakorlati, metodikai jelentősége is van: lehetőséget ad poli(A)+ mRNS-ek egy
lépésben történő izolálására oligo(dT)-cellulóz affinitás kromatográfiával.
A mRNS-ek degradációját egy 3’ → 5’ exonukleázokból felépülő fehérjekomplex, a citoplazmatikus
exoszóma végzi. Hasonló nukleázkomplex a sejtmagban is megtalálható: a nukleáris exoszóma pre-
rRNS-ek, snRNS-ek, snoRNS-ek érésében, illetve selejtes, hibásan módosított mRNS-darabok
lebontásában játszik szerepet.

118
 26. Transzkripció IV.: Pre-mRNS splicing eukariotákban
A molekuláris biológiai módszereknek az 1970-es években lezajlott forradalma utat nyitott a
génszerkezet és génexpresszió részletes tanulmányozása felé. Ezek a kutatások 1977-ben nem
várt felfedezéssel lepték meg a tudományos világot: eukariota sejtekben a legtöbb fehérjekódoló
génben az örökletes információ nem folytonosan tárolódik, hanem a kódoló, mRNS-ben megjelenő
szakaszokat (exonokat), az mRNS-ekből már hiányzó, fehérjét így nem kódoló régiók (intronok)
szakítják meg. Az exonok és intronok egyetlen transzkripciós egységet képeznek: nagyméretű pre-
mRNS molekulába íródnak át, majd abból a splicing folyamata távolítja el az intron-szakaszokat
és hozza létre az érett mRNS-t (26.1. ábra). (Az angol kifejezés az exonok „összecsomózására”
utal.)

26.1. ábra: A fehérjekódoló gének diszkontinuus szerkezete és a pre-mRNS splicing

A splicing jelentősége adenovírus mRNS-ek képződésében

Az intronokat az adenovírusok fertőzési mechanizmusának vizsgálata során fedezték fel. Ezek a
vírusok – melyek természetes gazdáikban légúti hurutos megbetegedéseket okoznak – megfelelő
szövettenyészeti sejtekben szaporodva nagy mennyiségű vírusspecifikus mRNS és fehérje
szintézisét idézik elő, ezért kedvelt modelljei a génexpresszió vizsgálatának. Az adenovírusok
genomja lineáris, kettős láncú DNS. Korai régiója a fertőzés kezdetén íródik át és az általa kódolt
korai fehérjék szükségesek más vírusgének átírásához, a vírus-DNS replikációjához. A késői gének
expressziója a víruspartikulumok kapszid fehérjéinek szintézisét eredményezi, az érett virionok
képződését, végső soron a fertőzött sejt pusztulását okozza.
Hibridizációs vizsgálatok kiderítették, hogy a mintegy 20 különböző késői mRNS mind ugyanarról
a promóterről íródik át. Az érett, késői mRNS-ek és a vírus-genom által alkotott hibrideket
elektronmikroszkópos módszerekkel is megvizsgálták: a körárnyékolással nyert képeken furcsa,
hurokszerű képleteket figyeltek meg (26.2. ábra). Ezeket a hurkokat olyan DNS-szakaszok
alkotják, amelyek a transzkripciós egységen belül helyezkednek el, de az általa kódolt régiók az
mRNS-ből már hiányoznak, azzal hibridizálni nem képesek. A hurkok közötti RNS-DNS hibridek
az exonoknak felelnek meg. Az mRNS-ek részletes analízise kiderítette, hogy valamennyi késői
adenovírus-mRNS négy exon összekapcsolásával jön létre. Az mRNS-ek 5’-vége három rövid
leader-szekvencia összeillesztéséből keletkezik. Ezek az összes késői adenovírus mRNS-ben
azonos 5’-végi nem kódoló régiót hoznak létre, amely rendkívül hatékony transzláció-iniciációt
biztosít, elősegítve a vírus-partikulumok fehérjéinek képzését (a sejt saját fehérjéi szintézisének
rovására). A negyedik, nagyobb méretű exon alkotja az mRNS 3’-végi részét; ez eltérő az egyes
mRNS-ekben és a fehérjekódoló régiót tartalmazza. (Az adenovírus késői mRNS-ek esetében ezt
az exont body-szekvenciának nevezik.)

119
 26.2. ábra: Intronok azonosítása RNS-DNS hibridek elektronmikroszkópos vizsgálatával. A. A
hibridek elektronmikroszkópos vizsgálata alapján készült sémás rajz. B. A vírus-DNS térképe az
exon- és intron-régiókkal
Az adenovírus késői transzkripciós egységéről egyetlen hosszú primer transzkriptum képződik,
ennek érése hoz létre különböző mRNS-eket. A húszféle mRNS képzését ugyanarról a
transzkripciós egységről két, egymástól független mechanizmus biztosítja (26.3. ábra). (I) A késői
génrégió öt helyen tartalmaz poliadenilációs elemet (L1–L5 helyek a 26.3. ábrán); a növekedő
RNS-lánc ezek bármelyikénél elhasadhat, ugyanazon a transzkripciós egységen tehát öt
különböző méretű pre-mRNS képződhet. (II) A splicing-mechanizmus az intron/body-határon
több 3’-splicing-helyet is használhat. Ezen alternatív splicing eredményeképpen az egyes pre-
mRNS-ekből 2–4, eltérő méterű body-szekvenciákat tartalmazó érett mRNS képződhet. A leírt
mechanizmusok lehetővé teszik azt, hogy viszonylag rövid DNS-szakaszok több polipeptidláncot
is kódolhassanak (komplex transzkripciós egységek), ami nyilvánvalóan előnyös a kisméretű
genommal rendelkező vírusok számára. (Az egyszerű transzkripciós egységek egyetlen fehérjét
kódolnak. Az alternatív splicing egyébként emberi sejtekben is nagy jelentőségű. A jelenséggel
részletesebben a 31. fejezet foglalkozik.)

120
 26.3. ábra: Az adenovírus késői gén-régióján képződő pre-mRNS-ek és az alternatív splicing
termékei. (Az ábra csak a legrövidebb pre-mRNS-ből képződő érett mRNS-eket mutatja.)
A 3’-vég érését lebonyolító komplex egyik alkotórésze a poli(A)-polimeráz: templáttól függetlenül
működő nukleotid-transzferáz, mely ATP-szubsztrát felhasználásával 100–250 nukleotidból álló
poli(A)-farkot szintetizál a pre-mRNS 3’-végére. (Ez alól csak a hiszton-mRNS-ek kivételek:
poli(A)-szekvenciát nem tartalmaznak.) A citoplazmában a poli(A)-farok rövidül, de teljes
lebontásáig stabilizája az mRNS-t, védelmet jelent nukleázok degradáló hatásával szemben. A
poli(A)-faroknak gyakorlati, metodikai jelentősége is van: lehetőséget ad poli(A)+ mRNS-ek egy
lépésben történő izolálására oligo(dT)-cellulóz affinitás kromatográfiával.
A mRNS-ek degradációját egy 3’ → 5’ exonukleázokból felépülő fehérjekomplex, a citoplazmatikus
exoszóma végzi. Hasonló nukleázkomplex a sejtmagban is megtalálható: a nukleáris exoszóma pre-
rRNS-ek, snRNS-ek, snoRNS-ek érésében, illetve selejtes, hibásan módosított mRNS-darabok
lebontásában játszik szerepet.

A splicing mechanizmusa
Az intronok eltávolítása két
lépésben zajlik (26.4. ábra).
Először az 5’-splicing-helyen
hasítás történik és az intron
5’-vége az intron belsejében
levő A-nukleotid 2’-OH
csoportjához foszfátészter-
kötéssel kapcsolódva
elágazást, lasszószerű
szerkezetet hoz létre. Ezt
követi a 3’-splicing-hely
elhasítása és az exonok
összekapcsolása.

26.4. ábra: A pre-mRNS

splicing lépései

121
Ezek a látszólag egyszerű reakciók valójában igen bonyolult folyamat formájában zajlanak le. A
splicing-mechanizmusnak ugyanis két rendkívül nehéz problémával kell megbirkóznia. A
hasításokat hajszálpontosan kell végrehajtani, mert egyetlen nukleotid kiesése vagy felesleges
nukleotid „becsempészése” az mRNS-be teljesen abnormális aminosavsorrendű fehérje
képződését eredményezné. Másrészt viszont az exonokat fizikai közelségbe kell hozni egymással,
hogy a ligálás végbemehessen. Figyelembe véve, hogy egyes intronok több tízezer nukleotidból is
állhatnak, ez egyáltalán nem könnyű feladat.
A megoldást hatalmas méretű komplexek, spliceoszómák biztosítják. A spliceoszómák a pre-
mRNS-en épülnek fel, uracilban gazdag, kisméretű snRNS-ekből és fehérjékből állnak. Az snRNP-
komplexekben a katalitikus funkciókat a ribozimekként működő kis RNS-molekulák látják el. (A
splicing speciális eseteiben [pl. egyes mitokondriális, kloroplasztisz RNS-ek, egysejtűek pre-rRNS-
einek érése során] az intronok eltávolítását maguk az RNS-ek végzik, fehérjék közreműködése
nélkül. Az auto-splicing felfedezésével azonosították az első ribozimet.) Az snRNS-ek
célszekvenciáikhoz komplementer bázispárosodással kapcsolódnak. A pre-mRNS-ek intronjaiban
három kitüntetett felismerőhelyet írtak le. Az 5’-splicing-hely konszenzus-szekvenciájában az
intron mindig GU-val kezdődik, ezt a régiót ismeri fel az U1-snRNS (26.5. ábra, 1. lépés). A lasszó
elágazási régiójához az U2-snRNS kötődik bázispárosodással (2. lépés). Az intron 3’-végi
konszenzus szekvenciája AG-nukleotid párossal végződik. A pre-mRNS-U1-U2 snRNP-
komplexhez kötődnek ezután az U4/U6- és U5-snRNP partikulumok, kialakítva a spliceoszómát
(3. lépés), melyben a hasítási-ligálási helyek egymáshoz viszonyítva optimális pozícióban
rendeződnek el. Megtörténik az intron kihasítása, az exonok összekapcsolása (4. és 5. lépés) és a
felszabaduló snRNP-részecskék új spliceoszómák felépítésébe kezdhetnek. Az intronlasszó
gyorsan degradálódik (6. lépés).

26.5. ábra: A spliceoszóma felépülése és a splicing mechanizmusa

122
Mint a fentiekből kiderült, a splicing hasítási és ligálási lépéseit ribozimek hajtják végre,
fehérjefaktorok is fontos szerepet játszanak azonban benne. Ezek a splicing faktorok szükségesek
a splicing-helyek pontos kiválasztásához, a spliceoszóma összeszereléséhez, illetve a
transzkripció és a splicing folyamatának összehangolásához. Az RNS-polimeráz II CTD-régiójához
kötődő splicing faktorok lehetővé teszik, hogy az intronok eltávolítása már a pre-mRNS szintézise
során, a kívánt sorrendben megtörténjen.

A splicing rendellenességei
A leírt bonyolult folyamatba csúszó hibáknak súlyos következményei vannak: az abnormális
splicing-termék képtelen működőképes fehérje szintézisét irányítani, esetleg ki sem jut a
sejtmagból. A systemás lupus erythematosus (SLE) autoimmun betegség: egyes eseteiben
antitestek képződnek az snRNP-partikulumok bizonyos fehérjéivel szemben, így különböző
szövetek sejtjeiben gátolt a pre-mRNS-ek splicingja, súlyos, esetenként halálos generalizált
kórképhez vezetve. (SLE-ben szenvedő betegek anti-snRNP-t tartalmazó szérumát egyébként
metodikai eszközként használták a splicing pontos mechanizmusának tisztázására.)
Az intronok konszenzus-szekvenciáiban bekövetkező pontmutációk olyan öröklődő betegségeket
okozhatnak, melyekben egy meghatározott gén expressziója gátolt. (Becslések szerint az emberi
öröklődő betegségek mintegy 15-20%-át aberráns splicingot előidéző mutációk okozzák!) Ennek
a mechanizmusnak jól ismert példái a thalassaemia bizonyos típusai: a globingének intronjaiban
bekövetkező mutáció abnormális splicingot, és az érintett globinlánc szintézisének csökkenését
eredményezi.

RNS-editing
Bár nem tartozik a pre-mRNS splicing témájához, említésre méltó az RNS-szerkesztés (angolul
editing) jelensége is: ennek során az RNS-érésben részt vevő enzimek egy-egy nukleotidot
megváltoztatnak, hozzáadnak, vagy elvesznek az RNS-molekulákból. (Ez a tevékenység a
sajtótermékek olvasószerkesztőinek munkájához hasonlít, innen származik az elnevezés.)
Emlős sejtekben az RNS-szerkesztés leggyakrabban C→U átalakítást jelent dezaminációval (l. 2.1.
ábra). Ennek egy érdekes, szövetspecifikus példája az apolipoprotein-B fehérje mRNS-ének
szerkesztése (26.6. ábra).

26.6. ábra: RNS-szerkesztés. A. Apo-B100 fehérje szintézise „szerkesztetlen” mRNS-ről. B. Apo-B48

fehérje szintézise „szerkesztett” mRNS-ről

123
Májsejtekben a „szerkesztetlen” mRNS-en nagyméretű fehérje (Apo-B100) képződik, ez
szekretálódik a vérplazmába és ott a lipidek szállításában játszik szerepet (l. 35. fejezet). A
vékonybél-nyálkahártya sejtjeiben viszont a kódoló régió egy citozinja uracillá alakul át és egy
transzlációs terminációs kodont hoz létre (l. 28. fejezet). A „szerkesztett” mRNS-en képződő
csonka fehérje (Apo-B48) a lipidfelszívást segíti elő a vékonybélből.

124
 27. Transzláció I.: mRNS-ek, tRNS-ek, riboszómák szerepe
a fehérjeszintézisben
A molekuláris biológia centrális dogmájának értelmében a génexpresszió első lépésében
(transzkripció, l. 11.1. ábra), a DNS bázissorrendjében rögzített genetikai információ RNS-be
íródik át, majd a második lépésben annak irányításával specifikus aminosavsorrendű fehérje
szintetizálódik (transzláció). A két folyamat latin neve pontosan érzékelteti a közöttük levő
különbséget: míg a transzkripció során az információ szövegét négybetűs ABC (a DNS bázisai)
szövegéből hasonlóan négy betűt használó szövegbe (az RNS bázisai) kell átírni, a transzláció a
nukleinsavak négybetűs kódrendszerét fordítja le a fehérjék húszbetűs (azaz húsz aminosavból
álló) nyelvére. Érthető tehát, hogy a transzláció bonyolult folyamat, speciális mechanizmusokat
kíván a fehérjeszintetizáló apparátustól.

A fehérjeszintézis templátja az mRNS

Az 1950-es években már ismert volt az a tény, hogy a fehérjeszintézis a riboszómák felszínén
történik. Ennek alapján kézenfekvőnek látszott a feltételezés, hogy a fehérjék aminosavsorrendjét
valamilyen módon a riboszómákban jelenlevő rRNS-ek határozzák meg. A hipotézis cáfolatát T2-
bakteriofágokkal végzett kísérletek szolgáltatták. Ha E. coli sejtekben a fágfertőzéssel egyidőben
az újonnan képződött RNS-eket radioaktívan jelölték, azt tapasztalták, hogy a fertőzés azon
szakaszában, amelyben a fágfehérjék már nagy mennyiségben szintetizálódtak, a riboszómák még
nem voltak radioaktívak. A riboszómák tehát már a fágfertőzést megelőzően jelen voltak a
baktériumokban, rRNS-ük fágspecifikus információt nem hordozhat. Nem sokkal később azután
kiderült, hogy a riboszómákhoz újonnan szintetizált RNS-ek kötődnek, ezeket a transzláció
templátjaiként azonosították és messenger-RNS-eknek (mRNS-eknek) nevezték el.

A tRNS-ek adapterszerepe
A fehérjeszintézis mechanizmusával kapcsolatos másik korai téveszme szerint az RNS a
templátfunkciót úgy látná el, hogy az aminosavak közvetlenül kötődnének a szintézist irányító
RNS-hez, majd köztük peptidkötések létesülnének. Kiderült azonban, hogy az aminosavak nem
mutatnak specifikus affinitást nukleinsavbázisok iránt, az apoláros aminosavak pedig egyáltalán
nem tudnak nukleinsavhoz kapcsolódni. Közvetítőkre, adapterekre van tehát szükség, amelyek az
aminosavakkal és az mRNS megfelelő régiójával is képesek specifikus kötést kialakítani. Ezt az
adapterfunkciót a transzfer-RNS-ek (tRNS-ek) látják el.
A tRNS-ek szintézise és érése
A tRNS-eket az RNS-polimeráz III pre-tRNS-ek formájában szintetizálja; ezek 5’- és 3’-végükön is
rövid, eltávolítandó régiókat tartalmaznak. Az érett tRNS 5’-végét létrehozó ribonukleoprotein, az
RNáz P fő nevezetessége, hogy RNS-komponense egyike az először felfedezett ribozimeknek. A
tRNS 3’-végét fehérjetermészetű endonukleáz alakítja ki, melyhez CCA trinukleotid
szintetizálódik. A tRNS nukleotidjainak kb. 10 százaléka kémiai módosuláson esik át.
A tRNS szerkezete
A tRNS-ek kisméretű (kb. 80 nukleotid, 4S szedimentációs állandó), a citoszólban oldott
állapotban jelenlevő RNS-molekulák. Adapterszerepre azért képesek, mert kovalens kötéssel
specifikus aminosavat tudnak megkötni, bázispárosodással pedig az mRNS megfelelő szakaszához
kapcsolódni. A tRNS-ek szokatlanul magas arányban tartalmaznak módosult nukleotidokat,
melyek hozzájárulnak a térszerkezet kialakításához. A tRNS-ek másodlagos szerkezetét a
lóherelevél-modell írja le (27.1.A ábra). A „lóhere” szárát a molekula 5’- és 3’vége közötti
bázispárosodás hozza létre. Az aminosavkötő hely a 3’-végi CCA-szekvencia: az aminosav a
terminális A-nukleotid ribózával alkot kovalens kötést (l. később). A TYCG-hurok nevét a benne

125
levő konzervált, módosult nukleozidokat (T = ribotimidin, Y = pszeudouridin) tartalmazó
régióról kapta; ez a tRNS riboszóma-kötőhelye. Az antikodonhurok az mRNS-kötőhely:
komplementer bázispárosodást alakít ki az mRNS megfelelő kodonjával. A D-hurok dihidrouridint
tartalmaz; ezzel kötődik a tRNS az aminoacil-tRNS szintetáz enzimhez (l. később). A tRNS-ek
harmadlagos szerkezete kompakt, L-alakot vesz fel; a szárak két végét az aminosavkötő kar és az
antikodonhurok alkotja (27.1.B ábra).

27.1. ábra: A tRNS-ek másodlagos (A.) és harmadlagos (B.) szerkezete

Aminoacil-tRNS-ek szintézise
Az aminosavak tRNS-hez kapcsolását az aminoacil-tRNS szintetázok végzik. Minden
aminosavnak saját enzime van, amely az aminosavnak megfelelő tRNS-t (vagy tRNS-eket) is
felismeri. Az enzimreakció két lépésben zajlik le (27.2. ábra). Az aminosav-aktiválás során az
aminosav az enzim felszínén ATP-vel reagál, aminoacil-adenilát képződik pirofoszfát
felszabadulása közben. Ezt követi az aminoacil-tRNS komplex szintézise: az aminosav a neki
megfelelő tRNS 3’-végéhez kapcsolódik a karboxilcsoport által létrehozott észterkötéssel. A
transzláció pontossága szempontjából az aminoacil-tRNS szintetázok működése döntő
fontosságú. Ha ugyanis egy aminoacil-tRNS komplexben utólag kémiai úton átalakítják az
aminosavat, az nem a saját, hanem az eredeti aminosav helyén épül be a fehérjébe. Az aminoacil-
tRNS szintetáz enzimek hibás működése esetén tehát csökken a fehérjeszintézis hitelessége:
abnormális aminosavsorrendű polipeptidek képződnek.

126
27.2. ábra: Az aminoacil-tRNS szintetáz reakció lépései. A. aminosav-aktiválás; B. aminoacil-tRNS
szintézis

A riboszóma szerepe a transzlációban

A fehérjeszintézis a riboszómák felszínén folyik. A riboszómák rRNS-molekulákból és nagyszámú
fehérjéből felépülő RNP-partikulumok. Prokariotákban és eukariotákban is kis és nagy alegység
alkotja őket. Valamennyi rRNS-ből és a legtöbb fehérjéből egyetlen molekulát tartalmaznak. (A
27.3. ábra foglalja össze az E. coli és emlős riboszómák méretére és összetételére vonatkozó
legfontosabb adatokat.) A riboszóma-alegységek pro- és eukariotákban is külön-külön
képződnek, egymással csak a transzláció idejére kapcsolódnak össze.

27.3. ábra: A riboszómák felépítése

A riboszómákról sokáig azt hitték, hogy rRNS-komponenseik csak az alegységek vázát alkotják, a
riboszóma speciális transzlációs funkcióit a fehérjék végzik. A mai álláspont ennek a fordítottja:
az rRNS-ek a főszereplők, a fehérjéknek kisegítő szerepük van. A tRNS-ek megkötése, a
riboszomális alegységek kapcsolódása, baktériumokban az mRNS kötése is RNS-ek
komplementer bázispárosodásával történik. A nagy alegység rRNS-e – ribozimként működve –
még a peptidkötés kialakítását is katalizálja. Mai feltevések szerint az élet keletkezése során a
primitív riboszómák csak RNS-t tartalmaztak, fehérjéket nem. A fentiek alátámasztják ezt az
elméletet.

127
 A transzláció vizsgálómódszerei
In vitro módszerek
Az első sejtmentes fehérjeszintetizáló rendszer kidolgozása Marshall Nirenberg nevéhez
fűződik. A Nirenberg-rendszer E. coli sejtkivonatot (benne riboszómákat, mRNS-eket, tRNS-eket,
enzimeket, fehérjefaktorokat), a húsz aminosavat, ATP-t, GTP-t, a szükséges ionokat tartalmazza.
Ha az egyik aminosav radioaktív izotóppal jelölt, a korábban már ismertetett filterprecipitációs
módszerrel mérhető a rendszer transzlációs aktivitása (l. 20. fejezet). A képződött
fehérjetermékek poliakrilamid gélelektroforézist követő autoradiográfiával részletesen
tanulmányozhatók.
In vivo módszerek
A transzláció poliszómák felszínén folyik. Izolált poliszómák elektronmikroszkópos vagy
hipopiknikus grádiens centrifugálással (27.4. ábra) végzett vizsgálatából következtetések
vonhatók le a sejt fehérjeszintetikus státusára: poliszómák csak transzlációsan aktív sejtekben
detektálhatók (l. 29. fejezet). Radioaktív aminosavval végzett jelölést követően fény- vagy
elektronmikroszkópos autoradiográfiával detektálhatók az újonnan szintetizált fehérjék. A jelölt
fehérjéket izolálva poliakrilamid gélelektroforézissel végezhetünk áttekintő jellegű vizsgálatot,
specifikus fehérje szintézisét pedig immunprecipitációval (l. 13. fejezet) tanulmányozhatjuk.

27.4. ábra: Poliszómák szacharóz grádiens

szedimentogrammja. Az a nyíllal jelölt csúcs
riboszóma monoméreknek; a, b és c csúcsok pedig
három, illetve öt riboszómát tartalmazó
poliszómáknak felelnek meg

128
 28. Transzláció II.: A genetikai kód
Az örökletes információ nukleinsavakról fehérjékre történő átvitelének fő kérdése: hogyan
határoz meg négyféle nukleotid húszféle aminosavat? A kombinatorika szabályai szerint egyes
bázisok (négyféle lehetőség) vagy báziskettősök (42 = 16-féle variáció) nem elégségesek a húsz
aminosav kódolásához. Annak igazolása, hogy a genetikai kód bázishármasokból áll (43 = 64-féle
triplet), illetve annak kiderítése, hogy az egyes trinukleotidok melyik aminosavat kódolják,
elsősorban Nirenberg laboratóriumának úttörő munkásságából származik.

A kódszótár felállítása
Triplet kód
Annak igazolása, hogy az aminosavakat bázishármasok határozzák meg, T4 bakteriofággal végzett
klasszikus genetikai kísérletekkel történt (28.1. ábra).

28.1.: ábra: A triplet kódot igazoló genetikai kísérlet elve. T4 bakteriofág DNS-ének egyik génjébe egy
(B.), két (C.) vagy három (D.) extra nukleotidot vittek be. Az ábrák a kódolt mRNS egy szakaszát,
illetve az azoknak megfelelő aminosav sorrendet mutatják. (A. vad-típusú gén). A mutáció
eredményeként megjelenő nukleotidokat kövér betűk, a megváltozott aminosavakat satírozás jelölik

Ha a fág egyik génjébe 1 vagy 2 extra nukleotidot vittek be, a kódolt fehérje inaktívvá vált, ha
azonban 3 nukleotidot, a fehérje általában aktív maradt. A kísérlet azt valószínűsíti, hogy a
genetikai információ leolvasása egy meghatározott ponton kezdődik és nukleotidok hármas
csoportjaiban folyik. Egy vagy két nukleotid bevitele (vagy deléciója) megzavarja ezt a leolvasási
ütemet (angolul reading frame), a mutációtól disztális aminosavsorrend teljesen megváltozik.
Három nukleotid bevitele (vagy eltávolítása) viszont csak egy aminosav megjelenését (vagy

129
kiesését) okozza, attól disztálisan az aminosavsorrend normális maradna, a változás a kódolt
fehérje aktivitását nem feltétlenül befolyásolja. A kísérlet a genetikai kód triplet-jellegét és
folyamatosságát (l. később) is valószínűsíti. A nukleotid-addíció vagy -deléció, ha a kódleolvasás
ütemét megbolygatja, frame-shift mutációt eredményez.
Szintetikus polinukleotidok in vitro transzlációja
A kódszótár első szavait szolgáltató kísérletekben olyan sejtmentes fehérjeszintetizáló
rendszert (l. 27. fejezet) alkalmaztak, melyben a poliszómák mRNS-eit lebontották, majd
polinukleotid-foszforiláz enzimmel készített szintetikus RNS-sel helyettesítették. (A polinukleotid-
foszforiláz ribonukleozid-difoszfátokból templáttól függetlenül szintetizál polinukleotidláncot,
melynek nukleotidösszetétele csak a reakcióelegy nukleozid-difoszfát tartalmától függ.)
Radioaktív aminosavak alkalmazásával, a filterprecipitáció módszerével meghatározható, hogy az
egyes templátok milyen aminosavak polipeptidláncokba épülését irányíthatják. Monoton
polinukleotid templátok egyetlen aminosavfajta beépülését idézik elő (pl. a poli(U) templáton poli-
fenilalanin szintetizálódik). Ismétlődő egységekből álló kopolimerek (pl. ACACAC, ACUACUACU...)
többféle aminosav fehérjébe épülését kódolhatják. Véletlenszerű szekvenciájú kevert
kopolimerekben a polinukleotid szintézise során alkalmazott nukleotidarányokból megállapítható
az egyes tripletkombinációk relatív gyakorisága. (Például, ha a poli(AC) templát előállításakor az
ADP-koncentráció nagyobb volt mint a CDP-koncentráció, a polinukleotid-láncban a tripletek
relatív gyakorisága a következő lesz: AAA > ACA = AAC = CAA > ACC = CAC = CCA > CCC.) A beépülő
aminosavak arányából következtetni lehet a kódszavak értelmére. A szintetikus
polinukleotidokkal számos triplet jelentését tisztázták, a kódszótár teljessé tételéhez azonban
hatékonyabb módszer kidolgozására volt szükség.
Aminoacil-tRNS-ek kötődésének vizsgálata

Nirenbergék megfigyelték, hogy ha az in vitro

fehérjeszintetizáló rendszerből kihagyják a
GTP-t, az aminoacil-tRNS-ek mRNS-hez
kötődése megtörténik, a peptidkötések
szintézise azonban elmarad. A kötődés a
riboszómák felszínén zajlik. Ha a reakció-
elegyet nitrocellulóz-filterre viszik fel, a
riboszómák rátapadnak a membránra,
minden más anyag azonban lemosható. A
filteren tehát csak az az aminoacil-tRNS
marad fenn, amelynek megfelelő mRNS-
szakaszt a reakcióelegy tartalmazta (28.2.
ábra). Ha az aminosav jelölt, filterhez
kötődése egyszerű radioaktivitás-méréssel
kimutatható. Ha a vizsgálatok során UUU
trinukleotidot használtak „templátként”,
fenilalanin kötődött. UU dinukleotid kötődést
nem idézett elő, háromnál több U-nukleotid
pedig nem fokozta a filterhez kötött
radioaktivitást. Az UUU trinukleotid tehát
szükséges és elégséges a fenilalanin
meghatározásához, a genetikai kódot valóban
tripletek alkotják. A kötődési kísérletekkel 28.2. ábra: A Nirenberg-féle kötődési analízis
mind a 64 lehetséges tripletkombinációt elve
tesztelték és felállították a teljes kódszótárat
(28.1. táblázat).

130
 28.1. táblázat: A genetikai kódszótár

A genetikai kód jellemzői

Az örökletes információ fehérjékben történő expressziójáért felelős genetikai kódot tehát
tripletek, bázishármasok alkotják: az aminosavakat az mRNS nukleotidhármasai, kodonjai
határozzák meg. Négy bázis kombinációi 64 tripletet eredményeznek (28.1. táblázat), közülük 61
értelmes kodon, azaz valóban aminosavat kódol; 3 bázishármas (UAA, UAG, UGA) tRNS-t – vagyis
aminosavat – nem képes megkötni, a fehérjeszintézis folyamatában terminációs szignálként,
stopkodonként működik (l. 29. fejezet).
A 61 értelmes triplet/20 aminosav arányból az is nyilvánvaló, hogy egy aminosavat több
bázishármas is kódolhat; a genetikai kód tehát redundáns, degenerált. Az ugyanazon
aminosavakat meghatározó tripleteket szinonim kodonoknak nevezzük. A degeneráció nem
véletlenszerű: az azonos aminosavat kódoló tripletek első két nukleotidja általában azonos, a
különbség a harmadik bázisnál jelentkezik. A jelenség molekuláris alapját az képezi, hogy a kodon-
antikodon kapcsolódás során a kodon 3. és az antikodon 1. nukleotidja között - térszerkezeti okok
miatt - nem komplementer bázispárosodás is létrejöhet (28.3. ábra). Az első két bázispár tehát
stabil, a harmadik azonban „lötyög”: innen származik a jelenség angol elnevezése: wobble. Ha
például a kodon wobble-pozíciójában G van, az antikodon megfelelő helyén C vagy U is lehet, és
fordítva: az antikodon G nukleotidja a kodonban C-vel és U-val is bázispárt alkothat. A wobble
következménye, hogy a sejt 61-nél kevesebb tRNS-sel is hatékony és hiteles transzlációt képes
végezni (E. coli baktériumokban kb. 40 különböző tRNS szállítja a 20 aminosavat).

131
 28.3. ábra: A kodon-antikodon kapcsolat wobble-pozíciója

A degenerált jelleg nem befolyásolja a fehérjébe építendő aminosavak kiválasztásának

pontosságát. Egy bizonyos kodon ugyanis mindig ugyanazt az aminosavat határozza meg. A
genetikai kód tehát egyértelmű.
Az mRNS-ben a kodonok folyamatosan követik egymást: minden nukleotid csak egy kodon
alkotórésze, a szomszédos tripletek között pedig nem maradhat ki egyetlen bázis sem. A kód tehát
átfedés- és vesszőmentes. Az mRNS-ek fehérjekódoló régiója iniciációs kodonnal kezdődik,
aminosavakat kódoló tripletekkel folytatódik, majd stopkodonnal végződik. A kódoló régió angol
elnevezése: open reading frame (ORF). A prokariota mRNS-ek gyakran több ORF-et is
tartalmaznak, policisztronosak; az eukariota mRNS-ek viszont általában egyetlen kódoló szakaszt
hordoznak, monocisztronosak (28.4. ábra).

28.4. ábra: Policisztronos prokariota mRNS (A.) és monocisztronos eukariota mRNS (B.) szerkezete
(I = iniciációs kodon, S = stopkodon, ORF = open reading frame)
A genetikai kód az evolúció során erősen konzerválódott: egy adott kodon ugyanazt az aminosavat
határozza meg minden élő szervezetben. Ez alól vannak kivételek: a mitokondriumok genetikai
apparátusa ezek közé tartozik. Ugyanazon sejtben néhány triplet a mitokondriumban más
aminosavat kódol mint a citoplazmában. A jelenség alapját a mitokondriális DNS magas mutációs
rátája, szokatlanul gyors evolúciója okozza (l. 38. fejezet). Ettől eltekintve a genetikai kód
általános érvényű.

132
 29. Transzláció III.: A fehérjeszintézis mechanizmusa
A fehérjeszintézis egy mRNS-molekulából és a hozzá kapcsolódó riboszómákból álló poliszómán
történik. A transzláció prokariotákban és eukariotákban is három fő lépésből áll: iniciációból,
elongációból, és terminációból.

Transzláció prokariotákban
Iniciáció
A fehérjeszintézis első lépése során az
mRNS 5’-végi régióján a riboszóma-
alegységek és az első aminoacil-tRNS
kötődése eredményeképpen iniciációs
komplex jön létre. A folyamat a
citoszólban jelenlevő iniciációs faktorok
közreműködését igényli. Ezek a fehérjék
szabad 30S riboszóma-alegységhez
kötődve elősegítik annak kapcsolódását
a formilmetionil-tRNS-hez és az mRNS-
hez (29.1. ábra). A tRNS az iniciációs
kodonokhoz (AUG vagy GUG) kötődik, az
mRNS-30S alegység-kapcsolatot pedig a
16S rRNS és az mRNS 5’- nem kódoló
régiójában található ún. Shine-Dalgarno
szekvencia közötti komplementer
bázispárosodás biztosítja. A leírt módon
kialakuló képződményt 30S iniciációs
komplexnek a kis alegység azon régióját
pedig, amelyen a kodon-antikodon
kapcsolatok létrejönnek, dekódoló
központnak nevezzük. Ezt követően
megkötődik az 50S riboszóma-alegység
is, az iniciációs faktorok pedig
felszabadulnak. Az iniciáció
végeredménye a 70S iniciációs komplex,
amelyben a riboszóma-monomer két fő
kötőhelye, a P-hely (peptidil-tRNS-
kötőhely) és az A-hely (aminoacil-tRNS-
29.1. ábra: A prokariota transzláció iniciációja. A: kötőhely) közül a formilmetionil-tRNS az
iniciációs faktorok kötődése a kis riboszóma előbbit foglalja el, az A-hely pedig e
alegységhez; B: a 30S iniciációs komplex létrejötte; C: pillanatban üres. A formilmetionin
a 70S iniciációs komplex kialakulása különleges aminosav: aminocsoportjához
aldehidcsoport kapcsolódik, így az
peptidkötést nem tud létesíteni más aminosavakkal, csak a fehérjelánc N-terminálisát alkothatja.
A láncnövekedés során a formilcsoport, de gyakran az egész aminosav is lehasad a peptidláncról.
Elongáció
A láncnövekedés a második aminoacil-tRNS komplexnek a riboszóma A-helyéhez kötődésével
kezdődik (29.2.ábra). Ehhez speciális elongációs faktorra, az EF-Tu-ra van szükség. Az EF-Tu
guaninnukleotid-kötő fehérje: GTP-t kötve aktiválódik, míg GDP-kötő állapotban inaktív. Az
aminoacil-tRNS/EF-Tu/GTP komplex riboszómához kötődése után a GTP GDP-re hidrolizálódik

133
és az EF-Tu/GDP komplex felszabadul. A második (és a többi) aminosav kiválasztása
természetesen kodon-antikodon felismeréssel történik (l. előbb), a dekódoló központ rRNS-
régiójának azonban minőségbiztosító szerepe van: korrekt kodon-antikodon bázispárosodás
esetén kiváltja az EF-Tu-hoz kötött GTP hidrolízisét. Ha ez nem következik be, az EF-Tu nem tud
leválni a riboszómáról és a szintézis nem folytatódhat mindaddig, amíg a helyes aminoacil-tRNS
meg nem kötődik. (Az EF-Tu „újratöltését” egy másik elongációs faktor, az EF-Ts végzi, a GDP GTP-
re cserélésével.) A riboszómán egymás mellé került két aminosav között kialakul a peptidkötés: a
formilmetionin karboxilcsoportja - mely addig tRNS-ének 3’-végéhez kötődött - és a második
aminosav aminocsoportja kapcsolódik vízkilépéssel. A feleslegessé vált iniciációs tRNS leválásával
felszabadul a P-kötőhely. A peptidkötési reakciót a peptidiltranszferáz centrum katalizálja, amely
a 28S rRNS speciális térszerkezetű régiója, ribozimként működik. Az elongáció következő
mozzanataként a riboszóma egy tripletnyit elmozdul az mRNS 3’-vége felé, a dipeptidil-tRNS
komplex így átkerül a P-kötőhelyre és az A-kötőhely hozzáférhetővé válik a következő aminoacil-
tRNS számára. (A P-kötőhelyről leszorított “csupasz”, deacilált tRNS átmenetileg a riboszóma E-
kötőhelyén időzik [E = exit, kilépés], majd végleg leválik annak felszínéről.) Ehhez a transzlokációs
lépéshez újabb elongációs faktor, az EF-G szükséges, GTP-hez kötött, aktív formában. A
láncnövekedés folyamán a leírt három lépés (aminoacil-tRNS-kötődés/peptidiltranszferáz
reakció/transzlokáció) ismétlődik.

29.2. ábra: A prokariota transzláció elongációja. A: aminoacil-tRNS kötődés; B: peptidkötés-

szintézis; C: transzlokáció

134
Termináció
A láncnövekedés befejezését az mRNS kódoló régiójának utolsó tripletje, egy stopkodon idézi
elő (29.3. ábra). Mivel a stopkodon nem köt meg aminoacil-tRNS-t, az A-kötőhely üresen marad.
Fehérjefaktorok (releasing faktorok) kapcsolódnak a riboszómához és aktiválják a
peptidiltranszferázt, amely lehasítja a kész polipeptidláncot az utolsó tRNS-ről. A fehérjemolekula
és a tRNS is felszabadul a poliszómáról, a feleslegessé vált riboszóma alegységekre disszociál és
legördül az mRNS-ről.

29.3. ábra: A prokariota transzláció terminációja

Az eukariota transzláció sajátosságai

Bár a fehérjeszintézis alapvető mechanizmusa minden élő sejtben hasonló, néhány lényeges
különbség feltétlenül megemlítendő. Ez azért is fontos, mert magasabb rendű szervezetek
bakteriális fertőzésének leküzdésére a baktériumok fehérjeszintézisének szelektív gátlása
szolgáltatja az egyik kézenfekvő lehetőséget, ehhez pedig ismerni kell a pro- és eukariota
transzláció közötti finom különbségeket.
Eukariota riboszómák mRNS-hez kötődését nem komplementer bázispárosodás biztosítja (az
mRNS-ekből hiányzik a Shine-Dalgarno szekvencia), hanem az 5’-cap-struktúra és a hozzá
kapcsolódó iniciációs faktorok. Ezt követően a transzláció az mRNS első, az 5’-véghez legközelebbi
iniciációs tripletjén kezdődik el. Ez a mechanizmus egyben magyarázatot ad az eukariota
transzláció monocisztronos jellegére is: iniciációs kódonként csak az 5’-véghez közeli AUG
működhet. (Vírus mRNS-ek policisztronosak is lehetnek: rajtuk a riboszóma-kötődés nemcsak a
cap-struktúrán, hanem az mRNS belsejében levő kötőhelyeken keresztül is történhet.)
Az eukariota fehérjeszintézis-apparátus komplexebb mint a prokariotáké: a riboszómák
nagyobbak, több rRNS- és fehérjemolekulát tartalmaznak. A transzlációban számos oldható
fehérjefaktor vesz részt: csupán a lánckezdéshez tucatnyi iniciációs faktor működése szükséges.
A folyamat így bonyolultabb és finomabb szabályozást is lehetővé tesz.
Lokalizáció szempontjából eukariota sejtekben a citoszólban levő szabad és az endoplazmatikus
retikulum membránjához kötött poliszómákat különböztetünk meg. A szabad poliszómák
szintetizálják a citoszól, a sejtmag, a mitokondriumok fehérjéit, míg a kötött poliszómákon
szekréciós fehérjék, a sejthártya, az endoplazmatikus retikulum, a Golgi-apparátus és a
lizoszómák fehérjéi képződnek. Utóbbiak transzportját és sejten belüli forgalmát bonyolult
mechanizmusok biztosítják (l. 33. fejezet).

135
 A transzláció általános jellemzői
Az előbbiekben leírtakból néhány fontos következtetés vonható le a fehérjeszintézis
mechanizmusára vonatkozóan.
1. Az mRNS templáton a szintézis 5’ → 3’ irányban folyik.
2. A növekvő polipeptidlánc szempontjából tekintve a transzláció iránya: N-terminális → C-
terminális.
3. A fehérjeszintézis folyamatában poliszómák képződnek (29.4. ábra): a riboszóma-alegységek
az iniciáció során kapcsolódnak az mRNS-hez, végigfutnak rajta, majd a terminációt követően
azonnal leválnak róla.
4. A poliszóma minden riboszómáján egy polipeptidlánc szintetizálódik. A naszcens fehérjelánc
C-terminális aminosava mindenkor az utolsó tRNS-hez kapcsolódik kovalens kötéssel.
5. A fehérjelánc térszerkezete már a transzláció közben kezd kialakulni.
6. A transzláció rendkívül energiaigényes folyamat: minden peptidkötés kialakításához négy
nagyenergiájú kötést használ fel (kettőt az aminoacil-tRNS szintézis ATP → AMP
átalakulásakor, egyet az aminoacil-tRNS riboszómához kötődésekor [GTP → GDP], egyet a
riboszóma transzlokációjakor [GTP → GDP]). Az energiabefektetés garantálja a transzláció
pontosságát.

29.4. ábra: Poliszóma képződése a fehérjeszintézis során

A fehérjeszintézis gátlószerei
Számos antibiotikum és eukariota gátlószer támadáspontja a transzláció. Az
embergyógyászatban is használatos antibiotikumok közül a kloramfenikol a peptidiltranszferázt,
az eritromicin a transzlokációt, a tetraciklin az aminoacil-tRNS kötődését, a streptomicin a 30S
alegység működését gátolja. A puromicin aminoacil-tRNS analóg, amely a növekedő polipeptidlánc
C-terminálisához kötődve pro- és eukariota sejtekben is idő előtti terminációt okoz.

136
 30. A génműködés szabályozása I.: A prokariota operon
modell
Az E. coli genom több ezer gént tartalmaz. Ezek egy része a sejt életkörülményeitől függetlenül
nagyjából azonos szinten, konstitutívan expresszálódik. Más gének működése azonban tág határok
között változhat a sejtet érő környezeti hatásoktól függően: expressziójuk szabályozott. A
génreguláció vezethet a génműködés fokozódásához (indukció) vagy csökkenéséhez (represszió).
Prokariotákban a génexpresszió szabályozásának fő célja, hogy a sejt minél sikeresebben
alkalmazkodjon ahhoz a tápanyagellátáshoz, melyet a környezet nyújt számára.

A génreguláció résztvevői
DNS-szekvenciaelemek
A génexpresszió szabályozása döntő részben az RNS-szintézis szintjén történik. Hogy egy gén
milyen intenzitással íródik át, azt a benne vagy közelében, elsősorban a promóter régióban
jelenlevő szekvenciaelemek határozzák meg. Magának a promóternek a szekvenciája
befolyásolja az RNS-polimeráz kötődésének erősségét, az iniciációs aktivitást. Más DNS-régiók az
RNS-polimeráz elongációs mozgására, esetleg a terminációra vannak hatással. Ezek a DNS-elemek
funkciójukat csak akkor tudják ellátni, ha természetes helyükön, a szabályozott gén közelében
hagyjuk őket: cisz-hatású elemekként működnek. Ugyanaz a szekvenciaelem a genomban több
(egyes esetekben sok) helyen is előfordulhat (a Pribnow-box például minden prokariota
promóter fontos régiója). Ezeknek a régióknak a bázissorrendje azonban általában nem
tökéletesen azonos. Azt a bázissorrendet, mely a legjobban hasonlít mindegyikükhöz konszenzus
szekvenciának nevezzük. A kis egyedi különbségek finoman befolyásolják a szekvenciaelem
működését, aktivitását. Ennek alapján beszélhetünk „erős” és „gyenge” promóterekről.
Regulátor-fehérjék
aktivitását: a represszorok negatív, az aktivátorok pozitív szabályozást végeznek. Mivel az őket
kódoló géneknek nem kell feltétlenül a szabályozott transzkripciós egység közelében
elhelyezkedniük, transz-hatású elemeknek nevezzük őket.
Effektor-molekulák
A regulátor-fehérjék DNS-kötő képességét kisméretű, általában metabolit jellegű effektor-
molekulák befolyásolják azáltal, hogy kötődésük a fehérje konformáció-változását idézi elő. Az
induktorok génaktivációt, a korepresszorok a génműködés gátlását váltják ki a leírt
mechanizmussal.

Lebontó anyagcsereutak operonjai

E. coliban a génindukció klasszikus példáját a sejteknek a laktózt tartalmazó táptalajhoz való
alkalmazkodása szolgáltatja. A baktériumok természetes cukorforrása a glukóz: a glukóz-
metabolizmus enzimeit konstitutívan termelik, szőlőcukor jelenlétében egyéb szénhidrátok
lebontását végző enzimeket nem szintetizálnak. Ha azonban táptalajuk glukóz helyett laktózt
tartalmaz, a tejcukor lebontásához szükséges enzimek nagy mennyiségben képződnek bennük,
enzimindukció megy végbe.
Genetikai kísérletek eredményeképpen Jacob és Monod a 60-as évek elején elméletet állított fel a
laktóz-metabolizáló enzimek termelésének szabályozására. Az operonmodell szerint (30.1.
ábra) a laktózlebontásban szerepet játszó enzimek génjei – az ún. struktúrális gének – a baktérium
genomban génsorozatot alkotva egyetlen promóterről íródnak át egy policisztronos mRNS-be. (A
géntermékek közül a β-galaktozidáz a laktózt galaktózra és glukózra bontja, a laktóz permeáz
pedig a tejcukor felvételét végzi. A harmadik gén egy transzacetiláz enzimet kódol, melynek

137
feladata, hogy hatástalanítsa a permeáz fehérje által felvett egyéb, toxikus
tejcukorszármazékokat.) A promóter és a strukturális gének között rövid szabályozó régió, az
operátor foglal helyet.

30.1. ábra: Negatív reguláció a laktózoperonon: a lac represszor működése.

(R = regulátor gén; P = promóter; O = operátor; S1, S2, S3 = struktúrális gének)
A regulátor gén által kódolt lac represszor az operátorhoz kötődve gátolja az RNS-polimeráz
promóterhez kapcsolódását, leállítva a transzkripciót az operonon (negatív reguláció). Ha
azonban a táptalaj tejcukrot tartalmaz, egy belőle képződő metabolit induktorként működve a
represszorhoz kötődik és konformációváltozást előidézve leválasztja az operátor régióról,
lehetővé téve az operon transzkripcióját. A laktózoperon az indukálható operon prototípusa:
természetes körülmények között nem működik, az effektor jelenléte azonban aktiválja. Ez a
szabályozás jellemző számos lebontó anyagcsereút enzimeinek expressziójára.
Ha azonban a táptalaj glukózt tartalmaz, a laktózoperon vagy más cukrok lebontásáért felelős
enzimeket kódoló génsorozatok nem indukálhatók hatékonyan. Ennek azért van biológiai
értelme, mert a glukóz-metabolizmust végző enzimek konstitutívan expresszálódnak E. coliban: a
sejtnek a glukóz felhasználásához nem kell újabb enzimmolekulákat szintetizálnia, felesleges a
sejtnek más cukrok lebontásával foglalkoznia. Korábban feltételezték, hogy a többi cukoroperon
leállításáért a glukóz valamely lebontási terméke a felelős, ezért a jelenséget katabolit
repressziónak nevezték el. A folyamat hátterében valójában génaktivációs mechanizmus áll.
Glukóz hiányában a baktérium adenilcikláz enzime aktiválódik és ATP-ból ciklikus AMP-t (l. 2.3.
ábra) képez. A cAMP komplexet alkot egy transzkripciós faktorral, a katabolit aktivátor fehérjével
(az angol név alapján használt rövidítés: CAP), amely a cukor-metabolizmust irányító operonok
promóter régiójához kötődik. A cAMP-CAP komplex stabilizálja az RNS-polimeráz DNS-hez
kapcsolódását, nagy-mértékben stimulálva az iniciációt (30.2. ábra). Glukóztartalmú táptalajon a
sejtek cAMP-szintje alacsony, a CAP ezért nem képes a promóterhez kötődni.
A laktózoperon tehát összetett szabályozás alatt áll. A laktóz jelenléte a lac represszor negatív
hatásának felfüggesztésével, a glukóz hiánya pedig a CAP-fehérje pozitív hatásának serkentésével
vezet az operon hatásos expressziójához. Laktózbontó enzimek csak akkor szintetizálódnak nagy
mennyiségben, ha a táptalaj glukóz helyett laktózt tartalmaz (30.2. ábra).

138
 30.2. ábra: A laktózoperon transzkripciójának összetett szabályozása. (G = glukóz; L= laktóz)

Bioszintetikus anyagcsereutak operonjai

Ha E. coli sejteket olyan táptalajon tenyésztenek, amely aminosavakat nem tartalmaz, a sejtekben
minden olyan enzim jelen van, amely az aminosavak szintéziséhez szükséges. Ha a táptalajhoz
aminosavat adnak, az illető aminosavat szintetizáló enzimek eltűnnek, azaz génrepresszió
következik be.
Az egyes aminosavak bioszintetikus enzimeit kódoló génsorozatok szerkezete hasonlít a laktóz-
operonéhoz, szabályozásuk azonban eltérő. A represszor fehérje ebben az esetben inaktív
formában szintetizálódik, azaz nem ismeri fel az operon operátor régióját (30.3. ábra). A megfelelő
aminosav azonban korepresszorként működve konformációváltozást indukál a
represszorfehérjében, így már megtörténhet a represszor–operátor kapcsolódás, és az operon
átírásának gátlása. Aminosav-szintetizáló enzimek tehát csak aminosav-éheztetés során
termelődnek a sejtben, az aminosav jelenléte az operon transzkripcióját leállítja (represszálható
operon). A 30.3. ábra példaként a triptofánoperon szerkezetét és szabályozását mutatja be. A
triptofán a fehérjék legritkább aminosava, előállítása a sejtek által így rendkívül költséges. A
baktériumok világában ezért sokféle, kifinomult mechanizmus alakult ki a triptofán-szintetizáló
enzimek expressziójának szabályozására. Közülük a leghatékonyabb a triptofánaktivált trp
represszor működése.

30.3. ábra: A triptofánszintézis enzimeit kódoló triptofánoperon szabályozása

139
 31. A génműködés szabályozása II.: A génreguláció
mechanizmusai eukariotákban
Prokariotákban és egysejtű eukariota élőlényekben a génexpresszió szabályozásának fő feladata,
hogy biztosítsa a sejt alkalmazkodását a változó táplálkozási és fizikai körülményekhez. Ezt
specifikus gének reverzibilis indukciójával vagy repressziójával éri el: a környezeti hatás
elmúltával helyreáll az eredeti génműködés. Magasabb rendű, soksejtű szervezetekben a belső
környezet állandósága többé-kevésbé megvédi a sejteket attól, hogy extrém környezeti hatásokra
kelljen reagálniuk. Reverzibilis génexpressziós változásokat extracelluláris szignálok (pl. idegi,
hormonális hatások, mitogének) válthatnak ki. A génreguláció másik fontos feladata, hogy
végrehajtsa az egyedfejlődés során a szöveti differenciációval kapcsolatos „döntéseket”. Ezek a
génexpressziós változások általában irreverzibilisek és az érett, differenciált szöveti sejtek
kialakulását eredményezik.

A génreguláció szerepe az egyedfejlődésben

A Gurdon-kísérlet
Az egyedfejlődés szabályozásának fő kérdése a következő: hogyan lehetséges, hogy egyetlen
diploid sejtből, a megtermékenyített petesejtből sokféle, fenotípusosan nagymértékben eltérő
differenciált szövet képződik? Elméletileg kétféle válasz lehetséges: (I) jelentős genomváltozással
(gének elvesztésével, átalakulásával, szövetspecifikus génállomány kialakulásával); (II)
változatlan genom mellett kialakuló szövetspecifikus, differenciált génexpresszióval. Az
ugyanazon szervezet különböző szöveti sejtjeiben mért azonos DNS-mennyiség (a DNS-
állandóság jelensége) a második lehetőséget valószínűsítette.
A (II) lehetőséghez a végső bizonyítékot John Gurdon laboratóriumának klasszikus kísérletei
szolgáltatták (1962). Kísérleti objektumként karmosbékát (Xenopus laevis) használtak (31.1.
ábra). Béka oociták sejtmagjait erőteljes ultraibolya besugárzással roncsolták, majd az enukleált
petesejtekbe mikroinjekcióval ebihalak vékonybélhámjából nyert sejtmagokat juttattak. A
mesterségesen létrehozott „zigóták” nagy része a durva beavatkozást nem élte túl, mások osztódni
kezdtek, de normális fejlődés helyett torz képződményeket eredményeztek. Egyes manipulált
petesejtek normális egyedfejlődésen keresztül ebihalakat, majd békát hoztak létre. A differenciált
szövet sejtmagja tehát petesejt citoplazmájába ültetve normális egyedfejlődést volt képes
irányítani. A kísérletből több fontos következtetés vonható le: (I) a differenciált sejtek
tartalmazzák a zigóta teljes génállományát; (II) a gének jelentős része represszált állapotban van
jelen az érett szöveti sejtekben, a differenciáció tehát a sejt génexpressziós kapacitásának
beszűkülésével jár; (III) a represszált gének bizonyos körülmények között újra aktiválódnak; (IV)
ilyen reaktivációhoz a petesejtben jelenlevő citoplazmatikus faktorok vezethetnek. Mindazokat a
folyamatokat, melyek a sejtmag génműködését befolyásolják, anélkül, hogy DNS-szekvencia
változást idéznének elő, epigenetikai mechanizmusoknak nevezzük (l. később).
A differenciáció folyamata tehát döntően génregulációs jelenség. (A teljességhez hozzátartozik,
hogy a differenciáció speciális eseteiben genomváltozások is elengedhetetlenek. Az
antitesttermelő B limfociták érése során pl. az immunglobulin-gének átrendeződése hozza létre a
sokféle ellenanyag képzéséhez szükséges kódoló kapacitást. Genomváltozást jelent a riboszomális
gének amplifikációja is béka petesejtekben [l. 15. fejezet].) Az élethez nélkülözhetetlen
géntermékek (pl. hisztonok, egyes citoszkeleton fehérjék, nukleinsav-szintetizáló enzimek stb.)
minden szövetben képződnek. Az ezeket kódoló géneket „háztartást fenntartó” (angol kifejezéssel
housekeeping) géneknek nevezzük. A szövetspecifikus gének (pl. globingének) csak a megfelelő
differenciált szövetben expresszálódnak. (A differenciális génexpresszió az RNS-ek és a fehérjék
szintjén is tanulmányozható: hibridizációs, illetve fehérjebiokémiai [immunológiai technikák,
kétdimenziós elektroforézis] módszerekkel.)

140
 31.1. ábra: A Gurdon-kísérlet lényege

Magtranszplantáció emlősökben
A Gurdon-kísérlethez hasonló próbálkozások emlősök esetében sokáig csak korlátozott
eredményekhez vezettek: sikerrel általában akkor kecsegtettek, ha a sejtmag korai embrionális
szövetből származott. 1997 tavaszán óriási médiapublicitást és vitát kiváltó kísérletről számoltak
be skót tudósok: enukleált petesejtből és egy anyaállat emlősejtjének magjából normális bárányt
„állítottak elő”. A tudomány történetében ez volt az első eset, hogy emlősben sikeres
magtranszplantációt hajtottak végre érett szöveti sejt magjával. A felzúdulást és tiltakozásokat
az váltotta ki, hogy a kísérlet sikere megteremtette annak elvi lehetőségét, hogy felnőttek
sejtjeiből nyert magokkal azonos genomú egyedeket állítsanak elő szinte korlátlan számban: az
ember klónozásával beköszöntsön Aldous Huxley „szép új világa”. Dolly, a bárány után más emlős
fajok (szarvasmarha, egér, macska, sőt, embrionális sejtmag transzplantációjával majom)
esetében is történtek sikeres klónozási kísérletek.
A sejtmagklónozás célját tekintve kétféle eljárást különböztetünk meg: a reproduktív és terápiás
klónozást (31.2. ábra). Az emlősfejlődés (31.2.A. ábra) során a megtermékenyített petesejtből
(zigóta) blasztociszta alakul ki, majd a méhnyálkahártyába ágyazódva végülis normális egyeddé
fejlődik. A reproduktív klónozás során (31.2.B. ábra) egy érett testi sejt diploid (2n) magját ültetik
enukleált petesejtbe, melyből szerencsés esetben normális egyedfejlődéssel klónozott egyed
alakul ki. Terápiás klónozás (31.2.C. ábra) során a beteg testi sejtjének magját transzplantálják
petesejtbe, a klónozott blasztocisztából embrionális őssejteket tenyésztenek, melyek
szövettenyészetben mesterségesen bármilyen sejttípussá differenciáltathatók, szükség szerint

141
génterápiás eljárással manipulálhatók és olyan betegségek sejtterápiájára használhatók,
melyekben meghatározott funkciójú sejtek pótlása szükséges (pl. diabetes mellitus, Parkinson-
kór, szívinfarktus stb.). Ez az eljárás a regeneratív medicina tudományágának nagy ígérete lehet:
mivel a klónozott sejtek a beteg génállományát tartalmazzák, bevitelük valószínűleg nem vált ki
immunológiai reakciót, a kilökődés elkerülhető. (A könyv írásának időpontjáig [2011] emberben
terápiás klónozással nem hajtottak végre sejtterápiát.)

31.2. ábra: A normális egyedfejlődés és a reproduktív, illetve terápiás klónozás összehasonlítása

A reproduktív klónozás rendkívül gyenge hatásfokú eljárás: a klónozott állatok nagy része méhen
belül elpusztul. A túlélő klónok gyakran súlyos tüdő, szív, agy, vese, máj rendellenességekkel
születnek, az újszülöttek a normálisnál nagyobb méretűek, később elhíznak, korán öregszenek.
(Dolly is idő előtt pusztult el.) A nehézségeket az okozza, hogy a klónozott sejtmagnak néhány óra
alatt kell(ene) a zigóta stádiumnak megfelelő állapotba „visszaprogramozódnia”, ez a gyors
kromatinátalakítás pedig kevés sikerrel kecsegtet. Az ember reproduktív klónozása jelen
pillanatban nemcsak etikai, hanem szakmai szempontból is elfogadhatatlannak látszik. A terápiás
klónozás megítélése is vitatott, de ennek elfogadása valószínűleg kevesebb akadályba ütközik
majd.

A génexpresszió szabályozásának szintjei eukariotákban

A génexpresszió fogalma alatt az örökletes információ fenotípusban történő megjelenítését értjük;
több lépésből áll, ezek mindegyikét befolyásolhatják szabályozó faktorok (31.3. ábra).

142
 31.3. ábra: Az eukariota génexpresszió szabályozásának szintjei

A transzkripció szabályozása
A génműködés regulációjának leghatékonyabb és legfontosabb módja annak eldöntése, hogy egy
gén átíródjon-e RNS-be és ha igen, milyen aktivitással. Az RNS-szintézis kromatinba rendezett
DNS-templáton folyik, így a gént tartalmazó kromatinállomány állapota eldöntheti a kérdést.
Transzkripció csak laza, dekondenzált kromatinban történhet. Specifikus nem hiszton fehérjék a
H1 hiszton leválasztásával fellazíthatják a szolenoid szerkezetet, más faktorok pedig az átírandó
gén promóter-régiójában található nukleoszómákat destabilizálhatják, lehetővé téve az aktív
iniciációs komplex kialakulását. Különösen fontosnak tartják a nukleoszomális hisztonok
acetilációs-deacetilációs változásait: egyes lizinek aminocsoportjainak acetilációja a töltések
közömbösítésével fellazítja a nukleoszomális szerkezetet, lehetővé téve transzkripciós faktorok
kötődését. Az első kísérleti megfigyeléseket, melyek a hisztonacetiláció klinikai jelentőségére
utalnak, egy izomspecifikus hisztondeacetiláz enzimre deficiens egerekben tették: ezekben a K.O.
egerekben súlyos szívizom-hipertrófia alakult ki. Az acetiláción kívül a hisztonok más kémiai
módosulásoknak is célpontjai. Metilációjuk és foszforilációjuk, attól függően, hogy melyik hiszton
molekula melyik célaminosaván történik, a promóter-kromatin fellazulásához vagy
kondenzációjához is vezethet, a transzkripciót serkenti, illetve gátolhatja is. Mivel a
hisztonfehérjéken több acetilálható, metilálható, foszforilálható hely is található, a kémiai
módosulások sokféle kombinációja a kromatinszerkezet finom szabályozását teszi lehetővé.
Szemben a korábbi szemlélettel, mely a hisztonokat strukturális fehérjéknek és a génműködés
nem-specifikus gátlóinak tekintette, a fentiekben leírt, hiszton-kódnak nevezett modifikációs
mintázat jelentős szerepet szán ezeknek a fehérjéknek a génspecifikus szabályozásban is.
A gének átírását befolyásolja a DNS metilációja is: a génekben előforduló CpG dinukleotidokban a
citozin metilációja a gén inaktivációjához vezet. Egyes génpárok esetében előfordul az, hogy a
maternális és paternális eredetű allélok metiláltsága eltérő: az egyik szülőtől örökölt metilálatlan
gén aktív, míg a másiktól kapott metilált gén inaktív. Ilyen esetekben a kérdéses tulajdonságra
vonatkozó fenotípust nem csak a genotípus határozza meg, hanem az is, hogy az eltérő gének
melyik szülőtől származnak. A jelenség neve: genomiális bevésődés (angol kifejezésse imprinting).
Génpromóterek abnormális (túlzott vagy csökkent) metilációja az érintett gének működési zavara
következtében betegséget is okozhat, jelentőségére elsősorban a daganatos betegségek esetében

143
figyeltek fel (l. 56. és 57. fejezet). Sejtek genomszintű DNS-metilációs profiljának vizsgálata a
genomika új ágának (epigenomika) kialakulásához vezetett.
A DNS-replikáció után a hiszton-modifikációs és DNS-metilációs mintázatok az újonnan képződött
nukleoszómákban, illetve DNS-láncon is kialakulnak. A sejt génexpressziós profilja tehát az
utódsejtekre is öröklődik (epigenetikai öröklődés).
Az utóbbi években kerültek az érdeklődés középpontjába a nem-kódoló RNS-ek. Bár a fehérjéket
és stabil RNS-eket (rRNS, tRNS, snRNS stb.) kódoló szekvenciák a genom 1-2 százalékát teszik csak
ki, kiderült, hogy a genom nagy része átíródik. A nem-kódoló RNS-ek között előfordulnak
specifikus kromatinrégiókhoz kötődő, heterokromatinizációt előidéző molekulák.
A génműködés szabályozásának legfontosabb tényezői a transzkripciós faktorok, melyek DNS-hez
kötődve szabályozzák az RNS-szintézis iniciációjának folyamatát. (Részletesen a következő fejezet
foglalkozik velük.) Szabályozásra ad lehetőséget a transzkriptumok 3’-végének kialakítása is: ha
a transzkripciós egység több poliadenilációs elemet tartalmaz, különböző mRNS-ek képződhetnek
ugyanarról a génszakaszról (pl. az adenovírus késői génrégió esetében, l. 26. fejezet).
A pre-mRNS-érés szabályozása
A pre-mRNS splicing kétféle módon mehet végbe. Konstitutív splicing esetén a pre-mRNS-ből
minden esetben ugyanazok az intronok hasadnak ki, belőle csak egyféle érett mRNS képződhet.
Az alternatív splicing során ugyanabból a pre-mRNS-ből – eltérő splicing-helyek felhasználásával
– különböző érett mRNS-ek képződhetnek; ez természetesen egymástól eltérő fehérjetermékeket
eredményez (31.4. ábra; l. a 26. fejezetet is). A szabályozás szövetspecifikus is lehet: ugyanarról a
génről különböző sejtekben eltérő doménszerkezetű, működésű fehérjék képződhetnek. A
splicinghelyek kiválasztását extracelluláris ágensek (hormonok, növekedési faktorok)
szabályozhatják, a folyamat az egyedfejlődés során is változhat. Az alternatív splicing nagy
mértékben növeli a proteom komplexitását: egyes gének akár többszáz fehérjét is kódolhatnak.
Becslések szerint az emberi genom mintegy 20–25 000 génjéhez többszázezer fehérjéből álló
proteom csatlakozik.
Az alternatív splicing lényegét és jelentőségét a kalcitonin és a CGRP (calcitonin gene-related
peptide) polipeptid példáján mutatjuk be (31.4. ábra). A kalcitonin a pajzsmirigy hormonja.
Hatására a vérplazma kálcium és foszfát ionjai a csontokba rakódnak le. A CGRP-t bizonyos
idegsejtek termelik, értágulatot, vérnyomáscsökkenést okoz. A két polipeptidet ugyanaz a gén
kódolja. Pajzsmirigyben a primer transzkriptumból az első négy exon összekapcsolódásával
képződik mRNS, idegsejtekben viszont az első három exonhoz az 5. és 6. exon kapcsolódik. A
kétféle sejtben tehát ugyanaz a gén eltérő szerkezetű és hatású fehérjéket kódol.

31.4. ábra: Kalcitonin és CGRP mRNS képződése alternatív splicing útján (E1-E6, exonok)

144
Az alternatív RNS-érés egy másik, a splicingtól független formája az RNS-szerkesztés (editing)
jelensége: a mechanizmus a transzkriptum fehérjekódoló régiójában egy nukleotidot kiiktat,
hozzáad vagy megváltoztat, módosítva a fehérjeterméket is. Ez a folyamat is lehet szövetspecifikus
(l. 26. fejezet).
Az RNS-transzport szabályozása
A transzkripció során képződött RNS-ek fehérjékhez kötött formában jutnak ki a citoplazmába a
maghártya pórusain keresztül. Az RNS-export szabályozása annak eldöntését jelenti, mely RNS-
molekulák kerüljenek ki a citoplazmába és melyek degradálódjanak a sejtmagon belül. Az RNS-
transzport mechanizmusairól keveset tudunk, de az bizonyos, hogy RNS-kötő fehérjék (ingázó
hnRNP fehérjék, az 5’-cap-hez kötődő fehérjék stb.) fontos szerepet játszanak benne.
Az mRNS-degradáció szabályozása
Az mRNS-ek szintjét nemcsak szintézisük, hanem lebontásuk üteme is szabályozza. Nukleázokkal
szemben védelmet jelent az 5’-cap, illetve a poli(A)-farok. mRNS-ek 3’-végi nem kódoló régiójában
az mRNS gyors lebontását, illetve viszonylagos védettséget biztosító specifikus szekvenciájú
régiók is lehetnek. Ezek a régiók viszonylag tág határok között, szelektíven szabályozhatják az
egyes mRNS-ek életidejét. Az mRNS-ek életidejét a hozzájuk kapcsolódó fehérjék is szabályozzák.
Egyes sejtek (pl. petesejtek) citoplazmájában specifikus mRNS-ek mRNP partikulumok
formájában tárolódhatnak, inaktív formában. Külső hatásokra az mRNS-ek felszabadulnak és
rajtuk fehérjék szintetizálódnak.
A transzláció szabályozása
A fehérjeszintézis elsősorban az iniciáció folyamatán keresztül szabályozható. Specifikus
iniciációs faktorok foszforilációja befolyásolhatja az 5’-cap riboszómához kapcsolódását, a
metionil-tRNS kötődését. Egyes mRNS-ek 5’-nem-kódoló régiója specifikus szekvenciát tartalmaz.
Az ezt felismerő transzlációs represszor fehérjék szelektíven gátolhatják ezen mRNS-ek
transzlációját anélkül, hogy befolyásolnák a sejt általános fehérjeszintetikus aktivitását.
Nem-kódoló RNS-ek a transzláció szabályozásában is fontos szerepet játszanak. Az siRNS-ek és
miRNS-ek (l. 12. fejezet), bár képződésük és érésük különbözik, hasonló szerkezetű és
hatásmechanizmusú molekulák. Mintegy 22 nukleotidpárból álló kettősláncú RNS-ek, melyek
egyik lánca egy fehérjekomplex-szel együtt komplementer bázispárosodással kapcsolódik cél-
mRNS-ükhöz. Ha a bázispárosodás tökéletes, az mRNS enzimatikusan lebomlik, ha tökéletlen,
degradáció helyett a transzláció gátlódik. Emberi sejtekben kb. 1500 miRNS-t azonosítottak eddig,
ezek célszekvenciája több különböző mRNS-en is jelen lehet. Becslések szerint a humán gének
egyharmadának expresszióját szabályozhatják miRNS-ek. A mechanizmus orvosi jelentőségének
felderítése folyamatban van (l. 57. fejezet).
A fehérje-degradáció szabályozása
A sejt fehérjéinek mennyiségét szintézisük és lebontásuk mértéke szabja meg. Eukariota
sejtekben a fehérje-degradációnak két fő útja lehetséges. A lizoszomális fehérjebontás során
membránnal határolt, lebontásra ítélt sejtalkotórészeket és makromolekulákat tartalmazó
vezikulák (autofagoszómák) képződnek a citoplazmában. Lizoszómákkal fuzionálva
fagolizoszómákat alkotnak és végbemennek bennük a lebontó folyamatok. A proteolízisnek ez a
fajtája kevéssé szelektív.
Specifikus fehérjebontást biztosít az ubikvitin-proteaszóma út. Az ubikvitin – nevéből sejthetően –
minden szövetben jelenlevő, kisméretű polipeptid. Meghatározott peptidrégiót (ún. destrukciós
boxot) tartalmazó fehérjékhez enzimatikus úton kovalens kötéssel több ubikvitin molekulából álló
lánc kapcsolódik. A poliubikvitinált fehérjét nagyméretű proteolitikus komplex (proteaszóma)
ismeri fel és gyorsan degradálja. A folyamat specificitását a célfehérje elsődleges szerkezete és az

145
ubikvitináló enzimek biztosítják. Az ubikvitin-proteaszóma rendszer egyik jól ismert „áldozata” a
ciklin B (l. 18. fejezet): anafázisban bekövetkező villámgyors degradációja szükséges ahhoz, hogy
a sejt be tudja fejezni a sejtosztódást. Az ubikvitin-proteaszóma rendszer a sejt fehérje-
homeosztázisának biztosításában is részt vesz: lebontja a sérült vagy selejtes, abnormális
konformációjú fehérjéket. Előfordul az is, hogy a célfehérjéhez egyetlen ubikvitin molekula
kapcsolódik. Szemben a poliubikvitinációval, a monoubikvitináció nem okozza a fehérje
degradációját, hanem szabályozó hatású: a protein aktivitását vagy sejten belüli lokalizációját
befolyásolja.
Fontos szabályozófehérjék túlzott lebontása emberi betegségek (daganatok, gyulladásos
kórképek, psoriasis [pikkelysömör]) patogenezisében is szerepet játszik. Proteaszóma-gátlók
hatásos gyógyszerek lehetnek ilyen kórképek kezelésében. Ebben az irányban már folynak
klinikai kísérletek.
A fehérjefunkció szabályozása
A legtágabb értelemben véve a génexpresszió mértékét nemcsak a gén által kódolt fehérje
mennyiségével, hanem aktivitásával is jellemezhetjük. A fehérjék aktivitása, működése
nagymértékben függ a térszerkezettől. A fehérjék konformációjának szabályozására több
lehetőség adódik.
Kis molekulák kötődése alloszterikus regulációt biztosít: a szabályozó molekula nem a fehérje aktív
centrumához kapcsolódik (alloszterikus = más helyen ható), kötődése viszont megváltoztatja az
aktív hely konformációját, így a fehérje működését. Az alloszterikus szabályozás számos
példájával foglalkozik ez a könyv (pl. a guaninnukleotid-kötő fehérjék aktiválása GTP-vel; szteroid
hormonok hatása receptorukra, stb).
A fehérjék kovalens módosulásai közül a foszforiláció a legáltalánosabb regulációs mechanizmus
(részletesen l. később). A fehérjékhez észterkötéssel kapcsolódó foszfátcsoportok
konformációváltozást és más makromolekulákhoz való kötődést is eredményezhetnek. Egy
protein foszforiláltságának mértékét proteinkinázok (foszforiláció) és proteinfoszfatázok
(defoszforiláció) ellentétes hatása szabályozza. Egy eukariota sejtben több száz különböző
specifitású fehérjekináz és hasonló számú foszfatáz lehet jelen, rendkívül finom és bonyolult
regulációt biztosítva. A foszforiláción kívül számos egyéb kovalens módosulás (acetiláció,
metiláció, glikoziláció, nitroziláció, monoubikvitináció stb.) befolyásolja a fehérjék működését.
A fehérjeműködés szabályozásának további lehetőségét a polipeptidláncok közötti
egymásrahatások szolgáltatják. Egyes enzimekben regulátor alegység kötődése szabja meg a
katalitikus alegység aktivitását (pl. ciklin/Cdk komplexek, l. 18. fejezet), máskor extracelluláris
hatás idézi elő jelátviteli fehérjék kapcsolódását (pl. hormonreceptorok és célfehérjéik
egymásrahatását, l. később).

146
 32. A génműködés szabályozása III.: Transzkripciós
faktorok
A transzkripciós faktorok olyan DNS-kötő fehérjék, amelyek a génátírást szabályozzák. Transz-
hatású faktorokként specifikus bázisszekvenciájú cisz-hatású DNS-elemekhez kapcsolódnak (l.
30. fejezet). Kötőhelyük és hatásuk alapján két nagy funkcionális kategóriába soroljuk őket: a
gének alapátírását biztosító általános transzkripciós faktorok, valamint a génregulációt végző
szabályozó transzkripciós faktorok kategóriájába. Az előbbiek a szorosabb értelemben vett
promóter-régióhoz, az utóbbiak pedig enhancer-elemekhez kapcsolódva fejtik ki hatásukat.
Az enhancerek mint cisz-hatású elemek, a szabályozott génnel fizikai kölcsönhatásban
működnek. A génhez viszonyított pozíciójukban azonban nagyfokú variabilitás tapasztalható:
egyes enhancerek a promóter közelében, mások egészen távol, sőt a gén „másik oldalán”, a
terminátor mögött helyezkednek el. Fontos az, hogy a kromatin térbeli organizációja lehetővé
tegye, hogy az enhancerhez kötődő fehérjekomplex kontaktust teremthessen a
transzkriptoszómával és így hatást gyakorolhasson a génátírás folyamatára. Ugyanazon gén
szabályozásában többféle enhancer-régió, azaz különböző transzkripciós faktorok is részt
vehetnek és fordítva: egy adott szabályozó fehérje különböző gének enhancer-szekvenciáit
ismerheti fel. A génreguláció tehát rendkívül komplex folyamat: egyrészt, egy gén maximális
aktiválásához különböző környezeti hatásoknak egyidőben kell érvényesülniük; másrészt, egy
bizonyos transzkripciós faktor stimulációja egész géncsoportok expresszióját befolyásolhatja.

Aktivátorok és represszorok
A transzkripciós faktorok célgénjük expresszióját serkenthetik (aktivátorok) vagy gátolhatják
(represszorok).
Az aktivátorok enhancer-régiójukhoz kötődve számos fehérjével (általános transzkripciós
faktorok, mediátor komplex, koaktivátorok [pl. hiszton acetiltranszferáz], transzkripciós
elongációs faktorok, splicing faktorok) létesítenek kapcsolatot, ezáltal serkentve az RNS-
polimeráz promóterhez kötődését és működését. Szabályozásuk sokféle lehet (32.1. ábra). A
„háztartási” gének expresszióját konstitutív transzkripciós faktorok biztosítják. A legtöbb
aktivátort fejlődési vagy jelátviteli folyamatok szabályozzák. Az utóbbiak esetében a serkentő jelet
kívülről a sejtbe kerülő, vagy a sejtben képződőlipidek (leggyakrabban szteroidok), vagy a
sejtfelszín receptorain keresztül ható ágensek biztosítják. Az érintett transzkripciós faktorok, vagy
állandóan a sejtmagban tartózkodnak, vagy a jel hatására transzlokálódnak a sejtmagba. Ezekkel
a folyamatokkal részletesen a jelátvitel tárgyalása (44–51. fejezet) során foglalkozunk.
A represszor fehérjék gátolják a célgének transzkripcióját. Egyesek aktivátor fehérjéket
szorítanak le enhancerükről, mások direkt módon gátolják általános transzkripciós faktorok, vagy
a mediátor komplex működését, vagy korepresszorokat (pl. hiszton dezacetiláz) kötnek meg.

147
 32.1. ábra: Eukariota aktivátor transzkripciós faktorok funkcionális osztályozása

Transzkripciós faktorcsaládok
A transzkripciós faktorok alapvető doménstruktúrája hasonló: tartalmaznak egy DNS-kötő
domént, amely felismeri a megfelelő szekvenciaelemet, és egy aktivációs domént, amely serkenti
az aktív RNS-polimeráz holoenzim kialakulását és katalitikus működését. A transzkripciós faktor
és enhancer elemének bázisai között gyenge, nem-kovalens kötések alakulnak ki, ezek mintázata
határozza meg a kapcsolat specifikus jellegét. A fehérjék elsődleges szerkezete alapján több,
egymástól eltérő családot különböztetünk meg. A ma ismert (emberi sejtekben kb. 2000)
transzkripciós faktor legtöbbje az alábbi típusok valamelyikébe tartozik (32.2. ábra).
Hélix-turn-hélix fehérjék
Ezekben a transzkripciós faktorokban három kiterjedt α-helikális régió alkotja a DNS-kötő
domént, melyeket rövid, flexibilis peptidszakaszok (ezekre utal az angol „turn” szó) választanak
el egymástól (32.2.A. ábra). Jellegzetes képviselőik a homeotikus gének által kódolt homeotikus
fehérjék. Ezek olyan transzkripciós faktorok, amelyek az egyedfejlődés kritikus pontjain hoznak
nagy jelentőségű döntéseket, szervek, egész testrészek kialakulását indukálva (l. 49. fejezet). A
homeotikus géneket eredetileg ecetmuslicában fedezték fel, de megfelelőik gerincesekben, így
emberben is léteznek. A homeotikus gének homeobox-régiókat tartalmaznak, ezek kódolják a
fehérjék DNS-kötő egységét, a homeodomént (l. 50. fejezet).

148
Cinkujjfehérjék
Nevüket DNS-kötő doménjük jellegzetes szerkezetéről kapták (32.2.B. ábra): a polipeptidlánc
ezen régiója kesztyűujjszerű kitüremkedéseket alkot. Az ujjak alapjának kritikus helyeit
ciszteinek és hisztidinek foglalják el, amelyek cinkionnal komplexálódva stabilizálják a DNS-
hélixet „megmarkoló” ujjakat. A cinkujjfehérjék – hasonlóan a legtöbb transzkripciós faktorhoz –
dimerként kötődnek felismerőhelyükhöz. Ebbe a fehérjecsaládba tartoznak a szteroid-receptorok,
illetve az RNS-polimeráz III iniciációs faktoraként működő TFIIIA.

Amfipatikus hélixfehérjék
A transzkripciós faktorok ezen családjába tartozó fehérjék nevüket különleges szerkezetű
dimerizációs doménjükről kapták (32.2.C. ábra). Tartalmaznak ugyanis egy olyan régiót, mely α-
helikális szerkezetű és a hélixet alkotó aminosavak aszimmetrikus eloszlásúak: egyik oldalra
apoláros oldalláncok lokalizálódnak, míg a hélix másik fele poláros jellegű. Ez az amfipatikus hélix
úgy alakulhat ki, hogy a polipeptidlánc ezen szakaszának minden hetedik aminosava apoláros
(többnyire leucin); az α-hélix-ben így minden második fordulat ugyanazon oldalára leucin esik (az
α-hélix egy csavarulatát 3.5 aminosav alkotja). A transzkripciós faktor dimer szerkezete úgy
alakul ki, hogy az amfipatikus hélixek leucinjai egymásba illeszkedve hidrofób kölcsönhatásokat
létesítenek. Az amfipatikus hélixfehérjék egyik alfaja éppen innen kapta nevét: leucin-cipzár
fehérjék. Legismertebb képviselőjük az AP1-faktor, mely ún. Fos- és Jun-fehérjék dimerje (ezekkel
részletesen az onkoproteinekkel kapcsolatosan később foglalkozunk). Leucin cipzárral
dimerizálódnak a hélix-loop-hélix (HLH) fehérjék is, ezekben azonban a dimerizációs domént
hajlékony hurok (loop) szakítja meg. Ennek az alcsaládnak ismert képviselője az izomszövet
differenciációjában kulcsszerepet betöltő Myo-D fehérje. Az amfipatikus hélixfehérjék dimerjei
bázikus jellegű DNS-kötő doménjükkel kapcsolódnak enhancer-elemükhöz.

32.2. ábra: Transzkripciós faktor családok

149
 A szteroid-receptor szupercsalád: ligand-aktivált transzkripciós
faktorok
A szteroidok kisméretű, apoláros molekulák (l. 4. fejezet). Lipidoldékonyságuknál fogva könnyen
átjutnak a sejthártya foszfolipid kettős rétegén, minden sejtbe bejutnak. Célsejtjeikben
intracelluláris receptorokhoz kapcsolódnak és felhalmozódnak, fiziológiás hatásaikat receptorhoz
kötött formában váltják ki. Ez a hatásmechanizmus nemcsak a szteroid-hormonokra
(glukokortikoidok, ösztrogének, progeszteron, androgének stb.), hanem az ugyancsak szteroid
természetű D3-vitaminra, a karotinoid retinsavra (l. 4. fejezet), sőt az apoláros
aminosavszármazék tiroxinra is jellemző. Ezen ágensek receptorai is rokonságot mutatnak:
szteroid-receptor szupercsaládról beszélünk.
A szteroidok közül a glukokortikoidok transzkripciós hatásának mechanizmusa a legjobban ismert
(32.3. ábra). A hormonok célsejtjeikben citoszólreceptorokhoz kapcsolódnak. Kezeletlen sejtekben
a receptor gátló chaperone fehérjével komplexálódva, inaktív formában van jelen. A
hormonmolekula felszabadítja az inhibitor-fehérjét és a szteroid-receptor komplex
transzlokálódik a sejtmagba. A cinkujjfehérjék családjába tartozó receptor transzkripciós
faktorként felismeri a glukokortikoid által szabályozott génekhez csatlakozó enhancer-elemét
(glukokortikoid-reszponzív elemnek nevezzük) és hozzákapcsolódva megváltoztatja a gén
expresszióját. A folyamat rendkívül bonyolult, hiszen a hormon-receptor komplex, transzkripciós
faktorhoz illően, az RNS-polimeráz II gépezet számos elemével kerül kölcsönhatásba.

32.3. ábra: A glukokortikoidok sejtszintű hatásmechanizmusa

Transzkripciós faktor betegségek

Az RNS-szintézist szabályozó fehérjék sokrétű, nagy jelentőségű funkciót látnak el a soksejtű
szervezetekben. Szükségesek az egyed normális fejlődéséhez és a differenciált szövetek normális
működéséhez, a szövetspecifikus génexpresszió szabályozásához, a sejtszaporodás kontrolljához.
A ma ismert, többezer transzkripciós faktor szövetspecifitása széles határok között változik: a már
említett AP1-faktor ubikviter fehérje, a szteroid-receptorok csak a megfelelő hormon célsejtjeiben
expresszálódnak, más faktorok szigorúan szervspecifikusak (a Pit-1 transzkripciós faktor például
kizárólag a hipofizis elülső lebenyében mutatható ki). A génjeiket érintő mutációknak tehát
változatos következményei lehetnek: többnyire letálisak, az élettel összeegyeztethető mutációk
pedig sokféle kórképet okozhatnak. A transzkripciós faktor betegségek molekuláris
patológiájának tisztázása csak az utóbbi években kezdődött meg.

150
Fejlődési rendellenességek
A morfogenezis veleszületett zavarainak hátterében gyakran állnak transzkripciós faktor
rendellenességek. Jellegzetes példa a kombinált adenohipofízis hormon-deficiencia: a
homeodomén fehérjék közé tartozó Pit-1 transzkripciós faktor működészavara következtében
nem fejlődnek ki a hipofízis elülső lebenyében a növekedési hormont, pajzsmirigyserkentő
hormont és prolaktint termelő sejtek. Az eredmény: hipofizer törpeség és szellemi
visszamaradottság.
Endokrin kórképek
A szteroid-receptor szupercsalád tagjainak genetikai károsodása a célsejtek
hormonérzékenységének zavarát okozza. Testicularis feminisatioban a beteg kromoszómálisan
hímnemű (XY), célsejtjeinek androgén-receptorai azonban hiányoznak. Így a herék és androgén
hormonok megléte ellenére a férfi nemi jellegek helyett látszólag normális női fenotípus alakul ki,
petefészek és normális női nemiszervek nélkül. A tiroxin-rezisztencia és a D-vitamin-rezisztens
angolkór ugyancsak a megfelelő receptor hiányára vezethető vissza.
Daganatos betegségek
A génexpresszió szabályozásában onkogén és antionkogén transzkripciós faktorok is szerepet
játszanak. Az onkogén hatású faktorok által okozott génaktiváció fokozza a sejtek proliferációját,
az antionkogén (tumor szuppresszor) faktorok génregulációs hatása pedig gátolja a sejtosztódást.
A kétféle szabályozás egyensúlya normális sejtszaporodást, annak felborulása pedig tumoros
sejtburjánzást okoz. Az onkogén és tumor szuppresszor transzkripciós faktorok
daganatképzésben játszott szerepével részletesen későbbi fejezetekben (l. 54. és 55. fejezet)
foglalkozunk.

151
33. Vezikuláris transzport I.: Fehérjék és lipidek szintézise
az endoplazmatikus retikulumban
Eukariota sejtekben a citoplazma állományának jelentős részét összefüggő csöveket és lapos
zsákokat alkotó bonyolult membránrendszer, az endoplazmatikus retikulum foglalja el, amely
a sejt legnagyobb organelluma (a sejt összes membránjának mintegy fele tartozik az
endoplazmatikus retikulumhoz). A membránok egy részének citoszól felőli felszínét riboszómák
borítják (durva felszínű endoplazmatikus retikulum), másik része sima felszínű. A durva és sima
felszínű endoplazmatikus retikulum tiszta formában izolálható: a sejtfrakcionálás során nyert
mikroszóma-frakcióból szacharóz grádiens centrifugálással különíthetők el a kisméretű
vezikulákká töredezett granulált és sima felszínű membránok. Az endoplazmatikus retikulum
közvetlen kapcsolatban áll a maghártyával, a Golgi-apparátussal és rajta keresztül a sejthártyával
közvetve, transzport vezikulák útján létesít összeköttetést. Az említett membránok egyik felszíne
a citoszóllal érintkezik (citoplazmatikus felszín), a másik pedig az organellum lumene, a sejthártya
esetén pedig az extracelluláris tér felé néz (exoplazmatikus felszín).
Az endoplazmatikus retikulum fontos bioszintetikus folyamatok színhelye: a sejt számos
fehérjéjének szintézise és érése a durva felszínű endoplazmatikus retikulumban zajlik, míg a sima
felszínű membránok egyik fontos funkciója a lipidek szintézise. A képződött fehérjék és lipidek
apró transzport vezikulák formájában jutnak el a végső állomáshelyüket jelentő organellumokba.
Az endoplazmatikus retikulum tehát a vezikuláris transzportfolyamatok fontos résztvevője.

Fehérjeszintézis a durva felszínű endoplazmatikus retikulumon

Szabad és kötött riboszómák
Az eukariota sejt szabad és membránhoz kötött riboszómái egyenértékűek: hasonló kémiai
összetétellel és fehérjeszintetikus aktivitással rendelkeznek. Funkciójuk azonban különbözik: a
szekréciós fehérjék, az endoplazmatikus retikulum, a Golgi-apparátus, a lizoszómák és a
sejthártya fehérjéi kötött riboszómákon képződnek, az állati sejt többi proteinjének szintézisét
viszont (néhány mitokondriális fehérjét leszámítva) szabad poliszómák végzik. Már a 60-as
években felmerült a kérdés: milyen mechanizmus dönti el, hogy egy mRNS-molekula transzlációja
hol történik?
Fehérjék kotranszlációs transzportja az endoplazmatikus retikulumba
Minden mRNS transzlációja szabad riboszómán kezdődik. Az endoplazmatikus retikulumba
„szánt” polipeptidláncok N-terminális régiójában van egy hidrofób aminosavakban gazdag
szignálszekvencia, amely a képződő láncot és a szintézisét végző riboszómát is a membránhoz
irányítja (33.1. ábra). A szignálszekvenciával egy citoplazmatikus RNP-szemcse, a szignálfelismerő
partikulum (angolul signal recognition particle, SRP) létesít kapcsolatot és ideiglenesen
felfüggeszti az elongációt a riboszóma felszínén. Az SRP specifikus kötőfehérjét, SRP-receptort
ismer fel az endoplazmatikus retikulum felszínén. A membránhoz kötődő riboszóma naszcens
polipeptidlánca több fehérjéből felépülő transzmembrán csatornába illeszkedik, kinyitja annak
üregét és becsúszik az endoplazmatikus retikulum lumenébe, miközben a feleslegessé vált SRP
felszabadul a citoszólba. A riboszóma kívülről szorosan lezárja a csatornát, a növekedő fehérjelánc
pedig egyre beljebb kerül az endoplazmatikus retikulum lumenébe. A folyamatot
fehérjetranszlokációnak nevezzük, és mivel időben egybeesik a polipeptidlánc elongációjával,
kotranszlációs fehérjetranszportról beszélünk.

152
 33.1. ábra: Szekréciós fehérje szintézise és transzlokációja az endoplazmatikus retikulumba (ER)
Az újonnan szintetizált polipeptidlánc N-terminális régióját egy szignál-peptidáz általában már a
transzlokáció közben lehasítja. A fehérje további sorsa attól függ, tartalmaz-e egyéb
szignálszekvenciákat is. Ha nem, terminációja után szolubilis fehérjeként szabadul fel az
endoplazmatikus retikulum lumenébe. A szintetizálódó membránfehérjéket hidrofób jellegű α-
helikális régiók horgonyozzák ki a membrán lipidrétegébe (33.2. ábra). Ezek a topogén
szekvenciák a fehérje membránon belüli orientációját is meghatározzák: egyes fehérjék (pl. az
inzulin receptora) N-terminálisukkal, mások (pl. a vasionokat szállító transzferrin fehérje
receptora) C-terminálisukkal érintkeznek az exoplazmatikus felszínnel. Ismét más fehérjék
multiplex topogén szekvenciákkal rendelkeznek: akár 7 (pl. az adrenalin β-adrenerg receptora)
vagy 12 (pl. a glukóztranszporter) transzmembrán α-hélixük is lehet.

33.2. ábra: Az endoplazmatikus retikulumon szintetizálódó membránfehérjék topológiája (a. az

inzulinreceptor α-alegysége; b. transzferrinreceptor; c. glukóztranszporter; d. β-adrenerg receptor)

Fehérjék poszttranszlációs módosulása az endoplazmatikus retikulumban

A membránhoz kötött riboszómákon szintetizált polipeptidláncok különböző modifikációs
reakciókon mehetnek keresztül, míg végső, funkcióképes formájukat elérik. Ezek egy része már

153
az endoplazmatikus retikulumban megtörténik, mások viszont a vezikuláris transzport későbbi
állomáshelyein (a Golgi-apparátusban, szekréciós granulumokban) mennek végbe.
A poszttranszlációs módosulások egyik legáltalánosabb formája a fehérjeglikoziláció:
oligoszacharid egységek kapcsolódása a fehérjelánchoz. A folyamat részleteivel a következő
fejezet foglalkozik.
Kovalens módosulást jelent a diszulfidhidak kialakítása is. Ez az endoplazmatikus retikulum
oxidatív jellegű közegében mehet végbe: egymáshoz közel kerülő ciszteinek szulfhidrilcsoportjai
hidrogént veszítve diszulfidkötéseket hoznak létre. (A citoszól redukáló „légköre” nem kedvez a
diszulfidhidak kialakulásának.) A normális, natív fehérjeszerkezet létrejöttéhez a
diszulfidkötéseknek a polipeptidlánc(ok) meghatározott pontjai között kell kialakulniuk. A
protein diszulfidizomeráz enzim feladata a naszcens fehérjeláncban megjelenő diszulfidhidak
átrendezése, a normális fehérjekonformáció kialakítása (33.3. ábra).

33.3. ábra: A natív polipeptidláncra jellemző diszulfidkötések kialakítása a protein

diszulfidizomeráz segítségével
A fehérjekonformációt nem kovalens kötések is stabilizálják. Ezek kialakulását, a polipeptidlánc
korrekt felcsavarodását chaperone fehérjék katalizálják. A növekedő fehérjelánchoz kötődnek,
megakadályozva annak denaturációját, aggregátumok képződését. A BiP-fehérje (= binding
protein, azaz kötőfehérje) az endoplazmatikus retikulum lumenének szolubilis chaperone-ja, a
kalnexin pedig transzmembrán fehérje. A kalretikulin, a BiP-hez hasonlóan, a lumenben
lokalizálódó chaperone; feladata a glikozilált fehérjék (l. 34. fejezet) oligoszacharidjának
ellenőrzése, hiba esetén a kijavítás biztosítása. A natív fehérjefelcsavarodás elősegítése mellett a
chaperonok szerepet játszanak oligomer protein-komplexek „összeszerelésében” is. Az említett
chaperone-ok minőségellenőrző funkciót is ellátnak: preferenciálisan kötődnek abnormális
konformációjú fehérjékhez, visszatartják őket az endoplazmatikus retikulumban, meggátolva
sérült proteinek eljutását végső állomáshelyükre. A kijavíthatatlan konformációs hibával
rendelkező fehérjék visszajutnak a citoszólba (retrotranszlokáció), ahol az ubikvitin/proteaszóma
rendszer „takarítja el” őket (l. 31. fejezet). Ez a minőségkontroll a sejtre nézve hátrányos
következményekkel is járhat: a cystás fibrosis vagy a familiaris hypercholesterinemia egyes eseteit
az okozza, hogy az érintett génekben bekövetkezett mutáció megakadályozza a géntermék
eljutását a sejthártyába (l. 35. és 42. fejezet). Extrém körülmények között az endoplazmatikus
retikulumnak ez a minőségbiztosítási rendszere túlterhelődhet. Ha az endoplazmatikus
retikulumban túlságosan sok abnormális konformációjú fehérje képződik (pl. magas
hőmérsékleten, oxidatív stressz esetén, vírusfertőzés során), a sejt fokozott chaperone-
termeléssel, a proteaszómális fehérjelebontás aktiválódásával, végső esetben programozott
sejthalállal reagál. A folyamat neve endoplazmatikus retikulum stressz.

154
 Membránlipidek szintézise a sima felszínű endoplazmatikus
retikulumban
A membránnövekedéshez membránfehérjék szintézisén kívül lipid molekulák képzésére is
szükség van. A foszfolipidek, glikolipidek és koleszterin bioszintézise a sima felszínű
endoplazmatikus retikulumban folyik.
A foszfolipid-szintézis az endoplazmatikus retikulum membránjának citoplazmatikus rétegében, a
citoszólban fellelhető komponensekből történik. Az újonnan szintetizált foszfolipidek először
ebben a rétegben halmozódnak fel, majd a foszfolipid-flippáz enzim segítségével egyes molekulák
transzlokálódnak az exoplazmatikus rétegbe (33.4. ábra). A sejt többi membránnal határolt
organelluma kétféle mechanizmussal tehet szert új foszfolipid molekulákra. Vezikuláris transzport
útján a szekréciós útvonal alkotórészei (Golgi-apparátus, szekréciós granulumok, lizoszómák stb.)
kapnak új membránrégiókat. A foszfolipid-kicserélő fehérjék viszont az endoplazmatikus
retikulum citoplazmatikus lipidrétegéből emelnek ki foszfolipid molekulákat és a citoszólon
keresztül továbbítják őket más organellumok (pl. a mitokondriumok) membránjába.
Különösen fejlett sima felszínű endoplazmatikus retikulumot tartalmaznak azok a sejtek,
amelyekben aktív szteroidszintézis folyik: a herében, a petefészekben, a mellékvesekéregben
szteroidhormonok, a májban epesavak képződnek koleszterinből. A foszfolipidek és szteroidok
szintézise bonyolult enzimatikus folyamatok sorozatából áll, ezek részleteivel a biokémia
tudománya foglalkozik.

33.4. ábra: Foszfolipidek transzlokációja az endoplazmatikus retikulum membránban

155
 34. Vezikuláris transzport II.: A szekréciós út. Fehérje-
glikoziláció és -szortírozás
A múlt század végén idegsejtekben nehézfém-impregnácós technikával tett láthatóvá Golgi egy, a
sejtmagot kosárszerűen körülvevő hálózatos állományt. Sokáig preparációs műterméknek
tekintették, majd létének elektronmikroszkópos igazolása után funkciójával kapcsolatban alakult
ki tanácstalanság. Ma már tudjuk, hogy a Golgi-komplex az eukariota sejtekben zajló
makromolekuláris transzport folyamatok egyik irányító központja.

A szekréciós út
A durva felszínű endoplazmatikus retikulumban képződő szekréciós, lizoszomális és
membránfehérjék kisméretű membránhólyagok közvetítésével, vezikuláris transzport útján érik
el végső állomáshelyüket. A háromféle fehérje sejten belüli szállítását lényegében ugyanaz a –
közös néven szekréciós útnak nevezett – mechanizmus biztosítja. Ez az út a durva felszínű
endoplazmatikus retikulumból a Golgi-komplexbe vezet, majd itt válik szét a lizoszómába, illetve
a sejtfelszínre vezető utakra (34.1. ábra). A lizoszómák képződésével a 36. fejezet foglalkozik, itt
a szekréció mechanizmusát ismertetjük.
Fehérjéket minden sejt szekretál (ha mást nem, a környező sejt közötti állomány
struktúrfehérjéit), a mirigysejtek azonban különösen alkalmasak a szekréció mechanizmusának
vizsgálatára. Rövid ideig [3H]aminosavval jelölt hasnyálmirigy acinus sejttenyészetet jelöletlen
aminosav jelenlétében tovább inkubálva (pulse-chase jelölés) a szekréciós fehérjék sejten belüli
útja elektronmikroszkópos autoradiográfiával (l. 7.2. ábra) vagy fehérjeszeparációs módszerekkel
figyelemmel kísérhető.
A szekrécióra szánt fehérjék az endoplazmatikus retikulum lumenébe kerülnek (l. 33. fejezet),
majd az arról lefűződő, speciális fehérjeburokkal rendelkező transzport vezikulák (ún. COPII
vezikulák) közvetítésével a Golgi-komplexbe jutnak. A Golgi-apparátus lapos membránzsákokból
felépülő, polaritással rendelkező sejtorganellum: cisz oldala az endoplazmatikus retikulum felől
fogadja, transz oldala pedig a sejtmembrán felé továbbítja a szekretálandó anyagokat; a transzport
tehát vektoriális jellegű. A COPII vezikulák a cisz-Golgi retikulum membránjával fúzionálva
továbbítják tartalmukat, mely a ciszternák érésével cisz-, középső-, majd transz-Golgi rekeszekké,
végül transz-Golgi retikulummá alakul át. A Golgi-apparátuson keresztül haladó fehérjék érési
folyamatokon mehetnek át (pl. glikoziláció, l. később). Az egyes ciszternák specifikus
enzimrendszerekkel rendelkeznek ezen érési módosítások végrehajtásához. Az endoplazmatikus
retikulumhoz tartozó fehérjék visszajuttatása a Golgi-komplexből, illetve az egyes Golgi-rekeszek
enzimkészletének fenntartása COPI burkolatú vezikulákkal történik: ezek a ciszterna-maturáció
során a transz-oldalra kerülő Golgi-enzimeket visszajuttatják eredeti ciszternájukba, vagy az
endoplazmatikus retikulumba. A Golgi-apparátus jelenleg leginkább elfogadott működési
modellje szerint tehát benne az anterográd transzport ciszterna-maturáció, a retrográd mozgások
viszont vezikuláris traszport útján valósulnak meg (34.1. ábra).

156
 34.1. ábra: A szekréciós út: lizoszómák képződése, szabályozott és folyamatos szekréció
A Golgi-komplexbe kerülő fehérjék szortírozása a transz-Golgi retikulumban történik. További
sorsukat a bennük levő szignálszerkezetek döntik el: ezek lehetnek specifikus aminosavsorrendű
szignálszekvenciák, meghatározott konformációjú régiók (ún. szignálfoltok) vagy
oligoszacharidok (pl. a lizoszomális enzimekre jellemző mannóz-6-foszfátot tartalmazó
oligoszacharid, l. 36. fejezet). Az egyes fehérjék a transz-Golgi hálózat meghatározott régióiban
elhelyezkedő receptorfehérjékhez kötődnek, így az ezekből lefűződő vezikulák ugyanazon helyre
szánt fehérjepopulációkat tartalmaznak.
A szekréció kétféle mechanizmussal mehet végbe (34.1. ábra). A szabályozott szekrécióval
kiválasztott fehérjék a sejtfelszín alatt szekréciós granulumokban tárolódnak. Ezek a szemcsék
érésük során vizet veszítenek, így tartalmuk egyre sűrűbb, elektronszóróbb lesz. A leadásra szánt
fehérjék érése is a szekréciós granulumokban fejeződik be: proteolitikus hasítások hatására a
proproteinekből érett fehérjék képződnek. Az A, B és C régióból álló proinzulinból pl.
endoproteináz hasítja ki a középső C-peptidet, a diszulfidhidakkal összekapcsolt A és B
peptidláncból így kialakul az érett inzulin hormon. Exocitotikus kiürülésük a sejtet érő stimuláló
hatásra következik be: a pancreas acinus sejtjeiből paraszimpatikus ingerület hatására ürülnek ki
az emésztőenzimek, az inzulinszekréciót a vércukorszint emelkedése idézi elő a Langerhans-

157
szigetek sejtjeiben. A transz-Golgi retikulum és a sejtfelszín között környezeti hatásoktól
független, transzportvezikulák által közvetített, folytonos, konstitutív szekréció is végbemegy. Ez a
mechanizmus is juttathat fehérjéket az extracelluláris térbe: így szekretálódnak a mátrixfehérjék,
a plazmasejtekből az antitestek, a májsejtekből az albumin. A folytonos exocitózis másik
jelentősége a sejtmembrán alkotórészeinek, fehérjéknek, lipideknek a pótlása. Vannak sejtek,
melyekben a sejthártya egyes régiói eltérő összetételűek, pótlásuk a transzportvezikulák célzott
exocitózisát igényli. Ilyen polarizált sejtek a vékonybél hámsejtjei (34.2. ábra): apikális és
bazolaterális membrándoménjükbe eltérő transzportvezikulák olvadnak bele. Ez a finoman
regulált vezikula-szortírozás az egyik előfeltétele a vékonybél normális működéséhez
elengedhetetlen transzepiteliális transzportnak (l. 42. fejezet).

34.2. ábra: Vezikuláris transzport vékonybél polarizált epiteliális sejtjeiben

Fehérje-glikoziláció
Az endoplazmatikus retikulumban és a Golgi-komplexben számos fehérje glikozilálódik:
kovalensen kötött szénhidrátkomponensre tesz szert. A fehérjékhez (és lipidekhez) kötött
oligoszacharidok szintézise rendkívül bonyolult folyamat: több száz enzim vesz részt benne. A
glikoziláció szekréciós, membrán- és lizoszomális fehérjékre jellemző elsősorban, de bizonyos
citoszól- és magfehérjékhez (pl. transzkripciós faktorokhoz) is kötődnek cukor molekulák. Az
utóbbiak esetében egyetlen N-acetil-glukózamin kapcsolódik a fehérjéhez, megváltoztatva,
szabályozva annak aktivitását. Az endoplazmatikus retikulumon szintetizálódó fehérjékhez
kapcsolódó oligoszacharidok szortírozó szignálként működhetnek (pl. a lizoszomális
enzimekben), elősegíthetik a funkcióképes konformáció kialakulását, fehérjekomplexek
„összeszerelését”, a polipeptidlánc stabilizálását, sejt–sejt és sejt–extracelluláris mátrix
kapcsolatok létesítését.
A cukoregységek kapcsolódását glikoziltranszferázok, az endoplazmatikus retikulum és a Golgi-
apparátus integráns membránfehérjéi végzik. Szubsztrátjaik nukleotid-cukor komplexek (pl. CMP-
sziálsav, UDP-galaktóz, GDP-mannóz, stb.): a glikozilációhoz szükséges energiát a nukleotid és
cukor közötti nagy energiájú kötés hidrolízise biztosítja.

158
A glikoproteineknek két fő típusa különböztethető meg (34.3. ábra): az N-kötésű
glikoproteinekben a szénhidrátrész az aszparagin savamid csoportjához, az O-kötésű
glikoproteinekben pedig a szerin, treonin vagy hidroxilizin hidroxilcsoportjához kapcsolódik. A
glikoproteinek két típusa számos vonatkozásban eltér egymástól.

34.3. ábra: N-kötésű és O-kötésű fehérjeglikoziláció

N-kötésű glikoziláció
A folyamat a durva felszínű endoplazmatikus retikulumban kezdődik. Az oligoszacharid egy
poliizoprenoid típusú membránlipiden, a dolicholon szintetizálódik, majd egészben helyeződik át
a képződő fehérjeláncra (34.4. ábra). A dolichol-oligoszacharid prekurzor szintézise a membrán
citoszól felőli felszínén kezdődik, majd a komplex egy flippáz segítségével áthelyeződik a lumen
felőli oldalra és a szénhidrátrész felépítése itt fejeződik be. A kész, 14 egységből álló
oligoszacharid prekurzor szigorúan meghatározott szerkezetű: 2 N-acetilglukózamin, 9 mannóz
és 3 glukóz molekula alkotja, pirofoszfát hídon keresztül kapcsolódik a dolicholhoz. Az
oligoszacharid prekurzort az oligoszacharid-protein transzferáz enzim viszi át a naszcens
fehérjelánc egyik aszparagin oldalláncára (34.4. ábra). Az N-kötésű glikoprotein ezután érési
folyamaton megy keresztül, melynek során egyes cukoregységek lehasadnak, ugyanakkor további
monoszacharidok is kapcsolódnak a szénhidrát részhez. Az érés az endoplazmatikus
retikulumban kezdődik, a Golgi-ciszternákban folytatódik és számos enzimatikus lépésen
keresztül végül is három érett oligoszacharid-típust eredményez: mannózgazdag, hibrid és
komplexoligoszacharidokat (34.5. ábra).
O-kötésű glikoziláció
Az O-kötésű oligoszacharidok kisebb méretűek, általában csak néhány cukoregységből állnak.
Ezekre a szénhidrátrészekre nem jellemző a közös szerkezet: magán a polipeptidláncon
szintetizálódnak, cukoregységek egyenként történő, specifikus glikoziltranszferázok által
katalizált hozzáadásával. Az O-kötésű glikoziláció a Golgi-apparátusban zajlik.
A glikoziláció folyamatai radioaktív cukorprekurzorokkal végzett jelöléssel tanulmányozhatók,
mind elektronmikroszkópos autoradiográfiás, mind fehérjeszeparációs módszerek
alkalmazásával. [3H]mannóz jelölés esetén az endoplazmatikus retikulumban, [3H]galaktóz adása
után pedig a Golgi-komplexben mutathatók ki először radioaktív fehérjék, bizonyítva, hogy az N-
típusú glikoziláció az endoplazmatikus retikulumban, az oligoszacharid érés és az O-típusú
glikoziláció viszont döntően a Golgi-apparátusban történik.

159
 34.4. ábra: Az oligoszacharid-protein transzferáz reakció

34.5. ábra: Az oligoszacharid prekurzorból képződő érett szénhidráttípusok az N-kötésű

glikoproteinekben

A glikoziláció orvosi jelentősége

A sejtfelszínen elhelyezkedő glikoproteinek és glikolipidek fontos szerepet játszanak fiziológiás
(sejt-sejt, sejt-matrix kapcsolatok, immunválasz) és kóros folyamatokban (vírus-fertőzés,
daganatképződés) is. A glikoziláció során keletkező oligoszaccharidokat alkotó mintegy 10
cukormolekula óriási számú strukturális kombinációt hozhat létre. A glikozilált makromolekulák
strukturális és funkcionális vizsgálata, illetve az ezen kutatások alapján történő
gyógyszerfejlesztés már folyik. A funkcionális glikomika (a glikoproteinek, glikolipidek és
oligoszaccharidok tudománya) egyike a modern alkalmazott biológiai kutatások
legperspektivikusabb területeinek.

160
 35. Vezikuláris transzport III.: Az endocitotikus út
Eukariota sejtekben a vezikuláris transzport két nagy rendszerét különböztetjük meg: a
szekréciós és az endocitotikus utat. A szekréciós út (mellyel az előző fejezet foglalkozott) az
endoplazmatikus retikulumból indulva a sejtfelszín felé irányul. Az endocitotikus út ezzel
ellentétes folyamat: a sejtmembránról lefűződő vezikuláknak a sejt belsejébe juttatását,
makromolekulák internalizációját jelenti.

Az endocitotikus út
A felvett molekulák sorsa
Az endocitózis során a sejthártya érintett régiója besüpped, majd a folyadékkal telt üreg addig
mélyül, amíg a képződő vezikula lefűződik a sejtfelszínről és a citoplazma belsejébe kerül.
Intracelluláris mozgását mikrofilamentumok és mikrotubulusok biztosítják. A vezikulának és
tartalmának többféle sorsa lehet (35.1. ábra).

35.1. ábra: Az endocitotikus vezikulumok sorsa a sejtben: 1. degradáció; 2. tárolás; 3. transzcitózis

Degradáció. Az endocitotikus vezikula leggyakrabban emésztőenzimekkel töltött primer
lizoszómákkal fuzionál; a képződő szekunder lizoszómában a felvett makromolekulák
építőköveikre hidrolizálnak.
Tárolás. Az endocitotikus vezikulák nagyméretű raktározó vezikulává olvadhatnak össze. Így
tárolódnak például a tyúktojásba transzportált tojássárgája-fehérjék.
Transzcitózis. A sejt egyik oldalán endocitózissal felvett anyagok áthaladnak a citoplazmán, majd
a másik oldalon exocitózissal távoznak. Transzcitózis minden epiteliális sejtben zajlik. Így
szívódnak fel például intakt állapotban az anyai ellenanyagok az újszülöttek vékonybélhámján
keresztül, vagy kerülnek antitestek az anyatejbe az emlőkapillárisok endoteljén keresztül.
Az endocitózis típusai
Fagocitózis. A folyamat során a sejt nagyméretű részecskéket, baktériumokat, vírusokat,
elpusztult sejtek törmelékét internalizálja (részletek a következő fejezetben).
Pinocitózis. A sejtek felszínéről folyamatosan fűződnek le a citoplazmába kisméretű vezikulák. A
pinocitózis célja egyrészt a sejtfelszín közelében elhelyezkedő, vízben oldott anyagok nem
specifikus módon történő felvétele, másrészt viszont az ugyancsak folytonos, nem szabályozott
exocitózis által megnövelt sejtmembrán feleslegessé vált komponenseinek visszajuttatása a sejt
belsejébe.
Receptor által közvetített endocitózis. Bizonyos anyagok internalizációja csak akkor történhet
meg, ha sejtfelszíni specifikus receptorfehérjéhez kapcsolódva beindítják az endocitotikus

161
folyamatot. A ligand-receptor kapcsolat rendkívül specifikus. A receptor által közvetített
endocitózisra számos példát ismerünk: membránnal burkolt vírusok (pl. influenzavírus) így
jutnak be a fertőzött sejtbe; a vasszállító transzferrin fehérje felvétele is így történik a célsejtek
által. A legalaposabban vizsgált folyamat azonban a koleszterin bejutása a sejtekbe.
Az LDL-partikulumok endocitózisa
A számos biológiailag fontos szteroidvegyület előanyagául szolgáló és mellesleg
membránalkotóként is eszenciális koleszterin hosszú szénláncú zsírsavval észterifikált formában
szállítódik a véráramban. Az LDL-partikulum (az angol low density lipoprotein, azaz alacsony
sűrűségű lipoprotein rövidítése) az erősen hidrofób koleszterinészter vízoldékony formája: a
részecske belsejét alkotó koleszterinésztert egyrétegű foszfolipidburok veszi körül, melybe
egyetlen polipeptidlánc, az apolipoprotein B (röviden apoB) fehérje ágyazódik be. Az LDL a
koleszterin transzportformája: a sejtek felveszik és felhasználják. Ha ez nem történik meg,
felhalmozódik a vérben, lerakódik az erek falában és atherosclerosis kialakulásához vezet. Az
atheroscleroticus plakkok előbb-utóbb thrombusképződéshez vezetnek és súlyos
következménnyel járó érelzáródást (pl. szívinfarktus, agyi erek thrombosisa) okozhatnak.
Az LDL-partikulumok a sejthártya citoplazmatikus felszínét borító klatrinrétegbe ágyazott
receptorokhoz kapcsolódnak (35.2. ábra). Az LDL-receptor transzmembrán glikoprotein, amely a
legtöbb sejtben expresszálódik, különösen nagy számban a szteroidogén szövetek sejtjeiben. (A
májsejtek epesavakat, a mellékvesekéreg és a gonádok sejtjei szteroid hormonokat
szintetizálnak.) A ligandkötés által indukált endocitózis klatrinnal bevont vezikulát eredményez,
amely a klatrinréteg leválása után korai endoszómábaolvad bele. Az ebben uralkodó savas pH
disszociálja a ligand-receptor kötést, az endoszómáról lefűződő reciklizálóvezikulák pedig
visszajuttatják az LDL-receptorokat a sejtmembránba. Az LDL-partikulumokat
transzportvezikulák továbbítják a késői endoszómába. Ez a Golgi-apparátusból érkező primer
lizoszómákkal fuzionál. Az LDL-partikulumok alkotórészeinek lebontása a szekunder
lizoszómákban megy végbe. A lizoszomális membránrégiókat transzportvezikulák reciklizálják a
Golgi-komplexbe. A szabad koleszterint a sejt membránképzésre, szteroid vegyületek szintézisére
használhatja fel, vagy ismét észterifikálva raktározó vezikulákban tárolhatja. A koleszterin
feedback regulátorként hat: gátolja az endogén koleszterinszintézist, serkenti a koleszterinésztert
szintetizáló enzimet és gátolja az LDL-receptor génjének transzkripcióját. Mindezek a hatások a
sejt koleszterin-homeosztázisát biztosítják: megakadályozzák az intracelluláris koleszterinszint
kóros érték fölé emelkedését.

162
 35.2. ábra: Az LDL-partikulumok receptor-közvetített endocitózisa

A sejtek koleszterin-felvételének veleszületett és szerzett zavarai

A familiáris hypercholesterinaemia autoszomális domináns öröklődésű kórkép. A betegséget
okozó mutációk az LDL-receptor génjét érintik: megszüntethetik a receptor expresszióját,
ligandkötését, transzportját az endoplazmatikus retikulumból a sejtfelszínre, beágyazódását a
klatrinrétegbe. A defektus molekuláris mechanizmusai tehát változatosak, a következmény
azonban minden esetben ugyanaz: az LDL-partikulumok internalizációja normális működésű
receptorok hiányában csökken vagy megszűnik. A vér koleszterinszintje emelkedik:
heterozigótákban az LDL-szint a normális érték kétszerese, beteg homozigótákban akár
hatszorosa is lehet. A következmény az erek korai, súlyos atheroscleroticus károsodása:
homozigóta betegekben az első szívinfarktus másfél–kétéves korban bekövetkezhet! (Hasonló
betegség alakul ki akkor is, ha a mutáció az LDL-partikulumban ligandként működő apoB-fehérje
génjében következik be.)
A familiáris hypercholesterinaemia nem gyakori betegség, bár a heterozigóta forma – amely
ugyancsak fokozott atherosclerosissal jár – incidenciája 1/500. Fejlett országokban viszont
minden második ember az atherosclerosis szövődményeiben hal meg. A koleszterin-anyagcsere
zavaraiban ugyanis a genetikai okok mellett egyéb, környezeti tényezőknek is szerepe van. A vér
LDL-szintje újszülöttekben igen alacsony, az évek során „normális” esetben is többszörösére
emelkedik. Ennek a szerzett hypercholesterinaemiának egyik oka a zsírgazdag étrend: nemcsak a
szervezet koleszterinfelvételét növeli, hanem a sejtekben csökkenti az LDL-receptor expressziót,
azaz az LDL-partikulumok internalizációját és a koleszterinfelhasználást. A receptor-mediált
endocitózis mechanizmusának és szabályozásának megismerése új, hatékony gyógyszerek

163
kifejlesztésére ad reményt. Biztató terápiás kísérletek folynak koleszterinszintézist gátló szerekkel
(ún. sztatinokkal), amelyek csökkentik a sejtek szabad koleszterinszintjét. A feedbackszabályozás
útján nő az LDL-receptor-expresszió, ami tartós LDL-csökkenést eredményez a vérplazmában és
megelőzi az atheroscleroticus plakkok lerakódását.

A vezikuláris transzport mechanizmusa

Mint az előző fejezetekből kiderült, eukariota sejtekben a membránnal határolt kompartmentek
állandó összetételét, működőképességét, az intracelluláris fehérjeforgalom jelentős részét a
köztük zajló vezikuláris transzportfolyamatok tartják fenn. A vezikuláris transzport kétirányú:
egyrészt biztosítja a fehérjék eljuttatását célállomásukra (anterográd transzport), másrészt egyes
membrán- és lumenfehérjék visszaszállítását az eredeti, kiindulási organellumba (retrográd
transzport). A vezikuláris transzport specifikus folyamat: a megfelelő szállítmány kiválogatását a
transzportálandó fehérjék szortírozó szignáljai és membránreceptorok közötti egymásrahatás
biztosítja, a vezikulumok rendeltetési helyükre juttatását pedig célzófehérjék irányítják.
A transzportgépezet alkotórészei
A vezikuláris transzport rendkívül bonyolult folyamat, melynek biokémiai részleteit – a szekréciós
folyamatok zavarait mutató élesztő mutánsok, illetve a vezikuláris transzport rekonstruálására
alkalmas sejtmentes rendszerek vizsgálatával – csak az elmúlt évtizedekben kezdték megismerni
(35.3. ábra). A kiindulás helyéül szolgáló donor kompartment membránjának citoszól felőli
oldalán fehérjeréteg, burok képződik (1. lépés a 35.3. ábrán). Ehhez többféle fehérje,
energiaforrásként pedig ATP és GTP szükséges. Az ARF (= ADP-ribozilációs faktor) GTP-kötő
fehérje, amely saját membránreceptorához kötődve, adaptinfehérjéket kapcsol a donor
membránhoz. Az adaptinek szerepe a burok strukturális fehérjéinek rögzítése a membránon. A
burokréteg kialakulása indítja el a membránkitüremkedést, a vezikula sarjadzását (2. lépés),
melynek eredményeképpen a hólyagocska végül is leválik a donor membránról és a citoszólon
keresztül megközelíti célpontját, az akceptor organellumot (3. lépés). A folyamat kritikus lépése a
fogadó membrán felismerése: ebben a vezikula membránjában és az akceptor hártyában
jelenlevő, egymást specifikusan felismerő transzmembrán célzófehérjék játszanak döntő szerepet
(35.4. ábra). A vezikula megkötődését kisméretű, a membránba horgonyzott GTP-kötő fehérjék, a
Rab-család tagjai katalizálják; a különböző membránok között végbemenő vezikulaforgalomban
más és más Rab-fehérjék vesznek részt (eddig a család mintegy 60 tagját azonosították
emberben). A vezikula dokkolása után
– valószínűleg chaperone fehérjék
közreműködésével – a burok leválik (4.
lépés), a vezikula pedig a citoszólból
érkező általános, nem specifikus fúziós
fehérjék hatására beleolvad a
fogadómembránba és tartalmát az
organellum lumenébe üríti (5. lépés).

35.3. ábra: A vezikuláris transzport

lépései: 1. burkolt membrán-
kitüremkedés képződése a donor
membránon; 2. burkolt vezikula
képződése; 3. dokkolás a
célorganellumon; 4. burokleválás; 5. a
vezikula fúziója az akceptor
membránnal

164
A vezikuláris transzport molekuláris mechanizmusainak tisztázása természetesen gyakorlati
haszonnal is járhat. A lizoszomális tárolási betegségek (l. 36. fejezet) közé tartozó Niemann-Pick
kórról kiderült, hogy a mutációk olyan fehérjék funkcióját érintik, melyek az LDL-partikulumok és
membrán-szfingolipidek internalizációjához szükségesek. Az örökletes zavar következtében a
máj, lép, agy sejtjeinek endoszómáiban, lizoszómáiban koleszterin és szfingolipidek halmozódnak
fel. Ez halálos betegséget okoz. A jövőbeni sikeres génterápia reményét adja, hogy
szövettenyészeti sejtekben a zavar specifikus Rab fehérjék expressziójával megszüntethető.

35.4. ábra: A membránfúzióban részt vevő fehérjék

A burkolt vezikulák típusai

A membrán citoplazmatikus felszínéhez tapadó fehérjeréteg alapján a transzportvezikulákat két
fő típusba sorolhatjuk.
Klatrin-borított vezikulák. Ilyen típusú transzportvezikulák fűződnek le a sejtfelszínről a
receptor-mediált endocitózis során, illetve a transz-Golgi retikulumról a lizoszómák képződésekor
(l. 36. fejezet). A klatrinegységek polimerizációja szabályos szerkezetű, poligonális hálózatot hoz
létre. A klatrinréteget ARF- és adaptin molekulák rögzítik a membránhoz. Utóbbiak a specifikus
receptorfehérjék (pl. LDL-receptor, mannóz-6-foszfát-receptor) kiválasztásában és klatrinba
ágyazásában is részt vesznek.
Más borítású vezikulák. A klatrinon kívül egyéb strukturális fehérjék is létrehozhatnak
transzportvezikulákat. Úgy tűnik, sokféle borítás létezik, ezek funkcionális változatosságot is
jelentenek; a különböző típusú vezikulák jellemzése még csak kezdeti stádiumában van. A COP-
borított vezikulák az endoplazmatikus retikulum és a Golgi-ciszternák közötti fehérjeforgalmat
bonyolítják. (Az elnevezés a coat protein, burokfehérje kifejezésből származik.) Különböző
fehérjeösszetételű fedőrétegük eltérő szerkezetet és funkciót eredményez. A burok térszerkezete
kevésbé szabályos mint a klatrinborításé.

165
 36. A sejt védekezési mechanizmusai
A sejtet különböző fizikai, kémiai, biológiai károsító hatások érik, melyekkel szemben – bizonyos
határok között – védekezni képes. Ebben a fejezetben a sejtvédekezés néhány, citoplazmatikus
organellumokhoz kötött fajtájával foglalkozunk.

Xenobiotikumok átalakítása
Az élő szervezetek és azok sejtjei sokféle testidegen, nem biológiai eredetű kémiai anyag,
xenobiotikum (pl. gyógyszerek, rovarirtók, élelmiszeradalékok) hatásainak vannak kitéve.
Különösen veszélyesek az apoláros, lipidtermészetű anyagok, hiszen ezek a sejthártyán keresztül
könnyen bejutnak a sejt belsejébe és a lipoprotein membránokba beépülve toxikus mennyiségben
halmozódhatnak fel. Ezeket az anyagokat a sejt csak akkor tudja hatékonyan kiválasztani, ha
előzőleg vízoldékonnyá tette őket. A sima felszínű endoplazmatikus retikulum membránjának
citokróm P450 enzimrendszere látja el ezt a funkciót. Ezek az enzimek ubikviterek:
baktériumoktól az emberig minden élőlényben jelen vannak. Emlősökben egy több mint 50
génből álló heterogén géncsalád tagjai (CYP-gének) kódolják őket. A család izoenzimei funkció,
szubsztrát-specificitás, szöveti expresszió és szabályozhatóság szempontjából is rendkívül
sokfélék. Egyesek szteroid vegyületek szintézisében, zsírsavak és egyéb természetes lipidek
metabolizmusában vesznek részt, xenobiotikum-transzformálást nem végeznek. Mások fő
funkciója viszont az idegen anyagok átalakítása, biotranszformációja.
A citokróm P450 enzimek molekuláris oxigén és NADPH felhasználásával C-H kötésekbe oxigént
építenek be; a hidroxiláció növeli a molekula vízoldékonyságát:

A biotranszformáció második lépésében a molekula enzimatikus úton glukuronsavval, kénsavval

konjugálódik, kijut a sejtből, majd a vesén át távozik a szervezetből.
A citokróm P450 oxigenázok azonban erősen reaktív, toxikus termékeket is eredményezhetnek.
Ha például a reakció kettős kötést alkotó szénatomokat érint, reakcióképes epoxidok képződnek:

Az epoxidok makromolekulákkal reagálhatnak; DNS-károsító, mutagén hatásuk a sejt malignus

transzformációjához, daganatképződéshez vezethet. A szervezetet érő karcinogének döntő része
eredeti formájában hatástalan, a biotranszformáció során alakul át a végső karcinogénné. A
citokróm P450 rendszer aktiválja többek között a policiklusos aromás szénhidrogéneket (36.1.
ábra), nitrózaminokat hatásos karcinogénekké. A citokróm P450 rendszer tehát egyrészt mérgező
anyagokat eliminál a sejtekből, másrészt viszont ártalmatlan vegyületeket daganatképző
ágensekké alakít át.

166
 A CYP-gének közül egyesek konstitutívan expresszálódnak,
másokat viszont különböző anyagokkal indukálni lehet (pl.
policiklusos aromás szénhidrogénekkel, fenobarbitállal,
egyes szteroidokkal stb.). A hatás általában átmeneti,
esetenként többszázszoros is lehet és a sima felszínű
endoplazmatikus retikulum hipertrófiája kíséri. Mivel a
gyógyszerek metabolizmusát elsősorban a máj citokróm
P450 rendszere végzi, ezt az indukciós jelenséget
gyógyszerrendelésnél figyelembe kell venni. A policiklusos
aromás szénhidrogének által kiváltott génindukció
mechanizmusa jól ismert: a szteroid hormonok génregulációs
hatásához hasonlít. A sejtbe jutó xenobiotikum a citoszólban
levő Ah (= aril-hidrokarbon) receptorhoz kapcsolódik. A
komplex a sejtmagba transzlokálódik és a célgének specifikus
enhancer-régióihoz kötődve azok expresszióját szabályozza.
A géntermékek közé tartozik az a citokróm P450 izoenzim (az
aril-hidrokarbon hidroxiláz), amely a policiklusos aromás
szénhidrogének karcinogénné aktiválását végzi.

36.1. ábra: A policiklusos aromás szénhidrogén benzpirén karcinogénné alakítása

A szervezet gyógyszerekkel szembeni reakciójára a génexpresszió változásai mellett a gyógyszer-
metabolizmust végző enzimek genetikai polimorfizmusa is hatással van: a génjeikben jelenlevő
genetikai variációk nagymértékben befolyásolhatják a gyógyszerhatás erősségét és időtartamát.
A farmakogenetika és farmakogenomika fontos célkitűzései közé tartozik az egyéni
gyógyszerérzékenység genetikai hátterének tisztázása, és ezáltal a személyre szabott
gyógyszerelés lehetőségének megteremtése.

A lizoszómák szerepe
A lizoszómák típusai és funkciója
A lizoszómákat az 1950-es években de Duve fedezte fel és izolálta a mitokondrium frakcióból. A
lizoszómák a sejten belüli emésztés organellumai. A primer lizoszómák kerek, egyetlen
membránnal határolt, erősen elektronszóró vezikulák. Mintegy 50-féle szolubilis savas hidroláz
enzimet (foszfatázokat, nukleázokat, proteázokat, lipázokat stb.) tartalmaznak. A hidrolítikus
enzimek pH-optimumának (kb. pH 5) megfelelő H+-koncentrációt a membránban lokalizálódó
aktív protonpumpa fehérjék tartják fenn: folyamatosan transzportálnak H+-kat a citoszólból a
lizoszómákba. A primer lizoszómák a lebontandó anyagokat tartalmazó vezikulákkal fuzionálva
nagyobb méretű, szabálytalan alakú szekunder lizoszómákat hoznak létre; a makromolekulák
emésztése ezekben zajlik le.
Szekunder lizoszómák kétféle folyamat eredményeképpen jöhetnek létre. A heterofágia a sejtbe
kívülről endocitózissal vagy fagocitózissal bejutott anyagok, kórokozók lebontását jelenti. A
fagocitózissal képződött fagoszóma primer lizoszómával egyesülve fagolizoszómát alkot. A sejt
elöregedett, feleslegessé vált organellumaitól autofágiával szabadul meg. A membránnal határolt
autofagoszómák primer lizoszómákkal szekunder lizoszómává olvadnak össze. Az autolítikus
folyamatok fiziológiás és kóros körülmények között (pl. szívinfarktus során) is aktiválódhatnak.
A lizoszómák képződése
A lizoszomális hidrolázok az endoplazmatikus retikulumon szintetizálódnak, N-kötött
oligoszacharidra tesznek szert, majd a Golgi-komplexben specifikus célzószignált kapnak (36.2.
ábra). A mannózgazdag oligoszacharid egyik mannózához enzimatikus úton N-acetilglukózamin-
foszfát kapcsolódik, majd az N-acetilglukózamin lehasad és egy mannóz-6-foszfát (M6P) csoport

167
marad vissza. Az M6P-jelölt fehérjék a transz-Golgi retikulumban membránreceptorokhoz
kötődnek és – ilyen módon elkerülve a szekréciós utakat – a Golgi-komplexről lefűződő klatrin-
borított vezikulákkal szortírozó vezikulákba kerülnek. A savas pH disszociálja a lizoszomális
enzimeket az M6P-receptorokról; az enzimek primer lizoszómákba kerülnek, a receptorok pedig
vezikuláris transzporttal visszajutnak a transz-Golgi retikulumba.

36.2. ábra: Lizoszomális enzimek mannóz-6-foszfát szignáljának képződése

Lizoszomális tárolási betegségek

Ha a lizoszomális emésztés zavart szenved, a megfelelő makromolekulák szekunder
lizoszómákban halmozódnak fel és súlyos zavarokat okozhatnak: tárolási betegségek alakulnak
ki.
A betegségek egyik fajtájánál egyes enzimek működésképtelenek. Az érintett géntől és a mutáció
típusától függően különböző kórképek eltérő súlyosságú (gyakran letális) formái alakulhatnak ki.
A leggyakoribb tárolási betegségben, a Gaucher-kórban cerebrozidok, a Tay-Sachs-kórban
gangliozidok, a Niemann-Pick-kórbanszfingomielinek halmozódnak fel.
Előfordul azonban az is, hogy a lizoszómákból valamennyi hidroláz hiányzik. Ilyenkor vagy az
M6P-szintézisszenved zavart (I-sejt betegség), vagy az M6P-receptorok működésképtelenek.
Mindkét mutációnak az a következménye, hogy a lizoszomális hidrolázok, mivel nem képesek a
lizoszómákba transzportálódni, szekretálódnak. Az érintett sejtekben emésztetlen anyagokat
tartalmazó szekunder lizoszómák halmozódnak fel.
A lizoszómák képződési mechanizmusának megismerése reményt ad a tárolási betegségek
hatásos kezelésére. Ha az M6P-receptorok génje ép, a receptor jelen van a sejtfelszínen. Ilyenkor
a szervezetbe juttatott lizoszomális enzimek receptor-mediált endocitózissal bejutnak a beteg
sejtek lizoszómáiba. Klinikai kísérletek szerint ez az enzimpótló terápia hatásos, egyelőre azonban
rendkívül drága.

Peroxiszómák
Minden eukariota sejt tartalmaz a lizoszómákhoz hasonló, kisméretű, egyetlen membrán által
határolt, hidrogénperoxidot termelő és lebontó citoplazmatikus organellumokat,
peroxiszómákat. A hasonlóság felületes: a peroxiszómák endoszimbionta eredetűek,
biogenezisük is a mitokokondriumokéra hasonlít (l. 38. fejezet): fehérjéik szabad poliszómákon
szintetizálódnak, majd chaperone fehérjék segítségével transzportálódnak a vezikulákba.
A peroxiszómák mintegy 50-féle enzimet tartalmaznak, metabolikus működésük sokrétű:
zsírsavakat oxidálnak, lipideket (koleszterint, epesavakat, dolicholt, foszfolipideket)
szintetizálnak, hidrogénperoxidot bontanak. Ebben a fejezetben történő tárgyalásukat az
indokolja, hogy a hidrogénperoxid felhasználásával kataláz enzimük számos toxikus anyagot

168
képes oxidálni és ezáltal hatástalanítani. A peroxiszomális működés örökletes zavarai súlyos,
gyakran már gyermekkorban halált okozó betegségek.

Szabad gyökök képződése és semlegesítése

A szabad gyökök páratlan elektronnal rendelkező, instabil atomok, atomcsoportok. Kémiai
reaktivitásuknak köszönhetően gyorsan reagálnak más molekulákkal, pusztítást végezve biológiai
rendszerekben.
Az élő sejtben a páratlan elektronok a leggyakrabban O-atomokhoz kötődnek, reaktív
oxigénszármazékokat hoznak létre. Ennek fő oka, hogy a mitokondrium működése során a
molekuláris oxigén vízzé redukálása egymást követő egyelektronos redukciós lépésekben
történik. Ha a folyamat megakad, reaktív oxigénszármazékok (szuperoxid, hidrogénperoxid,
hidroxil szabad gyök) keletkeznek:

Nagy mennyiségű reaktív oxigénszármazék képződik az endoplazmatikus retikulumban is. A

diszulfidkötések kialakulása (l. 33. fejezet) során molekuláris oxigén játssza az elektronakceptor
szerepét. Jelentős szekréciós aktivitással rendelkező sejtekben az endoplazmatikus retikulum
szabad gyök képzése az össztermelés 25 százalékát is kiteheti.
Az oxigén szabad gyököket a sejt hasznos célra is felhasználhatja, de halálos veszélyt is
jelenthetnek a számára. A túlzott szabad gyök termelés által kiváltott celluláris stressz állapotot
oxidatív stressznek nevezzük. Jellemzője a sejt különböző molekuláinak (nukleinsavak,
membránlipidek, fehérjék stb.) oxidatív károsodása, mely végső soron a sejt pusztulásához
vezethet.
Fagocitózis
Ha egy kórokozó (baktérium, vírus) megkötődik a fehérvérsejt felszínén, az állábakat növesztve
fagocitálja a támadót (36.3. ábra). A fagoszóma képződésével egyidőben membránjának
citoplazmatikus felszínén több fehérjéből álló komplex, a NADPH-oxidáz épül fel. A komplex
kialakulásában és aktiválásában fontos szerepet játszik egy GTP-kötő fehérje (Rac). A NADPH-
oxidáz enzim transzmembrán alegységei citokrómok, amelyek a NADPH koenzimről elektront
transzportálnak a molekuláris oxigénre: szuperoxid szabad gyökök szekretálódnak a fagoszómába.
A szuperoxid és a belőle másodlagosan képződő egyéb reaktív oxigénszármazékok
(hidrogénperoxid, hidroxil szabad gyök, hipoklorit ion) megölik a fagocitált mikróbát.
A leírt mechanizmus alapján érthetővé válik
az a régi megfigyelés, hogy fagocitáló
leukociták oxigénfogyasztása nagymértékben
megnő (légzési robbanás). A meglehetősen
ritka krónikus granulomás betegségben
szenvedő egyénekben örökletesen defektív a
NADPH-oxidáz. Leukocitáik hatékony
fagocitózisra képtelenek, súlyos, gyakran
halálos fertőzéseknek vannak kitéve.

36.3. ábra: A NADPH-oxidáz aktiválásának

eredményeképpen képződött reaktív
oxigénszármazékok elpusztítják a fehérvérsejt
által bekebelezett kórokozót

169
A szabad gyökök makromolekula-károsító hatásai
A szabad gyökök a sejtben minden makromolekulát megtámadnak. A DNS károsodása
mutációkhoz, ezáltal pedig rosszindulatú daganatok kialakulásához vezethet. A fehérjék lánctörést
szenvedhetnek, közöttük kovalens keresztkötések jöhetnek létre. Károsodhatnak a
poliszacharidok, glikoproteinek is. A szabad gyökök legfontosabb célmolekulái közé tartoznak a
telítetlen zsírsavláncok. A lipidperoxidáció során a szénhidrogénláncok bonyolult, többlépéses
reakciósorozat eredményeképpen darabolódnak, a membránkárosodás az endoplazmatikus
retikulum, mitokondriumok, lizoszómák degenerációját okozza. A szabad gyökök által kiváltott
citotoxikus hatást fontos kóroki tényezőnek tekintik számos betegség (gyomorfekély,
atherosclerosis, alkoholos és toxikus májkárosodás stb.) kifejlődésében.
Az oxigén szabad gyökök semlegesítése
A fentiek alapján érthető, hogy a számukra egyébként létfontos oxigénnel szemben az aerob
szervezetek hatékony védekezési mechanizmusokat voltak kénytelenek kifejleszteni. Az
antioxidáns enzimek közül a legfontosabbak a szuperoxid-dizmutázok (SOD-ok), melyek a
szuperoxid anionok átalakítását végzik:
2O•2 + 2H+ → H2O2 + O2
A képződő, még mindig veszélyes hidrogénperoxidot kataláz és peroxidáz enzimek bontják el. A
néhány év alatt megállíthatatlanul lassú halálhoz vezető központi idegrendszeri kórkép, az
amyotrophiás lateralsclerosis örökletes formájának hátterében az egyik SOD-gén mutációját
azonosították. A mozgató neuronokban fokozott lipidperoxidáció lép fel, ami
idegsejtpusztuláshoz, bénulásokhoz vezet. A betegség lefolyása antioxidáns kezeléssel
valamelyest késleltethető. Antioxidánsok (pl. C-vitamin, E-vitamin, karotin, szelén stb.) a
rosszindulatú daganatok megelőzésében is jelentőséggel bírhatnak, hiszen csökkentik az oxigén
szabad gyökök által előidézett mutációk számát.

170
 37. Mitokondrium I.: Felépítés és működés
A lebontó folyamatok fő célja a sejtben a kémiai kötésekben rejlő energia felszabadítása és ATP
formájában történő tárolása. Aerob eukariota sejtekben ez a glikolízis folyamatával a citoszólban
kezdődik (az 1. lépés a 37.1. összefoglaló ábrán): a glukózmolekula több enzimatikus lépésen
keresztül két molekula piruvátra bomlik le. A glikolízis tiszta nyeresége glukózmolekulánként két
ATP- és két NADH-molekula. A képződő piruvát a mitokondriumba transzportálódik és a lebontás
és energiametabolizmus további lépései, a citromsavciklus (2. lépés, 37.1. ábra) és az oxidatív
foszforilálás (3. lépés) itt játszódik le. A glukóz aerob lebontásának összegyenlege:
C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O
tiszta nyeresége pedig glukózmolekulánként 38 ATP-molekula.

A mitokondriumok általános jellemzői

A mitokondriumok kettős membrán által határolt, általában megnyúlt pálcika alakú,
mikrométeres átmérőjű citoplazmatikus organellumok. A külső membrán sima, a belső viszont
lemezek (mitokondriális kriszták), ritkábban tubulusok által erősen megnövelt felszínű membrán.
A mitokondriumok számát és sejten belüli lokalizációját a sejt energiaigénye határozza meg. A
metabolikusan rendkívül aktív májsejtekben több ezer mitokondrium is lehet. A sejten belül a
nagy energiafelhasználású régiókban halmozódnak fel: az aktív transzportot folytató vesetubulus
sejtekben például a bazális membrán közelében, osztódó sejtben a mikrotubulusok között stb.
A mitokondriumok sejten belüli mozgásait a citoszkeleton biztosítja: motorfehérjék (miozin,
kinezin, dinein) közvetítésével mikrofilamentumokhoz, mikrotubulusokhoz kapcsolódnak és ezek
mentén vándorolnak a citoplazmában (l. 39. és 40. fejezet).

A mitokondriumok szerkezeti elemei

A mitokondrium két membránból és az általuk határolt két kompartmentből épül fel. Ezek
szerkezeti jellemzőit és a bennük zajló anyagcsere-folyamatokat a 37.1. ábra foglalja össze, erősen
leegyszerűsített formában.
Külső membrán
A mitokondrium mindkét membránja a maga nemében különleges, más lipoprotein hártyáktól
eltérő tulajdonságokkal rendelkezik. A külső membrán gazdag a csatornaképző porin fehérjében,
mely a hártyát szokatlanul áteresztővé teszi: kb. 10 000 daltonos molekulasúlyhatárig a membrán
minden molekula, ion számára átjárható.
Intermembrán tér
A külső és belső hártya közötti közeg összetétele a fentiek értelmében nagymértékben
megegyezik a citoszóléval. A porincsatornákon áthatolni képtelen nagy molekulákra – elsősorban
a fehérjékre – ez a megállapítás természetesen nem érvényes. Az intermembrán tér tartalmaz
fehérjéket, ezek azonban nem a porincsatornákon keresztül, hanem aktív transzlokációval
kerülnek rendeltetési helyükre (l. 38. fejezet).
Belső membrán
A mitokondrium belső hártyája– éles ellentétben a külsővel – nagyfokú impermeabilitásával
tűnik ki, amit jórészt egy különleges foszfolipidnek, a kardiolipinnek köszönhet. A belső
membránon keresztül anyagtranszport csak fehérjék közvetítésével történhet; a foszfolipidréteg
ion-impermeabilitása alapvető fontosságú az ATP-termelés szempontjából (l. később). Ugyancsak
fontos a nagy felület, amit a kriszták kialakulása biztosít. A belső membrán fehérjéi három fő
funkcionális kategóriába sorolhatók. A transzport fehérjék közül a H+/piruvát szimporter és a

171
H+/foszfát szimporter a membrán két oldala közötti pH-különbséget (l. később) használja fel a
mitokondrium működéséhez szükséges piruvát és foszfát felvételéhez. Az ADP/ATP antiporter
ADP-t juttat a mátrixba és a termelt ATP-t transzportálja a citoszólba. A belső membrán
nagyméretű fehérjekomplexei az elektrontranszportot végző légzési lánc tagjai (I., II., III. és IV.
komplex). Az V. komplex az ATP-t termelő ATP-szintáz.
Mitokondrium mátrix
A belső membrán által határolt teret kitöltő rendkívül magas (kb. 50 százalékos) fehérjetartalmú,
kocsonyás állomány a mitokondrium mátrix. Több száz féle enzimet tartalmaz, amelyek a
piruvát- és zsírsavoxidációban, valamint a citrátciklusban vesznek részt. A mátrix alkotórészei
közé tartoznak a mitokondrium genetikai apparátusának elemei (DNS, riboszómák, mRNS-ek,
tRNS-ek), illetve az azt működtető enzimek is (l. 38. fejezet).

37.1. ábra: A mitokondrium felépítése és metabolikus folyamatai

172
 Energia-metabolizmus a mitokondriumban
A mátrixba transzportált piruvát (3 szénatomos sav) koenzim A-hoz kötött, aktivált ecetsavvá (két
szénatomos sav) oxidálódik. Acetil-koenzim A a végterméke a zsírsavoxidációnak is.
Citrátciklus
Az acetil-koenzim A oxálecetsavval (4 szénatomos sav) citromsavvá (6 szénatom) egyesül, amely
több enzimatikus átalakuláson és közti terméken keresztül a róla elnevezett körfolyamat végén
oxálecetsavvá alakul. Az acetil-koenzim A képződés és a citrátciklus során a láncrövidítő lépések
széndioxid-felszabadulással járnak. Történik direkt makroergkötés szintézis is (GDP → GTP),
energetikai szempontból a legfontosabb jelenség azonban koenzimek redukálása. A redukált
koenzimek (NADH, FADH2) visszaoxidálása biztosítja az ATP-képzés fő energiaforrását.
Oxidatív foszforilálás: a kemiozmózis mechanizmus
A NADH és FADH2 oxidációjából származó elektronok a légzési lánc komplexein futnak végig,
eközben energiaszintjük csökken. Az elektrontranszportlánc utolsó eleme, a végső elektronfelvevő
a molekuláris oxigén, amely ilyen módon redukálódva vízzé alakul. A légzési lánc komplexei az
elektronok felszabaduló energiáját – nem pontosan ismert módon – arra használják fel, hogy
protonokat pumpáljanak a mátrixból az intermembrán térbe. Mivel a membrán ionokra
impermeabilis, aktívan metabolizáló mitokondriumban a belső membrán két oldala között
meredek protongrádiens alakul ki (37.2. ábra). Ez egyrészt pH-grádienst (∆pH ~ 1 pH egység),
másrészt potenciálgrádienst (∆V ~ 200 mV) jelent, ezért elektrokémiai protongrádiensről
beszélünk (37.2. ábra).
A protongrádiens a hajtóereje a belső membránon keresztül folyó, a mitokondrium működése
szempontjából vitális transzportfolyamatoknak (piruvát-, foszfátfelvétel, ATP/ADP-csere). Fő
szerepe azonban az, hogy a belső membránban levő hatalmas fehérjekomplex, az ATP-szintáz
működéséhez biztosítja a muníciót. Az ATP-szintáz két multiprotein egységből áll (37.3. ábra): az
FO-komplex transzmembrán protoncsatorna: az intermembrán térből a mátrixba transzportál H+-
ionokat; az F1-komplex katalitikus funkciójú: a protonáramlás hatására forgómozgást végez és a
mechanikai energia felhasználásával ADP-ből és anorganikus foszfátból ATP-t szintetizál. Ezt a
protonáram által hajtott ATP-szintetizáló folyamatot kemiozmózis mechanizmusnak nevezzük.
Hasonló jellegű ATP-termelést biztosítanak a kloroplasztisz-membránon, illetve aerob
baktériumok sejthártyáján keresztül ható protongrádiensek is.

37.2. ábra: A mitokondrium belső membránjának két oldala

között fellépő elektrokémiai protongrádiens, melynek
elektromos eleme a potenciál-grádiens, kémiai komponense 37.3. ábra: Az ATP-szintáz
pedig a pH-grádiens szerkezete

173
 38. Mitokondrium II.: A mitokondriális DNS és betegségei
Az eukariota sejtek nukleáris genomjuk mellett extrakromoszomális DNS-t is tartalmaznak:
mitokondriális DNS-t (mtDNS-t), növényi sejtekben pedig a plasztiszok DNS-ét is. Az mtDNS
méretét és géntartalmát tekintve is jelentős eltéréseket mutat a különböző eukariota
élőlénycsoportokban: evolúciója a nukleáris genoménál nagyságrenddel gyorsabban ment végbe.

Az endoszimbiózis teória
Ma már általánosan elfogadott az az elmélet, mely szerint a mitokondriumok úgy jöttek létre, hogy
primitív anaerob eukariota sejtek aerob prokariotákat kebeleztek be és velük tartós együttélést,
endoszimbiózist létesítettek (l. 1. fejezet). Az eukariota szervezetek evolúciója során azután a
mitokondriális gének nagy része átkerült a sejtmagba. A mitokondrium genetikai apparátusának
azonban maradt néhány olyan jellemzője, amely alátámasztja a prokariota eredetet: a
fehérjekódoló génekben nincsenek intronok; a nukleinsav- és fehérjeszintézis antibakteriális
szerekkel gátolható; egyes fajokban a mitokondriális mRNS-ek riboszómakötése Shine-Dalgarno
bázispárosodással történik stb.

A humán mitokondriális genetikai apparátus jellemzői

Az emlősök, így az ember mtDNS-e is a kisméretű mitokondriális genomok közé tartozik: 16.5
kilobázis méretű, cirkuláris DNS, melynek teljes szekvenciája ismert. Egy mitokondriumban 2–10
azonos DNS-kópia van jelen a mátrixban, a belső membránhoz kötötten, mitokondriális nukleoidot
alkotva. Mivel egy sejtnek több száz mitokondriuma van, az mtDNS átlagosan 103–104 példányban
fordul elő sejtenként. A petesejt még ennél is több, mintegy 100 000 mtDNS-molekulát tartalmaz,
ami a sejt összes DNS-ének harmadát teszi ki! (Az mtDNS tehát a legnagyobb példányszámú
kromoszómánk.)
A mitokondriális genomnak és expressziójának sajátos tulajdonságai vannak. Az emberi
mtDNS két láncának bázisösszetétele olyan mértékben eltér egymástól, hogy a két lánc
céziumklorid egyensúlyi sűrűséggrádiens centrifugálással szétválasztható: H (heavy, azaz nehéz)
és L (light, azaz könnyű) láncot különböztetünk meg. Az mtDNS rendkívül kompakt genomot alkot:
nagyon kevés benne a nem kódoló régió, kódoló szakaszok pedig mindkét láncban előfordulnak
(38.1. ábra). A humán mtDNS két szokatlanul kisméretű rRNS-t (12S és 16S rRNS-t), 22 tRNS-t és
13 mRNS-t kódoló gént tartalmaz. Az utóbbiak a belső membrán néhány fehérjéjét: a légzési lánc
és az ATP-szintáz egyes alegységeit kódolják. A mitokondriális genom transzkripciója
szimmetrikus: mindkét DNS-lánc templátként szolgálva teljes hosszúságú transzkriptumokba
íródik át, amelyekből endonukleolítikus hasítások vágják ki az érett rRNS-eket, tRNS-eket és
monocisztronos mRNS-eket. A mitokondriumban mRNS-splicing nincs, az érett mRNS-ek 5’- capet
nem tartalmaznak, viszont poliadeniláltak. Az mtDNS replikációja és expressziója a nukleáris
genomban kódolt, citoszól-riboszómákon szintetizált importfehérjék (DNS-, RNS-polimerázok,
aminoacil-tRNS szintetázok, riboszomális fehérjék, stb.) segítségével történik. A transzkripció és
transzláció termékei a mitokondriumban maradnak: RNS- és fehérjeexport nincs. Emlős
mitokondriumokba citoplazmatikus RNS-ek nem importálódnak.

174
 38.1. ábra: A humán mtDNS géntérképe. (Az rRNS-géneket fekete, a fekérjekódoló szakaszokat
szürke régiók, a tRNS-géneket a megfelelő aminosav neve jelzi.)
A mitokondriumok genetikai kódja eltér az univerzális kódtól: egyes tripletek más aminosavat
kódolnak a mitokondriumban és a citoplazmában. Ennek oka az mtDNS rendkívül magas mutációs
rátája, ami számos tényezőre vezethető vissza. Az oxigén redukcója során szabad gyökök is
képződnek; az mtDNS-t nem védikhisztonok a károsító hatásoktól; a gyenge reparációs rendszer
nem tud lépést tartani a fokozott DNS-károsodással; a mitokondriális DNS polimeráz γ rossz
hatásfokú proofreading aktivitással rendelkezik, nagy hibaszázalékkal dolgozik. A nukleáris DNS-
énél mintegy húszszor nagyobb mutációs gyakoriságnak természetesen patológiás
következményei is lehetnek (l. később), felhasználható azonban egyedek, illetve etnikai csoportok
kapcsolatának tanulmányozására. Az emberi faj evolúciójának a vizsgálata vezetett az ún.
mitokondriális Éva-hipotézis felállításához. Különböző népcsoportok mtDNS-szekvenciáinak
összehasonlításából arra a következtetésre jutottak, hogy a ma élő emberek egyetlen ősanyától
származnak, aki kb. 200 000 évvel ezelőtt élt Afrikában. (Az elmélet – különösen pedig a humán
mtDNS-fa eredetének időpontja – antropológus körökben erősen vitatott.)

Mitokondriális fehérjeimport
Néhány belső membrán fehérje kivételével (l. előbb) a mitokondriális fehérjék a citoszólban
szintetizálódnak és transzportálódnak a mitokondrium megfelelő kompartmentjébe. Ez a
fehérjeimport – szemben az endoplazmatikus retikulum kotranszlációs transzportjával –
poszttranszlációs: a teljesen elkészült polipeptidláncok jutnak át a mitokondriális membránokon.
A mitokondrium ATP-termelése létfontos a sejt számára, így érthető, hogy mindazok a faktorok,
amelyek részt vesznek az organellum biogeneziséhez nélkülözhetetlen fehérjék importjában,
abszolút vitálisak. A fehérjék mitokondriumon belüli szortírozását specifikus szignálszekvenciák
biztosítják; a 38.2. ábra egy mátrixfehérje példáján keresztül mutatja be a fehérjeimport-gépezet
szereplőit.

175
 38.2. ábra: Mátrixfehérje importja a mitokondriumba
A mitokondriális fehérje szintézise szabad poliszómán történik (1. lépés). A szignálszekvencia az
N-terminális végen helyezkedik el, szignálspecifikus chaperone fehérje ismeri fel és kötődik hozzá.
A naszcens polipeptidlánc egyéb régióihoz citoszól chaperone-ok kapcsolódnak és
megakadályozzák kompakt térszerkezet kialakulását. A fehérje–chaperone komplex ezután a
külső mitokondrium membránban levő receptorfehérjékhez kapcsolódik (2. lépés). A receptor a
membrán síkjában oldalirányban mozogva olyan transzmembrán fehérjéket „keres”, amelyek a
belső membrán hasonló fehérjéivel együtt transzlokációs csatornát alkotnak (3. lépés). ATP-
hidrolízis kíséretében a chaperone fehérjék leválnak a komplexről, a polipeptidlánc pedig
transzlokálódik a két membránon keresztül (4. lépés). A szignálszekvencia pozitív töltésű, a
protongradiens így szó szerint „elektroforézissel” segíti át a csatornán. A transzlokáció másik
hajtóerejét mitokondriális chaperone fehérjék képezik: a mátrixban kötődve a transzlokálódó
fehérjelánchoz szinte behúzzák azt a mitokondrium belsejébe. A szignálszekvenciát mátrix
proteáz hasítja le (5. lépés), majd chaperone-ok asszisztálásával kialakul a funkcióképes fehérje
térszerkezete (6. lépés).

Mitokondriális betegségek
Az mtDNS nagy része kódoló szekvencia. Mutációja – ami bármelyik géntípusban bekövetkezhet
– csaknem mindig negatív következménnyel jár: az mRNS-kódoló gének a légzési lánc néhány
peptidláncának szintézisét irányítják, az rRNS- és tRNS-gének pedig az ezek szintézisét végző
transzlációs apparátusét. Bárhol történt a mutáció, az eredmény ugyanaz: az ATP-képzés
csökkenése. Az mtDNS mutációi elsősorban azokat a szerveket károsítják, amelyek működése
különösen energiaigényes (38.1. táblázat).

176
 Szerv Rendellenesség
Agy görcsrohamok, ataxia, dementia
Vázizom gyengeség, fáradékonyság, myopathia
Szívizom cardiomyopathia, vezetési zavar
Szem retinopathia, látóideg neuropathia, vakság
Máj hepatopathia
Vese glomerulopathia
Pancreas diabetes mellitus
Belső fül hallászavar

38.1. táblázat: Az mtDNS-mutációk következményei az egyes szervekben

Az első humán mtDNS-mutációt 1988-ban írták le. Azóta több mint 100 emberi betegség
patogenezisében tárták fel mtDNS-károsodás szerepét. A mitokondriális betegségek nem ritkák
(átlagosan 1 eset jut 10 000 emberre). A kórképek nagy száma, viszonylagos gyakoriságuk és a
tudományterületen az elmúlt években tapasztalt gyors fejlődés alapján nem meglepő, hogy ma a
klinikai genetikának ezt az ágát már csak mitokondriális medicinaként emlegetik. Az mtDNS-
betegségek két nagy osztályba sorolhatók, a harmadik mitokondriális betegségcsoportot a
sejtmag DNS mutációi okozzák.
Öröklődő mitokondriális betegségek
Az mtDNS csírasejt-mutációi öröklődő kórképeket hozhatnak létre. Ezekre a betegségekre a
maternális öröklődés jellemző: a petesejt több százezer mtDNS-molekulája hiánytalanul jelen van
a zigótában is, a hím ivarsejt mitokondriumai azonban nagyrészt elvesznek a megtermékenyítés
során, csak a sejtmag egyesül a petesejttel. A mitokondriális betegségeket ezért csak az anya
örökíti tovább. Az érintett egyedekre általában az jellemző, hogy sejtjeikben normális vad típusú
és mutáns mtDNS-molekulák együtt vannak jelen; a jelenség neve heteroplazmia. A mitotikus
osztódások során a sejtek több ezer normális és kóros mtDNS-molekulája véletlenszerűen oszlik
el az utódsejtek között: a tünetek megjelenése a heteroplazmia mértékétől függ (ún. küszöb hatás),
jellegük és súlyosságuk nehezen jósolható meg, rendkívül változatosak. Az mtDNS-mutáció
gyakran több szerv működését is károsítja; a mitokondriális betegségek általában multiszisztémás
kórképek.
A tünetek a korral egyre súlyosabbá válnak. Ennek oka, hogy a sejtekben szomatikus mutációk is
felhalmozódnak az mtDNS-ben, ami az oxidatív foszforilációt tovább csökkenti. Az öröklődő
mitokondriális betegségekre példaként a Leber-féle hereditaer opticus neuropathiát említjük. Ez
volt az első kórkép, melyet az mtDNS pontmutációira vezettek vissza. Kétoldali látóideg-sorvadás,
látótérkiesés alakul ki, mely végül teljes vaksághoz vezethet.
Szerzett mitokondriális betegségek
A testi sejtekben felhalmozódó szomatikus mtDNS-mutációk szomatikus heteroplazmiát hoznak
létre. Az érintett szövetekben csökken az oxidatív foszforiláció és ez degeneratív betegségekhez
vezethet. Szomatikus mtDNS-mutációkat találtak a diabetes mellitus egyes típusaiban, a
mozgászavarokkal járó Parkinson-kórban, az idő előtti dementia képében megjelenő Alzheimer-
kór egyes fajtáiban. Mitokondriális DNS-károsodást okoz az AIDS kezelésében hatásosnak talált
AZT (azidotimidin) is.

177
Általánosan elfogadott nézet, hogy az mtDNS szomatikus mutációinak felhalmozódása hozzájárul
a fiziológiás öregedés folyamatához is. Mivel az mtDNS-mutációk fő okozói az oxigén szabad
gyökök, felhalmozódásuk redox terápiával késleltethető. Hidrofób (pl. E vitamin, karotinoidok) és
vízoldékony (pl. C vitamin) antioxidáns szerek rendszeres szedése bizonyos védelmet nyújthat az
mtDNS-mutációk felhalmozódásával szemben. Elvi terápiás lehetőség az érintett sejtek
heteroplazmiájának eltolása a normális homoplazmia irányába. Ismert pontmutáció esetében
például a kóros mtDNS-hez hibridizáló oligonukleotid segítségével szelektíven gátolható lehet a
mutáns mtDNS replikációja. Ezek a génterápiás beavatkozások még csak korai kísérleti
stádiumban vannak.
A nukleáris DNS mutációi által okozott mitokondriális betegségek
A mintegy 1000 mitokondriális fehérje 99 százalékát a sejtmag kódolja, citoszól riboszómák
szintetizálják és fehérjeimporttal jutnak a mitokondriumokba. Az mtDNS a nukleáris DNS
„rabszolgája”: a mitokondriális genetikai apparátus valamennyi fehérjéje az organellumon
kívülről származik. Egyre több olyan mitokondriális betegséget írnak le, melyet a légzési lánc, az
mtDNS replikáció vagy a fehérjeimport enzimeinek, fehérjefaktorainak nukleáris génjeiben
bekövetkezett mutációk okoznak. Ezekre a betegségekre is az ATP-szintézis csökkenése által
kiváltott tünetek jellemzők, az öröklődés azonban nem maternális, hanem a mendeli
törvényszerűségek érvényesülnek.

178
 39. Citoszkeleton I.: Mikrofilamentumok
Az eukariota sejtek citoplazmája bonyolult, fehérjefonalakból álló hálózatot tartalmaz, melyet
citoszkeletonnak nevezünk. Nevéből sejthetően ennek a rendszernek egyik fő feladata, hogy
strukturális vázat alkotva meghatározza a sejt alakját. Egyes elemei biztosítják a sejt aktív
mozgását, illetve az intracelluláris organellumok transzportját, valamint a sejtosztódással
kapcsolatos mozgásokat és alakváltozásokat.
A citoszkeletont három nagy fonalrendszer alkotja: a mikrofilamentumok 7 nm átmérőjű
aktinfonalakból állnak, a mikrotubuláris rendszert 25 nm átmérőjű tubulincsövecskék alkotják,
míg az intermedier filamentum rendszerre (rostátmérő: 10 nm) változatos fehérjeösszetétel
jellemző. A három fonalrendszer közös jellemzője, hogy kisebb fehérjeegységekből áll, melyeket
nem kovalens kötések tartanak össze. A citoszkeleton ezen rendszerei, bár egymással szoros
kapcsolatban vannak, morfológiai, biokémiai és funkcionális szempontból jól elkülöníthető
entitásokat alkotnak.

A mikrofilamentum-rendszer
Az aktinfilamentumok szerkezete és polimerizációja
A mikrofilamentum-rendszer fő komponense az aktin, mely az eukariota sejtekben a
legnagyobb mennyiségben jelenlevő fehérje. Emlős sejtekben többféle aktin izoforma
különböztethető meg: a hattagú géncsalád egyes génjei az izomszövetek aktinját kódolják, mások
termékei pedig ubikviter fehérjék, különböző szövetek mikrofilamentum struktúráit alkotják. A
globuláris monomérekként szintetizálódó G-aktin egységek F-aktin filamentumokká
polimerizálódnak (39.1. ábra). Először néhány monomér képez komplexet (nukleáció), majd
ehhez a „maghoz” kapcsolódnak további G-aktin molekulák (elongáció). A növekedő
mikrofilamentumban az egymáshoz nem kovalens kötéssel kapcsolódó monomerek két sorban
helyezkednek el; ezek egymásba csavarodva kettőshélix-szerű szerkezetet alkotnak. A
filamentum polaritással rendelkezik: egyik vége (a plusz vég) gyorsabban növekedik, mint a másik
(mínusz vég). Az aktin-polimerizáció valójában reverzibilis folyamat: a szabad G-aktin
koncentrációjától függően előbb-utóbb egyensúlyi állapot alakul ki, amelyben a láncvégekről
ugyanannyi monomer válik le mint amennyi kapcsolódik (39.1. ábra). A mikrofilamentumok tehát
dinamikus struktúrák: a közeg monomerkoncentráció-változásaitól függően állandóan
növekednek vagy zsugorodnak.

39.1. ábra: Az aktin-polimerizáció mechanizmusa

A mikrofilamentum-képződés az ún. taposómalom (angol kifejezéssel treadmilling)

mechanizmussal jellemezhető (39.2. ábra). Ennek lényege, hogy létezik olyan szabad G-aktin
koncentráció, mely a plusz végen növekedést, a mínusz végen pedig depolimerizációt okoz. A G-
aktin monomerek ATP-t kötve kapcsolódnak a filamentum plusz végéhez, majd az ATP hidrolizál
és ez kedvez a mínusz végen aktin/ADP-komplexek leválásának. Az aktin-monomerek tehát
lassan végighaladnak a mikrofilamentumon, a plusztól a mínusz vég irányában.

179
 39.2. ábra: A mikrofilamentum-képződés taposómalom mechanizmusa (treadmilling)

A mikrofilamentum polimerizáció–depolimerizáció szabályozható folyamat. Az aktinkötő

fehérjék közül a formin a nukleációt, az Arp2/3 elnevezésű fehérje a filamentumok elágazását, a
kofilin pedig depolimerizációját serkenti. A gélszolin kész mikrofilamentumokat hasít el és a
csonkok plusz végéhez kapcsolódva gátolja polimerizációjukat.
A mikrofilamentumok működésének vizsgálatára gátlószereket használnak: a citohalazin a
filamentumok polimerizációját, míg a falloidin a depolimerizációt blokkolja.

Fehérje Funkció
formin filamentum-polimerizáció serkentése
tropomiozin filamentum-stabilizálás
gélszolin filamentum-hasítás
kofilin filamentum-depolimerizáció serkentése
profilin G-aktin kötés
fimbrin, villin, α-aktinin filamentum-köteg keresztkötése
filamin filamentum-hálózat keresztkötése
Arp 2/3 (actin-related protein) filamentum-elágazás
miozin motorfehérje
disztrofin, spektrin filamentum membránhoz kötése
vinkulin, talin filamentum integrinhez kötése (l. 43. fejezet)
kateninek filamentum övdezmoszómához kötése (l. 41. fejezet)

39.1. táblázat: Néhány aktinkötő fehérje

Miozinok szerepe a mikrofilamentumok működésében

A miozin-fehérjék aktin-aktivált ATPázok, melyek molekuláris motorként járulnak hozzá a
mikrofilamentum-rendszer mozgató funkciójához. Emlős sejtekben géncsalád termékei: több
mint tízféle izoformát azonosítottak eddig. Legtipikusabb képviselőjük a II. típusúmiozin (39.3.
ábra), mely izomszövetekben és más sejttípusokban is expresszálódik. A II. típusú miozin két
azonos nehéz láncból és négy könnyű láncból felépülő komplex. A nehéz láncok globuláris feji
doménje aktinkötő és ATP-kötő régiót tartalmaz, α-helikális farkuk pedig egymásba csavarodik.

180
 A miozin-fehérjék funkciójukat úgy látják el,
hogy ATP hidrolízise közben elmozdulnak a
mikrofilamentum mentén, annak plusz vége
irányába (39.4. ábra). A miozin feji régiójával
aktinfilamentumhoz kötődik. ATP-kötés
hatására ez a kapcsolat meglazul (1. lépés). A
miozin ATPáza hidrolizálja az ATP-t, az
ezáltal okozott konformációváltozás a
miozinfejet az aktinrost plusz vége felé
mozdítja, majd új aktin–miozin kontaktus
39.3. ábra: A II. típusú miozin szerkezete
jön létre (2. lépés). Az aktinfilamentum és a
miozinkomplex elcsúszik egymás mellett (3.
lépés), majd az ADP leválásával helyreáll az
eredeti állapot, de ekkor a két
fehérjestruktúra egymáshoz viszonyított
helyzete már megváltozott (4. lépés). Az
aktin–miozin komplex által létrehozott
mozgás hajtóereje tehát lényegében a
miozin-fejdomén ATP által kiváltott ciklikus
konformációváltozása.
Az aktinrostok és miozinkomplexek között
lejátszódó, a fentiekben ismertetett csúszó
filamentum modellt az izomkontrakció
mechanizmusára állították fel, de érvényes
más mikrofilamentum-mozgásokra is (pl. a
citokinézis [l. 19. fejezet] kontraktilis
gyűrűjének a működésére). A sejt-
organellumok transzportja során az I. típusú
miozin fehérje farki régiójával a vezikula
membránjához, feji doménjével pedig
mikrofilamentumhoz kapcsolódik (39.5.
ábra). A rost plusz végének irányában
mozogva húzza maga után a transzport-
álandó organellumot.

39.5. ábra: Vezikuláris transzport

39.4. ábra: A miozinműködés modellje mikrofilamentum mentén

181
A mikrofilamentumok szerveződése
Az F-aktin a citoplazmában kétféle struktúrát képes létrehozni: kötegeket és hálózatot; hogy
melyik alakul ki, azt a mikrofilamentumokat összetartó keresztkötő fehérje tulajdonságai döntik el
(39.6. ábra).
Az aktinkötegben párhuzamosan futó mikrofilamentumokat fűznek össze aktinkötő fehérjék (pl.
fimbrin, α-aktinin; 39.6.A. ábra). Ilyen kötegek figyelhetők meg például szövettenyészeti sejtek
citoplazmájában (stresszrostok) vagy a vékonybél-hámsejtek felszínét növelő mikrobolyhokban (l.
később).
Az aktinhálózatokban egymást keresztező mikrofilamentumok szövevényét nagyméretű, flexibilis
keresztkötő fehérjék (pl. filamin, 39.6.B. ábra) stabilizálják. Ilyen struktúrák alakulnak ki például
a sejtmembrán alatt kifeszülő kortikális hálózatban, mely a sejthártya belső felszínével is intim
kapcsolatba kerül.

39.6. ábra: Aktinkötegek (A.) és aktinhálózat (B.) szerkezete

A mikrofilamentum-rendszer és a sejtmembrán kapcsolata

Az aktinfilamentumok kiterjedt kapcsolatokat tartanak fenn a sejtmembránnal. A sejtet a
környező sejtekhez vagy az extracelluláris mátrixhoz kötő sejtmembránképletek (pl.
övdezmoszóma, fokális adhézió) és a citoszkeleton viszonyával később foglalkozunk.
A Duchenne-féle muscularis dystrophia fontos orvosi példáját képviseli a membrán és az aktin-
citoszkeleton közötti kapcsolat jelentőségének. A Duchenne-kór X-kromoszómához kötött,
recesszíven öröklődő betegség. Az érintett fiúkban progresszív izomdegeneráció lép fel, ami
megállíthatatlanul vezet mozgásképtelenséghez, majd a légzőizmok elégtelensége következtében
korai halálhoz. A gént, melynek mutációja a betegséget okozza (a jelenleg ismert legnagyobb,
mintegy 2.5 millió bázispárból álló gén) 1986-ban klónozták. A normális gén által kódolt disztrofin
fehérje az izomsejt aktinfilamentumait horgonyozza ki a sejthártya nagyméretű multiprotein
komplexeihez, rajtuk keresztül pedig az extracelluláris mátrixhoz (39.7. ábra). Feltételezik, hogy
ez a kapcsolat védi meg az izomsejt membránját a kontrakció során fellépő vongálástól.
Duchenne-kórban az izomsejtekből hiányzik a disztrofin, ennek eredménye az izomsorvadás. A
gén klónozása természetesen lehetővé tette molekuláris diagnosztikai tesztek kidolgozását a
hordozó nők felkutatására, illetve intrauterin diagnózisra.

182
A sejthártya és a citoszkeleton-rendszer speciális kapcsolatait jelentik a membrán aktintartalmú
kitüremkedései. Ezek közé tartoznak a mikrobolyhok (mikrovillusok, 39.8. ábra). Ezek tengelyében
keresztkötő fehérjékkel (fimbrin, villin) összetartott, a sejtmembránhoz és a mikrovillus
csúcsához és alapjához is rögzített aktinkötegek futnak. Szerepük a mikroboholy mechanikai
stabilitásának biztosítása. Aktinalapú képződmények a fagocitózist lebonyolító állábak
(pszeudopodiumok), illetve az egyes sejtek „araszoló mozgását” biztosító citoplazmalemezek
(lamellipodiumok) és citoplazmanyúlványok (filopodiumok) is.

39.7. ábra: A disztrofin fehérje funkciója

39.8. ábra: A mikrovillusok szerkezete

183
 40. Citoszkeleton II.: Intermedier filamentumok és
mikrotubulusok
Intermedier filamentumok
A citoszkeletonnak ez a része közepes vastagságú fehéjefonalakból épül fel. Ellentétben a
mikrofilamentumokkal és a mikrotubulusokkal, az intermedier filamentumok nem vesznek
részt a sejt mozgásainak, szaporodásának folyamataiban, hanem erős mechanikai vázat
biztosítanak a sejt számára.
Az intermedier filamentumok organizációja
A mikrofilamentumok (l. 39. fejezet) és mikrotubulusok (l. később) egymáshoz nem-kovalens
kötéssel kapcsolódó, globuláris alegységekből épülnek fel. Az intermedier filamentumok
monomer fehérjéi viszont pálcikaszerű α-helikális molekulák, melyek két végén kisméretű,
globuláris feji és farokrégió helyezkedik el (40.1. ábra). Két parallel orientációjú, egymásba
csavarodott fehérje dimert, antiparallel dimerek pedig tetramert, azok protofilamentumokat
alkotnak, melyek azután erős, kötélszerű filamentumokká sodródnak össze. Ezek a filamentumok,
eltérően a mikrofilamentumoktól és mikrotubulusoktól, polaritással nem rendelkeznek: nincs
plusz és mínusz végük. Az intermedier filamentumok képződésének, felépülésének a
mechanizmusa kevéssé ismert, az azonban valószínű, hogy – szemben a citoszkeleton más
elemeivel – sem ATP-t, sem GTP-t nem igényel. Meglehetősen stabil képződmények. Nem jellemző
rájuk a dinamikus instabilitás, bizonyos körülmények – például foszforiláció – hatására azonban
széteshetnek, majd újra felépülhetnek. Ez történik például a lamin és vimentin hálózattal a
sejtosztódás során.

40.1. ábra: Az intermedier filamentumok szerkezete

Az intermedier filamentumok sűrű hálózatot alkotnak a sejten belül, mely a maghártyával, a

mikrofilamentum és a mikrotubulus rendszerrel, a sejtmembrán dezmoszómáival (l. 41. fejezet)
speciális kötőfehérjéken keresztül kapcsolódik.

184
Intermedier filamentum fehérjék
Ebbe a fehérjecsaládba több mint 60-féle, hasonló alapszerkezetű protein tartozik. Az egyes
fehérjék – a laminok kivételével, melyek minden sejtben jelen vannak – szövetspecifikus módon
expresszálódnak.
A keratinok nagy családja mintegy 30 különböző izoformát tartalmaz. Ezek egy része
szaruképződményeket (szőr, köröm) alkot (úgynevezett kemény keratinok), a citokeratinok pedig
az epiteliális sejtek citoszkeletonjának komponensei (lágy keratinok). A vimentin kötőszöveti és
sima izomsejtek, fehérvérsejtek, adezmin az izom intermedier filamentuma. Specifikus fehérjéi
vannak a gliasejteknek, a környéki idegrendszer neuronjainak (periferin) és a központi
idegrendszer idegsejtjeinek (neurofilamentumok). Korai fejlődésük során az idegsejtek α-
internexint, az őssejtek pedig nesztineket expresszálnak. Az intermedier filamentumok családjába
tartoznak a laminok is, melyek a marginális kromatint rögzítik a maghártya belső felszínéhez.
Intermedier filamentum betegségek
Intermedier filamentumokat kódoló gének mutációját azonosították néhány öröklődő betegség
hátterében. Az epidermolysis bullosa simplex degeneratív bőrbetegség, melyet citokeratin-gén
mutációja okoz. Az érintett hámsejtek citoszkeletonja meggyengül és enyhe mechanikai stressz
(pl. dörzsölés) hatására is bőrhólyagosodás lép fel. A familiáris cardiomyopathia egyes eseteiben
dezminmutációt találtak. Az amyotrophiás lateralsclerosis hátterében multiplex genetikai és
környezeti tényezők húzódhatnak meg. Az esetek egy részében neurofilamentum-gént érint a
mutáció, aminek következtében neurofilamentum-aggregátumok képződnek, főleg a gerincvelő
motoneuronjaiban. Az idegsejtek progresszív pusztulása izomatrophiát, bénulásokat, végül halált
okoz. Hasonló következményekkel járhat az egyik szuperoxid-dizmutáz izozim génjének mutációja
is (l. 36. fejezet): a felszaporodó szabad gyökök oxidatív keresztkötéseket hozhatnak létre a
neurofilamentumok között, a fentihez hasonló eredménnyel.

Mikrotubulusok
A citoszkeleton harmadik nagy rendszerét 25 nm átmérőjű üreges pálcikák, a mikrotubulusok
alkotják. Ez a rendszer a sejt alakjának meghatározásában és mozgásainak irányításában is részt
vesz. Egyes képletei (pl. a csillók, flagellumok gerince) stabil struktúrák, mások azonban (pl. az
osztódási orsó, az organellumok transzportját végző mikrotubulusok) állandóan változó,
dinamikus képletek.
A mikrotubulusok szerkezete
A mikrotubulusok falát két globuláris
fehérjemolekula, az α- és β-tubulin
heterodimerjei alkotják (40.2. ábra). A felépült
csövecske falát 13, párhuzamosan futó,
alternáló α- és β-tubulin molekulákból álló
protofilamentum képezi. Hasonlóan a
mikrofilamentumokhoz, a mikrotubulusok is
polaritással rendelkeznek: gyorsan növő plusz
véget és lassan növő mínusz véget
különböztetünk meg rajtuk. A csövecskékhez
kapcsolódó mikrotubulusokhoz asszociált
fehérjék képződésüket segítik, illetve
stabilizálják őket. Ezek egyike az idegsejtek
axonjaiban a tau fehérje, melynek jelentőségét
40.2. ábra: A mikrotubulus szerkezete az adja, hogy Alzheimer-kórban felhalmozódik
az érintett agyterületeken.

185
Dinamikus instabilitás
Az aktinfilamentumokhoz hasonlóan a mikrotubulusok is dinamikus struktúrák: a
körülményektől függően növekednek vagy zsugorodnak. Képződésük a nukleációval kezdődik,
ami a citoplazma meghatározott régiójában, a mikrotubulus organizátor centrumban (MTOC)
megy végbe. Állati sejtekben ez általában a centroszóma (40.3. ábra), amely két egymásra
merőleges hengerből, a centriólumokból és az azt körülvevő amorf pericentrioláris anyagból áll (l.
19. fejezet). Az utóbbiban lokalizálódó harmadik tubulinfehérje, a γ-tubulin αβ-heterodimereket
megkötve nukleációs régióként szolgál. A képződő mikrotubulusok mínusz vége a pericentrioláris
anyagba ágyazódik, a plusz vég pedig a sejt perifériája felé növekszik azáltal, hogy αβ-dimer/GTP
komplexeket köt meg. Ha a GTP GDP-vé hidrolizál, a tubulinmolekulák hajlamossá válnak a
disszociációra, a mikrotubulus rövidül.

40.3. ábra: A centroszóma szerkezete

A mikrotubulusok dinamikus változásait gátló szerek az osztódási orsóra kifejtett hatásukkal

blokkolják a sejtszaporodást. A mikrotubulus-polimerizációt gátló kolhicin, vinkrisztin, vinblasztin
daganatok kemoterápiájában használatos szerek. Antitumor szerként alkalmazzák a taxolt is; ez
a mikrotubulusok stabilizálásával gátolja a sejtosztódást. Más mikrotubulusra ható szerek
gombaölő (pl. grizeofulvin) vagy féregirtó hatásúak.
Mikrotubulus motorfehérjék
A mikrotubulusok abban is hasonlítanak az aktinfilamentumokhoz (l. 39. fejezet), hogy hozzájuk
ATP-hidrolízis által hajtott fehérjék kapcsolódhatnak és rajtuk elmozdulva organellum-
transzportot végezhetnek. Ilyen motorfehérjék a kinezin- és dineincsalád tagjai. A kinezin-
fehérjék nagyméretű komplexek (40.4. ábra), melyek globuláris feji doménjeikkel
mikrotubulushoz, farokrégiójukkal pedig membránvezikulákhoz kötődnek és általában a
mikrotubulus plusz vége irányába, tehát a sejt széli része felé transzportálják őket. Az ugyancsak
több alegységből álló dineinek hasonló módon működnek, de szállítmányukat a mikrotubulus
mínusz vége felé, a sejt belsejébe továbbítják. A két fehérjecsalád tagjai szelektíven képesek
különböző vezikulákat megkötni és transzportálni. Szerepet játszanak egyes sejtalkotórészek
sejten belüli elhelyezkedésének meghatározásában is: az endoplazmatikus retikulumot és a
lizoszómákat kinezinek szorítják a sejt perifériája felé, míg a Golgi-apparátus dineineknek

186
köszönheti sejtmagközeli lokalizációját. Hogy az organellumok felismerése milyen molekuláris
mechanizmussal történik, még nem tisztázott; minden bizonnyal specifikus membránreceptorok
játszanak szerepet benne.

40.4. ábra: Mikrotubulus motorfehérjék

187
 41. Sejtmembrán I.: A lipoprotein membrán szerkezete.
Sejt–sejt kapcsolatok
A sejtet környezetétől elhatároló lipoprotein membrán, a sejthártya minden sejt alapvető és
létfontos alkotórésze. Meghatározza azt, milyen ionok és molekulák cserélődhetnek ki a sejt és
közvetlen környezete között, azaz szelektív filterként működik. Transzportfolyamatainak (l. 42.
fejezet) egyik fontos eredménye, hogy iongrádienseket hoz létre az intra- és extracelluláris tér
között, melyek szükségesek a normális sejtműködés fenntartásához, szabályozásához. Végül,
receptorfehérjéi közvetítésével szignálfelfogóként működik a sejtet kívülről érő jelek
érzékelésében.

A sejthártya szerkezete
A lipoprotein membránok folyékony mozaik modellje
A sejthártya, az intracelluláris membránrendszer és a sejtorganellumokat határoló speciális
membránok hasonló alapszerkezettel rendelkeznek: lipid kettős rétegbe ágyazott fehérjék alkotta
lipoprotein hártyák. Az elmúlt évtizedek során a membrán szerkezetének leírására számos
modellt dolgoztak ki, közülük a Singer és Nicolson által megfogalmazott folyékony mozaik
modell (41.1. ábra) vált széles körben elfogadottá. Eszerint a biológiai hártyákat folytonos,
folyékony, kétdimenziós lipid kettős réteg alkotja, melybe mozaikszerűen membránfehérjék
ágyazódnak.

41.1. ábra: A lipoprotein membránok szerkezete

A lipid kettős réteg

A lipidkomponens tehát a membránok szerkezeti integritását, folytonosságát biztosítja. A
membránlipidek közös jellemzője, hogy amfipatikus jellegűek (l. 4. fejezet): a molekulák apoláros
része a membrán belseje, centrális síkja felé néz, ahol a két réteg között hidrofób kapcsolatokat
hoz létre; a poláros csoportok a membrán két felszínén, a vizes közeg határán helyezkednek el. A
fizikokémia törvényszerűségei szerint a hidrofób csoportok a vizes fázissal tartósan nem
érintkezhetnek: ha a membrán folytonossága megszakad, a sérülés azonnal „beforr” vagy a
membrántöredékek kisebb vezikulákká záródnak, helyreállítva a lipid kettős réteg folytonosságát.
A membránokat három fő lipidtípus alkotja (ezek részletes ismertetését l. a 4. fejezetben):
Foszfolipidek. A membránalkotó glicerinfoszfolipidek közül a legjelentősebbek a foszfatidsav,
foszfatidilkolin, foszfatidiletanolamin, foszfatidilszerin. A szfingomielinek szfingozinszármazékok.
Strukturális szerepükön kívül egyes foszfolipidek a jelátviteli folyamatokat közvetítő másodlagos
messengerek forrásai is (pl. foszfatidilinozitol-származékok, foszfatidilkolin, szfingomielin; l. 45.,
46. fejezet).

188
Glikolipidek. Hidrofil régiójukhoz mono- vagy oligoszacharid kötődik, mely növeli ezeknek a
lipideknek a poláros jellegét. A lipid kettős réteg exoplazmatikus lemezében lokalizálódnak.
Koleszterin. Ez a szteroid típusú lipid minden eukariota membrán alkotórésze. A koleszterin
önmagában nem képes membránt létrehozni, de merev, lemezszerű szteránváza beékelődik a
foszfolipidek zsírsavláncai közé és növeli a membrán mechanikai stabilitását.
A lipidréteg bimolekuláris szerkezete és kémiai összetétele nagymértékben meghatározza a
membrán fizikai tulajdonságait. A „folyékony” jelleg egyik következménye, hogy a lipidmolekulák
saját rétegükben csaknem szabadon mozoghatnak oldalirányban, illetve foroghatnak
hossztengelyük körül. A laterális és rotációs mozgások könnyedségével élesen szembeállítható a
flip-flop: lipidmolekulák az egyik rétegből a másikba csak energiabefektetéssel juthatnak át,
flippáz enzimek katalitikus közreműködésével.
A membrán folyékonyságát elsősorban lipidösszetétele határozza meg. A hőmérséklet
csökkentésével a lipidréteg hirtelen megdermed, gél állapotúvá válik. A fázisátmenetnek megfelelő
„fagyáspontot” csökkenti az, ha a lipidréteg gazdag rövid, telítetlen zsírsavakban. Változó
testhőmérsékletű (poikiloterm) állatok a hideghez való alkalmazkodásképpen növelik
sejthártyáik telítetlen zsírsavtartalmát.
A membránok lipid kettősrétege aszimmetrikus: a két lemez összetétele különbözik. A negatív
töltést hordozó foszfolipidek például inkább a citoplazmatikus rétegre jellemzők, a glikolipidek
viszont az exoplazmatikus felszín felé néznek.
Liposzómák
Szárított foszfolipideket vizes közegben felszuszpendálva az amfipatikus molekulák spontán
módon lipid kettős rétegeket hoznak létre, melyek vezikulákká, liposzómákká záródnak.
Ezeknek a mesterséges membránoknak az összetétele tetszőlegesen határozható meg, tisztított
membránfehérjéket is építhetnek beléjük. A liposzómáknak óriási elméleti és gyakorlati
jelentőségük van. A kutatásban elsősorban a transzportfolyamatok törvényszerűségeinek a
tanulmányozására használják őket. Terápiás alkalmazásuk lehetőségei egyre szélesednek:
gyógyszervehikulumként kisebb toxicitással, tartósabb hatással használhatók bizonyos betegségek
kezelésére. Egyrétegű (unilamelláris) és többrétegű (mutilamelláris) liposzómákat egyaránt
használnak (41.2. ábra). Poláros és apoláros jellegű gyógyszerek szállítására egyaránt alkalmasak:
a hidrofil anyagok a vezikula belsejének vizes közegében, míg a lipofilek a liposzóma
membránjában oldódnak fel (41.2. ábra). A célsejt felszínén megkötődve többféle
mechanizmussal juttathatják be tartalmukat a sejtbe (41.3. ábra): egyszerű diffúzióval,
lipidkicserélődéssel, membránfúzióval vagy endocitózissal. A liposzómákat leggyakrabban
makrofágok fagocitálják, így a jelenleg klinikai kipróbálás alatt levő kezelési eljárások célpontjai
fagocitózisra képes sejtek. Biztató tapasztalatokat nyertek néhány fertőző betegség (brucellosis,
salmonellosis) antibiotikum-kezelésében, parazitás (pl. leishmaniasis) és szisztémás gombás
fertőzések kezelésében, bizonyos daganatok kemoterápiájában. Kísérletek folynak liposzóma-
vakcinákkal is: liposzóma-membránba építve az antigének ugyanis sokkal erősebb
antitestképzést indukálnak mint oldott állapotban.

189
 41.2. ábra: Unilamelláris (A.) és multilamelláris (B.) liposzómák szerkezete

41.3. ábra: Liposzóma által szállított gyógyszerek bejutása a célsejtbe: diffúzió (A.), lipidkicserélődés
(B.), endocitózis (C.), membránfúzió (D.)

Membránfehérjék
Hasonlóan a lipidekhez, a membránok fehérjekomponensei is amfipatikus jellegűek: hidrofób
régiójuk belemerül a lipid kettős réteg belsejébe, míg a hidrofil oldalláncok a membrán felszínére
lokalizálódnak. A membránfehérjék vízben általában rosszul oldódnak, szolubilizálásuk és
izolálásuk detergensek segítségével történik. A lipidréteghez való viszonyuk alapján kétféle
membránfehérjét különböztetünk meg. Az integráns membránproteinek belesüppednek a lipid
kettős rétegbe, esetleg teljesen át is érik azt. Ez utóbbi, transzmembrán fehérjék hidrofób régióját
egy vagy több α-helikális szakasz alkotja: az epidermális növekedési faktor (EGF) receptora például
egyetlen transzmembrán domént tartalmaz, míg az adrenalin-receptor 7, a multidrog transzporter
pedig 12 transzmembrán α-hélixszel rendelkezik. (Ezekkel a fehérjékkel későbbi fejezetekben
foglalkozunk.) A perifériás fehérjék csak lazán kötődnek a membrán felszínéhez. Ez történhet
gyenge, nem kovalens kötések közvetítésével (pl. jelátviteli fehérjék kötődése aktivált
membránreceptorokhoz, l. 46. fejezet) vagy a fehérjéhez kovalensen kötött zsírsavak,
szénhidrogénláncok útján (pl. Ras-fehérjék, l. 46. fejezet). A fehérjék orientációja, elhelyezkedése
aszimmetrikus: a perifériás fehérjék a membrán meghatározott oldalához kapcsolódnak és a
transzmembrán fehérjék is állandó citoplazmatikus és exoplazmatikus doménnel rendelkeznek.
A membránfehérjék laterális mozgása – hasonlóan a lipidekéhez – lehetséges, de gyakran
korlátozza ezt citoszkeleton fehérjék, vagy extracelluláris mátrix komponensek kapcsolódása.

190
Specializált, stabil membrán domének
41.4. ábra: A kaveola szerkezete
Sok sejt hártyáján elektronmikroszkópos
felvételeken kisméretű, klatrinborítástól
mentes betüremkedések figyelhetők meg. A
kaveoláknak nevezett képletek régóta
ismertek, pontos funkciójuk azonban ma sem
világos. Jellemző rájuk, hogy gazdagok
koleszterinben és szfingolipidekben és nagy
mennyiségben tartalmaznak kaveolin-
fehérjéket, melyek a membránlipidek belső
rétegébe merülnek és aktinfilamentumokkal
hoznak létre kapcsolatot.

Bár a kaveolák nem létfontos képződmények, részvételüket sokféle folyamatban feltételezik:

szerepet játszanak az endocitózis speciális eseteiben, a kapillárisok endotéljén keresztül folyó
transzcitózisban (transzendoteliális transzport), a koleszterin transzportban, jelátviteli folyamatok
szabályozásában. A közeljövőben gyors előrehaladás várható a kaveolák élettanának és
patológiájának kutatásában.

A sejtek kapcsolódásai
Többsejtű szervezetekben a sejtek fizikai kapcsolatba kerülnek egymással és a sejtközötti
állomány szilárd komponenseivel. Ezek a kapcsolatok mind a szöveti differenciáció és
morfogenezis, mind pedig az egyes sejtek és a szervezet működése szempontjából is nagy
jelentőségűek. Ebben a fejezetben a sejtek közötti kapcsolatokkal foglalkozunk, a 43. fejezetben
pedig röviden érintjük a sejt-extracelluláris mátrix kontaktusokat.
A sejtek közötti kapcsolatok egy része időleges. Fertőzött szövetekben például a fehérvérsejtek
felszíni fehérjéi és a kapilláris falát alkotó endotel sejtek között átmeneti, specifikus kötődés jön
létre, ami elősegíti a leukociták átjutását az érfalon (extravazáció) és a fertőzés leküzdését. A
folyamatban részt vevő sejtfelszíni fehérjék (szelektinek) örökletes rendellenessége súlyos,
visszatérő fertőzéseket eredményezhet.
A stabil intercelluláris kapcsolatokat funkcionális szempontból osztályozhatjuk: lezáró,
lehorgonyzó és kommunikáló sejt–sejt kapcsolatokat ismerünk (41.5. ábra).

41.5. ábra: Vékonybél-hámsejtek stabil kapcsolódásai

191
Lezáró kapcsolódások
Bizonyos szövetekben szükség van arra, hogy a sejtek között áthatolhatatlan, erős kapcsolat jöjjön
létre. Vékonybélsejtek között, közvetlenül a béllumen közelében, gyűrűszerű, transzmembrán
fehérjék által létrehozott hálózat kapcsolja össze az epiteliális sejteket, teljesen elzárva a lument
az intercelluláris tértől (41.6. ábra). A zonula occludens (angolul: tight junction)
transzmembrán okkludin fehérjéinek másik szerepe, hogy megakadályozzák a membrán-
komponensek laterális diffúzióját. Az epiteliális sejt ezáltal polárissá válik: apikális és bazolaterális
membrándoménje szerkezetileg és funkcionálisan is eltér egymástól (ennek jelentőségével később
foglalkozunk). A tight junction tökéletesen elválaszt folyadéktereket, illetve membrándoméneket
egymástól, összetartó erővel azonban alig rendelkezik. A vékonybél hámsejtjeit az alatta
elhelyezkedő övdezmoszóma és foltdezmoszómák kapcsolják össze erősen (l. alább).

41.6. ábra: A zonula occludens szerkezete

Lehorgonyzó kapcsolatok
A sejtkapcsolatok másik típusában a sejtmembrán speciális régiói a citoszkeleton fonalainak
letapadási helyéül szolgálnak.
Aktinfilamentumokhoz kötődő sejtkapcsolódások. A vékonybélsejtekben a tight junction alatt
helyezkedik el egy másik sejtkapcsolat, a zonula adherens (övdezmoszóma; 41.5. ábra). A két
sejt kontaktusát transzmembrán kadherin fehérjék biztosítják, ezek citoplazmatikus doménjéhez
katenin proteinek közvetítésével mikrofilamentumok tapadnak (41.7.A. ábra). (Az aktin
citoszkeleton az extracelluláris mátrixszal is kapcsolatot teremt, fokális adhéziók közvetítésével
[l. 43. fejezet].)
Intermedier filamentumokhoz kötődő sejtkapcsolódások. A sejt–sejt kapcsolatok
leggyakoribb fajtája a foltdezmoszóma (macula adherens; 41.5. és 41.7.B. ábra).
Transzmembrán kapcsolófehérjéi ugyancsak a kadherin-család tagjai, a citoplazmatikus oldalon
hozzájuk kötődő katenin fehérjék pedig a membránhoz simuló korongot, plakkot alkotnak. A
citoplazmatikusplakkon tapadnak a citoszkeleton intermedier filamentumai. Dezmoszómák olyan
szövetekben fordulnak elő nagy számban, melyekben a sejt–sejt kapcsolatok erőteljes mechanikai
hatásoknak vannak kitéve (pl. a szívizomban, a bőrhám stratum spinosumában). (A
hemidezmoszómák hasonló szerkezetű képződmények, melyek a sejtet a hámréteg alatt
elhelyezkedő bazálmembránhoz rögzítik [l. 43. fejezet]).
A bőr foltdezmoszómáinak működészavara okozza a pemphigus nevű betegségcsoportot. A
bőrhám dezmoszómák kadherin fehérjéivel szemben autoantitestek képződnek és roncsolják a
sejtek közötti adhéziós kapcsolatokat. Vízzel telt hólyagok jelennek meg testszerte, amelyek a
fertőzés és a dehidráció veszélye miatt akár végzetes állapotot is létrehozhatnak. Hasonló
kórképet (bullosus pemphigoid) hoz létre a hemidezmoszómák autoantitestek által okozott
károsodása is. Ilyenkor a hámréteg elválik a bazálmembrántól és a hám és irha között gyűlik össze
folyadék.

192
 41.7. ábra: Az övdezmoszóma (A.) és a foltdezmoszóma (B.) szerkezete

Kommunikáló kapcsolatok
A réskapcsolat (gap junction) két sejt membránja között vízzel telt csatornákon keresztül
valósul meg. Nevét onnan kapta, hogy a két hártya nem tapad szorosan egymáshoz, hanem köztük
keskeny rés marad. A csatorna falát 6–6 konnexin fehérjemolekula alkotja, mindkét membránon
áthaladva összeköti a két sejt citoplazmáját (41.8. ábra). Ionok, kis molekulák átjuthatnak rajta,
így biztosítja a két sejt működésének összehangolását. A szívizom sejtjeit összekötő
réskapcsolatok például szinkronizálják a kontrakciót. Így nem meglepő, hogy mind több adat
gyűlik össze arra vonatkozóan, hogy konnexin fehérjék mutációs léziója szerepet játszhat
bizonyos veleszületett szívrendellenességek patogenezisében. A konnexin-család más tagjai az
idegsejtek, a belső fül, a bőr sejtjeinek differenciálódásához, normális működéséhez szükségesek.
A konnexin-gének mutációját öröklődő idegrendszeri kórképek, bőrbetegségek, süketség,
szürkehályog hátterében is megtalálták már.

41.8. ábra: A réskapcsolat szerkezete

193
 42. Sejtmembrán II.: Transzport a sejthártyán keresztül
A sejtmembrán változatos eszközökkel rendelkezik arra, hogy anyagokat juttasson a sejtbe vagy
a sejtből környezetébe. Kis molekulák transzportját hajthatja a membrán két oldala között
fennálló koncentrációkülönbségük (passzív transzport), de a sejt metabolikus energiát is áldozhat
erre a célra (aktív transzport). Makromolekulák transzportja a sejthártyán keresztül
membránvezikulákba csomagoltan történik: az endocitózis (l. 35. fejezet) és exocitózis (l. 34.
fejezet) jelenségeivel már korábban részletesen foglalkoztunk. Ennek a fejezetnek a témája a kis
molekulák transzportja.

Passzív transzport folyamatok

A passzív transzportot a membrán két oldala közötti koncentráció-grádiens hajtja és
végeredménye a koncentrációkülönbség megszűnése. A transzporthoz ATP vagy más metabolikus
energiaforrás nem szükséges. A részt vevő molekuláris mechanizmusok alapján a passzív
transzportnak különböző típusait különböztetjük meg (42.1. ábra).

42.1. ábra: A membrántranszport folyamatok típusai

Egyszerű diffúzió
Kisméretű molekulák membránfehérjék közreműködése nélkül is áthatolhatnak a sejthártyán, a
foszfolipid kettős rétegen keresztül. Ez az egyszerű diffúzió kevéssé specifikus, sebessége
arányos a koncentrációkülönbséggel. A foszfolipidréteg permeábilis gázokkal (oxigén,
széndioxid), kisméretű hidrofób molekulákkal (kloroform, széntetraklorid), bizonyos mértékig
töltés nélküli poláris molekulákkal (víz, urea) szemben is. Ionok, töltéssel rendelkező molekulák
(nukleotidok, aminosavak), nagyobb molekulák (glukóz) nem jutnak át a membránlipideken.
A diffúzió speciális esete az ozmózis: a membrán impermeábilis az oldott részecskék számára, az
oldószer (víz) molekulái viszont átjutnak rajta. Az oldószer a nagyobb koncentrációjú oldal felé
vándorol mindaddig, amíg a különbség ki nem egyenlítődik. Néhány példa az ozmózis
jelentőségére: vörösvértestek szétrepedése hipotóniás oldatban (ozmotikus hemolízis); a központi
idegrendszer sejtjeinek károsodása extrémen magas vércukorszint esetén (diabeteses coma); a
vizelet mennyiségének növekedése cukorvizelés esetén (ozmotikus diuresis).
Facilitált diffúzió
A legtöbb kis molekula képtelen feloldódni a membránlipidekben, transzportja membránfehérjék
közreműködésével, facilitált diffúzióval történik. Ez a folyamat sokkal gyorsabb mint az
egyszerű diffúzió, erősen szelektív, és – mivel a rendelkezésre álló transzportfehérje molekulák
száma korlátozott – telíthető. Attól függően, hogy a transzportált részecske és a membránfehérje
között létrejön-e specifikus kapcsolat, a facilitált diffúziónak két fő típusát különböztetjük meg.

194
Fehérjecsatornák által közvetített diffúzió. A transzportnak ezt a fajtáját transzmembrán
fehérjék által kialakított csatornák végzik. Ha a csatorna nyitott állapotban van, a transzport
rendkívül gyors és általában szelektív. Vannak csatornák, melyek állandóan működnek (pl. a
mitokondrium külső membránjában levő porin), a legtöbb csatorna átjárhatósága azonban
szabályozható. Ilyenek az ioncsatornák, melyek rendkívül fontos szerepet játszanak a sejtek
ingerlékenységének és egyéb folyamatainak szabályozásában. Különösen fontosak a Na+-, K+- és
Ca++-csatornák. Ezek nyitottságát befolyásolhatja a membránpotenciál (feszültség által regulált
csatornák) vagy hormonok, ingerületátvivő anyagok (ligand által szabályozott csatornák). Az
ioncsatornák működésének jellegzetes példája az akciós potenciál (42.2. ábra) kialakulása.

42.2. ábra: Az akciós potenciál

A nyugalmi sejt membránpotenciálját elsősorban a Na+ -ionok kifelé és a K+ -ionok befelé irányuló
meredek koncentráció-grádiense alakítja ki. Ingerlés hatására először Na+-csatornákon keresztül
Na+ -ionok áramlanak a sejtbe (depolarizáció), majd K+-csatornákon át K+ -ionok diffundálnak az
extracelluláris térbe (repolarizáció). Nyilvánvaló, hogy a Na+- és K+-csatornák működésének
zavarai súlyos következményekkel járhatnak. Szívmegállással és hirtelen halállal járó
szívritmuszavarok hátterében gyakran mutatható ki a szívizomban expresszálódó ioncsatornák
génjének mutációja.
Speciális fehérjecsatorna működészavara okozza a cystás fibrosist. Ebben a gyakori, autoszomális
recesszív módon öröklődő betegségben a külső elválasztású mirigyek váladéka abnormálisan
sűrű, hasnyálmirigy-elégtelenséget, bélelzáródást, ismétlődő légúti fertőzéseket okozva. A CFTR-
fehérje (az angol cystic fibrosis transmembrane conductance regulator kifejezés rövidítése) Cl–-
csatorna: a mutációk következménye általában olyan konformációváltozás, mely megakadályozza
a fehérje transzportját a Golgi-apparátusba. Az éretlen fehérje az endoplazmatikus retikulumban
marad és gyorsan degradálódik.
A csatornafehérjék közé tartoznak az akvaporin-család tagjai is. Ezek szelektív vízcsatornák,
ionokat nem transzportálnak. Minden sejt hártyájában jelen vannak, nagymértékben növelve a
foszfolipidréteg által biztosított korlátozott víz-permeabilitást. A víztranszport hajtóereje a
membrán két oldala között fennálló ozmotikus grádiens. Akvaporin csatorna transzportálja a
vizet a szemlencsébe, fenntartva annak transzparenciáját. Ennek mutáció által okozott
működészavara öröklődő cataractát okoz. A vese gyűjtőcsatornáinak sejtmembránjaiban
vazopresszin által aktivált akvaporin expresszálódik. A hipofízis hátsó lebenyének ez a hormonja
felelős szomjazás esetén a vese vízvisszaszívó kapacitásának fokozódásáért. A vesében
expresszálódó akvaporin génjében bekövetkező mutáció vazopresszin kezeléssel nem javítható
polyuriát (nephrogen diabetes insipidust) okozhat.

195
Carrier-fehérjék által közvetített diffúzió. A carrier-fehérjék (42.1. ábra) nem képeznek
csatornát, hanem a transzportálandó anyagot megkötik, konformációváltozást szenvednek és a
membrán másik oldalán leadják. Ilyen fehérjék végzik fontos tápanyagok (cukrok, aminosavak,
nukleozidok) membrántranszportját. A carrier-fehérjék egy része uniporter: egyetlen anyagot
transzportál (pl. a glukóz transzporter). Más fehérjék kotranszporterek, azaz egy ion vagy
molekula aktív transzportja egy másik anyag passzív transzportjával van összekötve. A két
részecske szállítása történhet egyirányban (szimporter, pl.: Na+/glukóz szimporter) vagy
ellentétes irányban (antiporter, pl.: Na+/Ca++ antiporter). Ez utóbbi transzportfehérje típus fontos
példája a Na+-H+kicserélő fehérje is: a Na+ ionok passzív sejtbe áramlása az anyagcserefolyamatok
során felgyülemlő H+ ionokat pumpál ki a sejtekből, meggátolva így a citoplazma elsavasodását.

Aktív transzport folyamatok

Szemben a diffúziós jelenségekkel, az aktív transzport folyamatok koncentráció-grádienst
hoznak létre és tartanak fenn. Fiziológiás jelentőségüket jelzi, hogy egy sejt energiatermelésének
mintegy 50 százalékát iongrádiensek fenntartására használja fel. Az aktív transzportot az igénybe
vett energiaforrás alapján szokás osztályozni.
ATP-függő transzporterek
Ezek a transzmembrán fehérjék a transzporthoz szükséges energiát közvetlenül ATP
hidrolíziséből nyerik.
P-típusú ATPázok. Működésük során foszforilálódnak, nevük innen származik. A fehérjecsalád
legismertebb tagja a Na+-K+ ATPáz, amely a sejthártya két oldala közötti ionaszimmetria (ezáltal a
membránpotenciál) fenntartásáért felelős: extracellulárisan a Na+, intracellulárisan pedig a K+
dominál. Az ionaszimmetria biztosítja a sejt ingerlékenységét és a fiziológiás ozmotikus nyomást,
a Na+-grádiens pedig a sejt számára létfontos anyagok felvételét hajtja (l. később). A Na+-K+ -
pumpa tetramer szerkezetű (42.3. ábra): a két α-alegység az iontranszportot végzi, a β-alegységek
a pumpa „összeszerelését” és sejten belüli transzportját irányítják. Működése során a pumpa belső
felszínén három Na+-t köt meg, foszforilálódik, majd a Na+-okat a sejtfelszínen leadja. Ezután az
extracelluláris felszínen két K+ kötődik meg, az α-alegységek defoszforilálódnakés a K+-ok a
citoszólba disszociálnak.

42.3. ábra: A Na+-K+ pumpa működése

A szívizom-összehúzódást erősítő, krónikus szívelégtelenségben gyógyszerként alkalmazott

szívglikozidák hatásukat a szívizom Na+-K+-pumpájának gátlásával fejtik ki. Hatásukra ugyanis
csökken a Na+-grádiens, így a Na+/Ca++ antiporter működése is. A szívizomban kissé emelkedik a
Ca++-koncentráció, az izomrostok összehúzódása erőteljesebbé válik.
P-típusú ATPáz a Ca++ ATPáz is. Ca++-okat pumpál az endoplazmatikus retikulumba és a sejt közötti
állományba. A Ca++ -pumpa működésének eredményeképpen a nyugalmi sejt citoszóljában a Ca++-
koncentráció mintegy tízezerszer (!) alacsonyabb mint extracellulárisan. Ez azért fontos, mert
bizonyos hatásokra a sejt azzal reagál, hogy citoszóljában hirtelen megnöveli a Ca++-szintet, ami

196
különböző biokémiai folyamatokat indít be (l. 45. fejezet). A meredek nyugalmi Ca ++-grádiens
előfeltétele ennek a gyors válasznak.
V-típusú ATPázok. A sejt egyes vezikulumaiban (lizoszómák, endoszómák) erősen savas pH
uralkodik. Membránjukban bonyolult alegységszerkezetű protonpumpák működnek, melyek ATP-
függő módon H+-okat transzportálnak a vezikula belsejébe.
F-típusú ATPázok. A mitokondriumok (és kloroplasztiszok) F0F1 partikulumai (l. 37. fejezet)
valójában ATP által hajtott protonpumpák: ATP-t hidrolizálva H+-okat exportálnának a
mitokondrium mátrixból. A működő mitokondriumban azonban a reakció megfordul: az
elektrontranszport lánc által létrehozott protongrádiens ATP-szintázként működteti az F0F1
komplexet.
ABC-transzporter család. E glikoprotein család tagjai multiplex transzmembrán α-helikális
régiókkal és a citoszólba nyúló hurkaikban ATP-kötő doménnel (angolul: ATP-binding cassette)
rendelkeznek. Bár közéjük tartozik a CFTR csatornafehérje (l. előbb), a család legtöbb tagja aktív
transzporter. Legismertebb képviselőik a multidrog transzporter fehérjék (42.4. ábra), melyek
fiziológiás funkciója, hogy toxikus hatású hidrofób anyagokat (xenobiotikumokat) pumpálnak ki
a sejtekből. A multidrog transzporter család tagjaira jellemző a csekély mértékű specificitás:
kémiailag kevéssé hasonló vegyületek széles körét képesek kipumpálni a sejtből. Orvosi
jelentőségét az adja, hogy gyakran felelős a daganatterápiában használatos kemoterápiás
szerekkel szemben fellépő rezisztencia kialakulásáért. Ilyenkor a kezelésre addig jól reagáló
tumorban olyan mutáns sejtek jelennek meg, melyekben egy multidrog transzporter génje
amplifikálódott, a fehérje nagy mennyiségben termelődik és a daganat többféle szerrel (pl.
kolhicin, vinblasztin, adriamicin) történő kezelés ellenére is tovább nő. A multidrog rezisztencia
kialakulását késlelteti, ha a beteget kezdettől különböző citosztatikumok kombinációjával kezelik.
Jelentős erőfeszítések történnek a multidrog transzportereket gátló gyógyszerek kifejlesztésére
is.

42.4. ábra: A multidrog transzporter szerkezete

Ionfüggő transzporterek
Az aktív transzport másik fő típusában ATP-hidrolízisnek nincs közvetlen szerepe: az aktív
transzportot olyan kotranszporter fehérjék végzik, melyek a kérdéses anyagot ionok passzív
transzportjához kapcsolva halmozzák fel a membrán egyik oldalán. A transzportot tehát a
transzmembrán iongrádiensekben tárolt energia hajtja. Mivel az iongrádienseket ATP-függő
pumpák tartják fenn, végső soron az ionfüggő transzporterek (ún. másodlagos aktív

197
transzporterek) működése is ATP-hidrolízist igényel. Az ionfüggő transzporterek jellegzetes
példája a Na+/glukóz szimporter: segítségével a sejtek környezetükből koncentráció-grádienssel
szemben is képesek felhalmozni a szőlőcukrot.
Gyakori eset, hogy egy anyag transzmembrán transzportjához különböző carrier-fehérjék
összehangolt működése szükséges. Ennek jól ismert példája a szőlőcukor felszívódása a
keringésbe, ami a vékonybélsejteken keresztül transzepiteliális transzporttal történik (42.5.
ábra). A vékonybél hámrétegét polarizált sejtek alkotják: apikális és bazolaterális membránjuk
fehérjeösszetétele eltérő, a proteinek laterális diffúzióval történő összekeveredését a tight
junction által képzett barrier akadályozza meg. A glukózfelvételben három transzportfehérje
játszik fő szerepet. A Na+/glukóz szimporter a mikrovillusokon keresztül felveszi a bél lumenéből
a cukrot. Az emelkedő intracelluláris glukózkoncentráció a bazolaterális membrán glukóz
transzporterén keresztül facilitált diffúzióval a hám alatti kötőszövet kapillárisaiba juttatja a
cukrot. A bazolaterális membrán Na+-K+ -pumpája pedig biztosítja azt az alacsony intracelluláris
Na+-szintet, ami előfeltétele a Na+/glukóz szimporter hatékony működésének.

42.5. ábra: A glukóz transzepiteliális transzportja a vékonybél hámsejtjén keresztül

198
 43. Sejtmembrán III.: A sejthártya és az extracelluláris
mátrix kapcsolata
Soksejtű állatokban a sejtek nemcsak egymással létesítenek kapcsolatot membránjaikon
keresztül, hanem az általuk kiválasztott, a kérdéses szövetre jellemző összetételű sejt közötti
állomány (extracelluláris mátrix) alkotórészeivel is. A mátrix szekretált fehérjékből és
poliszacharidokból áll, vizes közegében egyes szövetekben szervetlen sók is lerakódhatnak (pl. a
csontokban kálciumfoszfát). Számos funkciója van: sejt közötti vázat alkot a szöveti sejtek
számára; a szövetek, szervek embrionális formálódása, morfogenezise során felszínt biztosít a
sejtmozgások, átrendeződések számára; a membránon keresztül kapcsolatot létesítve a
citoszkeletonnal részt vesz a sejtek alakjának meghatározásában; a komponensei által megkötött
hormonok, növekedési faktorok szignál transzdukciós hatásait segíti, modulálja. A sejtmembrán
specifikus fehérjéivel kapcsolódva, azok közvetítésével maga az extracelluláris mátrix is hatással
van a sejtek génexpressziójára.
Az extracelluláris mátrix és a sejtek kapcsolatában négy makromolekuláris struktúra játssza a fő
szerepet (43.1. ábra): kollagén rostok, glikózaminoglikánok és proteoglikánok, multiadhezív
fehérjék és a sejthártya integrin fehérjéi.

43.1. ábra: Az extracelluláris mátrix és a sejtmembrán kapcsolata

Kollagének
A kollagén fehérjék vízben oldhatatlan, fibrilláris proteinek, az állatvilág legelterjedtebb fehérjéi.
Emberben egy nagy géncsalád tagjai kódolják őket. A kollagénláncok hármasával felcsavarodva
tripla-hélix struktúrát alkotnak (43.2. ábra), a polipeptidláncokat hidroxilált aminosavak
(hidroxilizin, hidroxiprolin) között kialakuló hidrogénkötések tartják össze. A szokatlan tripla-
helikális fehérjeszerkezet kialakulását az teszi lehetővé, hogy a kollagénlánc minden harmadik
aminosava glicin, a legkisebb méretű aminosav (oldallánca csak egy hidrogénatom). A
glicinmolekulák különleges hajlékonyságot kölcsönöznek a polipeptidláncnak.

43.2. ábra: A kollagén tripla-helikális szerkezete

199
A kollagénláncok szintézise a durva felszínű endoplazmatikus retikulum felszínén történik (43.3.
ábra, 1. lépés). A lumenbe kerülő szolubilis prokollagén (2. lépés) lizin és prolin oldalláncai
hidroxilálódnak, a polipeptidlánc glikozilálódik (3. lépés). A hidroxilációhoz C-vitaminra van
szükség; skorbutban a C-vitaminhiány következtében a hidroxilálatlan prokollagén nem képes
tripla-hélixet alkotni, a sejten belül gyorsan degradálódik. A kollagén rostok hiánya vezet az erek,
inak, bőr sérülékenységéhez. A hidroxilált prokollagén rostok viszont tripla-helikális szerkezetet
vesznek fel, köztük diszulfidhidak is létesülnek (4. lépés). A transzportvezikulákkal a Golgi-
komplexbe jutó prokollagén (5. lépés) glikozilációja befejeződik, majd exocitózissal a sejtfelszínre
kerül (6. lépés). Itt az N- és C-terminális propeptidek lehasításával tropokollagén egységek
képződnek (7. lépés), melyek között kovalens keresztkötések alakulnak ki és a tripla-helikális
egységek így kollagén rosttá állnak össze (8. lépés).

43.3. ábra: A kollagénképzôdés mechanizmusa

A képződő kollagénstruktúrák szerkezetük és funkciójuk alapján különböző típusokba

sorolhatók. A rostképző kollagénekben a láncok rendkívüli szakítószilárdságú kötegekbe
rendeződnek. Ez a kollagéntípus alkotja a csontok, inak, szalagok teherbíró rostállományát. A
rostképző kollagének génjének mutációi instabil tripla-hélixek képződéséhez vezethetnek, ezek
nem transzportálódnak az endoplazmatikus retikulumból a Golgi-komplexbe. A rostszegény
csontok törékenyek, az ismétlődő törések nyomorékká tehetik a beteget. Az autoszomális
domináns öröklődésű kórkép neve: osteogenesis imperfecta. A mutáció általában egy glicint érint
a kollagénláncban, gátolva a tripla-helikális szerkezet kialakulását. A bőr, izületek, erek
kollagénjét érintő öröklődő betegség az Ehlers-Danlos-szindróma. Jellemzői a nyúlékony, „lötyögő”
bőr, laza ízületek, aneurysmák kialakulására hajlamos artériák.

200
A rostasszociált kollagének az extracelluláris mátrix különböző elemeihez rögzítik a kollagén
rostokat. Az epiteliális sejtrétegek alapjához rögzített lamina basalist hálóképző kollagének
alkotják.
A kollagén rostok mellett a szövetek gyakran rugalmas rostokat is tartalmaznak (pl. tüdő, nagy
artériák), melyek keresztkötésekkel összekapcsolt elasztin fehérjék hálózatából állnak.

Glikózaminoglikánok és proteoglikánok
Az extracelluláris mátrix jelentős mennyiségben tartalmaz összetett szénhidrátokat. A
glikózaminoglikánok (l. 4. fejezet) monoton módon ismétlődő diszacharid egységekből épülnek
fel. A diszacharid egyik alkotórésze N-acetilglukózamin vagy N-acetilgalaktózamin, a másik pedig
egy savas cukor. A glukózaminoglikánok gyakori oldalláncai a szulfátcsoportok is. Kémiai
összetételük erősen hidrofil jelleget ad nekik: hidratált gélt alkotnak, meghatározzák a sejtközötti
állomány konzisztenciáját. Közülük a hialuronán szabad állapotban létezik, előnyös fizikai
tulajdonságai felelősek a porcszövet rugalmas teherbírásáért.
Más poliszacharidok fehérjéhez kötötten proteoglikánokat alkotnak; ilyenek például a
dermatán-szulfát, kondroitin-szulfát, heparán-szulfát. A mátrix proteoglikánok a sejtközötti
állomány alkotórészei (43.1. ábra). Egyik képviselőjük a porcszövet aggrekánja, melyben egy
központi fehérjelánchoz (core protein) kondroitin-szulfát és keratán-szulfát molekulák kötődnek.
Az aggrekán egységek kapcsolófehérjék közvetítésével hialuronán óriásmolekulákhoz rögzülnek,
hatalmas méretű komplexeket alkotva (43.4. ábra).
A proteoglikánok másik típusa transzmembrán core protein közvetítésével a sejthártya külső
felszínéhez van lehorgonyozva. Ilyen sejtfelszíni proteoglikánok például a szindekán és a
fibroglikán (43.5. ábra). Glikózaminoglikán láncaikkal a sejtet a sejtközötti állomány rostjaihoz
rögzítik.

43.5. ábra: Sejtfelszíni proteoglikánok

43.4. ábra: Aggrekán komplexek
felépítése
Multiadhezív fehérjék
Az extracelluláris mátrix fontos komponensei azok a
fehérjék, melyek sejtfelszíni receptorokkal, kollagén
rostokkal, proteoglikánokkal egyaránt kapcsolatot
létesítenek. A multiadhezív fehérjék egyik fontos
képviselője a laminin, mely a bélhám, a kapillárisfal, a
veseglomerulusok lamina basalisának „ragasztóanyaga”.
A kötőszöveti sejteket fibronektin köti a kollagén
rostokhoz.

201
 Integrinek
A szövetek organizációjának, integritásának kialakításában fontos szerepet játszanak ezek a
transzmembrán fehérjék, melyek az extracelluláris mátrix komponenseit felismerő receptorként
működnek (az integrinek jelátviteli szerepével a 48. fejezetben foglalkozunk). Az integrinek αβ
heterodimerek; mindkét alegységcsalád több, szövetspecifikus tagból áll, kombinációik több mint
húsz integrin dimert eredményeznek. Az integrinek a sejthártya külső felszínén mátrixfehérjékkel
(kollagénnel, lamininnal, fibronektinnel) kapcsolódnak, a citoszól felől pedig vagy
aktinfilamentumok végződnek rajtuk fokális adhéziót alkotva, vagy pedig intermedier
filamentumokkal hemidezmoszómákat képeznek (43.6. ábra). Az integrinek fontosságát mutatja,
hogy a K.O. mutáns egerekben súlyos fejlődési rendellenességek alakulnak ki és általában már in
utero elpusztulnak.

43.6. ábra: A fokális adhézió (A.) és a hemidezmoszóma (B.) szerkezete

A fokális adhéziók (43.6.A. ábra) különböző sejttípusokat (fibroblasztok, leukociták, stb.) kötnek
össze az extracelluláris mátrix elemeivel. Nagyméretű, dinamikus fehérjekomplexek, melyek a
sejtek vándorlása során kialakulnak, majd eltűnnek. Integrin dimerjeik a külső oldalon
multiadhezív fehérjékkel (pl. fibronektin) kötődnek az extracelluláris mátrix molekuláihoz,
intracellulárisan pedig aktinkötő fehérjék (pl. vinkulin, α-aktinin) útján kapcsolódnak a
mikrofilamentum rendszerhez. Számos jelátviteli fehérjével kapcsolódva a szignál transzdukció
folyamataiban is részt vesznek (l. 48. fejezet).
A hemidezmoszómák (43.6. B. ábra) sokkal statikusabb struktúrák. A hámsejteket rögzítik a
bazálmembránhoz, a kapcsolatot laminin hozza létre. Az integrin dimerek sejten belüli
doménjéhez citoplazmatikus plakk, hozzá pedig intermedier filamentumok kapcsolódnak.
Daganatsejtekben az integrinek eltűnése baljós jel: a sejtek elvesztik kontaktusukat a mátrixszal,
a daganat invazívvá válik és áttétképző, metasztatizáló képessége is megnő. Bizonyos integrinek
örökletes defektusa leukocita-adhéziós deficienciát okoz: a fehérvérsejtek képtelenek a sérülés,
gyulladás helyszínére vándorolni és életveszélyes fertőzések léphetnek fel.

202
 44. Szignáltranszdukció I.: Jelátviteli molekulák és
receptoraik
Az élő sejt egyik alapvető jellemzője, hogy anyagcsere-folyamatait csak a környezetével folytonos
kölcsönhatásban képes végrehajtani. Élete során így környezetéből számos behatás éri:
hőhatások, sugárzás, mechanikai, elektromos ingerek, kémiai jelek (44.1. ábra). Különösen
fontosak ezek az extracelluláris szignálok a többsejtű szervezetek esetében, hiszen biztosítják a
sejtek közötti kommunikációt, a szervezet egészének összehangolt működését. Mivel a sejtek
közötti kapcsolatfelvétel döntő részben kémiai ágensek közvetítésével történik, kémiai
jelátvitelről, szignáltranszdukcióról beszélünk.

44.1. ábra: A sejtet érő környezeti hatások

A jelátvitel fázisai
A kémiai jelátvitel két szakaszban zajlik
(44.2. ábra). A sejtek közötti
szignalizáció során a jeltermelő sejt
jelátviteli anyagot (ligandot) képez,
mely eléri és felismeri a megfelelő, a
ligandra specifikus receptorral
rendelkező célsejtet. A ligand
receptorhoz kötődésével megkezdődik
a szignáltranszdukció második fázisa:
az intracelluláris jelátvitel, melynek
eredményeképpen a sejt anyagcsere-,
strukturális és génexpressziós
változásokkal biológiai választ ad az őt
ért hatásra.

44.2. ábra: A kémiai jelátvitel szakaszai

203
 A kémiai jelátvitel fajtái
A jeltermelő és a célsejt egymáshoz való viszonya alapján a szignáltranszdukció több típusát
különböztethetjük meg (44.3. ábra).

44.3. ábra: A kémiai jelátvitel típusai. A:
endokrin; B: parakrin; C: juxtakrin; D:
autokrin; E: intrakrin szignalizáció (•, ligand;
Υ, receptor)
Endokrin jelátvitel
A belső elválasztású (endokrin) mirigyek
által termelt hormonok a véráram útján érik el
távoli célsejtjeiket (44.3.A. ábra). Mivel a
jelátvitelimolekulának a szervezet különböző
víztereiben (vérplazmában, szövetnedvben,
esetleg az intracelluláris folyadékban is) kell
eloszlania, a folyamat lassú és a hormonnak
igen kis koncentrációban is hatásosnak kell
lennie: a célsejtek nagy affinitású
receptorokkal rendelkeznek.
Parakrin jelátvitel
A parakrin szignalizáció esetében a
jeltermelő és a célsejt egymás közelében
helyezkedik el (44.3.B. ábra). A ligand (itt
lokális kémiai mediátornak nevezzük)
diffúzióval éri el a célsejtet, nem kerül a
véráramba. A hatás gyors, átmeneti, a
mediátor viszonylag nagy helyi koncentrációt
ér el. Parakrin jelátvitellel fejti ki például
hatását a lokális értágulatot, duzzanatot okozó
hisztamin. A nitrogénoxid (NO) ugyancsak
fontos lokális kémiai mediátor. A jeltermelő
sejtekben nitrogénoxid szintáz enzimek
argininből hozzák létre, gázként könnyedén
átjut a sejtmembránokon és a környező
szövetekben értágulatot okoz. Hatását a sejtek
ciklikus-GMP szintjének emelésén, illetve
fehérjék nitrozilációján keresztül fejti ki. A
parakrin jelátvitel speciális esetét jelenti a
szinapszis működése: a preszinaptikus sejt
neurotranszmitterrel viszi át a jelet a
posztszinaptikus célsejtre.
Juxtakrin jelátvitel
A juxtakrin jelátviteli mechanizmus
közvetlen sejt–sejt szignalizációt biztosít
(44.3.C. ábra): a ligand sejtfelszíni fehérjeként
(pl. növekedési faktorként) expresszálódik és
kapcsolódik a célsejt sejtfelszíni receptorához.
Ez a szignalizációs forma tehát a jeltermelő és
célsejt fizikai kontaktusát igényli.

Autokrin jelátvitel
A jeltermelő és a célsejt egy és ugyanaz (44.3.D. ábra): a sejt által szekretált ligand (pl. növekedési
faktor) a sejt saját sejtfelszíni receptorához kötődik. Autokrin stimuláció érvényesül az
egyedfejlődés egyes folyamataiban és bizonyos daganatok növekedésében (l. később).

204
Intrakrin jelátvitel
Sejten belül képződő anyagok (pl. metabolitok) intracelluláris receptorokhoz kötődve fejthetnek
ki hatást, anélkül, hogy elhagynák a jeltermelő sejtet (44.3.E. ábra). Hogy ilyen intrakrin
szignalizációs mechanizmus is létezhet, valószínűsítette olyan ún. árva receptorok léte, melyek
ligandja sokáig ismeretlen volt. Ezek a szteroid-receptorcsaládba tartoznak, közülük soknak a
ligandját is azonosították már és egyre többet tudnak fiziológiás szerepükről is. „Árva receptorok”
ligandjukat kötve transzkripciós faktorokként szabályozzák trigliceridek, epesavak, zsírsavak,
xenobiotikumok metabolizmusát végző enzimek expresszióját.

A receptorfehérjék lokalizációja
A jelátviteli molekulák fizikai-kémiai tulajdonságaiktól függően kétféle receptorfehérje
közvetítésével fejthetik ki hatásukat a célsejtekben (44.4. ábra).

44.4. ábra: Intracelluláris (A.) és sejtfelszíni (B.) receptorok

Kis hidrofób molekulák (szteroidok, tiroxin, retinsav stb.) számára a sejthártya szabadon átjárható:
intracelluláris receptoruk a citoszólban vagy a sejtmagban helyezkedik el (44.4.A. ábra), a
ligand-receptor komplex hatásait közvetlenül fejti ki a sejtben (l. 32. fejezet).
A hidrofil természetű jelátviteli anyagok vagy nagyméretű polipeptidek (pl. inzulin,
hipofízishormonok, növekedési faktorok) vagy kisméretű töltéssel rendelkező molekulák (pl.
adrenalin, acetilkolin, hisztamin). Ezek számára a membrán foszfolipidrétege impermeábilis:
hatásukat sejtfelszíni receptorfehérjék közvetítésével fejtik ki (44.4.B. ábra). (Megjegyzendő,
hogy bizonyos lipidtermészetű jelátviteli ágensek [pl. a trombocita-aggregációt, sima izom
összehúzódást okozó, lokális mediátorként ható prosztaglandinok] receptorai is sejtfelszíni
fehérjék.)

205
45. Szignáltranszdukció II.: Heterotrimer G-proteinek által
közvetített jelátvitel
A sejtbe bejutni képtelen ligandok sejten belüli hatásait a sejtfelszíni receptorok közvetítik: a
receptor stimulálása a sejten belül biokémiai folyamatok láncreakcióját indítja el, melyek végül a
sejtmagba is eljuttatják a szignált. Transzkripciós faktorok közvetítésével specifikus
génexpressziós jelenségek következnek be, melyek strukturális és metabolikus változásokhoz
vezetnek és végeredményben a sejt biológiai válaszát eredményezik (45.1. ábra). Az intracelluláris
jelátviteli folyamatok általános elvei közösek és egyszerűek; az elmúlt évek rendkívüli intenzitású
kutatásai azonban nyilvánvalóvá tették, hogy a receptor és a sejtmag számos különböző
szignalizációs pályával köthető össze, melyekben nagyszámú jelátviteli molekula játszik szerepet.
A következő fejezetek a legfontosabb jelátviteli utak jellemzőivel foglalkoznak.
A jeltovábbításra használt mechanizmus alapján a
sejtfelszíni receptorokat négy kategóriába szokás
sorolni: (I) az ioncsatorna receptorok valójában ligand
által szabályozott csatornafehérjék (pl. az idegsejtek,
haráncsíkolt izom acetilkolin-szabályozott Na+/K+-
csatornái, l. 42. fejezet); (II) a G-protein-kötött
receptoroktranszmembrán jeltovábbítását guanin-
nukleotid-kötő fehérjék végzik; (III) a katalitikus
receptorokenzimaktivitásuk segítségével továbbítják
a szignált; (IV) más receptorok enzimaktivitással nem
rendelkeznek, citoplazmatikus tirozin-proteinkináz
enzimeket használnak a szignalizációra. Ebben a
fejezetben a G-proteinek által közvetített
mechanizmussal foglalkozunk.

45.1. ábra: A sejtfelszíni receptorokról induló

intracelluláris jelátviteli pályák felépítésének elve

Heterotrimer G-proteinek
A G-proteinek népes családjának tagjai guaninnukleotidok megkötésére képesek: GDP-kötő
állapotban inaktívak, GTP-t kötve azonban képessé válnak biokémiai funkciójuk ellátására.
Lehetnek kisméretű monomer fehérjék (l. 46. fejezet), illetve α-, β- és γ-alegységből felépülő
heterotrimer G-proteinek. A jeltovábbítás szempontjából az α-alegység jelentőségét ismerték fel
legkorábban. Emberben ennek a polipeptidcsaládnak több mint húsz tagja ismert. GDP-, GTP-
kötésre képesek, saját GTPáz-aktivitással rendelkeznek. A β- és γ-alegységeknek ugyancsak
többféle izoformája létezik. Ezek a fehérjék erősen egymáshoz tapadnak, fiziológiás körülmények
között nem válnak el egymástól. A γ-subunithoz izoprenillánc kapcsolódik, az egész G-protein
komplexet ez horgonyozza le a sejthártya belső felszínéhez.
A heterotrimer G-proteinek specifikus receptor- és effektorfehérjék között közvetítenek (45.2.
ábra). A ligand receptorhoz kötődésének hatására a5 Gpαβγ-komplex a receptorhoz kapcsolódik,
konformációváltozást szenved és az α-alegységen a GDP GTP-re cserélődik. Az így aktivált α-
alegység disszociál a βγ-komplexekről és hatást gyakorol effektorára (E1 a 45.2. ábrán), mely a
jelet a sejt belsejébe továbbítja. Bizonyos rendszerekben a βγ-komplex is képes – az α-alegységtől
független – szignalizációra (E2 effektor az ábrán). Az α-subunit GTPáz aktivitása közben a GTP-t
GDP-re hidrolizálja, az inaktivált α-lánc így ismét βγ-dimerhez kötődik, a receptor-G-protein-
effektorok rendszer visszakerül a nyugalmi alapállapotba.

206
 45. 2. ábra: Heterotrimer G-fehérje által közvetített jeltovábbítás. (A: alapállapot; B: receptor-
aktiválás; C: alegység-disszociáció; D: effektor-aktiválás; E: GTP-hidrolízis)

A heterotrimer G-proteinek útján ható receptorok hatalmas fehérjecsaládot alkotnak. Jellemző

rájuk, hogy hét transzmembrán α-hélix rögzíti őket a sejthártyába (heptahelikális receptorok, l.
33.2. ábra). A család egyes tagjai érzékszervi ingereket (szag, íz, fény), mások kémiai jelátvivő
ágenseket (hormonok, neurotranszmitterek) érzékelnek. Számuk ezernél is nagyobb. A G-
proteinek effektorai is többfélék lehetnek; az alábbiakban részletesen az adenilcikláz és a
foszfolipáz C enzimek által közvetített mechanizmusokkal foglalkozunk.

A cAMP-út
A G-proteinek által közvetített jelátviteli utak közül a legrészletesebben vizsgált mechanizmus az
adrenalin β-adrenerg receptorokon keresztül kifejtett hatása: májsejtekben ez a glikogén
lebontásához vezet. A β-adrenerg receptorral kölcsönhatásba kerülő G-protein effektora az
adenilátcikláz enzim (45.3. ábra). Az adrenalin receptorhoz kötődése stimulálja az adenilátciklázt:
a közvetítő G-proteint ezért Gs-nek (α-alegységét pedig αs-nek) nevezzük. Az adenilátcikláz
transzmembrán fehérje, a citoszól felé néző aktív centruma ATP-ből 5’, 3’-ciklikus-AMP-t
(cAMP-t) hoz létre. (45.4. ábra) A cAMP másodlagos messenger molekula: példánkban adrenalin
(az elsődleges messenger) hatására képződik a sejtben és célmolekuláihoz diffundálva az
adrenalin intracelluláris hatását közvetíti mindaddig, amíg koncentrációja a nyugalmi szintre nem
csökken. (Elbontását a ciklikus nukleotid foszfodiészteráz enzim végzi: 5’-AMP-vé alakítja.) A cAMP
fő célmolekulái a cAMP-függő fehérjekináz (protein-kináz A, PKA) enzimek. A PKA izoformái két
regulátor (R) és két katalitikus (C) alegységből állnak. A tetramer szerkezetű enzim inaktív, cAMP
molekulák az R-alegységhez kötődve a komplex disszociációját idézik elő: a felszabaduló aktív C-
alegységek különböző célfehérjéket foszforilálnak.

207
 45.3. ábra: A cAMP-út

45.4. ábra: A ciklikus-AMP képződése és elbontása

A PKA szerin/treonin proteinkináz: ATP-molekulák szélső foszfátját hasítja le és kapcsolja

észterkötéssel a célfehérjék specifikus szerin vagy treonin oldalláncainak hidroxilcsoportjaihoz.
A foszforiláció konformációváltozást, következésképpen a fehérje funkciójának, aktivitásának
módosulását eredményezi. A ligandumtól és a célsejttől függően a cAMP különböző fehérjék
foszforilációját serkenti: enzimek (pl. a glikogén-metabolizmus kulcsenzimei), membránfehérjék,
strukturális fehérjék, transzlációs faktorok stb. módosulhatnak.
A felszabaduló C-subunitok egy része transzlokálódik a sejtmagba és ott transzkripciós faktorokat
foszforilál. Ezek közül a legfontosabb egy olyan fehérje, amely a cAMP-reszponzív elem (CRE) nevű
enhancerhez kötődik. A CREB (CRE-binding protein) leucin-cipzár fehérje (l. 32. fejezet), számos
izoformája létezik. Enhancer-eleme – mely sok gén promóterrégiójában jelen van – dimer
formában köti meg a CREB-komplexeket, majd foszforilációjukat követően megnő az érintett gén
expressziója. A génaktivációban fontos szerepet játszik egy koaktivátor fehérje, a CBP (CREB-
binding protein). Ez a fehérje nukleoszomális hisztonokat acetilál az érintett gén promóter-
régiójában, fellazítja a kromatint és elősegíti az RNS-polimeráz II kötődését. A CREB-fehérjéknek
és a CBP-nek fontos szerepük van a cAMP sokszínű celluláris hatásainak kialakításában (a sejtek

208
szaporodásának, differenciálódásának, túlélésének serkentésében, a központi idegrendszerben
pedig a tanulás és a memória bonyolult folyamataiban).
A cAMP-rendszert az adrenalinon kívül számos egyéb hormon használja jelátvitelében: a hipofízis
elülső lebeny hormonok közül az ACTH, FSH, LH, TSH, a hátsó lebeny vazopresszin hormonja, a
parathormon, a glukagon ugyancsak Gs-közvetített szignalizációval működik. Más ágensek gátló,
inhibítor hatású Gi-fehérjéken keresztül hatnak: az aktivált receptor az αi-alegységet GTP-kötő
állapotba hozza, az azonban nem serkenti, hanem gátolja az adenilátciklázt, csökkenti a cAMP-
szintet. Így fejti ki például hatását az acetilkolin a szívizomban.

Az inozitol-foszfolipid út
Az 1970-es években figyelték meg, hogy az acetilkolin egyes célszöveteiben (pl. az exokrin
pankreászban) fokozza a foszfolipidek metabolizmusát. Az elmúlt években bebizonyosodott, hogy
a hatás jelátviteli jelenség és hogy foszfolipid eredetű másodlagos messengerek nemcsak az
acetilkolin szekréciót kiváltó hatásában, hanem más szignáltranszdukciós folyamatokban is részt
vesznek.
A leírt hatást inozitol-foszfolipidek hidrolízise közvetíti. A sejtmembrán belső foszfolipidrétegének
egyik komponensét, a foszfatidilinozitol-biszfoszfátot (PIP2) egy foszfolipáz C (PLC) enzim
diacilglicerinre (DAG) és inozitol-triszfoszfátra (IP3) hidrolizálja (45.5. ábra). Mindkét termék
másodlagos messenger, melyek két külön jelátviteli utat aktiválnak (45.6. ábra).

45.5. ábra: A foszfolipáz C reakció (a rövidítéseket l. a szövegben)

A ligand-stimulált receptor hatását speciális heterotrimer G-protein, a Gq-fehérje közvetíti.

Hatására a foszfolipáz C enzimcsalád PLC-β izoenzimei a membrán belső felszínén
PIP2 molekulákat hasítanak. Az egyik termék, az IP3 vízoldékony másodlagos messenger, mely
díffúzióval gyorsan eléri célfehérjéit, az endoplazmatikus retikulum membránjának Ca++-
csatornáit. A csatornák megnyilása Ca++-ionoknak a citoszólba özönlését eredményezi, ahol a
Ca++– ugyancsak másodlagos messengerként – számos célfehérje aktivitását befolyásolja. Ezek
egyike a kalmodulin, mely Ca++-t megkötve egy szerin/treonin-specifikus fehérjekinázt, a
Ca++/kalmodulin-függő proteinkinázt (CaM-kináz) aktiválja. A CaM-kináz egyik szubsztrátja az a
CREB transzkripciós faktor, melyet a PKA is foszforilál (l. előbb): mindkét jelátviteli út serkentése
a megfelelő célgének expressziójához vezet.
A PLC-β reakció másik terméke a DAG; apoláros molekula lévén ez a másodlagos messenger a
membránban diffundál és a citoszólból magához vonzza célfehérjéit, a proteinkináz C (PKC)
enzimeket. Ezek a szerin/treonin proteinkinázok ugyancsak több fehérjeszubsztrátot – közöttük
transzkripciós faktorokat is – foszforilálnak. A PKC-jelátvitel génexpressziós hatásának egyik
fontos sejtmagon belüli mediátora az AP-1 transzkripciós faktor (l. 32. fejezet), mely számos
célgén indukcióját idézi elő.

209
45.6. ábra: Az inozitol-foszfolipid út

210
 46. Szignáltranszdukció III.: Jelátvitel tirozin-proteinkináz
receptorokról
A sejtfelszíni receptorok egy csoportja transzmembrán jelátviteli funkcióját enzimaktivitása
segítségével látja el. A katalitikus receptorok legfontosabb és legnépesebb családját olyan
membránfehérjék alkotják, melyek tirozinspecifikus fehérjekináz aktivitással rendelkeznek. Az
első tirozin-proteinkináz enzimet 1980-ban azonosították a daganatkeltő Rous sarcoma vírus
Src onkoproteinje „személyében” (az onkogénekkel és termékeikkel az 55. fejezetben részletesen
foglalkozunk): ez az enzim szubsztrátfehérjéinek aromás hidroxilcsoportokat tartalmazó tirozin-
oldalláncait foszforilálja ATP felhasználásával. Nem sokkal később kiderült, hogy számos
sejtfelszíni receptorfehérje is rendelkezik tirozinspecifikus fehérjefoszforilációs aktivitással. Ezek
a receptorok polipeptid természetű növekedési faktorok sejten belüli hatásait közvetítik.

Növekedési faktorok és receptoraik

A szervezetünkben termelődő több tucat növekedési faktor sokrétű és létfontos szabályozási
funkciókat lát el sejtjeinkben: a sejtszaporodás, -túlélés, -anyagcsere, a szövetek differenciációja
egyaránt polipeptid növekedési faktorok ellenőrzése alatt áll. (Néhány fontos képviselőjüket a
46.1. táblázat sorolja fel.)

Növekedési faktor Hatás

PDGF trombocita-eredetű növekedési faktor különböző sejtek (pl. fibroblasztok) proliferációja

(platelet-derived growth factor)
EGF epidermális növekedési faktor különböző sejtek (pl. hámsejtek) proliferációja
(epidermal growth factor)

FGF fibroblaszt növekedési faktor különböző sejtek proliferációja neuronok

(fibroblast growth factor) differenciációja embrionális fejlődés

NGF idegsejt növekedési faktor neuronok túlélése és differenciációja

(nervegrowth factor)

inzulin metabolikus hatások (pl. glukózfelvétel)

sejtproliferáció

IGF inzulinszerű növekedési faktor sejtproliferáció metabolikus hatások

(insulin-like growth factor) sejtdifferenciáció

VEGF angiogenetikus növekedési faktor endotel sejtek proliferációja

(vascular endothelial growth factor)

46.1. táblázat: Polipeptid növekedési faktorok

A receptoraktiváció mechanizmusa
Bár a receptorok között finom szerkezeti és jelentős funkcionális különbségek vannak (46.1. ábra
és táblázat), a megfelelő növekedési faktor kötődése lényegében hasonló molekuláris
mechanizmussal idézi elő a transzmembrán jelátvitelt (46.2. ábra).

211
 46.1. ábra: Néhány növekedési faktor receptor szerkezete

46.2. ábra: A növekedési faktor receptorok aktiválásának mechanizmusa (1. ligandkötés; 2.

receptor-dimerizáció; 3. autofoszforiláció; 4. jelátviteli fehérjék kötődése és foszforilációja [a
rövidítések jelentését lásd később a szövegben])

212
A specifikus ligand kötődése a receptor sejtfelszíni ektodoménjéhez receptor-dimerizációt idéz elő
(a tetramer szerkezetű inzulinreceptor esetében erre nincs szükség, l. 46.1. ábra). A receptor-
alegységek egymás citoszól-doménjét több tirozin-oldalláncon foszforilálják (receptor-
autofoszforiláció). A receptoron létesülő foszfotirozin oldalláncok specifikus szignalizációs
fehérjék kötőhelyéül szolgálnak. A kapcsolódó jelátviteli fehérjéket a receptor foszforilálja és
ezáltal aktiválja, a jel továbbhalad a sejt belsejébe.
A receptorfunkció kritikus lépése a receptor-célfehérje komplexek kialakulása. Ennek
molekuláris részleteit az 1990-es évek kutatásai tisztázták. A növekedési faktor receptorokkal
kölcsönhatásba kerülő fehérjék elsődleges szerkezetének vizsgálata kiderítette, hogy hasonló
stukturális elemeket tartalmaznak. Mivel ezeket először az Src-fehérjében írták le, Src-homológia
(SH) doméneknek nevezték el őket (46.3. ábra). Az SH2-domének kompakt, globuláris polipeptid-
régiók, melyek a partnerfehérjén foszforilált tirozint ismernek fel és kötődnek hozzá. Mivel a
receptoron általában több tirozin-oldallánc is foszforilálódik és ezek aminosav környezete
különböző, az aktivált receptor egyszerre többféle jelátviteli fehérjével létesíthet kapcsolatot,
egyidőben több jelátviteli út is aktiválódhat. Az autofoszforilált receptor tehát specifikus SH2-
domén tartalmú fehérjéket „halász ki” a citoszólból és használ jeltovábbításra. (Ezek kilétével és
funkciójával a fejezet második felében foglalkozunk.) A receptorhoz kötődő fehérjék SH3-domént
is tartalmazhatnak: ez a jelátvitelben disztálisan elhelyezkedő célfehérje prolinban gazdag
régióját köti meg és vonja be ezzel a szignáltranszdukciós folyamatba. (A teljesség kedvéért: az
Src-fehérje SH1 doménje a tirozin-proteinkináz centrum.)

46.3. ábra: SH2- és SH3-doméneket tartalmazó jelátviteli fehérjék

(a rövidítések jelentését lásd a szövegben)

A növekedési faktor receptorokról kiinduló jelpályák

Az aktivált növekedési faktor receptorokról több szignáltranszdukciós út indul ki (46.4. ábra).
Ezek között vannak, amelyek közvetlenül a receptorról erednek, több jelátviteli utat azonban egy
monomer G-protein család (Ras-fehérjék) közvetítenek.
A foszfolipáz C út
A ras-független jelátvitel egyik példája a foszfolipáz C út. A foszfolipáz C enzimek bizonyos típusai
(PLC-β izoenzimek) heterotrimer G-proteinek effektorfehérjéi (l. 45. fejezet). A foszfolipáz C-γ
(PLC-γ) enzimcsalád tagjai SH2-doménnel rendelkeznek, tehát képesek aktivált növekedési
faktor receptorok hatását közvetíteni a sejtbe. A PLC-γ enzimek szubsztrátja is a PIP2, termékei
pedig a DAG és az IP3, a jelátviteli utak tehát megfelelnek a PLC-β-val kapcsolatban leírtaknak (l.
45. fejezet).
A Ras-fehérjék
A Ras-fehérjéket – a korábban említett Src-proteinhez hasonlóan – eredetileg mint daganatkeltő
RNS-vírusok onkoproteinjeit azonosították, majd normális sejtekben is megtalálták őket (l. 54.
fejezet). Kisméretű, egyetlen polipeptidláncból álló monomer G-proteinek, izoprenillánccal

213
rögzülnek a sejthártya belső felszínén. Egyéb guaninnukleotid-kötő fehérjékhez hasonlóan
inaktív, GDP-kötő és aktív, GTP-kötő alakban léteznek. A Ras-fehérjék aktivációját a növekedési
faktor receptorához kötődése idézi elő (46.5. és 46.6. ábra). Az autofoszforilált receptor speciális
adapterfehérje molekulát köt meg: ez SH2-doménjével a receptorhoz, SH3-doménjével pedig egy
olyan enzimhez kapcsolódik, mely a Ras-fehérjén a GDP-t GTP-re cseréli (az enzimfajta jelölése –
az angol név [guanine-nucleotide exchange factor] alapján – GEF). Az aktivált Ras•GTP-komplex
effektorfehérjékre továbbítja a jelet (l. később), majd saját GTPáz-aktivitása segítségével visszatér
a nyugalmi Ras•GDP-formába. Mivel a Ras-fehérjéknek – szemben a heterotrimer G-proteinek α-
alegységével – gyenge GTPáz-aktivitásuk van, a hatékony inaktivációhoz egy, ugyancsak a
receptor által szabályozott faktorra, a GTPáz aktiváló proteinre (GAP) is szükség van. Mint később
látni fogjuk, a Ras-ciklus zavarai gyakran vezetnek fokozott sejtproliferációhoz,
daganatképződéshez.

46.4. ábra: A növekedési faktorok jelátviteli útjai

214
46.5. ábra: A Ras/MAPK jelátviteli út (a rövidítések jelentését l. a szövegben)

A Ras•GTP komplexekhez a
citoplazmából effektor
fehérjék kötődnek és viszik
tovább a jelet a sejt
belsejébe. Ezek száma
megközelíti az egy tucatot,
rendkívül bonyolulttá,
biológiai hatásait tekintve
pedig sokszínűvé téve a
növekedési faktorok
jelátvitelét. Közülük az
alábbiakban a három
legfontosabb jelpályával
foglalkozunk (l. 46.4. ábra).

46.6. ábra: A Ras-ciklus

215
Az ERK-út
Az 1990-es évek egyik legjelentősebb sejtbiológiai felfedezése olyan fehérje-foszforilációs
láncolatok felfedezése volt, melyekben mitogén (vagy másfajta) stimuláció hatására hierarchikus
rendszerben egymásra épülő proteinkinázok egymást foszforilálva-aktiválva továbbítják a jelet a
sejtmembrántól a sejtmag felé. Az elsőként azonosított, szerin/treonin-specifikus mitogén-
aktivált proteinkinázokról (MAPK) ezeket a rendszereket összefoglaló néven MAPK-
kaszkádoknak nevezzük. A növekedési faktor jelátvitel MAPK-ai az extracelluláris szignál által
regulált kinázok (ERK-ek; 46.5. ábra). Ezeket MAPK-kinázok (MAPKK-ok) aktiválják tirozinon és
treoninon végrehajtott foszforilációval; a növekedési faktor jelátvitelben részt vevő MAPKK-ok
neve: MEK (MAPK/ERK-kináz). A kaszkád legproximálisabb elemei a MAPKK-kinázok (MAPKKK-
ok): ebben a jelátviteli útban az eredetileg onkoproteinként felfedezett Raf-fehérjék. Az aktivált
Ras·GTP-komplex a membránhoz vonzza a Raf szerin/treonin-specifikus kináz fehérjéket és
rajtuk keresztül stimulálja az egész proteinkináz-kaszkádot. Az ERK-enzimek számos célfehérjét
foszforilálnak. Egyes molekuláik a sejtmagba is transzlokálódnak és ott transzkripciós faktorokat
is aktiválnak. A növekedési faktor jelátvitel egyik fontos célpontja a szérum-reszponzív elem nevű
enhancer. Ehhez trimer szerkezetű transzkripciós faktor kapcsolódik, melynek egyik alegységét
foszforilálja az ERK. Így az SRE-tartalmú célgének transzkripciója fokozódik. A génindukció
gyorsan, néhány perccel a növekedési faktor receptorhoz kötődése után bekövetkezik. Az indukált
gének (ún. korai válasz gének) közül sokan transzkripciós faktorokat kódolnak (pl. a Fos, Jun, Myc
fehérjét), melyek szintézisüket követően a sejtmagba transzlokálódnak és egy második
génindukciós hullámot idéznek elő. Az ún. késői válasz gének termékei (pl. ciklin fehérjék) hozzák
létre a sejt biológiai változásait (pl. proliferáció, differenciáció). Emlős sejtekben több, hasonló
szerkezetű, de eltérő funkciójú MAPK-kaszkádot azonosítottak az elmúlt években (l. 48. fejezet).
Megkülönböztetésül, a fentiekben vázolt foszforilációs kaszkádot ERK-útnak nevezzük. Az ERK-
jelpálya jelentőségét aláhúzza, hogy az emberi daganatok 85 százalékában a normálisnál
aktívabban működik.
A foszfatidilinozitol 3-kináz út
A sejthártya inozitol-foszfolipidjei nemcsak foszfolipázok, hanem lipidkinázok szubsztrátjai is
lehetnek. Az utóbbiak közé tartozik a foszfatidilinozitol 3-kináz (PI3K) enzim: ennek a
heterodimer szerkezetű enzimnek az egyik alegysége adapterfehérjeként kapcsolódik az aktivált
növekedési faktor receptorhoz (46.3. ábra), a katalitikus alegység pedig ATP felhasználásával
inozitol-foszfolipid molekulákat foszforilál (46.7. ábra). (A teljesség kedvéért jegyezzük meg, hogy
a PI3K-nak van olyan formája is, melynek aktivációja Ras-fehérjén keresztül történik.) A
foszforilált lipidmolekulák (pl. a foszfatidilinozitol-triszfoszfát [PIP3]) másodlagos messengerként
működnek. (A PIP3 molekula inaktiválását egy lipidfoszfatáz enzim, a PTEN [az angol phosphatase
and tensin homológ rövidítése] végzi.)

46.7. ábra: A foszfatidilinozitol 3-kináz reakció (a rövidítéseket lásd a szövegben)

216
A PI3K-út elemeinek és funkcióinak feltárása napjainkban is folyik. A sejthártya belső oldalán a
növekedési faktor stimuláció hatására PIP3 molekulák szaporodnak fel, melyek a citoszólból
specifikus jelátviteli fehérjéket vonzanak magukhoz és az így kialakuló szignalizációs komplexek
továbbítják a jeleket a sejt belsejébe (46.4. ábra). Az út legfontosabb enzime egy szerin/treonin-
specifikus kináz, a proteinkináz B (PKB). (A PKB homológja daganatkeltő RNS-vírusok
onkoproteinje [l. 54. fejezet], melyet Akt-fehérjének nevezünk. A PKB és Akt kifejezés
szinonímaként használatos.) Aktiválódva, ez az enzim számos célfehérjét foszforilál, rajtuk
keresztül gének expresszióját, a sejt túlélését, transzlációs folyamatait szabályozza. A PI3K/Akt-
út egyik fontos résztvevője egy szerin-treonin specifikus fehérjekináz, az mTOR (mammalian
target of rapamycin; l. 46.4. ábra). Nevét a rapamicin nevű antibiotikumról kapta, melyet
szervátültetésen átesett betegek kezelésében immunszuppresszánsként alkalmaznak. Az mTOR a
fehérjeszintézis iniciációját, ezáltal a sejtek növekedését serkenti. Gátlószerét, a rapamicint
különböző daganatok kezelésében tesztelik. Más PIP3-aktivált komplexek a citoszkeletont
képesek átformálni. A PIP3-út orvosi jelentőségét hangsúlyozza az a tény, hogy fokozott működése
az emberi daganatok mintegy felében kimutatható.
A Ral út
A növekedési faktorok egyes sejtek alakját, mozgékonyságát is megváltoztatják, a citoszkeleton
átszervezésén keresztül. A hatás fő közvetítője a Ras-fehérjék nagycsaládjába tartozó monomer
G-protein, a Ral (neve a Ras-like angol kifejezésből származik). A Ral guaninnukleotid kicserélő
faktora hozzákötődik a növekedési faktor stimuláció következtében aktivált Ras-hoz, az általa
létrehozott Ral•GTP komplex pedig a Rho-fehérjék családjába tartozó G-proteinek közvetítésével
formálja át a mikrofilamentum rendszert (46.4. ábra). Ennek az útnak a fokozott aktivitása
valószínűleg szerepet játszik a tumorsejt-invázióban és az áttétképződésben (l. 57. fejezet).

217
 47. Szignáltranszdukció IV.: citokinek és egyéb mitogének
jelátvitele
A sejtszaporodás legfontosabb extracelluláris szabályozói a tirozin-proteinkináz receptorokon
keresztül ható növekedési faktorok (l. 46. fejezet). Számos egyéb fehérjetermészetű ágens
található azonban szervezetünkben, melyek – egyéb hatásaik mellett – a sejtek proliferációját is
szabályozzák. Az általuk aktivált jelpályák működési zavarai – hasonlóan a növekedési faktorok
jelátvitelének fokozódásához – daganatos megbetegedések kialakulásához vezethetnek, így rövid
áttekintésük feltétlenül indokolt.

Citokin-jelátvitel
A citokin-család tagjai polipeptid természetű ligandok, melyek sokféle célsejtben sokféle
biológiai hatást fejtenek ki. Közéjük tartoznak az interferonok, melyek célsejtjüket rezisztenssé
teszik vírusfertőzésekkel szemben; a limfociták proliferációját és differenciációját serkentő
interleukinek; a vörösvérsejt-éréshez szükséges eritropoietin; a vérlemezkék képzését serkentő
trombopoietin; az adenohipofizis hormonjai közül a növekedési hormon és a prolaktin.
A citokinreceptorok olyan transzmembrán
fehérjék, melyek katalitikus aktivitással nem
rendelkeznek. Hasonlóan a tirozin-
proteinkináz-receptorokhoz, a ligandkötést
követően dimerizálódnak és aktív
konformációt vesznek fel. Az aktivált receptor
citoplazmatikus doménjeihez nonreceptor
tirozin-proteinkináz enzimek kötődnek nem-
kovalens kötéssel (47.1. ábra). A citokin-
receptorokhoz kapcsolódó fehérjekinázok
neve: JAK (a Janus-kináz elnevezés a bennük
levő két kinázdoménre utal). A JAK-enzimek
egymást foszforilálják, ezáltal kötőhelyeket
teremtenek SH2-domént tartalmazó
citoplazmatikus fehérjék számára (l. 46.
fejezet). A citokin-jelátvitel fő közvetítői a
STAT-fehérjék (az angol elnevezés rövidítése:
signal transducer and activator of
transcription): SH2-doménjeikkel a JAK-
enzimek foszfotirozin oldalláncaihoz
kapcsolódnak, majd tirozin-foszforilációjukat
követően egymással hoznak létre dimereket. A
STAT-dimerek a sejtmagba transzlokálódnak
és a megfelelő célgének enhancer-eleméhez
kötődve aktiválják a transzkripciós folyamat
iniciációját, ezáltal a gének expresszióját. A
célgének a sejtproliferációban és -túlélésben
kulcsszerepet játszó fehérjéket kódolnak.
Egyéb jelátviteli mechanizmusokhoz képest a
citokinek szignáltranszdukciója viszonylag
47.1. ábra: A citokin jelátvitel (a rövidítések
egyszerű: a sejthártya és a sejtmag között
jelentését l. a szövegben)
egyetlen jelátviteli fehérje (a STAT) közvetít.

218
A citokinhatás speciális esetét jelenti az interferon fehérjék szerepe a vírusfertőzés elleni
kűzdelemben (47.2. ábra). A vírus által megtámadott sejtben specifikus fehérjekinázok
aktiválódnak, melyek interferon-reguláló transzkripciós faktorokat (IRF-fehérjék) foszforilálnak a
citoplazmában. Az IRF-fehérjék sejtmagba történő transzlokációjukat követően interferonokat
kódoló géneket indukálnak. A szekretált interferon autokrinés parakrin mechanizmussal, a
JAK/STAT-út aktiválásával antivirális fehérjék szintézisét idézi elő és ezzel a fertőzött sejtben
korlátozza a vírusszaporodást és gátolja a szomszédos sejtek fertőzését is.

47.2. ábra: Az interferon fehérjék képződésének szabályozása és szerepe a vírusfertőzés gátlásában

219
 A TGF-β-út
A transzformáló növekedési faktor (TGF-β)
népes ligandcsalád tagja. Ezek a fehérjék
különböző sejttípusok proliferációját,
differenciációját szabályozzák. A TGF-β
orvosi jelentőségét elsősorban az adja, hogy
jelátviteli útjának túlzott aktivációja szerepet
játszik a tumorinvázió (l. 57. fejezet)
folyamatában.
A TGF-β receptora szerin/treoninkináz
aktivitással rendelkező heterodimer.
Ligandkötés hatására a receptor egy
citoplazmatikus lokalizációjú transz-kripciós
faktor család tagjait foszforilálja. A dimerizált
Smad-fehérjék transzlokálódnak a sejtmagba
és célgénjeiket indukálják (47.3. ábra).
47.3. ábra: A transzformáló növekedési faktor
(TGF-β) jelátvitele

Hedgehog-jelátvitel
Az ecetmuslicában azonosított Hedgehog
fehérje (nevét a mutáns légy sündisznószerű
fenotípusáról kapta) szekretált ligand.
Receptorához kötődését követően egy
transzmembrán effektor fehérje aktiválódik,
mely a citoplazmában egy transzkripciós
faktort stabilizál, az pedig a sejtmagba bejutva
génexpressziós változást idéz elő (47.4. ábra).
A Hedgehog-út elsősorban az egyedfejlődés
determinációs, differenciációs folymataiban
játszik szerepet (l. 50. fejezet). Kóros
aktivációja daganatképződéshez vezethet.

47.4. ábra: A Hedgehog jelátviteli út

Wnt-jelátvitel
A Wnt-géneket muslicában, majd emlősökben is azonosították. A Hedgehog-ligandhoz hasonlóan
a Wnt-fehérjék is szekretált növekedési faktorok, fiziológiás szerepük az egyedfejlődés
folyamatainak szabályozása. A Wnt-receptorok aktivációja a mikrofilamentumokat az
övdezmoszómákhoz kötő β-katenin-fehérje (l. 41. fejezet) szolubilis formájának stabilizálása: a
jelpálya serkentésekor a β-katenin felszabadul egy multiprotein komplexből, bejut a sejtmagba és
célgének indukciójában vesz részt (47.5. ábra). A jelátviteli út több fehérjéjének (Wnt, β-katenin
és a fehérjekomplex egyik komponense, az APC-fehérje) abnormális expressziója
daganatképződéshez vezethet (l. 56. fejezet).

220
 Notch-jelátvitel
Ennek az útnak ugyancsak az egyedfejlődés folyamataiban van jelentősége. (Nevét egy
muslicamutánsról kapta, melynek szárnyán rovátkák jelennek meg.) A jelpálya tipikus példája a
juxtakrin szignalizációnak (47.6. ábra). A Notch-fehérje transzmembrán receptor, mely a
szomszédos sejt membránjában elhelyezkedő Notch-liganddal kapcsolódva aktiválódik. Az
aktivált receptor citoplazmatikus doménjét egy proteáz lehasítja, az a sejtmagba transzlokálódik
és egy transzkripciós faktor komplex részeként célgének expresszióját indukálja.
Hasonlóan a fejezet többi jelátviteli útjaihoz, a Notch-jelpályának is vannak onkológiai
vonatkozásai.

47.5. ábra: A Wnt jelátviteli út

47.6. ábra: Notch jelátviteli út

221
 48. Szignáltranszdukció V.: Stressz- és integrin-jelátvitel
Az előző fejezetekben azokkal a jelátviteli mechanizmusokkal foglalkoztunk, melyekre a sejt
szaporodásának fokozásával válaszol. Vannak azonban olyan környezeti hatások is, melyek
celluláris stresszt okozva veszélybe sodorják a sejteket, vagy éppen mechanikai ráhatással alak-
vagy mozgékonysági változásokat idéznek elő. Ebben a fejezetben a celluláris stressz és az integrin-
aktiváció jelátviteli következményeit ismertetjük röviden.

Stresszhatások jelátvitele
Stresszaktivált fehérjefoszforilációs kaszkádok
Az ERK-enzimeknek (l. 46. fejezet) a sejtek proliferációs és differenciációs jelátvitelében játszott
szerepét az 1990-es évek elején ismerték fel. Genetikai és molekuláris biológiai módszerek
segítségével ezt követően további mitogén-aktivált proteinkinázizoenzimeket fedeztek fel. Ezek
egymással szekvencia-rokonságot mutatnak és szabályozásuk is az ERK-enzimekhez hasonló
elvek alapján, MAPKK és MAPKKK enzimek által közvetített fehérje-foszforilációs kaszkád útján
történik. Magasabb rendű élőlények sejtjeiben tehát több, hasonló felépítésű, egymással
párhuzamos MAPK-út létezik (jelenleg már több mint egy tucat emlős MAPK-izoenzim ismert):
ezek feltérképezése, biokémiai és funkcionális jellemzése jelenleg is folyik.
Az „új” MAPK-utak (48.1. ábra) között vannak olyanok, melyek a sejt stresszválaszát közvetítik.
A sejtet élete során számos stresszhatás érheti: sugárzások, hősokk, DNS-károsodás, oxidatív
stressz, bizonyos extracelluláris ligandok, ozmotikus sokk, mérgező anyagok. A sejtnek ilyenkor
két lehetősége van, hogy helyreállítsa a megbomlott egyensúlyt: túlélési, regenerációs
képességének fokozása vagy sejthalál indukálása. A túlélésben az ERK-út, a sejtpusztulás
előidézésében más MAPK-kaszkádok: a JNK- és a p38-út játszanak szerepet. (A sejthalál ezen
fajtája, az apoptózis jellemzőivel az 51. fejezetben foglalkozunk részletesen.)
A JNK-enzimek nevüket fő szubsztrátjukról az AP-1 transzkripciós faktor Jun-komponenséről
kapták: a Jun-fehérje N-terminális régiójában levő szerin-oldalláncokat foszforilálva aktiválják az
AP-1 komplexet (JNK = JunN-terminális kináz). A JNK-ok azonban más transzkripciós faktorokat
is képesek foszforilálni: az AP-1-helyen kívül a CRE és SRE elemen keresztül is képesek
génaktivációt előidézni. A p38-proteinkináz a JNK-úthoz hasonló módon szabályozott, de attól
elkülönült jelátviteli út kulcsenzime, ugyancsak több fehérjeszubsztrát foszforilálására képes. A
stresszhatások tehát a JNK-út és a p38-út közvetítésével sokrétű, részben még feltárásra szoruló
génexpressziós és biokémiai változásokat indítanak el az érintett sejtekben.

222
 48.1. ábra: MAPK jelátviteli utak emlős sejtekben. (A rövidítések magyarázatát l. a szövegben. Az
üresen hagyott téglalapok olyan, már azonosított jelátviteli fehérjéket reprezentálnak, melyek
nevének ismertetése meghaladja a könyv kereteit.)

Az NFκB-út
A fentiekből már kiderült, hogy a stresszválasz általában génexpressziós változásokkal jár. Ezeket
a hatásokat számos transzkripciós faktor közvetíti, közülük is talán legjelentősebb az NFκB
faktor-család. Az NFκB fehérjét B limfocitákban, mint az immunglobulin kappa-lánc génjének
regulátorát fedezték fel (innen származik az elnevezés: nuclear factor κB), a faktorcsalád egyes
tagjai azonban minden szövetünkben expresszálódnak, a stresszválaszon kívül a sejttúlélés és a
sejthalál szabályozásában is szerepet játszanak. Nyugalmi sejtben az NFκB-heterodimer egy gátló
fehérjével (IκB, inhibitor κB) alkot komplexet és a citoplazmában, tehát inaktív formában
mutatható ki (48.2. ábra). Stresszhatásra (pl. sejtfelszíni receptorokon keresztül ható, gyulladást
kiváltó fehérjék [ún. gyulladási citokinek], oxidatív stressz, bizonyos vírusok hatására) az IκB-t
specifikus fehérjekináz (IκB-kináz) foszforilálja, aminek következtében a gátlófehérje
proteaszomális degradáció áldozatául esik. A felszabaduló NFκB transzlokálódik a sejtmagba és
számos célgén transzkripcióját serkenti: gyulladási citokinek, immunreceptorok, sejtadhéziós
fehérjék, a sejthalált szabályozó proteinek képződnek, ezek együttes hatása adja meg a sejt
válaszát a környezeti behatásra.

223
 48.2. ábra: A stresszválasz NFκB-útja

Integrin-jelátvitel
Az integrinek az extracelluláris mátrix fehérjekomponenseit (kollagén, fibronektin, laminin stb.)
a citoszkeletonnal, elsősorban a mikrofilamentum rendszerrel összekötő transzmembrán
fehérjék (l. 43. fejezet). Mint strukturális fehérjék, fontos szerepet játszanak a sejtadhézióban, a
sejt alakjának meghatározásában és a sejtmozgások szabályozásában. Ezeken a létfontos
funkciókon túlmenően azonban egyre több adat gyűlik össze szignáltranszdukciós működésükre
vonatkozóan. Az αβ-heterodimer felépítésű integrineket úgy foghatjuk fel, mint sejtfelszíni
receptorokat, melyeket az extracelluláris mátrix komponenseinek kötődése, illetve a sejtet érő
mechanikai ingerek aktiválják. Az integrin-molekulák citoplazmatikus doménjein hatalmas
méretű multiprotein komplexek (fokális adhéziók) képződnek, melyek bonyolult – és részben még
fel nem tárt – jelátviteli pályákon sokrétű biológiai válasz kialakulását közvetítik (48.3. ábra).

224
 48.3. ábra: A fokális adhézió által közvetített integrin-jelátviteli utak (a rövidítések jelentését l. a
szövegben)
Az adhéziós komplexek dinamikusképződmények: gyorsan felépülnek, de le is bomlanak. A mátrix
fehérjekomponenseinek kötődése a membrán integrindimerjeinek aggregációját idézi elő.
Hasonló hatása van a sejtet érő mechanikai ingereknek is: az izomösszehúzódás feszítő hatása az
izomsejtek membránjában, a véráram által kifejtett erő az erek falát bélelő endotelsejtek
hártyájában vált ki integrin-oligomerizációt. Az így aktivált, saját enzimaktivitással nem
rendelkező integrinek a citoszólból nonreceptor tirozin-proteinkinázokat kötnek meg. Ezek közül
a legfontosabb a fokális adhézió kináza (FAK): az aggregált receptorokhoz kapcsolódó FAK-
molekulák egymást foszforilálva kötőhelyeket hoznak létre SH2-domént tartalmazó fehérjék
számára. Először a Src-családba tartozó tirozin-proteinkinázok komplexálódnak a FAK-láncokkal,
kiterjesztve a megindult tirozin-foszforilációt. Aktinkötő fehérjék (pl. vinkulin, talin, α-aktinin)
kapcsolódása lehetőséget teremt stresszrostok kifejlődésére a fokális adhézióból, a citoszkeleton
átrendeződése pedig a sejtek alakjának, migrációs aktivitásának megváltozásához vezet.
A foszforilált FAK adapterfehérjéken keresztül a Ras-t is aktiválja: az ERK jelátviteli út stimulációja
– a sejttípustól és egyéb körülményektől függően – specifikus gének expressziójához és
proliferációs, differenciációs, sejtmotilitási válaszokhoz vezet. Előfordulhat a JNK-pálya aktiválása
is, ami a sejt stresszválaszát idézi elő. A PI3K-út serkentése a mátrixhoz tapadt sejt életben
maradását biztosítja. Ha a sejt leválik a mátrixról, a PI3K-jelátvitel megszakadása, illetve
stresszkináz utak aktiválódása a sejt pusztulását eredményezi. A programozott sejthalálnak ez a
speciális, anoikisznek (magyarul hajléktalanságnak) nevezett típusa akadályozza meg, hogy a
szabaddá vált sejt más, nem kívánt helyen tapadjon le és hozzon létre sejtburjánzást.
Tumorsejtekben az anoikisz gyakran nem működik, ez okozza a távoli áttétek, metasztázisok
képződését (l. az 57. fejezetet).
A fentiekben ismertetett, erősen leegyszerűsített és részleteiben ma még nem is ismert kép is
bizonyítja, hogy az integrin-jelátvitel a sejtek életét komolyan befolyásoló, patológiai
vonatkozásokkal is rendelkező mechanizmus.

225
 49. Szignáltranszdukció VI.: Általános következtetések és
gyakorlati vonatkozások
Ebben a fejezetben a szignalizációs folyamatokban fellelhető általános törvényszerűségeket
foglaljuk össze, illetve röviden foglalkozunk a témában rejlő gyakorlati, klinikai felhasználási
lehetőségekkel.

A jelátviteli folyamatok általános jellemzői

Mint az előző fejezetekből kiderült, az intracelluláris szignáltranszdukció rendkívül szövevényes
folyamat: nagyszámú jelátviteli fehérje és másodlagos messenger vesz részt benne, ezek több
jelátviteli pályába rendeződnek. A kép rendkívül kaotikusnak tűnik, néhány általános működési
elv, a különböző pályákban közös molekuláris mechanizmus azonban fellelhető a bonyolult
rendszerben.
A jelátvitel specificitása
A szignáltranszdukció központi – és jórészt megoldatlan problémája – a jelátvitel
redundanciájának és pleiotrópiájának molekuláris mechanizmusa. A redundancia lényege:
különböző ligandok ugyanabban a sejtben azonos vagy hasonló fenotípusos hatást váltanak ki.
Idegsejt-prekurzorokban például mind az NGF, mind az FGF neuritnövekedést indukál. A jelenség
magyarázatát a jelátviteli pályák átfedése magyarázza: bár az NGF és az FGF eltérő receptorokat
stimulál, a jeltovábbítás – legalábbis részben – ugyanazokon az utakon történik. Mindkét
növekedési faktor differenciációs hatását döntő részben az ERK-út közvetíti.
Ugyanakkor egy bizonyos ligand különböző sejttípusokban eltérő, pleiotróp biológiai választ
idézhet elő. Fibroblasztokon például az FGF mitogén, idegsejteken differenciációs hatású,
békaembrióban pedig a mezoderma indukcióját váltja ki. A szöveti specificitást nyilvánvalóan az
eltérő génexpresszió magyarázza: a különböző sejttípusokban a jelátviteli utak különböző
célfehérjéi vannak jelen, az általuk kiváltott fenotípusos hatások tehát eltérőek lesznek. A szöveti
specificitást szolgálja az is, hogy a jelátviteli fehérjék általában fehérjecsaládokat alkotnak: az egy
családba tartozó proteinek elsődleges szerkezete hasonló, de nem azonos. Biokémiai, funkcionális
jellemzőik is különböznek és szöveti expressziójuk is eltérő: egyesek ubikviter fehérjék, míg
mások kifejeződése szigorúan szövetspecifikus. A jelátviteli fehérjecsaládok által kínált
nagyszámú kombinációs lehetőség olyan funkcionális és szabályozási sokszínűséget eredményez,
melynek részleteit még csak most kezdi tisztázni a sejtbiológia.
Molekuláris mechanizmusok a jelátvitelben
Bár a jelek intracelluláris továbbításában több ezer molekula vehet részt, az alapvető
szignáltranszdukciós mechanizmusok néhány kategóriába besorolhatók.
Másodlagos messengerek. Ezek a nem fehérje természetű, diffuzibilis molekulák a megfelelő
jelátviteli út stimulációja során képződnek, célfehérjéiket diffúzióval érik el és hozzájuk
kapcsolódva alloszterikus hatással befolyásolják aktivitásukat. A vízoldékony másodlagos
messengerek (ciklikus nukleotidok, IP3, Ca++ stb.) a sejt víztereiben találják meg célmolekuláikat.
A lipidtermészetű másodlagos messengerek (DAG, PIP3, a szfingomielinekből képződő ceramid stb.)
a membránban mozognak és így jutnak el hatáshelyükre vagy vonzzák magukhoz a citoszólból a
célfehérjét.
Fehérjék mennyiségének változásai. Környezeti hatások gyakran okoznak változásokat a
jelátviteli fehérjék koncentrációjában. A fehérjeszint növekedését leggyakrabban génindukció
okozza, mely általában két hullámban zajlik: előbb a korai, majd a késői válasz gének
transzkripciója fokozódik (l. 46. fejezet). Fehérjeszint növekedéshez vezet mRNS-ek, illetve
fehérjék szelektív stabilizálása is. Egy fehérje koncentrációjának csökkenését génrepresszió, a

226
mRNS, illetve fehérje gyors degradációja okozhatja. Az mRNS-ek templátfunkciójának, illetve
életidejének szabályozásában fontos szerepet játszanak az miRNS-ek, a fehérjék gyors és
specifikus lebontása pedig az ubikvitin/proteaszóma rendszer feladata (l. 31. fejezet).
Fehérje-módosulások. A jeltovábbítás közvetlen formája a célfehérje foszforilációja
proteinkinázokkal. Két fő típusa, a szerin/treonin- és a tirozin-foszforiláció eltérő biokémiai
következményekkel jár. A szerinés treonin kisméretű oldalláncainak foszforilálása egyszerűen
töltésváltozást, az pedig konformációmódosulást és így a fehérje aktivitásának változását
eredményezi. A tirozin megnyúlt, kiterjedt oldalláncának foszforilációja viszont felismerőhelyet is
teremt a polipeptidláncon más fehérjék számára. Érthető módon a szerin/treonin- és a
tirozinspecifikus fehérjekinázok két, egymástól jól megkülönböztethető enzimcsaládot alkotnak.
(Az egyetlen ismert kivétel a MAPKK-ok családja, melyek kettős specificitású fehérjekinázokként a
MAPK-okat treonin- és tirozin-oldalláncokon is foszforilálják.) A proteinkinázok gyakran
jelátviteli kaszkádokat alkotnak: a lánc tagjai egymást foszforilálva továbbítják a jelet (pl. a MAPK-
kaszkádok). A humán genom program több mint 500 proteinkináz gént azonosított az emberi
genomban: a fehérjekinázok a legnagyobb fehérjecsaládot alkotják sejtjeinkben. Részt vesznek a
sejtciklus, differenciáció, sejtmozgások, sejthalál, transzkripció, transzláció, génexpresszió
szabályozásában, kóros működésük betegségeket okozhat.
A fehérje-foszforiláció kétségtelenül az egyik legfontosabb szabályozási mechanizmus
sejtjeinkben, számos egyéb fehérje-módosulásnak (acetiláció, metiláció, hidroxiláció, stb.) is
szerepe van azonban a jelátviteli folyamatokban. Ezeknek a poszttranszlációs módosulásoknak a
jellemzőivel korábbi fejezetekben foglalkoztunk.
Makromolekuláris egymásrahatások. A
közvetlen jelátvitel fontos formái a jelátviteli
fehérjék között kialakuló protein–protein
egymásrahatások: fehérjedomének felismerik
egymást és komplexet képeznek.
Legismertebbek az SH2- (foszfotirozin-kötő)
és SH3-domének (poliprolin-kötő régió).
Ezeknek a kapcsolatoknak a jelentősége, hogy
a multiprotein komplexekben fizikai
közelségbe kerülnek egymással szabályozó és
szabályozott, enzim és szubsztrát. A kapcsolat
lehet indukált (pl. a növekedési faktor
receptorok esetében) és állandó is. Az utóbbi
esetben a jelátviteli fehérje a sejt olyan
régiójában helyezkedik el, ahol stimuláció
esetén egyébként is működnie kell. A PKA-t
például lehorgonyzó fehérjék több sejtben a
citoszkeletonhoz rögzítik, mert egyes
célfehérjéi is itt lokalizálódnak. A jelátviteli
fehérjéknek ez a kompartmentalizációja
nagymértékben hozzájárul a szignalizáció
hatékonyságához, gyorsaságához és
fajlagosságához.
A jelátvitel lipid-fehérje kapcsolatok
létesülését is előidézheti. A PI3K-út serkentése
során képződő PIP3 másodlagos messenger
például olyan fehérjekinázt vonz magához,
49.1. ábra: Jelamplifikáció a cAMP-úton mely speciális lipidfelismerő domént
tartalmaz.

227
A transzkripciós faktorok szekvenciaspecifikus DNS-fehérje kapcsolat kialakításával látják el
génregulációs funkciójukat. Az enhancer-kötés szabályozása döntően a transzkripciós faktor
foszforilációján keresztül történik, de más mechanizmusok is ismertek. Az emberi sejtekben
expresszálódó mintegy 3000 transzkripciós faktor szignál-transzdukciós mechanizmus általi
szabályozását egy korábbi fejezetben tárgyaltuk (l. 32.1. ábra).
Jelamplifikáció
A szignáltranszdukció nem egyszerűen a jel sejten belüli továbbítását, hanem annak felerősítését
is jelenti. Az amplifikációt az okozza, hogy egy enzim molekula több másodlagos messengert
termel vagy több szubsztrátot képes átalakítani. A 49.1. ábra a cAMP-úton mutatja be a jelátviteli
út amplifikált lépéseit, de hasonló jelerősítés más szignáltranszdukciós pályákon is történik. A
jelamplifikáció mértéke több ezerszeres is lehet.
Jelterminálás
Egy jelátviteli mechanizmus gyors és hatékony működtetésének előfeltétele az, hogy az aktivált
állapot csak addig maradjon fenn, amíg szükséges: a receptorstimuláció megszűnése után az egész
rendszer minél előbb kerüljön vissza a nyugalmi állapotba. A jelet tehát nemcsak generálni kell,
hanem a megfelelő pillanatban terminálni is (példák a 49.1. táblázatban). Ha a jelátviteli rendszer
aktivált állapota tartóssá válik, ez nemcsak a szabályozottságot veszélyezteti, de súlyos patológiás
következményekkel is járhat (pl. daganatképződés, l. később).

Jelátviteli ágens Jeltermelő fehérje Jeltermináló fehérje

cAMP adenilátcikláz ciklikus nukleotid foszfodiészteráz
Ca++ IP3-érzékeny Ca++-csatorna Ca++-ATPáz
G-protein GEF GTPáz
foszfoprotein fehérjekináz fehérjefoszfatáz
acetilált fehérje hiszton acetiltranszferáz (HAT) hiszton deacetiláz (HDAC)
PIP3 PI3K PTEN

49.1. táblázat: Jelátviteli ágensek aktiválásának és inaktiválásának néhány példája

Jelátviteli hálózatok
Az előző fejezetekben a legfontosabb jelátviteli pályákat – a könnyebb érthetőség kedvéért – mint
önálló, egymástól elkülönült egységeket ismertettük. A valóságban a szignáltranszdukciós utak
egymással számos ponton érintkeznek, párhuzamos pályák helyett szövevényes jelátviteli
hálózatok formájában járják be a sejtet. A 49.2. ábra az egy pontból kiinduló és elágazó, divergáló,
illetve a különböző írányokból érkező, konvergáló utak egy-egy példáját mutatja be.
A sejtet környezeti hatások százainak milliónyi kombinációi érhetik. A ligand-kombinációktól
függően a sejt proliferációval, differenciációval, anyagcsere-változásokkal vagy akár pusztulással
is válaszolhat. Ennek a kombinatoriális szignalizációnak a biokémiai hátterét biztosítja a jelátviteli
pályák közötti „párbeszéd” lehetősége, a beérkezett szignálok integrálása.

228
 49.2. ábra: A növekedési faktor receptorokról divergáló (A.) és a fos-promóteren konvergáló (B.)
jelpályák

Klinikai vonatkozások
Intracelluláris jelátvitel szükséges a szöveti differenciációhoz, a hormonhatáshoz,
neurotranszmitterek, növekedési faktorok hatásának közvetítéséhez. Várhatóan nagyon sok
olyan emberi betegséget fognak találni, melynek hátterét jelátviteli zavar adja. Új
tudományterületről lévén szó, a jelátviteli betegségek molekuláris patomechanizmusának
tisztázása még éppen csak megkezdődött. Ebben a fejezetben csak néhány példa megemlítésére
van lehetőség.
Nem inzulindependens (II. típusú) diabetes mellitus
A cukorbetegség (diabetes mellitus) világszerte a leggyakoribb anyagcserebetegség, a vakság,
veseelégtelenség, érszűkület, szívinfarktus és agyvérzés vezető kóroki tényezője. Az esetek
többségében (II. típusú diabetes) az okozza, hogy a célszövetek inzulinérzékenysége csökken. (Az
I. típusú, inzulindependens diabetesben a Langerhans-szigetek inzulintermelése elégtelen.) Az
inzulinrezisztens diabetes poligénes öröklődésű betegség; az esetek egy részében az
intracelluláris jelátvitel fehérjéit és az anyagcsereutak enzimeit kódoló génekben bekövetkező
mutációk eredményezik. Az inzulin-jelátvitel tirozin-proteinkináz receptoron kezdődik (49.3.
ábra). Az aktivált receptorhoz nagyméretű dokkoló fehérjék (IRS = inzulinreceptor szubsztrát
proteinek) kapcsolódnak, melyek adapterfunkciót látnak el: több jelpálya indul róluk. A Ras/ERK-
úton keresztül mitogén jelátvitel érvényesül. Az inzulin metabolikus hatásainak fő közvetítője a
PI3K-út: serkenti a glikogénszintézist, a fehérjeszintézist és a sejtek glukózfelvételét. A PI3K-út
stimulációja következtében a citoplazmában vezikulák membránjában raktározott
glukóztranszporter fehérjék exocitózissal a sejtmembránba kerülnek és ezáltal megnő a glukóz
transzportja a sejtbe. Az inzulinrezisztens diabeteses betegekben eddig végzett molekuláris
biológiai vizsgálatok több jelátviteli fehérje mutációs inaktiválódását találták (a receptor, IRS-
fehérjék stb.). Későbbi kutatásoknak kell tisztázniuk, hogy ezek és más mutációk milyen
mértékben felelősek a klinikai kép kialakulásáért.

229
 49.3. ábra: Az inzulin jelátviteli pályái. (A rövidítések jelentését l. a szövegben.)

Nephrogen diabetes insipidus

A hipofízis antidiuretikus hormonja (ADH, vazopresszin) a vesetubulusok sejtjeinek
membránjában levő akvaporin fehérjéket aktiválva serkenti a víz visszaszívását (l. 42. fejezet). A
jelátvitel a cAMP-úton keresztül történik. Ennek megszakadása (pl. az ADH-receptor hiánya vagy
működésképtelensége következtében) ADH-rezisztens diabetes insipidus kialakulásához
vezet.
Cholera
A cholerafertőzés patomechanizmusa jó példát szolgáltat arra, milyen súlyos következményei
lehetnek egy jelátviteli út konstitutív aktiválásának. A baktérium által termelt choleratoxin a
vékonybél hámsejtjeiben tartósan aktiválja a Gs-fehérjét, az emelkedett cAMP-szint pedig az
epiteliális sejtek membránján keresztül nagymértékű víz- és sóvesztéshez vezet. A hasmenés
életveszélyes állapotot idéz elő, anélkül, hogy a vékonybél nyálkahártyájában jelentős morfológiai
károsodás jelenne meg.
Krónikus gyulladásos betegségek
Számos gyakori, súlyos tünetekkel járó betegségre az érintett szövetek krónikus gyulladása
jellemző (pl. rheumatoid arthritis [izületi gyulladás], colitis ulcerosa [vastagbélgyulladás]). Ezen
betegségek patogenezisében fontos tényező az NFκB-út tartós aktiválódása (l. 48. fejezet), mely a
gyulladásos folyamat fenntartását biztosító fehérjék expresszióját indukálja. A betegségek
kezelésére használt gyógyszerek (glukokortikoidok, antioxidánsok) éppen az NFκB
transzkripciós faktor gátlásával fejtik ki jótékony hatásukat.
Daganatok
A rosszindulatú sejtburjánzást a sejtek proliferációját szabályozó jelátviteli utak mutáció(k)
következtében fellépő konstitutív aktivációja okozza. A daganatképződés molekuláris
mechanizmusaival a későbbi fejezetekben részletesen foglalkozunk.

230
 50. Az egyedfejlődés celluláris és molekuláris alapjai
Magasabb rendű, soksejtű szervezetek egyedfejlődése során a megtermékenyített petesejtből
(zigótából) jön létre a kifejlett szervezet hatalmas sejttömege. A fejlődés eredménye nagyfokú
diverzitás: emlős szervezetekben mintegy 300 különböző sejttípus alakul ki. Ugyanakkor viszont
a genom érintetlen marad, a szervezet szomatikus sejtjei azonos DNS-állománnyal rendelkeznek
(ez a genom-ekvivalencia törvénye). (A létező néhány kivétel – pl. az immunglobulin-gének
átrendeződése – a szabályt erősíti.) Az azonos genom – eltérő fenotípus paradoxon molekuláris
alapjainak megfejtése a modern embriológia egyik fontos feladata. Ebben a fejezetben az
egyedfejlődés néhány általános celluláris és molekuláris vonatkozásával foglalkozunk,
hangsúlyozva, hogy a fejlődéstan egyéb kérdései messze meghaladják egy molekuláris
sejtbiológia-könyv tematikáját. Röviden összefoglalva: az egyedfejlődés során azért alakul ki a
sejtek sokfélesége, mert (I) a sejtek különböző jeleket generálnak és különböző jelekre adnak
biológiai válaszokat; és mert (II) génjeik expresszióját szabályozni képesek.

Az emlősök korai egyedfejlődése

50.1. ábra: A megtermékenyítés és a zigóta első
mitotikus osztódása
Az egyedfejlődés a megtermékenyítéssel
kezdődik (50.1. ábra): a spermium és az
oocita membránja összeolvad és
létrehozza a zigótát. A megtermékenyítés-
sel kiváltott jelátviteli folyamatok
eredményeképpen aktiválódik az anafázis
promóciós komplex (l. 18. fejezet), így az
oocita be tudja fejezni a II. meiotikus
osztódást, mely egy 2. sarki testet is
létrehoz. (A sarki testek később
elsorvadnak. A meiózis folyamatával
egyébként a 19. fejezetben foglalkoztunk.)
A zigóta hím és nőstény pronukleusza S-
fázisba lép, majd a maghártyák felbomlása
után az apai és anyai eredetű
kromoszómák összekeverednek és
végbemegy az embrió első mitotikus
osztódása.
Az emlős embrió fejlődése (50.2. ábra) a
méh védett környezetében folyik. A zigóta
barázdálódási osztódások sorozatán megy
keresztül. Az ezek közötti rövid
interfázisok alatt a sejtek alig növekednek,
így a barázdálódás során az embrió mérete
alig változik, szaporodó sejtjei pedig egyre
kisebbek lesznek. Egészen a 8-sejtes
stádiumig a sejtek totipotensek: azonos
fejlődési potenciállal rendelkeznek, azaz
mindegyikükből külön-külön normális
egyed fejlődhet. A morula (szedercsíra)
sejtjei már differenciálódni kezdenek: a
képződő blasztociszta embriócsomójából
az embrió, külső trofoblaszt sejtjeiből
pedig a méhlepény fog kialakulni. Az

231
embriócsomó növekedésével és sejtjeinek differenciálódásával először csíralemezek, majd
magzati szervkezdemények jelennek meg (organogenezis), végül kifejlődnek a végleges szervek.

50.2. ábra: Az emlős egyedfejlődés korai szakasza

Az egyedfejlődés alapvető celluláris folyamatai

Sejtproliferáció
Az embrió növekedését mitotikus sejtosztódások sorozata biztosítja. A barázdálódó embrió
sejtjeinek ciklusa rövid, gyakorlatilag csak S- és M-fázisból áll. Az embrionális sejtpoliferáció
rendkívül szigorú kontroll alatt áll.
Determináció
Az embrió korai fejlődése során a pluripotens sejtekből különböző szöveteket, szerveket
létrehozó sejtek alakulnak ki. A sejtek tehát „döntési helyzet” elé kerülnek, melyben egy
meghatározott fejlődési út mellett kötelezik el magukat (determináció), lemondva arról, hogy
más fejlődési irányt vegyenek. Az elkötelezett sejtek – rájuk a -blaszt kifejezést használjuk (pl.
fibroblaszt, mioblaszt, neuroblaszt) – megtartják osztódási képességüket és így azonos fejlődési
potenciállal rendelkező sejtek csoportját, klónját hozzák létre.
A determináció állapota öröklődik az utódsejtekre. Ennek hátterét a sejtmemória biztosítja: az
elkötelezett sejtre jellemző specializált génexpressziós program változatlan formában átkerül az
osztódások során képződő új sejtekbe is. A stabil génexpressziós mintázat fenntartásában
többféle mechanizmus vehet részt. (I) A citoplazmatikus memóriát a determinált sejt szabad
poliszómáin képződő transzkripciós faktorok biztosítják. Ezek ún. szelektor gének termékei,
melyek számos egyéb, a differenciálódó sejtre jellemző fenotípusos jelleg kialakításáért
közvetlenül felelős gén működését szabályozzák. A szelektor gének terméke gyakran az őket
kódoló gén transzkripcióját is serkenti. Ez a pozitív feedback biztosítja a megfelelő transzkripciós
faktor szintet az utódsejtekben is. (II) Az autokrin memória szekretált ágens útján tartja fenn az
elkötelezett állapotot: a sejtfelszíni receptorok közvetítésével a sejt saját növekedési faktorára
reagál. (III) A nukleáris memóriát öröklődő kromatin-modifikációk tartják fenn. Ennek egy példája
az egyik X-kromoszóma inaktivációja az egyedfejlődés korai szakaszában. DNS-metilációval
előidézett permanens, öröklődő géninaktiváció a genomiális bevésődés (imprinting).
Differenciáció
Az embrionális sejtek specializálódásának következő lépése a differenciálódás: a sejtek már
nemcsak elkötelezettek egy meghatározott fejlődés irányában, hanem fenotípusos változásokat is
mutatnak és fenn is tartják azokat. A terminálisan differenciált sejtek – melyeket -citáknak
nevezünk (pl. leukocita, eritrocita stb.) – felveszik az illető sejttípusra jellemző morfológiai és
funkcionális jellegeket, ezeket az élet végéig megtartják, osztódási képességüket pedig általában
elvesztik. A differenciált sejtekre jellemző fenotípusos tulajdonságok hátterében specifikus
génexpressziós mintázat húzódik meg.

232
Sejtmozgások
A fejlődő embrió formálódásának, morfogenezisének szempontjából nagy jelentőségű a sejtek
vándorlása. A sejtmozgások irányításában fontos szerepet játszanak kapcsolataik egymással,
illetve az extracelluláris mátrix elemeivel. Ezek az egymásrahatások a sejtek pozíciójának
meghatározásán kívül a differenciációs folyamatokat szabályozó intracelluláris jelátviteli
eseményeket is befolyásolnak (l. később).
Programozott sejthalál (apoptózis)
Az embrionális fejlődés nemcsak bizonyos sejtcsoportok elszaporodását, hanem más, feleslegessé
vált sejtek eliminálását is igényli. A normális organogenezis tehát a proliferációs és apoptotikus
folyamatok finoman szabályozott egyensúlyán alapul. (Az apoptózis mechanizmusával a
következő fejezetben foglalkozunk.)
Alakzatformálódás
Az embriogenezis során a sejtek és a sejt közötti állomány a szövetek és szervek szigorúan
rendezett térbeli struktúráit, konfigurációit hozzák létre, mely folyamat a mintázatkialakulás
(angol szakkifejezéssel pattern formation) elnevezést viseli. A jelenség alapja a sejtek pozíciófüggő
determinációja. Parakrin típusú szignalizációval egyes sejtek morfogén hatású anyagokat
(növekedési faktorokat, retinsavat stb.) bocsátanak ki környezetükbe, melynek koncentrációja a
sejttől távolodva fokozatosan csökken. A környező sejtek, érzékelve a ligandkoncentrációt, a
morfogéngrádiensből egyrészt pozíciós információt nyernek, másrészt pedig a bennük végbemenő
szignalizációs és génexpressziós folyamatok eredményeképpen meghatározott fejlődési útvonal
iránt kötelezik el magukat, determinálttá válnak.

Szignáltranszdukció és embrionális fejlődés

Mint a fentiekből kiderült, a sejtek közötti és sejten belüli jelátviteli folyamatoknak fontos
szerepe van az embrionális fejlődés szabályozásában. A szignalizáció minden formája működik:
direkt sejt–sejt kommunikáció réskapcsolatok és sejtadhéziós fehérjéken keresztül; jelátvitel az
extracelluláris mátrix felől integrinek közvetítésével; szolubilis növekedési faktorok sejtfelszíni
receptorai útján.
A növekedési faktorok változatos hatásokkal járulnak hozzá a szövetek, szervek kialakulásához.
Az EGF-család tagjai az epiteliális sejtek, a PDGF elsősorban a sima izom- és gliasejtek
proliferációját indukálja. Az FGF-család fontos hatása a mezoderma indukciója. Ebben a
transzformáló növekedési faktor β (TGF-β) -családba tartozó aktivin is részt vesz. Az inzulinszerű
növekedési faktor (IGF, szomatomedin) növekedési hormon hatására a májban képződik és a váz
elemeinek fejlődését stimulálja.

Homeotikus szelektor génkomplexek szerepe

A homeotikus gének nagy jelentőségű korai döntéseket hoznak az egyedfejlődés során: egész
testrészek, szegmentumok kialakulását irányítják. Termékeik a helix-turn-helix osztályba tartozó
transzkripciós faktorok (l. 32. fejezet), melyek egy sor „végrehajtó” fehérjét (strukturális
fehérjéket, növekedési faktorokat, mátrix és sejtadhéziós proteineket, enzimeket stb.) kódoló gén
expresszióját szabályozzák. A homeotikus gének csaknem minden állat genomjában
megtalálhatók. Különösen a DNS-kötő homeodomént kódoló régiójuk (az ún. homeobox)
konzerválódott erősen az evolúció során.
A homeotikus gének sorozatos génduplikáció eredményeképpen génsorozatokat, komplexeket
alkotnak. Drosophilában egyetlen ilyen génsorozat (HOM-komplex) van, melyet 8 gén alkot (50.3.A.
ábra), emlősőkben viszont 4 hasonló génsorozat van jelen (50.3.B. ábra; HoxA-D komplexek). A
homeotikus komplexek jellegzetes tulajdonsága, hogy a gének kromoszomális sorrendje megfelel

233
annak a mintázatnak, ahogyan ezek a gének a fej–farok tengely mentén az egyes szelvényekben
expresszálódnak (50.3.C. ábra).

50.3. ábra: A homeotikus génkomplexek Drosophilában (A.) és egérben (B.). A komplexek azonos
számmal jelölt génjei egymással homológok. A C. ábra a Hox-gének expressziójának eloszlását
mutatja az egér embrió központi idegrendszerében és szelvényeiben

Az egyedfejlődés veleszületett zavarai

Az ember mintegy 4000 öröklődő betegségének felében írtak le abnormális morfogenezist. Az
embrionális fejlődés zavarait előidéző mutációk sejtadhéziós molekulák, növekedési faktorok,
receptorok, intracelluláris jelátviteli fehérjék, transzkripciós faktorok génjeiben egyaránt
előfordulhatnak. Az alábbiakban néhány viszonylag gyakori, ismert patomechanizmusú
betegséget említünk példaként.
Az achondroplasia az öröklődő törpeség leggyakoribb formája, csontosodási zavar okozza. Az FGF-
receptorok egyik típusának pontmutációs betegsége. Más FGF-receptor mutációk domináns
öröklődésű craniosynostosis-szindrómákat okoznak. Ezekben a kórképekben a varratok fúziója
koponyadeformitásokat idéz elő. Tirozinkináz receptor mutációs funkcióvesztése okozhatja a
Hirschprung-betegséget is. Ezt a gyakori veleszületett kórképet a vastagbél idegellátásának
rendellenessége következtében fellépő szűkület, elzáródás és az obstrukció előtti
vastagbélszakasz kitágulása (megacolon) jellemzi. Az Albright-féleherediter osteodystrophiát a Gs
fehérje α-alegység génjében bekövetkező mutáció okozza. Transzkripciós faktorok génjében
bekövetkező mutáció eredményezi többek között a törpenövéssel járó kombinált hipofízis
hormon-deficienciát, illetve az abnormális férfi nemi fejlődéssel és a csontrendszer
rendelleneségeivel jellemezhető campomeliás dysplasiát.

234
 51. Programozott sejthalál
A többsejtű szervezetekben a sejteknek nemcsak képződniük, hanem – az egyensúly fenntartása
érdekében – pusztulniuk is kell. Ezt a fiziológiás, programozott sejthalált már a 19. század
közepén leírták, majd az 1970-es évektől került az érdeklődés középpontjába. Ebből az időből
származik a ma már széles körben használt elnevezése, az apoptózis is (görög eredetű szó,
lombhullást jelent). Általánosan elfogadott nézet napjainkban az, hogy minden fiziológiás
sejthalál, de a patológiás sejtpusztulások számos fajtája is apoptózissal megy végbe. A
programozott sejthalál a soksejtű állatok sejtjeinek az evolúció során erősen konzervált,
általánosan alkalmazott „öngyilkossági” mechanizmusa. Az apoptózisvizsgálatok
modellszervezete a primitív fonalféreg Caenorhabditis elegans, melynek egyedfejlődése során
bekövetkező apoptotikus folyamatok genetikai módszerekkel jól tanulmányozhatók. A C. elegans
„halálgénjeinek” vizsgálata értékes információkat nyújtott az emlősök programozott
sejthalálának megértéséhez is.

Nekrózis és apoptózis
A programozott sejthalál élesen
különbözik a sejtpusztulás másik alapvető
típusától, a nekrózistól. Ha sejtek egy
csoportját súlyos fizikai vagy kémiai
károsító hatás éri, jellegzetes celluláris
tünetek mellett pusztulnak el (51.1. ábra).
A sérült sejt megduzzad, magjában a
kromatin szétszórt csomók formájában
kondenzálódik. A membránstruktúrák
károsodása következtében tartalmuk
kiszivárog a környező extracelluláris térbe
és gyulladást idéz elő, melynek keretében
az érkező makrofágok végül is fagocitálják
a dezintegrált sejtet. A nekrózis
lejátszódásához génexpressziós vál-
tozások nem szükségesek, a sejt passzív
módon elszenvedi pusztulását.

51.1. ábra: A nekrózis és az apoptózis

morfológiai jellemzői
Az apoptózist olyan – gyakran fiziológiás – hatások váltják ki, melyek önmagukban nem
halálosak: a sejt maga „döntheti el”, hogy életben marad-e vagy pedig elpusztítja magát. Ez a fajta
sejthalál tehát aktív, szabályozott folyamat, lebonyolításában génexpressziós változások is
szerepet játszanak. Az apoptózis során a membránok mindvégig épek maradnak: sejttartalom
nem kerül a sejtek közötti térbe, gyulladásos reakció sem alakul ki. A haldokló sejt stuktúrájának
lebontása tehát anélkül történik, hogy a környező szövetek komolyan károsodnának. Az
apoptotikus sejt zsugorodik, magjában a kromatinállomány a maghártya alatt kondenzálódik,
közben DNS-ét internukleoszomális hasítások darabolják. A zsugorodó sejtfelszínről
sejtorganellumokat tartalmazó apoptotikus testek válnak le, melyeket a szomszédos sejtek
fagocitálják. Az apoptotikus sejtek bekebelezése szelektív, specifikus folyamat. A haldokló sejt
membránjának egyik alkotórésze, a foszfatidilszerin – mely egészséges sejtekben a foszfolipid
kettősréteg belső, citoszól felőli lemezében fordul elő - externalizálódik, a sejtfelszínre kerül. A
fagocitáló sejtek receptoraikkal a foszfatidilszerint felismerve kebelezik be az apoptotikus

235
sejteket. A sejttörmeléknek ez a hatékony eltakarítása megakadályozza, hogy az elpusztuló
sejtekből immunogén hatású makromolekulák (fehérjék, DNS-darabok) szabaduljanak fel, melyek
autoimmun betegséget idézhetnének elő.
A teljesség kedvéért jegyezzük meg, hogy a szabályozott sejthalálnak van egy másik fontos típusa
is, az autofágia. Toxikus hatásokra a sejtben autofág vakuolumok jelennek meg, a lizoszómák
aktiválódása pedig végső soron a sejt pusztulásához vezethet.

Az apoptózis fiziológiás szerepe

Sejtek, sejtcsoportok tervszerű, programozott elhalása számos célt szolgál a többsejtű élőlények
életében. Az egyedfejlődés során feleslegessé vált szövetek, szervek eltüntetése (pl. az ebihal
farkának felszívódása, az emlősök előveséjének visszafejlődése), új struktúrák kialakítása (pl. az
ujjak kifejlődése a köztük levő szövetek felszívódásával) apoptotikus sejtpusztulást igényel. A
kifejlett szervezetben a szövetek, szervek állandó volumenének, homeosztázisának fenntartása a
sejtproliferáció és -pusztulás egyensúlyát feltételezi: a felnőtt emberi szervezetben mintegy 1011
sejt pusztul el naponta. A hormonmegvonás következtében fellépő szöveti involúció (pl. az
endometrium elhalása a menstruációt megelőzően) ugyancsak apoptózissal valósul meg.
Apoptózissal pusztulnak el a saját antigéneket felismerő, nem kívánatos immunsejtek.
Minőségellenőrző mechanizmusként működik a programozott sejthalál abnormális, károsodott
sejtek eliminálásában. Az apoptotikus folyamatok túlsúlyba kerülése az egyik fontos tényezője a
fiziológiás öregedés folyamatának is.

Az apoptózis legfontosabb regulátorai

A programozott sejthalál rendkívül összetett folyamat, lebonyolításában többezer fehérje vesz
részt. Az alábbiakban a legfontosabb szereplők rövid jellemzése következik.
p53-fehérje
A p53-fehérje a sejtek daganatos átalakulásának gátat szabó tumor szuppresszor fehérjék
legfontosabbika (részletes bemutatását l. az 56. fejezetben). Transzkripciós faktor, mely számos
apoptózist kiváltó (pro-apoptotikus) fehérje génjét indukálja. Stresszhelyzetben (DNS-károsodás,
széruméheztetés, stb.) mennyisége megnő a sejtben.
Bcl-2 család
Emberben ez a fehérjecsalád több mint 20 tagot számlál. Nevét első képviselőjéről, a Bcl-2
fehérjéről kapta, mely a B-sejtes lymphomák egyik típusában fokozott mértékben expresszálódik
(B cell lymphoma protein 2, l. 55. fejezet). Szerkezet és funkció alapján a család tagjait három
csoportba oszthatjuk (51.2. ábra).

51.2. ábra: A Bcl-2 család: A. anti-apoptotikus Bcl-2 fehérjék; B. pro-apoptotikus multidomén Bcl-2
fehérjék; C. pro-apoptotikus BH3-domén fehérjék

236
Az anti-apoptotikus fehérjecsalád prototípusa maga a Bcl-2 fehérje. Négy konzervált régiót
tartalmaz (BH1-BH4; Bcl-2 homológia domének), melyek az alcsalád minden tagjában jelen
vannak. Ezek a fehérjék a sejt túlélését serkentik.
A pro-apoptotikus multidomén fehérjék (pl. Bax fehérje) nem tartalmaznak BH4-domént. A
mitokondriumok külső membránjában pórusokat hoznak létre, ezzel indítják el a sejtpusztulás
folyamatát (l. később).
A pro-apoptotikus BH3-domén fehérjék (pl. Bad fehérje) az előbbi két alcsalád aktivitásának
szabályozásával idéznek elő sejthalált.
A Bcl-2 család a sejttúlélés és sejthalál fontos szabályozói (51.3. ábra). A reguláció központi elemei
a BH3-domén fehérjék. Normális sejtben ezek inaktívak, az anti-apoptotikus Bcl-2 fehérjék pedig
gátolják a pro-apoptotikus multidomén proteineket; a sejt életben marad. A celluláris stressz
különböző formáiban (DNS-károsodás, hipoxia, növekedési faktor megvonás, stb.) a BH3-domén
család különböző tagjai aktiválódnak, megkötik és inaktiválják az anti-apoptotikus Bcl-2
proteineket, a pro-apoptotikus multidomén fehérjék pedig permeabilizálják a mitokondriumok
külső membránját és beindítják a sejthalál gépezetét.
Kaszpáz-család
A kaszpáz fehérjék az apoptózis jelátviteli és végrehajtó fázisában is fontos szerepetjátszó
enzimek. Olyan proteolítikus enzimek, melyek aktív centrumában egy cisztein helyezkedik el, a
célfehérjét pedig aszparaginsav mellett hasítják el (caspase: cysteine aspartyl-specific protease).
A kaszpáz-családba emberben 11 enzim tartozik; ezek inaktív pro-kaszpázok formájában
képződnek, aktiválásuk pedig proteolítikus hasítással történik. Kaszpázok mind a „kivégzés”
elindításában, mind a végrehajtó fázisban részt vesznek: az iniciátor kaszpázok közül legfontosabb
a kaszpáz-8 és kaszpáz-9, az effektor kaszpázok közül pedig a kaszpáz-3. Az iniciátor kaszpázok
effektor kaszpázokat hasítanak és aktiválnak, utóbbiak pedig többszáz célfehérjét hasítanak el. Ez
a kaszpáz-kaszkád amplifikálja a haláljelet és vezet a sejt pusztulásához.

51.3. ábra: A Bcl-2 család tagjainak egymásra hatásai a sejttúlélés és a sejthalál szabályozásában

Apoptózis utak
A sejthalált kiváltó szignál hatáshelyétől függően az apoptózis két fő típusát különböztetjük meg:
az extrinsic vagy receptor által közvetített és az intrinsic vagy mitokondriális utat (51.4. ábra).

237
 51.4. ábra: Az apoptózis extrinsic (receptor által közvetített) és intrinsic (mitokondriális) útja
(részletek a szövegben)

Extrinsic út
Az apoptózisnak ezt a típusát szekretált polipeptidek, „halálligandok” váltják ki. Egyik fajtájuk a
tumor nekrózis faktor-α (TNF-α), mely daganatsejteket és egyes normális sejteket is képesek
elpusztítani. Receptorához („halálreceptor”) kötődve annak trimerizációját, ezáltal adapter
fehérjék kötődését idézi elő (51.4. ábra). A létrejövő komplexhez pro-kaszpáz-8 kapcsolódik,
aktiválódik és proteolítikus hasítással kaszpáz-3 enzimet hoz létre. A végrehajtó kaszpáz számos
fehérjét hasít el: a laminok proteolízise kromatin-kondenzációt és a sejtmag zsugorodását idézi
elő; citoszkeleton fehérjék hasítása a sejt alakjának megváltozásához, apoptotikus testek
lefűződéséhez vezet; stresszkinázok (pl. JNK) proteolítikus stimulálása hozzájárul a sejthalál
felgyorsulásához. Magfehérjék hasítása génexpressziós változásokat okoz. Kaszpázok aktiválják a
jellegzetes DNS-fragmentációt kiváltó DN-áz enzimet is. Általánosan elfogadott vélemény, hogy
nem egyes fehérjék, hanem számos kaszpáz-szubsztrát hasítása együtt felelős a sejthalálért. Az
apoptózis tehát „halál ezer vágás által”.
Intrinsic út
Vannak stresszhatások, melyek nem sejtfelszíni receptorok, hanem a sejt belsejében okozott
károsodás által okoznak sejthalált (51.4. ábra). DNS-károsodás, oxidatív stressz, növekedési
faktor megvonás egyaránt a p53 fehérje aktivációjához vezet. A p53 transzkripciós faktorként

238
egyéb gének mellett BH3-domén fehérjék génjét indukálja, a BH3-fehérjék hatására multidomén
Bcl-2 proteinek pórusokat képeznek a mitokondriumok külső membránjában. Az intermembrán
térből pro-apoptotikus fehérjék szabadulnak ki a citoszólba. Közülük a legfontosabb, a citokróm c
pro-kaszpáz-9 enzimmel és az Apaf-1 elnevezésű strukturális fehérjével nagyméretű, 7 küllővel
rendelkező kerékhez hasonló komplexet, apoptoszómát hoz létre. Az aktivált kaszpáz-9 ezután
csatlakozik az extrinsic úthoz és a sejt sorsát a fentiekben már leírt kaszpáz-3-tevékenység teljesíti
be. A kaszpáz-kaszkád működésének eredményeképpen irreverzibilis változások mennek végbe a
sejtben: a kromatin kondenzálódik, majd darabolódik, a citoplazma zsugorodik, a sejtfelszínről
apoptotikus testek válnak le, melyek áldozatul esnek a szomszédos, túlélő sejtek fagocitáló
aktivitásának. Az apoptotizált sejt, anélkül, hogy megbontaná a szövet integritását, nyomtalanul
eltűnik.

Az apoptózis betegségei
Mivel a programozott sejthalál a szervezet homeosztázisához hozzájáruló rendkívül fontos
jelenség, a normálistól eltérő mértéke káros következményekkel jár (51.1. táblázat). Túl kevés
apoptózis a proliferáció túlsúlya által káros sejtszaporulatot okoz (pl. daganatok, egyes
vírusbetegségek stb.). Túl sok apoptózis létfontos sejtek, szövetek elvesztéséhez (pl. AIDS,
szívinfarktus, stroke), degeneratív kórképekhez (pl. Alzheimer-kór, Huntington-kór stb.)
vezethet.

Csökkent apoptózissal járó betegségek Fokozott apoptózissal járó betegségek

AIDS
daganatok neurodegeneratív kórképek
follicularis lymphomák Alzheimer-kór
p53– szolid tumorok Parkinson-kór
autoimmun kórképek amytrophiás lateralsclerosis
systemás lupus erythematosus ischaemiás kórképek
vírusfertőzések myocardiális infarctus
herpesvírus toxin-indukált betegségek
poxvírus alkoholos májkárosodás

51.1. táblázat: Az apoptózis rendellenességei

Érthető módon a programozott sejthalálkutatásnak egyik legaktívabb területe apoptózisindukáló
és apoptózisgátló anyagok keresése, gyógyszerek kifejlesztése. Apoptózist előidéző szerként a
TNFα, glukokortikoidok, kemoterapeutikumok használatosak. A daganat-terápiában az
apoptózis-jelátvitelt szelektíven serkentő eljárások az állatkísérletek, illetve klinikai kipróbálás
fázisában vannak. Ilyen lehetőségek a „halálreceptorok” célzott serkentése, a PI3K/PKB út (l. 46.
fejezet) blokkolása, a Bcl-2 fehérje szintjének csökkentése. A programozott sejthalál
gátlószereiként növekedési faktorok, szelektív kaszpáz-inhibitorok, antioxidánsok jönnek
számításba. Neurodegeneratív kórképek gyógyszereiként reményteljes eredményekkel
tesztelnek apoptózis-gátlószereket. A programozott sejthalál rendkívül bonyolult folyamatainak
feltárása mind több teret nyit a racionális gyógyszerfejlesztések számára.

239
 52. Daganatbiológia I.: A tumorsejt általános jellemzői
A tumorképződés abnormális sejtproliferáció eredményeként jön létre. A normális sejtnek
rosszindulatú daganatsejtté történő átalakulása (malignus transzformáció) során mélyreható
változások játszódnak le a sejt életének minden területén: zavarok támadnak a jelátviteli
folyamatokban, felborul a sejtciklus szabályozása, megváltozik a gének működése, a sejtek közötti
kommunikáció, a sejt–mátrix kapcsolatok. A transzformáció bonyolult mechanizmusának,
jelenségeinek részletes tanulmányozása az elmúlt három évtizedben, a molekuláris sejtbiológia
metodikai arzenáljának fejlődésével vált igazán lehetővé. A következő fejezetekben az emberiség
e félelmetes betegségének alapvető celluláris és molekuláris jelenségeivel foglalkozunk. (A
bonyolult részletek az onkológia tárgykörébe tartoznak.)

A daganatok osztályozása
A daganatokat biológiai tulajdonságaik és a betegség várható kimenetele alapján két nagy
kategóriába szokás sorolni. A jóindulatú (benignus) tumorok sejtjei morfológiai és funkcionális
szempontból is hasonlítanak azokhoz a normális szöveti sejtekhez, melyekből a daganat
származik. A tumor növekedése lassú és lokalizált: kötőszöveti tok veszi körül, mely meggátolja a
környező szövetek infiltrálását. Életveszélyt csak akkor jelent, ha rossz helyen vagy túl nagyra nő,
vagy ha káros anyagokat termel. (Mint például az agyalapi mirigy növekedési hormont termelő
jóindulatú daganatai.) Sebészi úton általában meggyógyítható. A rosszindulatú (malignus)
daganatok kevésbé differenciáltak, a tumor fejlődése során átlépi a szövet, szerv határát, belenő
a környező szövetekbe (invázió) és távoli áttéteket (metasztázis) képez. A beteg halálát általában
nem a kiindulási helyen kialakuló primer daganat, hanem a tumor terjedésének következményei
okozzák. (Meg kell jegyezni, hogy a benignus és malignus sejtburjánzás között nem mindig könnyű
különbséget tenni: a rosszindulatú daganat képződésének legkorábbi stádiuma gyakran nehezen
azonosítható. A „rosszindulatú” kifejezés prognosztikai értéke is csökkent az utóbbi időben: a
malignus daganatban szenvedő betegek mintegy fele ma már meggyógyítható.)
A malignus tumorok eredetük alapján osztályozhatók. A hámszövet eredetű carcinomák teszik ki
a rosszindulatú tumorok mintegy 90 százalékát. Mindhárom csíralemezből származhatnak:
ektodermális eredetűek a bőr carcinomái; az endodermából alakulnak ki a tüdő és a gyomor-bél
rendszer rákjai; a mezodermából származnak az ovarium és az urogenitális rendszer carcinomái.
A sarcomák (pl. fibrosarcoma, osteosarcoma, myosarcoma, angiosarcoma) mezodermális eredetű
tumorok. A leukaemiák a vérképző szövetek különböző sejtjeiből származó rosszindulatú
daganatok, a lymphomák pedig a nyirokrendszer szilárd tumorai. Külön kategóriába sorolhatók a
velőcső eredetű neuroektodermálistumorok (neuroblastoma, retinoblastoma, medulloblastoma,
glioblastoma, stb.).

A tumorsejt morfológiája
A daganatsejtek nagyon különböző mértékben hasonlítanak normális megfelelőikhez. A jól
differenciált tumorok sejtjei kevéssé térnek el a normális szöveti képtől, a dedifferenciált
(anaplasztikus) daganatok viszont inkább az embrionális sejtekhez hasonlítanak, organellumaik
az érett szöveti sejtekének szinte csak „karikatúrái”. Általános szabályként azonban leszögezhető,
hogy a „legbetegebb” sejtek sem tartalmaznak olyan morfológiai jegyeket, melyek kizárólagosan
jellemeznék a daganatsejtet.
A sejtmag elváltozásai
A daganatsejt magja gyakran a fokozott aktivitás jegyeit viseli. A daganatszövet mitotikus indexe
(az osztódó sejtek aránya) emelkedett, az interfázikus magok általában duzzadtak.
Differenciálatlan tumorokra jellemző az eukromatinizáció: a kromatinállomány kevéssé
elektronszóró, a heterokromatin keskeny marginális kromatinsávra korlátozódik. Differenciált

240
daganatokban viszont fokozott kromatin-kondenzáció is előfordul. A nukleoluszelváltozások
gyakoriak: hipertrófia, a fibrilláris állomány dominanciája fokozott riboszómaképzésre utal. A
sejtmag lebenyezettsége, hiperszegmentációja, bizarr magalakok és nukleolusz-hipertrófia
együttes megjelenése poliploid daganatokra jellemző. A maglebenyezettséget okozó
citoplazmatikus betüremkedések pszeudoinkluziók formájában jelenhetnek meg
elektronmikroszkópos felvételeken: a sejtmagon belül megfigyelhető citoplazmatikus
organellumokat kettős maghártya választja el a mag többi részétől. Vírusok, glikogénszemcsék,
lipidcseppek valódi magzárványokat is alkothatnak. A tumor nekrózisát kariopiknózis
(magzsugorodás), kariolízis (magszétesés), apoptotikus jelek kísérhetik.
A citoplazma és a sejtfelszín elváltozásai
A daganatsejt differenciáltsági állapotától függően organellumszegénység vagy éppenséggel
túlzsúfoltság is előfordulhat. A mitokondriumok száma megnőhet, bizarr, degenerált alakok
jelenhetnek meg. A durva felszínű endoplazmatikus retikulum eltűnését általában a szabad
riboszómák felszabadulása kíséri. Más daganatokban az endoplazmatikus retikulum hipertrofizál.
Zárványok, glikogén-, lipidszemcsék felszaporodása gyakori. Epiteliális tumorsejtek között a
dezmoszómák felszaporodása kompenzációs mechanizmusnak tekinthető a sejt–sejt kapcsolatok
erősítésére. A sejtek legömbölyödését citoszkeletonváltozások (pl. a mikrofilamentum rendszer
átrendeződése) eredményezi. Az intermedier filamentumok diagnosztikus markerként
használhatók a daganatsejtek eredetére vonatkozóan: minden carcinoma citokeratint, a
sarcomák, lymphomák, melanoma malignum vimentint, a myosarcomák dezmint, az
astrocytomák gliafehérjéket, a neuroneredetű daganatok neurofilamentumokat tartalmaznak. A
tumor eredete immuncitokémiával tisztázható. Hámeredetű daganatok esetében a szöveti invázió
megindulásának biztos jele a hámsejteket a kötőszövettől elválasztó lamina basalis
(bazálmembrán) károsodása.

A tumorsejt funkcionális jellemzői

Szövettenyészeti sejtek transzformációja

Ha erre alkalmas szövettenyészeti sejteket

kémiai karcinogénekkel, sugárzással vagy
daganatkeltő vírusokkal kezelnek, ezek egy
része a tumorsejtekre jellemző fenotípusos
tulajdonságokat vesz fel (malignus
transzformáció). A transzformált sejtek
citoszkeletonjuk átrendeződése követ-
keztében lekerekednek, kevésbé tapadnak
a szövettenyésztő edény aljához,
elszaporodva egymás tetejére nőnek és a
normális sejtek rétegéből kiemelkedő kis
sejtcsomókat (fókuszokat) alkotnak (52.1.
ábra). Minden fókusz egyetlen
transzformált sejt genetikailag azonos
utódaiból alakul ki. A fókusz izolálható,
tovább tenyészthető és kitűnő
52.1. ábra: Szövettenyészeti sejtek malignus modellrendszert szolgáltat a tumorsejt
transzformációja fiziológiai, biokémiai és genetikai
tulajdonságainak tanulmányozására.

A transzformált sejtek viselkedése

Az 52.1. táblázat foglalja össze a transzformált sejtek legfontosabb sajátosságait és azok klinikai
vonatkozásait.

241
A sejtmozgás és osztódás kontakt gátlásának megszűnése. A normális sejtek addig
vándorolnak és szaporodnak a szövettenyésztő edény felszínén, amíg a sejtek egymáshoz nem
érnek. Összefüggő sejtréteg kialakulása után a mozgás és osztódás leáll a sejtek G0 fázisba
kerülnek; a jelenséget kontakt inhibíciónak nevezzük. A daganatsejtek ezt a képességüket
elvesztik, egymásra nőve csomókat, több sejtréteget is kialakítanak. A sejtek mozgékonyságát
növeli a membrán megváltozása: a membránfehérjék oldalirányú mozgása könnyebbé válik, a
glikoproteinek és glikolipidek összetétele módosul.
Csökkent növekedési faktor függőség. Normális sejtek csak szérumtartalmú tápoldatban
szaporodnak: a szérum növekedési faktorai stimulálják a proliferációt fenntartó mitogén
jelátviteli utakat (l. 46. fejezet). A daganatsejtek szérumigénye csökkent. Sok tumorsejt autokrin
mechanizmussal elégíti ki növekedési faktor igényét (l. 44. fejezet). Más daganatokban a mitogén
jelpálya konstitutívan aktív: növekedési faktorok nélkül is állandóan stimulálja a sejtosztódást (l.
később).
A letapadástól való függőség megszűnése. A legtöbb normális sejt szaporodásához az kell, hogy
a sejt szilárd felszínhez tapadjon. Ha a kitapadás megszűnik, a sejt apoptózissal elpusztul (l. 48.
fejezet). In vivo ennek a jelenségnek – melynek görög neve anoikisz (hajléktalanság) – óriási
jelentősége van: az extracelluláris mátrixról esetleg leváló sejtek nem tudnak a véráramba kerülni,
máshol letapadni és szövetidegen sejtpopulációt létrehozni. A daganatsejtek – megváltozott
sejtfelszíni tulajdonságaik, csökkent fibronektinképző képességük miatt – eleve gyengébben
tapadnak a mátrixhoz. A leváló sejtek pedig nem pusztulnak el, megőrzik szaporodó-
képességüket, ami in vivo áttétképzéshez vezethet. A metasztázisok megjelenése a
tumorprogresszió legsúlyosabb jelensége: a daganatos halálozás 90 százalékát az áttétek
következményei okozzák.

A daganatsejtre jellemző változás Klinikai következmény

Megváltozott morfológia Szövettani diagnózis lehetősége
Megváltozott sejtszaporodás
Fokozott sejtosztódás
Immortalitás Progresszív növekedés
Csökkent növekedési faktor igény Invázió és metasztázis
Kontakt gátlás elvesztése
Fokozott motilitás
Sejtfelszíni változások
Glikoziláció változása
Metasztázis
Fibronektin csökkenése
Invázió
Letapadás-függőség megszűnése
Proteáz szekréció
Anyagcsere változások
Fokozott glukóz és aminosav felvétel Kachexia
Fokozott glikolízis
Genetikai változások
Tumor progresszió, gyógyszer-rezisztencia
Fokozott genetikai instabilitás

52.1. táblázat: A daganatsejtek főbb jellemzői

242
Immortalitás. A szervezetből szövettenyésztő edénybe kiültetett sejtek egy ideig normálisan
szaporodnak, de egy bizonyos számú osztódás után a proliferáció akkor is megáll, ha a tenyésztés
egyébként optimális körülmények között folyik és a kultúra sejtjei végül is elpusztulnak. A sejtek
halandóságát a jelenlegi elképzelések szerint elsősorban a kromoszómák telomér-rövidülése
okozza (l. 21. fejezet). Normális sejtek is túlélhetik ezt a krízist és halhatatlanná válnak
(immortalizáció). Az így nyert, korlátlan ideig tenyészthető klónokat sejtvonalaknak nevezzük. Az
immortalitás a daganatsejtek általános jellemzője. Alapja valószínűleg az, hogy a sejtek a daganat
progressziója során visszanyerik telomeráz-expresszáló képességüket.
Génexpressziós és anyagcsere-változások. A daganatsejtekben számos gén működése
változhat meg, ezek hozzájárulhatnak a tumor progressziójához. Proteáz enzimek fokozott
szekréciója például az extracelluláris mátrix fehérjerostjainak lebontásához, daganatterjedéshez
vezet. Sejtfelszíni transzportfehérjék felszaporodása fokozza aminosavak, glukóz felvételét, így
elősegíti a daganatsejtre jellemző fokozott metabolizmust. A példákat tovább lehetne sorolni.
Az apoptózis képességének elvesztése. Ha egészséges sejtekben genotoxikus hatásokra DNS-
károsodások jönnek létre, azok egy bizonyos szint felett a sejt pusztulását eredményezik (l. 51.
fejezet). A rosszindulatú daganatsejtek ezt a képességüket elveszítették: a genomban
felhalmozódó mutációk nem vezetnek apoptózishoz. Ennek leggyakoribb oka a p53 fehérje
funkciójának elvesztése (l. 51. és 56. fejezet).
A differenciációs képesség elvesztése. A differenciált sejtek általában nem osztódnak tovább.
Ha a szöveti differenciáció valamilyen oknál fogva elakad, a sejtek osztódási hajlama megmarad,
daganat alakulhat ki. Erre a mechanizmusra a leukaemiák szolgáltatnak számos példát.
Angiogenezis. A daganat növekedésével a belsejében levő sejtek oxigén- és tápanyagellátása
elégtelenné válik. A növekedés csak akkor folytatódhat, ha a tumor belsejébe új erek nőnek és
biztosítják annak vérellátását. Minden szolid (szilárd) tumor sejtjeire jellemző, hogy
angiogenetikus faktorokat (vaszkuláris endoteliális növekedési faktor [VEGF], FGF) termelnek és
parakrin módon serkentik új kapillárisok kialakulását. Az angiogenezis a rosszindulatú daganatok
növekedésének elengedhetetlen feltétele: nélküle 2 mm-nél nagyobb tumorok nem képződnének.
Az angiogenezis gátlása a tumorterápia reményteljes lehetősége.

243
 53. Daganatbiológia II.: Onkogén DNS-vírusok
A rosszindulatú daganatok kialakulásáért különböző környezeti hatások, faktorok tehetők
felelőssé. A kémiai karcinogének és a sugárzás mellett jelentős szerep jut a daganatkeltő
vírusoknak is.

Onkogén vírusok
A tumorvírusok között igen hatékony karcinogén ágensek vannak. In vitro szövettenyészeti
sejtekben malignus transzformációt, in vivo fertőzéssel pedig daganatképződést idéznek elő.
Orvosi jelentőségük sem hanyagolható el, hiszen az emberi daganatok mintegy 15 százalékában
valószínűsíthető a vírusetiológia. Ez nem azt jelenti, hogy ezek a daganatok hagyományos
értelemben vett fertőző betegségek. A humán tumorvírusok ugyanis nem teljes értékű
karcinogének: a daganatképződéshez egyéb genetikai vagy környezeti tényezők hatására is
szükség van (l. 57. fejezet). Tumorvírusokkal sokan fertőződnek, de daganat – szerencsére – csak
kevesekben alakul ki.
Hatásmechanizmusuk alapján az onkogén vírusok két típusba sorolhatók: a direkt hatású vírusok
genomja onkogént tartalmaz, melynek terméke a fertőzött sejt szabályozhatatlan szaporodását
idézi elő (pl. humán papillomavírusok, Epstein-Barr vírus, l. később). Az indirekt hatású vírusok
onkogént nem tartalmaznak, proliferációs hatásukat közvetett úton fejtik ki (pl. hepatitis B vírus).
Az onkogén vírusok közé DNS- és RNS-vírusok is tartoznak. Viszonylag kis genommal
rendelkeznek. Közös tulajdonságuk, hogy ahhoz, hogy a sejtet stabilan transzformálják, a fertőzés
során genetikai információjukat be kell építeniük, integrálniuk kell a celluláris genomba. A
daganatképződés mechanizmusának vizsgálata nyilvánvalóvá tette, hogy a virális és nemvirális
karcinogenezis molekuláris jelenségei nagyon hasonlóak. Az elmondottak alapján érthető, hogy a
daganatkeltő vírusokat előszeretettel használják mint a karcinogenezis modell rendszereit.

Onkogén DNS-vírusok
SV40- és poliomavírus
A vírus-tumorigenezis legjobb modellobjektumai a majmok SV40-vírusa és az egerek
poliomavírusa. Ezek a vírusok nagy hatásfokkal transzformálnak erre érzékeny szövettenyészeti
sejteket, in vivo azonban sem természetes gazdáikban, sem más fajokban nem mutatnak
tumorigenitást. (A csoport néhány tagját – így az SV40 vírust is – újabban kapcsolatba hozzák
emberi daganatokkal, a rendelkezésre álló bizonyítékok azonban inkább ellene szólnak ennek a
feltételezésnek.)
A vírusgenom és termékei. Az SV40- és a poliomavírus kisméretű, kb. 5000 bázispár nagyságú,
cirkuláris DNS-genomja két régióból áll (53.1. ábra). A korai régióról képződő transzkriptum
alternatív splicinggal korai mRNS-eket produkál, melyekről a nagy T, a kis t (poliomavírus
esetében pedig a közepes T is) elnevezésű fehérjék képződnek a fertőzött sejtben. A korai fehérjék
a vírus szaporodásához szükségesek. A poliomavírus nagy T fehérjéje a gazdasejt magjában
expresszálódik, transzkripciós és replikációs folyamatokat befolyásol és immortalizálja a sejtet. A
közepes T a plazmamembránhoz kötött és a morfológiai transzformációt idézi elő. (SV40-vírus
esetében a nagy T-fehérje hordozza mindkét funkciót.) A kis T citoplazmatikus fehérje és
közreműködik a teljes malignus transzformáció kialakításában.
A genom késői régiója a fertőzés későbbi szakaszában expresszálódik. Az általa kódolt fehérjék a
kapszid strukturális komponensei, melyek a vírusreplikáció során képződő érett vírionokba
épülnek be.

244
 Fertőzési ciklus. Az SV40- és a poliomavírus-fertőzés
kimenetele döntően függ a fertőzőtt sejttől (53.2. ábra). A
természetes gazdasejtekben a vírus a sejtmagba jut, korai
régiója átíródik. A T-fehérjék hatására a sejt morfológiailag
transzformálódik, a vírus-DNS pedig a sejt genomjától
függetlenül, extrakromoszomális állapotban maradva
replikálódni kezd a sejtmagban. A késői régió által kódolt
fehérjékkel kapcsolódva a sejtmagban nagy mennyiségű
víruspartikulum jelenik meg, a sejt hamarosan szétesik, az
új vírusok kiszabadulnak. A fertőzésnek ezt a típusát lítikus
fertőzésnek nevezzük, az azt lehetővé tevő gazdasejtet
pedig permisszív sejtnek.

53.1. ábra: Az SV40-polioma víruscsalád genomjának

szerkezete (a nyilak a transzkripció irányát jelölik)

53.2. ábra: Az SV40-vírus fertőzési ciklusa. A: lítikus fertőzés permisszív sejtekben; B: permanens
transzformáció nonpermisszív sejtekben
Más fajba tartozó sejtekben a fertőzés korai szakasza hasonlóan zajlik (53.2.B. ábra): a vírus a
magba hatol, transzformálja a sejtet. Ezekben a sejtekben azonban a vírus-DNS nem tud

245
replikálódni (nonpermisszív sejtek), a celluláris genom vírus által stimulált replikációja viszont
folytatódik. A sejt osztódásával egyre több utódsejtből tűnik el a replikálódni képtelen vírus-DNS.
A vírusgenom hiányában ezek a sejtek ismét normálissá válnak, transzformált állapotuk
megszűnik. Nagyritkán, kb. minden ezredik fertőzött sejtben azonban a vírusgenom
véletlenszerűen integrálódik a sejt DNS-ébe, azzal együtt replikálódik és az utódsejtben is
fenntartja a transzformált állapotot. A fertőzésen átesett nonpermisszív sejtek kis részében tehát
permanens transzformáció alakul ki.
Az elmondottakból következik, hogy ezeknek a vírusoknak nem az a „célja”, hogy tumort
okozzanak, hanem hogy szaporodjanak a fertőzött sejtben. Malignus transzformáció akkor
következik be, ha a vírus szaporodása, a lítikus ciklus gátolt.
Adenovírusok
Az adenovírusok nem állnak rokonságban az SV40-poliomacsoport tagjaival: genomjuk
lényegesen nagyobb (kb. 35 kb), lineáris kettős láncú DNS. Biológiai viselkedésük azonban nagyon
hasonló: permisszív sejtekben lítikus fertőzést okoznak, nonpermisszív sejtekben pedig
transzformációt; genomjuk korai és késői régióra osztható, az előbbi termékei (az E1A és E1B
korai proteinek) transzformáló, az utóbbié strukturális fehérjék. Az adenovírusok az emberben
tumort nem okoznak. Hasonlóan az SV40- és poliomavírusokhoz, az adenovírusok is kitűnő
laboratóriumi modellek molekuláris biológiai folymatok tanulmányozására.
Hepatitis B vírus
A májrák (hepatocelluláris carcinoma) egyike a leggyakoribb rosszindulatú daganatoknak.
Gyakorisága nagy földrajzi eltéréseket mutat: Afrikában, Kinában sokkal általánosabb mint a
fejlett nyugati országokban. Ennek oka, hogy etiológiájában fontos szerepet játszik az elégtelen
higiéniás körülmények között gyakori vírus-hepatitis.
A hepatitis B vírus (HBV) a vér és testnedvek útján, transzfúzióval, intravénás
kábitószerélvezettel, szexuális érintkezéssel terjedő fertőző ágens. A vírussal fertőzött
májsejteket az immunrendszer elpusztítja: a folyamat akut hepatitis képében zajlik, mely az esetek
többségében következmények nélkül gyógyul. A fertőzések 5–10 százalékában azonban a
gyulladás perzisztál, a krónikus hepatitis talaján májzsugorodás (cirrhosis) alakul ki, ez pedig
mintegy százszorosára növeli a hepatocelluláris carcinoma kifejlődésének valószínűségét. A
vírusfertőzés és a májdaganat megjelenése között évtizedek telhetnek el.
Bár a hepatitis B vírus az állatvilág legkisebb genommal rendelkező vírusa – a 3.2 kb méretű
cirkuláris DNS géntérképe és szekvenciája is ismert, a hepatokarcinogenezis mechanizmusa
tulajdonképpen még nem tisztázott. A legvalószínűbb ok a krónikus fertőzés és sejtpusztulás által
kiváltott állandó regeneráció, fokozott sejtproliferáció malignus folyamattá változása. A
hepatokarcinogenezisben szerepet játszhat egy vírusgenom által kódolt fehérje (HBX protein) is,
mely celluláris gének expresszióját szabályozza. A vírus kóroki szerepét mindenesetre
alátámasztja az a tény, hogy az anti-HBV vakcináció bevezetésével a hepatocelluláris carcinoma
gyakorisága is lassan csökkenni kezdett. (Itt említjük meg a hepatitis C vírust is. Bár RNS-vírusként
nem tartozna ebbe a fejezetbe, hatását a HBV-hez hasonlóan fejti ki: specifikusan a májsejteket
fertőzi, majd az esetek egy részében a krónikus hepatitis talaján hepatocelluláris carcinoma alakul
ki.)
Papillomavírusok
A több mint 100 humán papillomavírus (HPV) -típus komoly orvosi jelentőséggel bír. Epiteliális
sejteket fertőzve egyesek jóindulatú szemölcsök kialakulásához vezetnek, más típusok azonban
anogenitális rákokat okoznak; közülük a leggyakoribb a nők méhnyakrákja (cervix carcinoma).
A cervix carcinoma szexuális úton terjedő betegség: a fertőzés a sérült nyálkahártyán keresztül
történik. A vírus egy specifikus integrint használ receptorként; megkötődik a hám bazális

246
rétegének sejtjein, endocitózissal jut be a sejtbe, majd transzlokálódik a sejtmagba és genomja
integrálódhat a megtámadott sejt DNS-ébe. Nagyon erős bizonyíték a HPV kóroki szerepére, hogy
a vírus-DNS a cervix carcinomák több mint 99 százalékában kimutatható a daganatsejtek
genomjában.
A HPV-genom hasonló az SV40- és
poliomavírusok DNS-éhez, bár azoknál
komplexebb génszerkezetű (53.3. ábra). A
transzformáló géntermékek (E6 és E7 fehérje)
a korai proteinek közé tartoznak, a késői
gének (L1–L2) kapszidfehérjéket kódolnak. Az
onkoproteinek hatásmechanizmusának ta-
nulmányozása kiderítette, hogy az SV40-,
polioma-, adeno- és papillomavírusok közös
támadáspontot használnak a sejt malignus
transzformálásához: a sejtproliferációt féken-
tartó, kulcsfontosságú szabályozó fehérjéket
(a p53 és az Rb tumor szuppresszor fehérjét)
inaktiválják. Ezekkel a fehérjékkel részletesen
később foglalkozunk (l. 56. fejezet). Újabb
adatok szerint a HPV onkoproteinjei zavart
53.3. ábra: A cervix carcinomát okozó HPV-16 idéznek elő a centroszómák duplikációjában
vírus genomjának szerkezete. (E1-E7, a korai is, az így fellépő kromoszóma-
régió termékei; L1-L2, a késői régió termékei; a rendellenességek ugyancsak hozzájárulnak a
nyíl a transzkripció kezdőpontját és írányát malignus daganat kialakulásához (l. 57.
jelzi.) fejezet).

Herpeszvírusok
Nagyméretű (100–200 kb) genommal rendelkező vírusok, több fajtájuk daganatképződést
indukál gerinces gazdaszervezetében. Orvosi szempontból két herpeszvírus jelentős.
Epstein-Barr vírus (EBV). Nagyon elterjedt vírus: az emberek 90 százaléka fertőződik élete
folyamán, többnyire tünetmentesen. Egyes esetekben a vírus akut fertőzést okoz, a B limfociták
proliferációjával, nyirokcsomó-megnagyobbodással, magas lázzal (mononucleosis infectiosa).
Általában gyorsan, következmény nélkül gyógyul. Immunszuppresszált állapotban (pl. maláriás,
AIDS-es betegben) azonban a folyamat malignizálódhat, nyirokeredetű daganat alakulhat ki. Egyik
formája az Afrikában gyakori, de máshol is előforduló Burkitt-lymphoma. A vírus pontos szerepe
a tumor kialakulásában még nem tisztázott. Egyes vírusgének termékei transzformáló hatásúak
lehetnek, de az is elképzelhető, hogy a vírus által kiváltott, fokozott B-sejt proliferáció vezet a
daganatképzésért felelős genetikai léziók kialakulásához (l. 55. fejezet).
Kaposi-sarcomához társuló herpeszvírus. A Kaposi-sarcoma rendkívül ritka bőrdaganat, mely
azonban az AIDS-betegek jelentős hányadában megjelenik a kór késői szakaszában. 1994-ben
írtak le egy herpeszvírust (humán herpeszvírus-8, HHV8), melyet azóta minden Kaposi-
sarcomából származó biopsziában megtaláltak. A vírus genomjában több olyan gént
azonosítottak, melynek terméke felelős lehet a fertőzött sejtek malignus transzformációjáért és a
daganat progressziójáért. Az egyik géntermék angiogén növekedési faktor szekrécióját indukálja;
ez az ágens biztosítja a daganat vaszkularizációját, fokozott vérellátását. Egy másik gén
ciklinfehérjét kódol, ami a vírusfertőzést követő fokozott sejtszaporodásért felelős. A vírusgenom
a Bcl-2 családba tartozó antiapoptotikus hatású fehérjét is kódol. Komoly erőfeszítések folynak az
említett vírusgének pontos szerepének tisztázására, az AIDS ezen végzetes kimenetelű
szövődményének hatásos kezelésére.

247
 54. Daganatbiológia III.: Onkogén RNS-vírusok
Míg a daganatkeltő DNS-vírusok közé különböző, egymással rokonságot nem mutató vírusfajták
tartoznak, az onkogén RNS-vírusok ugyanazon vírusosztály tagjai. Az első RNS tumorvírust
Peyton Rous fedezte fel 1911-ben (a csirkék róla elnevezett Rous sarcoma vírusát). Az 1960-as
években Howard Temin igazolta, hogy a Rous sarcoma vírus RNS-ének replikációja egy DNS-
intermedier közvetítésével történik, majd Temin és David Baltimore azonosították a DNS-kópia
szintézisét végző reverz transzkriptáz enzimet. A fordított információátvitelből származik az
onkogén RNS-vírusok általánosan használt neve: retrovírusok.

A retrovírusok fertőzési ciklusa

A retrovírusok külső burkát a fertőzött sejt
membránjából származó foszfolipid kettős réteg
alkotja, melybe transzmembrán fehérjék (Env
fehérjék) ágyazódnak (54.1. ábra). A nukleokapszidot
két azonos nukleotidszekvenciájú, nagyméretű
genomiális RNS-molekula, strukturális fehérjék (Gag
proteinek) és reverz transzkriptáz molekulák
alkotják.

54.1.ábra: A retrovirusok vírionjának szerkezete

A víruspartikulum megtapad a fertőzött sejt felszínén, burka fuzionál a sejthártyával, a
nukleokapszid pedig bejut a citoplazmába (54.2. ábra). A felszabaduló RNS-genomon, tRNS-
primer segítségével a reverz transzkriptáz kettős láncú DNS-másolatot készít. A bonyolult
szintetikus folyamat eredményeképpen a cDNS két végén azonos szekvenciájú szakaszok, LTR-
szekvenciák képződnek, melyek a vírusfertőzés további lépéseiben döntő szerepet játszanak.
(Nevük az angol long terminal repeat, azaz hosszú láncvégi ismétlődés rövidítése.) A vírus-DNS
bejut a sejtmagba és beépül, integrálódik a celluláris genomba. (Szemben az onkogén DNS-
vírusokkal – melyek esetében a vírusgenom beépülése a fertőzött sejt DNS-ébe nagyon ritka
esemény [l. 53. fejezet] - a provírus-integráció a retrovírusok életciklusának része, minden sikeres
fertőzés során bekövetkezik.) A vírus-cDNS genomba épülését az integráz enzim katalizálja,
melyet a vírusgenom kódol (l. 54.4. ábra). Az integráció helye véletlenszerűen dől el, maga a
folyamat alapvető fontosságú a vírus életciklusában. Az integrálódott vírus-DNS, melyet
provírusnak nevezünk, az LTR-ek végeivel kapcsolódik a gazdasejt DNS-éhez. Mindkét LTR –
hiszen azonos szekvenciájúak – tartalmaz promóter-, enhancer-régiókatés poliadenilációs elemet.
A proximális (upstream) LTR RNS-polimeráz II promóterként, a disztális (downstream) LTR pedig
terminátorként működve a provírus átírását irányíthatja. Rajta a teljes vírusgenomnak megfelelő
RNS-molekulák és rövidebb mRNS-ek is képződnek, érés után kijutnak a citoplazmába és ott
vírionfehérjék szintézisét irányítják. A vírusfehérje prekurzorok proteolítikus hasítását, érését a
vírus saját proteáz enzime végzi. Az Env proteinek beépülnek a sejtmembránba és megkötik a
citoszólban összeszerelt nukleokapszid partikulumokat. Az új vírionok sarjadzással válnak le a
sejtfelszínről. A vírus szaporodását is biztosító fertőzés tehát általában nem pusztítja el a sejtet, a
fertőzés nem lítikus. Ugyanakkor a sejt malignusan transzformálódhat is és a vírustermelést is
folytathatja.
A fertőzés in vitro (szövettenyészeti) és in vivo körülmények között hasonló módon megy végbe.
Nagyritkán előfordul, hogy a provírus-integráció a csírasejtvonal sejtjeiben megy végbe. Ilyenkor
a provírus az utódokra is öröklődhet, és celluláris DNS-szekvenciává válva endogén retrovírusként
elterjedhet a populációban. A gerincesek – beleértve az embert is – számos endogén retrovirális
elemre tettek szert az evolúció során, melyek retrotranszpozonként (l. 15. fejezet) viselkednek a
genomban.

248
 54.2. ábra: A retrovírusok fertőzési ciklusa

Erős és gyenge onkogenitású retrovírusok

Különböző gerinces fajok számos retrovírusát ismerjük. Biológiai viselkedésük alapján ezeket a
vírusokat két nagy csoportba lehet besorolni.
Az erősen onkogén retrovírusok prototípusa a Rous sarcoma vírus (RSV). Csirke bőre alá
fecskendezve ez a vírus 1-2 hetes latenciával sarcomaképződést idéz elő. A tumor poliklonális
jellegű, azaz több, egymástól függetlenül transzformálódott sejtből képződött sejtpopuláció
alkotja. Szövettenyészetben az RSV hatékonyan transzformál csirkesejteket, melyek vírust is
termelnek. Különböző gerinces fajok (pulyka, egér, patkány, macska, majom) több mint 40 erősen
onkogén hatású retrovírusát ismerjük.
A gyenge onkogenitású retrovírusok egyik példája az avián leukaemiavírus (ALV). Az ALV-vel
fertőzött csirkékben hosszú, több hónapos inkubáció után lymphoma alakulhat ki, mely szinte
mindig monoklonális, azaz a daganatsejtek egyetlen transzformált sejt utódai.
Csirkesejttenyészetben a vírus replikálódik, de nem transzformálja azokat. Hasonlóan az erősen
onkogén retrovírusokhoz, a gyenge onkogenitású vírusok is számos gerinces fajban előfordulnak.
Az erősen és gyengén transzformáló retrovírusok eltérő biológiai viselkedése arra utal, hogy
onkogén hatásukat merőben különböző úton érik el, és ez az erősen onkogén vírusok esetében
sokkal hatékonyabb mechanizmus.

249
 Retrovirális onkogének
A fent leírt különbségek molekuláris okait transzformáció-defektív RSV-mutánsok (td-RSV)
tanulmányozásával tisztázták. A td-RSV-mutánsok viselkedése hasonló az avián
leukaemiavíruséhoz: csirke fibroblasztokban replikálódnak, de nem képesek transzformálni
azokat. Genomjuk pedig kb. 1500 nukleotiddal rövidebb mint a vad-típusú RSV-é (vt-RSV).
Logikus volt a feltételezés, hogy ez az RNS-szakasz tartalmazza a transzformációért felelős
információt, a retrovirális onkogént.
Az RSV onkogénjét 1976-ban Michael Bishop és Harold Varmus azonosította (54.3. ábra). Vad-
típusú RSV RNS-én reverz transzkriptáz segítségével egyes láncú, tríciummal jelölt cDNS-
fragmentumokat szintetizáltak, majd ezeket td-RSV RNS-ével hibridizálták. Feltételezték, hogy a
két vírusban közös szekvenciáknak megfelelően RNS·DNS hibridek jönnek létre, a csak a vt-RSV
genomra jellemző – a feltételezett onkogénnel komplementer – cDNS-darabok viszont egyláncú
állapotban maradnak. A kettős láncú hibrideket és az egyláncú cDNS-t hidroxiapatit ioncserélő
kromatográfiával választották szét egymástól. Ilyen módon izoláltak egy, az RSV onkogénjére
specifikus hibridizációs próbát. Meglepetésükre, ez a próba RSV-vel nem fertőzött csirkesejtek, sőt
más gerinces és gerinctelen fajok DNS-ével is hibridizált. A kísérletsorozatban tehát nemcsak az
első retrovirális onkogént, a v-src-t, hanem normális sejtekben jelenlevő celluláris
protoonkogénnek nevezett párját, a c-src-t is felfedezték.

54.3.ábra: Bishop és Varmus kísérlete: a v-src onkogén azonosítása

A vírusgenomok géntérképének, majd szekvenciájának megállapításával kiderült, hogy a gyenge
onkogenitású ALV-genom a kapszidfehérjék gag-, a reverz transzkriptáz pol- és a burokfehérje
env-génjét tartalmazza, míg az RSV-genomban ehhez még az src is csatlakozik (54.4. ábra). Az
erősen onkogén retrovírusok genomjának vizsgálata ezután azt is kideritette, hogy a v-src-génen
kívül közel harminc további retrovirális onkogén is létezik. Ezek különböző biokémiai aktivitással
rendelkeznek (néhány példát az 54.1. táblázat tartalmaz) és valamennyinek létezik protoonkogén
megfelelője. Kiderült az is, hogy az RSV különleges abban az értelemben, hogy tartalmazza a

250
vírusszaporodáshoz szükséges összes gént (gag, pol, env). A legtöbb erősen onkogén hatású
retrovírus defektív: a retrovirális onkogén a genom egy részét helyettesíti. Ezek a vírusok csak
segítő helper-vírus jelenlétében képesek szaporodni, mely szolgáltatja számukra a vírion
felépítéséhez szükséges fehérjéket. Érthető módon ezek a defektív retrovírusok természetes
állatpopulációkban nemigen képesek fennmaradni; laboratóriumi körülmények között, illetve
háziállatokban (pl. macskákban) okoznak inkább daganatokat. Természetes populációkban a
retrovírus-indukált tumorokat jobbára gyenge onkogenitású vírusok okozzák (daganatképző
mechanizmusukkal később foglalkozunk).

54.4. ábra: Az avián leukaemia vírus és a Rous sarcoma vírus provírusának géntérképe

Onkogén Vírusgazda Vírus-indukált tumor Onkoprotein funkció

src csirke sarcoma non-receptor tirozin-proteinkináz

myc csirke myelocytoma, sarcoma, carcinoma transzkripciós faktor

erbA csirke erythroleukaemia, fibrosarcoma transzkripciós faktor

erbB csirke erythroleukaemia, fibrosarcoma receptor tirozin-proteinkináz

jun csirke fibrosarcoma transzkripciós faktor

fos egér osteosarcoma transzkripciós faktor

abl egér leukaemia, sarcoma non-receptor tirozin-proteinkináz

raf egér sarcoma MAPKKK

ras patkány sarcoma, erythroleukaemia Monomer G-protein

sis majom sarcoma PDGF

akt egér lymphoma proteinkináz B

kit macska sarcoma receptor tirozin-proteinkináz

54.1. táblázat: Néhány retrovirális onkogén jellemzői

251
 A retrovirális onkogének eredete
Miután kiderült, hogy minden retrovirális onkogénnek van egy celluláris megfelelője, felmerült a
kérdés: honnan származik ez a homológia, mi a rokonság alapja? A kérdésre egy egér leukaemia
vírustörzzsel kapcsolatos véletlen megfigyelés adott választ (54.5. ábra).

54.5. ábra: Transzdukáló retrovírus képződése (a ∆ gag a részlegesen deletált gag gént jelöli)
Ebben a kísérletben egy gyenge onkogenitású vírustörzzsel, a Moloney egér leukaemia-vírussal
idéztek elő daganatképződést egerekben; a vírus genomjára a klasszikus gag-pol-env
génszerkezet jellemző. Az egyik állatban kifejlődött tumorból meglepetésre olyan vírust izoláltak,
mely erős onkogén-képességre tett szert (Abelson egér leukaemia-vírusnak nevezték el). A vírus
genomja drámaian megváltozott: az eredeti genom nagy része – a gag-gén proximális részének
kivételével – elveszett és helyét egy celluláris gén foglalta el, melyet abl-nek neveztek el. Ezt a
jelenséget – celluláris gén beépítését egy vírusgenomba – a fággenetikából már régóta ismerték
és transzdukciónak nevezték. A virális onkogénnel rendelkező, erősen transzformáló hatású
vírusok tehát transzdukáló retrovírusok.
A részletes molekuláris biológiai vizsgálatok azután a transzdukció mechanizmusát is tisztázták
(54.6. ábra). A Moloney-vírussal beoltott egér egyik fertőzött sejtjében a provírus a c-abl
protoonkogén mellett integrálódott. Ezt követően a gag- gén és a c-abl-gén első exonja közötti
DNS-régió deléciót szenvedett. A létrejött fúziós gén a provírus megmaradt LTR-promóteréről
átíródott, majd splicinggal olyan érett RNS képződött belőle, melynek 5’végi részét a retrovírus
gag-régiója, a 3’-végi szakaszt pedig a maradék c-abl mRNS alkotta. Ezután egy retrovirális RNS-
molekula és a fúziós RNS közötti rekombinációval a gag-abl mRNS 3’-végére is retrovirális
szekvencia került. Ez azért fontos, mert az így képződött vírus által fertőzött sejtben olyan
provírus szintetizálódhat, melynek mindkét végét LTR alkotja, ami, mint tudjuk, szükséges a
hatékony integrációhoz, és így a daganatképződéshez is. A fenti leírásból következik, hogy a
transzdukáló retrovírusok létrejöttéhez három véletlenszerű, nagyon ritka eseménynek kell
egyszerre bekövetkeznie: provírus-integráció egy protoonkogén mellett; deléció; rekombináció.
Érthető, hogy ilyen vírusok nagyon ritkán keletkeznek.

252
 54.6. ábra: Transzdukáló retrovírus genomjának kialakulása

Humán retrovírusok
Egyéb kóroki tényezőkhöz viszonyítva a retrovírusok szerepe az emberi daganatképződésben
elhanyagolható. A humán T-sejtes leukaemiavírus két típusa (HTLV-1 és -2) viszonylag ritka
vérképzőszervi daganatok kialakulásáért tehető felelőssé. Óriási epidemiológiai jelentősége van
viszont a hasonló szerkezetű humán immundeficiencia vírusnak (HIV), amely a rettegett AIDS
kórokozója. Ez a vírus azonban nem daganatkeltő, hanem lítikus fertőzést okoz: egy bizonyos T-
sejt-populációt pusztít el, ami az immunrendszer összeomlásához vezet. A kialakult
immunszuppresszált állapot kedvez másodlagos daganatok kifejlődésének (l. az 53. fejezetet),
ezeket azonban nem a HIV okozza.
Orvosi jelentősége lehet a humán endogén retrovírusoknak is. Ezek nem fertőzőek, sőt, általában
át sem íródnak. Abnormális expressziójuk azonban autoantitestek képzését indukálhatja. Az
autoimmun betegségek közül a systemás lupus erythematosus (l. a 26. fejezetet is) és a
nyálmirigyek, valamint a könnymirigy krónikus gyulladásával járó Sjögren-szindróma
kóroktanában feltételezik az endogén retrovirális részvételt.

253
 55. Daganatbiológia IV.: Celluláris onkogének
A daganatok mutációs eredete széles körben elfogadott, tudományosan bizonyított tény. Mint az
előző fejezetekből láttuk, az esetek egy részében a sejt változását az okozza, hogy onkogén vírus
transzformáló génje integrálódik genomjába, annak terméke pedig daganatos sejtburjánzást idéz
elő. A daganatok nagyobbik hányadában azonban a vírusetiológia nem mutatható ki, virális
onkogén nem kerülhetett a genomba. Mi lehet ezekben az esetekben a mutáció következménye?
Milyen géneket érinthet? Átvihető-e a transzformált fenotípus a daganatsejt DNS-ével normális
sejtekre is? Az utolsó kérdésre az Avery baktérium-transzformációs kísérleteihez (l. 2. fejezet)
hasonló DNS-átviteli kutatások adták meg a választ.
Onkogének keresése transzfekciós kísérletekkel
Tisztított DNS-t eukariota sejtekbe is be lehet juttatni (l. 11. fejezet). A génbeviteli módszerek
közül a legegyszerűbb a transzfekció: megfelelő kísérleti körülmények között DNS-sel kezelt
szövettenyészeti sejtek egy része felveszi, genomjába integrálja és expresszálhatja is az idegen
géneket.
Az első sikeres transzfekciós kísérleteket az 1970-es évek elején hajtották végre: RSV-
transzformált sejtek genomiális DNS-ével normális csirkesejteket transzformáltak és a sejtek
vírust is termeltek. A kísérlet igazolta, hogy a fertőzött sejt DNS-e provírus formájában
tartalmazza az RSV teljes genetikai információját. A transzfekciós kísérleteket Robert Weinberg
és Geoffrey Cooper fejlesztették tovább. Kémiai karcinogénnel transzformált sejtek DNS-ével
sikerült átvinniük a transzformált fenotípust NIH3T3 egér fibroblaszt sejtekre, igazolva, hogy
onkogének nonvirális eredetű daganatokban is jelen vannak. A legfontosabb kérdés
megválaszolása még hátra volt: vannak-e onkogének természetes körülmények között kifejlődő
emberi daganatokban?
Az első emberi onkogén felfedezése
Az első nonvirális eredetű, humán celluláris onkogént egy emberi hólyagtumor sejtvonal DNS-
ében azonosították. Az ezt követő nagyszabású transzfekciós kísérletsorozatokban azt találták,
hogy az összes humán neoplasia mintegy 20–30 százalékában mutatható ki géntranszferrel
onkogén szekvencia.
A hólyagtumor sejtvonal onkogénjének klónozását 1982-ben hajtották végre Weinberg, Mariano
Barbacid és Michael Wigler munkacsoportjai. A klónozási stratégiát az 55.1. ábra mutatja. A
munka fő nehézségét az okozta, hogy az akkor még ismeretlen onkogént több milliárd bázispárnyi
DNS-ben kellett megtalálni. Ehhez a keresett gén két tulajdonságát használták fel: egy biológiait
(transzformáló-képesség) és egy genetikait (közelében lennie kell specifikus humán Alu-
szekvenciáknak). A hólyagtumor DNS-sel egy a sejtbiológiai kutatásokban gyakran használt
sejtvonalat, NIH3T3 egér fibroblasztokat transzfektáltak. Ilyenkor a DNS darabolódva jut be a
sejtekbe és véletlenszerűen néhány helyen integrálódik. A működő onkogént felvevő sejtek
transzformálódnak, utódaik fókuszokat alkotnak. A transzformált sejtek DNS-e valószínűleg
onkogént nem tartalmazó humán DNS-régiókat is tartalmaz; hogy ezektől megszabaduljanak, egy
második transzfekciót is végrehajtottak. A transzformált fókuszok DNS-ében ilyenkor nagy
valószínűséggel már csak egy humán DNS-darab van: ez tartalmazza a humán onkogént és –
szerencsés esetben – Alu-szekvenciát is. Ha a második transzformáns DNS-éből genomtárat
hoznak létre és abban olyan rekombináns fágot találnak, amely humán Alu-próbával hibridizál, az
nagy valószínűséggel az emberi onkogént is tartalmazza. A stratégia sikeres volt: a gén
szekvenciájának meghatározásakor kiderült, hogy egy ras-génről (rasH) van szó, mely a
protoonkogén párjától egyetlen bázispárban különbözik. Később tisztázták, hogy a pontmutáció
következményeképpen a celluláris onkogéntermék Ras-fehérje elveszti GTPáz-aktivitását,
képtelen önmagát inaktiválni: konstitutívan aktív állapotba kerülve daganatos sejtproliferációt
indukál.

254
 55.1. ábra: Az első humán onkogén klónozása
Az első humán onkogén azonosítása a daganatkutatás egyik kiemelkedő felfedezése volt. Ezt
követően rövid idő alatt számos emberi onkogént izoláltak és jellemeztek; az 54.1. táblázat ezek
közül tartalmaz néhányat. Szembetűnő, hogy a celluláris onkogének egy részének van retrovirális

255
megfelelője, másokat azonban eddig csak nonvirális eredetű daganatokban találtak meg. A kódolt
fehérjék valamilyen módon a sejtek jelátviteli folyamatainak, sejtciklusának, apoptózisának
szabályozásában vesznek részt (a részleteket l. később). Kitűnik az is, hogy egyes onkogének
különböző típusú daganatok kialakulásáért lehetnek felelősek, és fordítva: ugyanazt a tumort
különböző celluláris onkogének okozhatják.

Az onkogén-aktiváció mechanizmusai
Az 55.1. táblázat adataiból kiderül, hogy a celluláris onkogének kialakulásának többféle
molekuláris mechanizmusa lehetséges: pontmutáció, transzlokáció, deléció, génamplifikáció,
inszerciós onkogén-aktiváció.
Pontmutáció
A géntranszferrel kimutatható humán onkogének döntő többsége pontmutációval aktivált ras-
gén: az összes daganat mintegy 20–25 százalékában mutattak ki ras-mutációt. A mutáció
következtében a Ras-fehérje konstitutívan GTP-kötő állapotba kerül és folyamatosan küld
mitogén szignálokat a sejt belsejébe. Az emlős sejtek háromféle ras-génje közül kettő (a rasH és
rasK) retrovirális megfelelője transzdukáló vírusban is jelen van, a rasN-génnek azonban csak
celluláris fajtája létezik.
Más gének is aktiválódhatnak pontmutációval. A neu-gén az EGF-receptor családba tartozó
tirozinkinázt kódol. (Ennek a génnek több neve is van. A HER2 név arra utal, hogy terméke a
humán EGF-receptor család tagja. Mivel ez utóbbi nevén emlegetik az emlőtumorokkal
kapcsolatban [l. később], a továbbiakban a neu/HER2 elnevezést használjuk.) A gsp-, illetve a gip-
gén aktivációja a cAMP-út zavarát idézi elő. A gsp (Gs-protein α-subunit génje) aktivációja olyan
szövetek malignus átalakulását idézi elő, melyekben a cAMP sejtproliferációt okoz, míg a gip (Gi-
protein α-alegység génje) mutációja olyanokban, melyekben a cAMP gátolja a sejtszaporodást.
Inszerciós mutagenezis
A gyenge onkogenitású retrovírusok virális
onkogénnel nem rendelkeznek (l. 54. fejezet).
Akkor hogyan okoznak daganatképződést? A
kérdésre a választ az avián leukaemiavírus által
okozott lymphomák molekuláris analízise adta
meg.
Az ALV-fertőzés során a csirkében
elszaporodik a vírus, nagyon sok
vérképzőszervi sejtet megfertőz, és a fertőzés
során provírusa beépül a sejt genomjába. Mint
ahogy az más retrovírusok esetében is
történik, az ALV-provírus véletlenszerűen
integrálódik a fertőzött sejt genomjába. Az
ALV által indukált lymphomákban azonban a
provírus-integráció mindig ugyanazon a
helyen történik. Másképpen fogalmazva: a
számtalan lehetséges integrációs esemény
közül csak az okoz malignus transzformációt,
mely a genom meghatározott helyén megy
végbe. A daganatképződés szempontjából 55.2. ábra: A c-myc protoonkogén inszerciós
nyilvánvalóan lényeges, milyen celluláris gént aktiválódása ALV-fertőzést követően, (E1, E2,
érint ez a mutációs esemény. E3: a c-myc gén exonjai)

256
 Jelenléte Jelenléte nonvirális Aktiváció
Onkogén Onkoprotein funkció
retrovírusban daganatban mechanizmusa

receptor tirozin- amplifikáció

neu/HER2 – neuroblastoma
proteinkináz pontmutáció

hipofízis és pajzsmirigy
gsp –
daganatok
Gs-protein α-alegysége pontmutáció

mellékvese-kéreg és
gip –
petefészek daganatok
Gi-protein α-alegysége pontmutáció

Harvey patkány pajzsmirigy, hólyag, bőr

ras H sarcoma vírus stb. daganatok
monomer G-protein pontmutáció

vastagbél, tüdő,
Kirsten patkány
ras K sarcoma vírus
pankreász stb. monomer G-protein pontmutáció
daganatok

neuroblastoma,
ras N –
leukaemiák stb.
monomer G-protein pontmutáció

Abelson egér krónikus myeloid nonreceptor tirozin-

abl leukaemia vírus leukaemia proteinkináz
transzlokáció

avián
Burkitt-lymphoma, transzlokáció
myc myelocytomatosis
emlő-, tüdő- carcinoma
transzkripciós faktor
amplifikáció
vírus

N-myc – neuroblastoma transzkripciós faktor amplifikáció

follicularis B-sejtes
bcl-2 –
lymphoma
antiapoptotikus fehérje transzlokáció

homeotikus fehérje
hox-11 – akut T-sejtes leukaemia
(transzkripciós faktor)
transzlokáció

mellékpajzs-mirigy
PRAD1 –
adenoma
ciklin D transzlokáció

avián
receptor tirozin-
erbB1 erythroblastosis glioblastoma
proteinkináz
deléció
virus

55.1. táblázat: Néhány humán celluláris onkogén jellemzői

Az ALV esetében ez egy transzkripciós faktort kódoló protoonkogén, a c-myc (55.2. ábra). Ez a gén
növekedési faktorok (és más mitogén ágensek) által is hatásosan indukálható, nyilvánvalóan
fontos szerepe van a normális sejtproliferáció szabályozásában. Az ALV-fertőzés akkor vezet
lymphomaképződéshez, ha a provírus integrációja a c-myc gén 1. és 2. exonja között történik. Ha
ezt követően a c-myc-gén 1. exonja és a provírus nagy része deléciót szenved, olyan gén keletkezik,
mely a c-myc eredeti, szabályozható promótere helyett a provírus erős, konstitutív promóteréről
íródik át. Mivel az E1 exon kódoló szekvenciát nem tartalmaz, a génen képződő mRNS normális
Myc-fehérje szintézisét irányítja. A malignus transzformáció annak köszönhető, hogy az érintett
gén expressziója a fiziológiás érték több százszorosát is elérheti.
A későbbi, részletes kutatások kiderítették, hogy a leírt inszerciós mutagenezis a gyenge
onkogenitású retrovírusok általános tumorkeltő mechanizmusa. Több protoonkogént éppen a
provírus-integrációs helyek környezetének analízisével fedeztek fel (pl. a Wnt-1 növekedési
faktort kódoló gént [l. 47. fejezet]).

257
Transzlokáció
A daganatsejtekben megjelenő kromoszóma-rendellenességek (aneuploidia, strukturális
aberrációk) régóta ismertek voltak. Ezek közül a legismertebb a krónikus myeloid leukaemiában
1960-ban felfedezett Philadelphia-kromoszóma (Ph1): abnormálisan kisméretű 22. kromoszóma.
Mivel a rendellenesség gyakorlatilag minden beteg leukeamiás sejtjeiben kimutatható, kezdettől
fogva gyanították, hogy kóroki szerepe van a daganatképződésben. A molekuláris biológiai
vizsgálatok megerősítették a feltevést.
A kromoszóma-rendellenességet valójában a 9. és a 22. kromoszóma között lezajló reciprok
transzlokáció okozza (55.3.A. ábra): mindkét kromoszóma eltörik és a levált részek kicserélődve
a másik kromoszómára forrnak vissza. A 9. kromoszómán a törés a már korábban is említett c-abl
protoonkogénben történik (55.3.B. ábra). A 22. kromoszómán az érintett régiót éppen a törések
halmozódásáról nevezték el bcr-génnek (= breakpoint cluster region). A transzlokáció
következtében létrejövő Ph1-kromoszómán fúziós gén keletkezik, melynek proximális részét a
bcr, disztális régióját pedig az abl-gén egy része alkotja. Az abnormális génen fúziós mRNS, azon
pedig fúziós fehérje (Bcr/Abl) képződik, mely fokozott, konstitutív biokémiai aktivitásával
leukaemogén hatású.

55.3. ábra: A Philadelphia-kromoszóma (A.) és a bcr/abl fúziós gén, (B.) létrejötte reciprok
transzlokációval

258
Hasonló reciprok transzlokációt írtak le a Burkitt-lymphoma esetek többségében. A B-
limfocitákban lezajló transzlokáció következtében a c-myc protoonkogén promótere egy
immunglobulin-gén promóterére cserélődik, a c-Myc fehérje fokozott mértékben és
szabályozatlanul termelődik. A betegség kialakulásában az Epstein-Barr vírus is szerepet játszik
(l. 53. fejezet): fokozott B-sejt-szaporodást vált ki, ami megnöveli a transzlokációs esemény
esélyét.
A transzlokáció gyakori onkogénaktivációs mechanizmus, különösen a B- és T-limfociták
malignus folyamataiban. (A különböző emberi daganatokban eddig több mint 600-féle
transzlokációt mutattak ki.) A normális immunválasz alapját ugyanis az ezekben a sejtekben
fiziológiás körülmények között is végbemenő DNS-átrendeződések képezik. A génátrendeződés
növeli a strukturális kromoszóma-rendellenességek kialakulásának veszélyét. Számos onkogént
azonosítottak transzlokációs töréspontok analízisével. Ezek gyakran transzkripciós faktorok
génjei: leukaemiában, lymphomákban gyakran aktiválódnak homeotikus gének vagy az ezeket
szabályozó fehérjék génjei; termékeik ugyanis kulcsszerepet játszanak a fehérvérsejtek érésében.
Transzlokációs töréspont vizsgálatával fedezték fel az antiapoptotikus hatású bcl-2 onkogént is (l.
51. fejezet), melynek fokozott expressziója folliculáris B-sejtes lymphomát okoz.
A leukaemiák, lymphomák mintegy kétharmadában kimutatható transzlokáció. A pontos
molekuláris mechanizmus kiderítése diagnosztikus, prognosztikus és a terápiát is meghatározó
jelentőségű. (Egy példa: gyermekkori akut leukaemiák egy típusában a retinsavreceptorokból
leukemogén hatású fúziós fehérje alakul ki. Ha ez kimutatható a kóros sejtekben, a retinsavkezelés
várhatóan jótékony hatású lesz, egyébként viszont hatástalan és értelmetlen.)
Deléció
A deléciós protoonkogén-aktivációra egyes glioblastoma daganatok szolgáltatnak példát. Ebben
az agytumorban gyakori egy EGF-receptor extracelluláris, ligandkötő doménjének deléciós
csonkolódása. A mutáns receptor konformációja úgy változik meg, hogy tirozinkináz doménje
ligand hiányában is aktív.
Génamplifikáció
A gének sokszorozódása abnormális replikáció eredménye: egy DNS-régió az S-fázisban
„tévedésből” többször megkettőződik, majd átrendeződéssel a régió tandem ismétlődése jön létre
(55.4.A. ábra). A sokszorozódás általában nagyobb, többmillió bázispár kiterjedésű régiót
(amplikon) érint, mely több gént is tartalmazhat. Ilyenkor az amplifikáció kariotípus-vizsgálattal
is kimutatható (55.4.B. ábra): sávtechnikával homogén festődésű régióként jelenik meg, illetve
extrakromoszomális formában is létezhet, kettős szemcsék, ún. kettős parányok formájában.
Az amplifikáció legismertebb példája az N-myc gén sokszorozódása neuroblastomában, de más
gének (pl. c-myc, neu) kópiaszáma is megnőhet különböző daganatokban. A tumor kialakulását a
normálisnál nagyobb mennyiségű géntermék okozza. Érthető módon az amplifikáció mértéke
(azaz a génkópiák száma) arányos a malignitás fokával, így prognosztikus értékű.

259
 55.4. ábra: A génamplifikáció mechanizmusa (A.) és kromoszomális megjelenési formái (B.)

Celluláris onkogének, a daganatterápia célpontjai

A hagyományos daganatterápia (kemoterápia, radioterápia) a tumorsejtek gyors
osztódóképességét használja ki: cél a sejtosztódás gátlása vagy DNS-károsító hatással apoptózis
indukálása. A terápia hatékony lehet, de a normálisan is gyorsan szaporodó szövetek (bélhám,
csontvelő) károsodása miatt a kezelést súlyos toxikus mellékhatások kísérik.
A célzott tumorterápia a daganatképzéshez vezető aktivált jelátviteli utat támadja meg, hatása
szelektív, mellékhatásai enyhébbek. Az onkoproteinek hatásmechanizmusának tisztázása mind
tágabb teret nyit a racionális gyógyszertervezés számára: jelenleg is több onkoprotein-specifikus
szer van a klinikai kipróbálás stádiumában, az engedélyezett szerek közül pedig az első két
sikertöténetet a Herceptin és a Glivec szolgáltatta.
Az emberi emlő tumorok mintegy negyedében a daganatsejtekben fokozottan expresszálódik az
EGF-receptor családba tartozó Neu/HER2 fehérje (l. előbb). Ezekben a sejtekben konstitutív
NFκB-aktiváció és a normálisnál magasabb ciklin D1 szint mutatható ki. A HER2-gén
amplifikációja rossz klinikai prognózist jelent. A Herceptin monoklonális anti-HER2 antitest,
melyet sikeresen alkalmaznak ennek a metasztatizáló emlőtumor típusnak a kezelésében.
Még reményt keltőbb szer a Glivec, egy Abl-specifikus tirozinkináz inhibitor. A CML-t (l. előbb)
okozó Bcr/Abl fúziós fehérje több jelátviteli utat is aktivál a leukaemiás sejtekben (Ras/ERK-út,
PI3K/PKB-út, STAT-fehérjék, stb.), proliferációs és anti-apoptotikus hatást eredményezve. A
betegség korai szakaszában adva a Glivec szelektíven elpusztítja a leukaemiás sejteket, a betegek
95%-ában javulást, remissziót idézve elő. Bár egyes betegekben később ezzel a szerrel szemben
is kialakul rezisztencia, a Glivec példája mutatja, hogy az onkogénkutatás nagyhatású
kemoterápiás szerek kifejlesztéséhez vezethet.

260
 56. Daganatbiológia V.: Tumor szuppresszor gének
Az emberi daganatokból izolált DNS-minták transzfekciós vizsgálatai (l. 55. fejezet) az esetek 25–
30 százalékában adtak pozitív eredményt; a tumorok többségében ezzel a módszerrel
onkogéneket kimutatni nem sikerült. A transzfekciós kísérletekben kimutatott celluláris
onkogénekre jellemző, hogy a DNS-t felvevő NIH3T3 sejteket a bennük levő normális
protoonkogén alléleket elnyomva transzformálták. A celluláris onkogének tehát a
protoonkogének domináns hatású, hiperaktív formái, melyek proliferációt serkentő fehérjéket
kódolnak. Ha a daganatok 70–75 százaléka ilyen gént nem tartalmaz, mi okozza ezek malignus
fenotípusát?

A tumor szuppresszor gének létének kimutatása sejtfúziós

kísérletekkel
Normális és malignus sejtek hibridjei (l. 18. fejezet) általában nem tumorigén sejtek: érzékeny
egerekbe fecskendezve daganatképződést nem idéznek elő. Ha a hibrid sejteket tenyésztik, a
tumorigenitás az utódsejtek egy részében visszatérhet, ezt pedig a normális sejtekből származó
egyes kromoszómák elvesztése kíséri. A sejtfúziós kísérletek eredményeiből arra lehet
következtetni, hogy a normális sejtekben vannak olyan gének, melyek elnyomják a tumorsejtek
transzformációjáért felelős gének hatását; ezek az onkogének tehát recesszívek, hatásuk csak
akkor érvényesül, ha a sejt elveszíti a normális alléleket. Két különböző tumorsejtvonal fúziója
esetén is tapasztalták a tumorigenitás elvesztését: ez azt jelenti, hogy többféle recesszív onkogén
létezik.
A recesszív onkogének normális, vad típusú alléljeinek funkciója tehát az, hogy meggátolja a sejtek
malignus proliferációját, nevük ebből a hatásból származik: tumor szuppresszor gének. Ezt
többféle mechanizmussal érhetik el: a sejtek G0-fázisba vitelével, terminális differenciáció
indukálásával, apoptózis kiváltásával. Szemben a protoonkogénekkel (melyek funkciónyerő
mutációval válnak celluláris onkogénekké), akkor okoznak daganatképződést, ha funkcióvesztő
mutációval mindkét kópiájuk inaktiválódik.
A tumor szuppresszor gének kutatása az 1980-as évek közepétől gyorsult fel. Mint azóta kiderült:
az emberi daganatképződés szempontjából fontosabbak mint az onkogének: míg az onkogén-
aktiváció elsősorban a leukaemiák, lymphomák kialakulásáért felelős, a többi daganatban a tumor
szuppresszor gének mutációi dominálnak.

Az első humán tumor szuppresszor gén klónozása

A retinoblastoma ritka gyermekkori, a szem ideghártyájából fejlődő daganat, melynek két típusa
ismert. A ritkább örökletes forma egészen korán, csecsemőkorban jelentkezik, mindkét szemben,
több gócban megjelenő tumor formájában. Családi halmozódást mutat, monogénikus
autoszomális domináns öröklődéssel. A heterozigóta egyedekben 95 százalékos valószínűséggel
fejlődnek ki a szemdaganatok. A sporadikus retinoblastoma családi halmozódást nem mutat,
általában később jelenik meg, az egyik szem egyetlen tumora formájában.
A kétféle – szövettanilag egyébként megkülönböztethetetlen – alak kialakulására vonatkozóan
Alfred Knudson 1971-ben állította fel két találat hipotézisét. A statisztikai adatok matematikai
elemzésével arra a következtetésre jutott, hogy a retinoblastomát két egymástól független
mutációs esemény okozza. A familiáris forma esetében az egyik csírasejt-mutáció (azaz az egyed
minden sejtjében jelen van), a második mutáció pedig az ideghártya fejlődése során szomatikus
mutációval több retinoblasztban is létrejön. A sporadikus típus esetében mindkét mutáció
szomatikus: annak valószínűsége, hogy ugyanabban a retinoblasztban jönnek létre, csekély; ez
megmagyarázza a daganat egygócú jellegét.

261
Citogenetikai vizsgálatok később bizonyítékokat adtak a Knudson-elmélethez és az érintett gének
kromoszomális lokalizációjára is információt szolgáltattak. Öröklődő retinoblastomában
szenvedő gyermekek fehérvérsejtjeiben néha megfigyelték a 13. kromoszóma egy régiójának
delécióját. Ezt a kromoszóma-elváltozást a sporadikus esetekben csak a tumorsejtekben észlelték,
ami a mutáció szomatikus jellegét igazolta. A tumor szuppresszor gének inaktivációját egyébként
nemcsak mutáció, hanem epigenetikai tényezők (l. 31. fejezet) is okozhatják: promóter régiójuk
CpG szigeteinek hipermetilációja a gének csökkent működéséhez vezet, gyakran mutatható ki
daganatokban.
A hozzávetőleges kromoszóma-lokalizáció ismeretében 1986-ban Robert Weinberg (aki az első
celluláris onkogén klónozásában is részt vett) munkacsoportja a pozíciós klónozás módszerét
alkalmazva azonosította és izolálta a humán retinoblastoma (Rb) gént. A hibridizációs próba
birtokában végzett Southern-blot vizsgálatok teljes mértékben igazolták a Knudson-teóriát:
herediter retinoblastomás gyermekek fehérvérsejtjeiben az Rb-génpár egyik tagja deletált, a
másik érintetlen, a tumorsejtekben azonban, függetlenül attól, hogy a betegség milyen formájából
származnak, nincs működőképes Rb-gén. Hogy valóban tumor szuppresszor génről van szó,
később transzfekciós kísérlettel igazolták: az Rb-cDNS bejuttatása retinoblastoma sejtekbe
megszüntette azok tumorigenitását (56.1. ábra). A kísérletben veleszületett immundeficienciában
szenvedő kopasz egér törzset használtak. Mivel ezek az állatok normális immunvédekezésre
képtelenek, a daganatsejtek gyorsan szaporodnak bennük.

56.1. ábra: Az Rb-gén tumor szuppresszor hatásának bizonyítása kopasz egerekben

Paradoxnak tűnhet, hogy míg a tumor szuppresszor gének – így az Rb-gén is – recesszív
onkogének, a retinoblastoma dominánsan öröklődik. Az ellentmondás látszólagos: sejtszinten a
transzformáció recesszív öröklődésű: létrejöttéhez a génpár mindkét tagjának funkcióvesztése
szükséges. Mivel a második, szomatikus mutáció nagy valószínűséggel létrejön néhány
retinasejtben, a heterozigótákban majdnem biztosan kifejlődnek a tumorok: a szervezet szintjén
az öröklődés domináns.

Tumor szuppresszor gének és szerepük az emberi

daganatképződésben
Az Rb-gén klónozása (1986) óta mintegy három tucat humán tumor szuppresszor gént
azonosítottak és ez a szám minden bizonnyal még nőni fog. Ebben a fejezetben legjelentősebb
képviselőikkel foglalkozunk; fontosabb jellemzőiket az 56.1. táblázat foglalja össze.

262
 Gén Öröklődő tumor Szomatikus mutáció A géntermék
funkciója
retinoblastoma, transzkripció
Rb különböző tumorok
osteosarcoma szabályozása
multiplex tumorok (Li-
p53 sokféle tumor transzkripciós faktor
Fraumeni szindróma)

p16 familiáris melanoma többféle tumor Cdk-inhibitor

familiáris adenomatosus sejtadhéziós és
APC colorectális tumorok
polyposis jelátviteli fehérje
Wilms-tumor transzkripció és
WT1 Sporadikus Wilms-tumor
(nephroblastoma) splicing szabályozása
von Recklinghausen-kór
NF1 többféle tumor Ras-GAP
(neurofibromatosis)
sejtciklus szabályozása,
BRCA1 familiáris emlőtumor ovárium tumor
DNS-reparáció
sejtciklus szabályozása,
BRCA2 familiáris emlőtumor többféle tumor
DNS-reparáció
többféle tumor
gyakori emlő-, pajzsmirigy foszfatidilinozitol 3-
PTEN (glioblastoma,
tumor foszfatáz
prosztatarák, emlőrák, stb.)
Von Hippel-Lindau
VHL vesecarcinoma ubikvitináló fehérje
szindróma

56.1. táblázat: A legfontosabb tumor szuppresszor gének jellemzői

Rb
Az Rb-gén terméke minden szövetben expresszálódó, létfontos magfehérje. (A mindkét Rb-
génjüket elvesztettRb–/– nullizigóta egerek életképtelenek.) Szokás a restrikciós pont (l. 18.
fejezet) őrének is nevezni: aktivitásával megakadályozza, hogy a sejt átjusson ezen a kritikus
szabályozási ponton és végigmenjen a sejtcikluson. Nyugalmi, G0-fázisú sejtekben az Rb-fehérje
gyengén foszforilált; ebben a formájában erősen kötődik az E2F transzkripciós faktor család egyes
tagjaihoz és inaktiválja azokat (56.2.B. ábra). Mitogén hatásra a Ras/ERK jelátviteli út
közvetítésével ciklin/Cdk-komplexek aktiválódnak (l. 18. fejezet) és többek között az Rb-fehérjét
is foszforilálják. A hiperfoszforilált Rb-proteinről felszabadul az E2F transzkripciós faktor és több
olyan gént (ún. S-fázis géneket) aktivál, melynek terméke (pl. bizonyos ciklinek, DNS-polimeráz
alegységek, c-Myc fehérje) szükséges a G1 → S átmenet indukciójához. Az Rb-funkció kiesése tehát
érthető módon tumoros sejtburjánzáshoz vezet (pl. a retinoblastoma, osteosarcoma esetében)
vagy más mutációkkal együtt járul hozzá sok más daganat kifejlődéséhez. Az Rb-fehérje
inaktiválásán keresztül fejti ki transzformáló hatását több onkogén DNS-vírus (SV40-, polioma-,
adenovírus, papillomavírusok) egyes onkoproteinjei is (l. 53. fejezet).

263
 56.2. ábra: A p53/Rb-út. A: A p53-fehérje hatása a sejtciklusra; B: Az Rb-fehérje
hatásmechanizmusa

p53
A p53-fehérje nevét molekulatömegéről kapta. 1979 óta ismert, jelentőségét azonban csak az
1990-es években ismerték fel. Ekkor derült ki ugyanis, hogy az emberi daganatok több mint fele
mutáns p53-gént tartalmaz! A Knudson-mechanizmusnak megfelelően autoszomális domináns
öröklődést mutató Li-Fraumeni-szindróma szerencsére nagyon ritka betegség; a különböző
szervekben kifejlődő sokféle daganat jellemzi. A p53-fehérje klasszikus tumor szuppresszor
fehérje: p53- daganatsejtekben expresszálva megszünteti azok tumorigenitását.
Az elmúlt években sok mindent kiderítettek a p53-fehérje biokémiájáról. Ubikviter expressziójú
transzkripciós faktor, melynek szintje növekedési faktorral stimulált sejtekben nagyon alacsony.
Ezért egy protoonkogén hatású fehérje, az Mdm2 felelős (56.3. ábra; nevét a mouse double minute
kifejezésből kapta: egér sejtekben azonosították amplifikált génjét kettős parányok formájában [l.
55. fejezet]). A növekedési faktor jelátviteli utak az Mdm2 fehérjét indukálják és foszforilációval
aktiválják is. Ez a fehérje egy p53-ubikvitináló enzim, hatására a p53-fehérje gyorsan lebomlik.
Génjét ugyanakkor a p53 transzkripciós faktor is indukálni képes, így a két fehérje negatív
feedback mechanizmussal szabályozza egymást.
A p53-fehérje mennyisége akkor nő meg a sejtben, ha azt a sejtszaporodást gátló stresszhatások
érik. Ezek közül a legfontosabbnak a DNS károsodása látszik. A DNS-ben sugárzás, kémiai
anyagok hatására létrejött sérüléseket speciális fehérjék ismerik fel (56.3. ábra), majd hatásukra
megnő a p53-fehérje mennyisége, részben foszforiláció, részben fehérje-fehérje kölcsönhatások
közvetítésével. A DNS-károsodás mértékétől függően a p53 két különböző utat nyithat meg a sejt
számára a krízishelyzetből való „menekülésre”. Enyhe károsodás esetén leállítja a sejtciklust,
elsősorban azáltal, hogy serkenti egy Cdk-inhibitor génjének átírását (56.2.A. ábra): csökken az
Rb-fehérje foszforilációja és így az S-fázis gének működése is. A sejt mindaddig G0-fázisban marad,
amíg a DNS-károsodást ki nem javítja; ebben segít, hogy a p53 a DNS-reparáció néhány génjét is
indukálja (56.3. ábra). Ha a DNS-károsodás olyan súlyos, hogy nincs remény a kijavítására, a p53
– elsősorban pro-apoptotikus gének indukciójával – apoptózist idéz elő.

264
 56.3. ábra: A p53-fehérje szabályozása és effektor mechanizmusai
A p53-fehérje mindkét hatása a genom integritásának megőrzését szolgálja. Ha ez a funkció elvész,
a sejtben mutációk halmozódnak fel, genetikai instabilitás lép fel. A daganatok elleni sugárkezelés
és kemoterápia célpontja általában a sejt DNS-e: normális p53-funkció esetén a kezelt sejtek vagy
elpusztulnak, vagy osztódásuk gátlódik. A klinikai tapasztalatok szerint a p53+ tumorok általában
jól reagálnak a kezelésre. Ha azonban a tumor progressziójával p53-gén mutáció jön létre, a
daganatsejtek nemcsak rezisztenssé válnak a kezeléssel szemben, hanem éppen a terápiás
próbálkozások hatására további mutációkat halmoznak fel és a daganat egyre agresszívebbé,
malignusabbá válik.
Az Rb-fehérjéhez hasonlóan a p53-protein szerepet játszik a virális onkogenezisben is: DNS
tumorvírusok egyes onkoproteinjei a p53-fehérje inaktiválásán keresztül fejtik ki transzformáló
hatásukat.
Cdk-inhibitorok
Több fehérjét azonosítottak, melyek különböző ciklin/Cdk-komplexeket gátolva le tudják állítani
a sejtciklust. Közülük a p16-fehérje bizonyítottan tumor szuppresszor hatású: génjének öröklődő
mutációja familiáris melanomát okoz; gyakoriak a p16-mutációk sporadikus melanomában, a
hasnyálmirigy, a vese, a tüdő daganataiban is.

265
APC
Az APC-gén (= adenomatosus polyposis coli) mutációjára heterozigóta egyedek vastagbelében
több száz kisméretű, jóindulatú daganat, polip fejlődik; a daganatsejtek DNS-e a másik APC-gént
is elvesztette (Knudson-mechanizmus). További genetikai léziók malignus sejtburjánzáshoz
vezetnek (l. 57. fejezet); az APC-gén mutációja tehát colorectális daganatok fontos, korai
eseménye. A gén terméke citoplazmatikus fehérje, mely az epiteliális sejtek adhézióját és
jelátviteli folyamatait is szabályozza. Az APC-fehérje a Wnt jelátviteli út fontos alkotórésze (l. 47.5.
ábra): hiányában a szolubilis β-katenin szintje megnő a sejtben, mely a sejtmagba transzlokálódva
sejtosztódást serkentő gének indukciójában vesz részt.
WT1
A Wilms-tumor ritka gyermekkori vesedaganat. Örökletes formája kétoldali, a sporadikus tumor
egyoldali, egygócú. A tumorsejtekben kimutatható a WT1-gén mindkét kópiájának deléciója. A
gén terméke cinkujj-doménnel rendelkező transzkripciós és splicing faktor. Kizárólag az
urogenitális rendszer sejtjeiben expresszálódik, nélkülözhetetlen a glomerulusok kifejlődésében.
NF1
A von Recklinghausen neurofibromatosis viszonylag gyakori, autoszomális domináns öröklődésű
kórkép. Fő tünete a bőr alatti neurofibromák kialakulása testszerte; malignizálódva ezek
neurofibrosarcomává alakulhatnak át. Az NF1-gén fehérjeterméke (neurofibromin) GTP-áz
aktiváló protein: hiányában az érintett szövetekben a Ras-fehérje konstitutívan aktív állapotba
kerül és folyamatosan serkenti a mitogén jelátvitelt közvetítő ERK-kaszkádot (l. 46. fejezet).
BRCA1 és BRCA2
Az emlőrák egyike a leggyakoribb rosszindulatú daganatoknak, így érthető, hogy
patomechanizmusának tisztázására óriási erőfeszítések történnek. Az 1990-es évek közepén
klónoztak két gént (BRCA1 és 2 az angol breast cancer kifejezésből), melyek csírasejt mutációja
felelős az összes emlőtumor-esetek mintegy 10 százalékát kitevő familiáris emlőrák és petefészek
daganat kialakulásáért. A gének nagyméretű fehérjéket kódolnak, pontos szerepük tisztázása
jelenleg is folyik. A két fehérje nincs rokonságban egymással, de a legújabb kutatások szerint
mindkettő szerepet játszhat a sejtciklus szabályozásában, illetve bizonyos DNS-károsodások,
elsősorban a kettősláncú DNS-törések kijavításában. A BRCA1 és BRCA2 fehérjék nagyméretű,
multiprotein DNS-reparációs komplexek alkotórészei, funkcióvesztésük strukturális
kromoszóma-rendellenességeket eredményez, melyek hozzájárulnak a malignus folyamat
kialakulásához. Ezen tulajdonságaik alapján egyesek nem is tumor szuppresszor fehérjéknek,
hanem mutátor gének (l. alább) termékeinek tekintik őket.
PTEN
Ezt a tumor szuppresszor fehérjét mint a PI3K-út negatív szabályozóját fedezték fel (l. 46. fejezet).
A PI3K enzimmel ellentétes reakciót katalizál: a 3. helyzetben foszforilált inozitolfoszfolipidekről
(pl. PIP3) hasítja le ezt a foszfátcsoportot, leállítva a PKB enzim által közvetített túlélési jelátvitelt.
A PTEN öröklött deléciója olyan kórképet eredményez, melyben megnő az emlő- és
pajzsmirigyrák gyakorisága. Szomatikus PTEN-mutációkat illetve a gén promóterének
hipermetilációját számos daganatban mutatták ki (56.1. táblázat).
VHL
A von Hippel-Lindau szindróma ritka öröklődő tumorszindróma: rosszindulatú vesedaganat,
melyhez a központi idegrendszerben és a retinában kialakuló éreredetű daganatok
(haemangioblastomák) társulhatnak. A génje által kódolt fehérje a sejt rendelkezésére álló oxigén
szabályozó hatását közvetíti (56.4. ábra). Alacsony oxigénszint (hipoxia) esetén a HIF-1

266
transzkripciós faktor mennyisége megnő a sejtben. A HIF-1 célgénjei olyan fehérjéket kódolnak,
melyek az oxigénhiányhoz való alkalmazkodást segítik: a VEGF növekedési faktor szekréciója
angiogenezist, az eritropoietin illetve receptorának expressziója fokozott vörösvértest-képzést
idéz elő, a glikolízis enzimei pedig oxigénhiányban is biztosítanak bizonyos mértékű ATP-
termelést (56.4.A. ábra). Normoxiás állapotban ezekre a fehérjékre nincs szükség: a VHL-fehérje
egy multiprotein komplex részeként ubikvitinálja a HIF-1 traszkripciós faktor egyik alegységét, az
degradálódik és a célgének nem íródnak át (56.4.B. ábra). A VHL-gén inaktivációja esetén ezek a
gének normális oxigénszintnél is aktívak, elősegítve a daganat vaszkularizációját.

56.4. ábra: A VHL tumor szuppresszor fehérje hatásmechanizmusa A: hipoxiás állapot; B:

normoxiás állapot

Mutátor gének
A daganatképződésre prediszponáló genetikai faktorok egyik típusa tehát a tumor szuppresszor
gének mutációja. Ezen gének termékei – tudományos zsargonnal élve – „ajtónállóként”,
közvetlenül felügyelik a sejtciklust, sejtszaporodást. Ha ez a funkciójuk elvész, semmi sem tudja
útját állni az egyensúly felborulásának, a kóros sejtburjánzás megindulásának. Ehhez – a Knudson-
elmélet értelmében – két mutációra van szükség. Egy kóros allél öröklése esetén az egyedben nagy
valószínűséggel megjelenik a tumor.
A tumorra hajlamosító géneknek van egy másik csoportja, melyek hatásukat közvetve fejtik ki.
Ezek a gének a genom integritását megőrző, ún. „karbantartó” fehérjéket kódolnak: közéjük
tartoznak a DNS-reparáció különböző faktorai (pl. XP-fehérjék, a mismatch repair enzimei, a
BRCA1 és 2 gén termékei). Ha funkciójukat elvesztik, genetikai instabilitás lép fel: növekszik a
sejtekben a mutációs ráta, ami viszont növeli a protoonkogén-aktiválódás, illetve a tumor
szuppresszor gén inaktiválódás veszélyét. A mutátor gének károsodása tehát nem okoz
feltétlenül karcinogenezist, de jelentősen növeli annak veszélyét. Az elmondottakból következik,
hogy a mutátor gének károsodása következtében kifejlődő daganatokban legalább 3-4 egymástól
független mutáció halmozódik fel.
A tumorigenezis bonyolult folyamatában tehát három fő géntípus: a mutátor gének, a
protoonkogének és a tumor szuppresszor gének mutációi játsszák a fő szerepet. Az 56.2. táblázat
foglalja össze ezeknek a géneknek és termékeiknek legfontosabb tulajdonságait.

267
Jellemzők Protoonkogének Tumor szuppresszor Mutátor gének
gének
A normális gén-
mitogén szignál- a DNS integritásának
termék a sejtproliferáció gátlása
transzdukció fenntartása
funkciója

növekedési faktorok,
receptorok, G-
szabályozó fehérjék (GAP, DNS-repair fehérjék
proteinek,
Példák Cdk-inhibitorok, (XP-faktorok, mismatch
fehérjekinázok,
transzkripciós faktorok) repair fehérjék)
transzkripciós
faktorok, ciklinek

A mutáns gén
transzfekcióval igen nem nem
azonosítható

A mutáció
domináns recesszív recesszív
jellege

A mutáció
funkciónyerés funkcióvesztés funkcióvesztés
következménye

A mutáció
szomatikus öröklött és szomatikus öröklött és szomatikus
eredete

56.2. táblázat: Protoonkogének, tumor szuppresszor gének és mutátor gének jellemzői

268
 57. Daganatbiológia VI.: A karcinogenezis többlépéses
mechanizmusa
Általánosan elfogadott nézet, hogy a rosszindulatú daganatok többsége genetikai betegség:
szomatikus és – ritkábban – csírasejt mutációk okozzák. A legtöbb esetben a tumor nem hirtelen,
a „semmiből” jön létre: a karcinogenezis hosszú, többlépéses folyamat, melynek során a
daganatsejtben mind több mutáció halmozódik fel, egyre jobban elvész a sejtszaporodás
kontrollja. Az epidemiológiai adatok egyértelműen a többlépéses mechanizmust támasztják alá, a
daganatok többsége az idősebb kor betegsége. Az első karcinogén hatás és az igazán malignus
tumor megjelenése között hosszú, gyakran több évtizedes latencia-periódus telik el. A tudomány
ennek a bonyolult folyamatnak egyre több molekuláris részletét tárja fel.

Experimentális karcinogenezis: a daganatok klonális evolúciója

Kísérleti körülmények között a malignus transzformáció karcinogén hatásokkal (kémiai ágensek,
ultraibolya sugárzás, ionizáló sugárzások, vírusok) idézhető elő. A legtöbb karcinogén ágens DNS-
károsodást vált ki, azaz mutagén, genotoxikus hatású. A rákkeltő anyagok lehetnek direkt hatású
karcinogének, melyek DNS-hez kötődve mutációt idéznek elő. A legtöbb karcinogén azonban
indirekt hatású prokarcinogén, mely metabolikus aktivációval alakul át reakcióképes, mutagén
anyaggá (l. 36. fejezet).
A daganatképződés egyetlen, mutációt szenvedett sejtből indul ki (iniciáció), mely promóciós
hatások következtében progrediál és végül malignus sejtpopulációt eredményez. A karcinogének
egy része csak iniciációt képes előidézni (inkomplett karcinogének vagy iniciátorok), más hatások
(pl. ismételt kezelés policiklusos aromás szénhidrogénnel, UV-besugárzás) azonban a
tumorképződés teljes folyamatát kiváltják (komplett karcinogének).
Tumor-iniciáció
Az iniciátorok olyan mutációt váltanak ki a genomban, melynek következtében a sejt
proliferációs képessége fokozódik (57.1. ábra). A hatás irreverzibilis: a sejt utódaiban a mutáció
évtizedekig fennmarad; ezek a sejtek még nem daganatsejtek, de szaporodásuk a normálisnál
gyorsabb.
Tumor-promóció
Az iniciált sejtek lassan túlnövik a normális szöveti sejteket. Ez a folyamat mitogén hatású
anyagokkal, ún. promóterekkel gyorsítható. Ezek az anyagok általában nem mutagének; az
iniciált, proliferációs előnyt élvező sejtklón túlburjánzását, expanzióját okozzák. A gyors
szaporodás viszont növeli az újabb genetikai hibák kialakulásának esélyét.
A promóter anyagok jelentőségére egy klasszikus kísérlet hívta fel a figyelmet. Ha egerek bőrét
ismételten karcinogén hatású policiklusos aromás szénhidrogénnel kezelik, először jóindulatú
szemölcs, papilloma, majd bőrrák alakul ki. Egyszeri expozíció általában nem okoz daganatot. Ha
azonban a bőrterületet ismételten forbolészterrel is kenegetik, egyetlen policiklusos aromás
szénhidrogén-kezelés is daganatkeltő hatású. A forbolészter nem genotoxikus anyag, a
proteinkináz C serkentésével azonban mitogén hatást okoz. A kísérletben a policiklusos aromás
szénhidrogén az iniciátor; a forbolészter önmagában nem karcinogén hatású, promóterként
azonban fokozza a policiklusos aromás szénhidrogén karcinogenitását (kokarcinogén). A
promóció szakasza - legtöbbször a folyamat kezdetén - reverzibilis: a promóter megvonásával a
mitogén hatás megszűnik, a daganat progressziója megszüntethető vagy lassítható.
Szervezetünk számos promóter hatásának van kitéve. Szerepük a természetes karcinogenezisben
kiemelkedően fontos. A hormonok közül pl. az ösztrogének promóterként járulnak hozzá az
endometrium-tumorok, emlődaganatok kialakulásához. Promóterhatás érvényesül a krónikus

269
gyulladásos megbetegedések daganatképződésre hajlamosító hatásában is. A hepatitis B és C
vírusok által kiváltott krónikus májgyulladásban, colitis ulcerosaban és más gyulladásos
állapotban az érintett sejtekben aktiválódik az NFκB jelátviteli út (l. 49. fejezet). Ez egyrészt
fokozza a sejtproliferációt, másrészt gyulladási citokinek (pl. TNF-α) termelésére sarkallja a
sejteket, önmagát erősítő pozitív feedback szabályozáshoz vezet. Ilyen körülmények között
megnő a gyorsan szaporodó sejtek malignus elfajulásának valószínűsége.
Tumor-progresszió

A daganatképződés végső fázisában az iniciált

sejt malignus sejtté alakul át. Ebben a
progresszíós szakaszban újabb és újabb
mutációk mind gyorsabban szaporodó
sejtpopulációkat eredményeznek. A mutációk
és a gyors proliferáció következtében a sejtek
kariotípusa instabillá válik, egyre több
kromoszóma-rendellenesség halmozódik fel.
Ezek a drasztikus genomváltozások
természetesen irreverzibilisek.
A leírt mechanizmus alapján érthető, hogy a
daganatok általában monoklonális jellegűek.
Egyetlen sejtből indul ki a folyamat, melyből
ismételt mutációkat és epigenetikai
változásokat követően egyre gyorsabban
proliferáló sejtpopulációk szelektálódnak.
Ezen klonális evolúció során kialakuló
malignus daganat valamennyi sejtjében jelen
van a tumorigenezis folyamatában
felhalmozódott valamennyi mutáció (57.1.
ábra). A progresszió végső fázisában azonban
a genom-instabilitás következtében az
eredetileg monoklonális tumor egyes
sejtjeiben különböző mutációk léphetnek fel, a
most már gyorsan növekvő daganatban
genetikai heterogenitás alakulhat ki.

57.1. ábra: A daganat klonális evolúciója (Az

eltérő árnyalatú, illetve alakú szimbólumok
genetikailag/epigenetikailag eltérő sejteket
jelölnek.)

270
 A karcinogenezis klinikai stádiumai
Bár a rosszindulatú daganatok nem alkotnak egységes
betegségcsoportot (emberben közel 200 különböző
neoplasia létezik), a tumorok fejlődésének nagyjából
hasonló és az experimentális karcinogenezis
fázisainak megfelelő lépései vannak. Az 57.2. ábra a
bőrrák példáján mutatja be a daganatképződés
stádiumait.
Primér tumor kialakulása
Az iniciált tumorsejt osztódása először hyperplasiát
eredményez: normális megjelenésű sejtek nagyobb
csoportja jön létre. A következő stádium az epiteliális
dysplasia, melyet a normálistól kissé eltérő
morfológiájú sejtek alkotnak. Ez a stádium
preneoplasztikus állapotnak tekintendő. A sejtek
további szaporodása a hámrétegből kiemelkedő, de a
bazális membránt még épen hagyó, lokális daganatot,
in situ carcinomát hoz létre.
Tumor-invázió
Súlyos fordulatot a bazálmembrán áttörése jelent: a
daganatsejtek mátrix proteázokat kezdenek
szekretálni, melyek lebontják a sejtközötti állomány
struktúrfehérjéit és a tumorsejtek infiltrálják a hám
alatti kötőszöveti réteget. A bazálmembránt áttörő
sejtekben további drámai változások zajlanak le.
Nagymértékben lecsökken a hámsejtekre jellemző E-
57.2. ábra: A bőrrák stádiumai
kadherin expressziója, a sejt-sejt kapcsolatok
felszakadnak.A sejtek mozgékonyságát fokozó ún. motogén növekedési faktorok (pl. EGF, PDGF,
HGF [hepatocita növekedési faktor]) hatására átrendeződik a mikrofilamentum-rendszer. A
citoszkeleton változások szabályozásában a Rho-fehérjecsalád tagjai vesznek részt, lehetővé téve
a sejtek gyors vándorlását. Az invazív karcinomasejtek citokeratinját vimentin váltja fel. A
helyükhöz rögzített, osztódásukban és mozgásukban korlátozott hámsejtek tehát kötelékeikből
felszabaduló, mozgékony, fibroblasztszerű sejtekké alakulnak át. A jelenség neve epiteliális-
mezenchimális átalakulás, mely az invazív daganatok frontvonalát alkotó sejtekre jellemző. A
tumorsejt invázió utat nyit a rosszindulatú daganatok legsúlyosabb, általában halálhoz vezető
szövődményéhez, az áttétképződéshez.
Metasztázis-képződés
A metasztázisok kialakulásában szerepet játszó molekuláris mechanizmusok még ma is kevéssé
tisztázottak. Az áttétképződés nagyon rossz hatásfokú folyamat: a primér tumorból felszabaduló
minden tízezredik sejt tud csak máshol megtapadni és másodlagos daganatot létrehozni. Számos
faktort ismerünk, melyek az áttétképződés ellen dolgoznak. A sejt–sejt és a sejt–mátrix
kapcsolatok igyekeznek a sejteket eredeti helyükön rögzíteni. Az extracelluláris mátrixról
leszakadó sejtek integrin molekuláiról normális körülmények között olyan jelátviteli folyamatok
indulnak el, melyek a sejt apoptotikus halálát indukálják. A metasztatizáló tumorsejtek ezt a
képességüket, az anoikiszt (l. 47. fejezet) elveszítik és így túlélik útjukat a keringési rendszeren
keresztül.

271
A metasztázisok kialakulása több lépésben zajlik le. Az invázió során a tumorsejtek vér- és
nyirokereket érnek el, rést ütnek a kapillárisok bazálmembránján, átjutnak az endotélsejtek
között és bekerülnek a keringésbe (intravazáció). A véráram útján végbemenő transzport komoly
megpróbáltatás a sejtek számára: a nagyméretű daganatsejtek a szűk kapillárisokban
mechanikailag károsodnak, az immunrendszer támadásának is ki vannak téve. A túlélők általában
kis erekben akadnak el, szaporodva kis daganatokat hoznak létre, melyek az endotélt, majd a
bazálmembránt áttörve (extravazáció) kikerülnek a környező szövetekbe és ott megtelepednek
(kolonizáció). Ha a mikrokörnyezet ellenséges, a daganatsejtek elpusztulnak. Ritkán „alvó”
mikrometasztázisok jönnek létre, melyek akár évekig, évtizedekig fennmaradhatnak, míg egyszer
osztódásnak indulnak és tüneteket okozó, végül halálhoz vezető makrometasztázisokká alakulnak
át. Az áttétek jelentős méretűre csak akkor nőhetnek, ha megteremtik saját vérellátásukat. Az
angiogenezist több, a tumorsejtek által is termelt növekedési faktor (VEGF, FGF, PDGF, TGF-β)
serkenti. Az angiogenezist gátló gyógyszerek kifejlesztése a daganatok elleni küzdelem ígéretes
területe.
Az áttétképződés mechanizmusának molekuláris szintű vizsgálata metasztázis szuppresszor gének
felfedezéséhez vezetett. Ezek termékei – szemben a tumor szuppresszor fehérjékkel – nem
gátolják a primér tumor kialakulását, szelektíven gátolják viszont az áttétképződést. Vannak
közöttük Rho-fehérjét vagy mátrix metalloproteázokat gátló fehérjék, az anoikiszt közvetítő
MAPKK. Talán legfontosabb képviselőjük az epiteliális sejt-sejt kapcsolatokat biztosító E-
kadherin.

Onkogén-kooperáció
A tumorképződés többlépcsős mechanizmusa tehát azt jelenti, hogy több (átlagosan 5–6) mutáció
szükséges a malignus daganat kifejlődéséhez. A mutációk protoonkogének aktivációját és tumor
szuppresszor gének inaktivációját egyaránt okozhatják.
Klasszikus kísérletekben igazolták, hogy celluláris onkogének a transzformációban egymás
hatását erősíthetik. Az immortális 3T3 sejtek mind ras, mind pedig myc onkogénnel
transzformálhatók (l. 55. fejezet). A kísérleti állatból kivett és tenyésztett primer
fibroblasztkultúrában azonban mindkét onkogén hatástalannak bizonyult. Ha viszont ezeket a
sejteket a ras és a myc onkogén keverékével transzfektálták, bekövetkezett a transzformáció. A
két onkogén által beindított mechanizmusok tehát szinergizáltak egymással.
Az onkogének kooperációját in vivo kísérletekben is igazolták. Ha olyan transzgénikus egereket
hoztak létre, melyek emlősejtjeiben aktivált ras-gént expresszáltak, néhány állatban, hosszú
latenciával emlőtumor fejlődött ki. Ugyanez történt a myc-gént emlősejtjeikben expresszáló
transzgénikus állatokban. Ha viszont a transzgénikus egerek emlőjében mindkét onkoprotein
túltermelődését sikerült elérni, valamennyi állatban bekövetkezett a daganatképződés,
lényegesen rövidebb lappangás után. Különböző onkogének tehát mind szövettenyészeti, mind
pedig in vivo körülmények között kooperálni képesek egymással a tumorigenezis folyamatában.

Colon carcinoma: a többlépéses karcinogenezis modellje

A vastagbél daganatai elhelyezkedésük miatt viszonylag korán diagnosztizálhatók,
endoszkóppal vizsgálhatók, műtétileg eltávolíthatók. A tumorképződés különböző stádiumaiban
végzett, nagyszámú beteget érintő vizsgálatok eredményeképpen meglehetősen világos kép
alakult ki a colon tumor progressziója során fellépő genetikai léziók természetéről (57.3. ábra).

272
 A tumor kialakulásában az APC tumor szuppresszor
gén (l. 56. fejezet) inaktiválódása általában korai
esemény. A mutáció gyakran öröklött: a familiáris
adenomatosus polyposisban fokozott sejtproliferáció
lép fel, apró polipok százai-ezrei nőnek a
bélnyálkahártyában. (APC-mutációk a nem öröklődő
colon daganatokban is gyakoriak.) A rasK
protoonkogén aktiválódása nagyobb adenomák
kialakulását eredményezi. A tumor-progresszió
későbbi szakaszára a 18. kromoszóma egy specifikus
régiójának elvesztése jellemző. Sokáig azt hitték, hogy
ez egy receptorszerű fehérjét kódoló tumor
szuppresszor gén, a DCC (= deleted in colon cancer)
kiesése miatt fokozza a sejtburjánzást. Ma inkább úgy
gondolják, hogy a DCC-gén terméke az idegrendszer
fejlődésében nélkülözhetetlen, a vastagbélrák
progressziójához viszont a 18. kromoszóma ezen
régiójában egy másik tumor szuppresszor génnek a
deléciója járul hozzá. Az igazán malignus colon
carcinoma megjelenéséhez a p53-gén inaktiválódása
vezet. A colon carcinoma kifejlődéséhez tehát legalább
egy protoonkogén és három tumor szuppresszor gén
mutációja szükséges. A léziók nem feltétlenül a leírt
sorrendben jönnek létre, de a carcinoma stádiumra
mindenképpen a genetikai léziók leírt felhalmozódása
jellemző; ezek mélyreható változásokat idéznek elő a
sejt proliferációs, differenciációs és apoptotikus
viselkedésének szabályozásában. További fehérjék 57.3. ábra: A colon carcinoma
(Raf, β-katenin, TGF-β receptor stb.) génjének genetikai változásai
mutációja, promóter-metilációja bonyolíthatja a
képet.

A daganatképződés elméletei
Daganatkutatásra évtizedek óta óriási összegeket költenek a világ gazdag országaiban. Átfogó,
minden tumorra érvényes és a tudósok nagy többsége által elfogadott elmélet azonban még nem
született a daganatok kialakulásával kapcsolatban.
A legelfogadottabb az előbbiekben ismertetett többszakaszos karcinogenezis modell, amit
génmutációs elméletnek nevezhetünk. Lényege tehát mutációk, és epigenetikai változások
felhalmozódása a sejtszaporodást szabályozó génekben és a mind malignusabbá váló tumorsejtek
klonális expanziója. Eddig több mint 100 emberi protoonkogént és mintegy 35 tumor
szuppresszor gént azonosítottak. Többezer mutációt írtak le ezekben, de nem találtak még egy
olyan mutáció-kombinációt sem, amely egy meghatározott daganattípus minden esetében jelen
lenne. Valószínű tehát, hogy nem egyedi mutációk, vagy azok kombinációja vezet
daganatképzéshez, hanem egész jelátviteli utak, szabályozó mechanizmusok meghibásodása. A
Ras-út aktivációja, az Rb-út abnormális működése felelős elsősorban a fokozott proliferációért. A
p53-jelpálya működési zavara az apoptózis képességének elvesztését, a telomeráz abnormális
expressziójával együtt a daganatsejt immortalizációját eredményezi. Hasonló, még kevéssé ismert
regulációs zavarok vezethetnek a fokozott angiogenezishez, invazív és metasztatizáló képességek
megjelenéséhez. Az említett jelátviteli utak zavara szinte minden malignus daganatra jellemző.
A mutátor fenotípus (l. 56. fejezet) hipotézis hívei azt vallják, hogy a véletlenszerű mutációk túl
ritkák ahhoz, hogy általuk malignus tumorok képződhessenek. Kell tehát egy korai mutáció, mely
DNS-repair gént érint és a mutátor fenotípus már megfelelő hátteret biztosít a nagyszámú

273
génmutáció létrejöttéhez. A herediter nonpolyposis colon carcinoma, vagy a xeroderma
pigmentosum (l. 22. fejezet) esetében jelentkező fokozott prediszpozíció daganatos betegségekre
muníciót biztosít az elmélet hívei számára.
Kariotípus-rendellenességek gyakoriak a daganatok végső stádiumában (l. előbb). Sokan úgy
vélik, hogy az aneuploidia a tumor-progresszió korai eseménye lehet, sőt, vannak, akik szerint
másra nincs is szükség a malignus sejtburjánzáshoz. A „minden-az-aneuploidia” teória szerint
a daganat úgy jön létre, hogy a szervezetben képződő aneuploid sejtek közül egy-egy túléli ezt a
genetikai katasztrófát és „megbolondulva” mértéktelenül osztódni kezd, génmutációkra
egyáltalán nincs is szüksége ehhez. (Ezt a szélsőséges elméletet egyébként a tudósok nagy része
elveti, a kromoszóma-rendellenességek, mint fontos kóroki tényezők szerepét azonban sokan
hangsúlyozzák.)
Klinikai szempontból egyáltalán nem közömbös, hogy melyik elmélet bizonyul igaznak. Az első
esetben onkoproteinekre ható szerek, a másodikban a hibás DNS-repair korrekciója biztosíthat
eredményes terápiát, míg a harmadik mechanizmus esetében csak a prevenció, korai
szűrővizsgálatok jöhetnek szóba.

274
 58. Molekuláris medicina I.: Molekuláris diagnosztika
A molekuláris medicina új tudomány: a betegségek molekuláris megközelítését jelenti. Két nagy
ága van kialakulóban. A molekuláris diagnosztika a molekuláris biológia módszereit veti be a
klinikumban betegségek kórisméjének felállítására vagy megerősítésére, a molekuláris lézió
pontos mechanizmusának megállapítására. A génterápia célja az érintett sejtek kóros
génműködésének helyreállítása.
A molekuláris sejtbiológia módszereinek diagnosztikus célú felhasználása történhet a teljes
genom vagy egyes gének szintjén. A továbbiakban a legfontosabb eljárásokat ebben a
csoportosításban tárgyaljuk.

Genomszintű diagnosztikai módszerek

Molekuláris sejtbiológiai módszerekkel az emberi genom szerkezete és működése (expressziója)
vizsgálható. Az előbbivel a citogenetika és strukturális genomika, az utóbbival pedig a funkcionális
genomika foglalkozik.
Citogenetika és strukturális genomika
A humán citogenetika módszereinek célja az emberi kromoszóma-szerelvény láthatóvá tétele,
a kromoszómák számának és mikroszkópos szerkezetének vizsgálata.
Kariotípus analízis. A kromoszóma-szerelvény elvileg bármilyen osztódó szövetben láthatóvá
tehető. Legegyszerűbben a perifériás vér leukocitái vizsgálhatók. A vérből elkülönített
fehérvérsejteket mitogén hatású fitohemagglutinin jelenlétében tenyésztik, majd az osztódást
kolhicinnel gátolva metafázikus sejteket nyernek. A megfestett kromoszóma-szerelvényt
lefényképezik, a kromoszómákat kivágják és méret szerint rendezik (58.1. ábra). A módszer
egyszerű, a hasonló méretű és alakú kromoszómapárok egyértelmű megkülönböztetése azonban
nem mindig lehetséges.
Sávtechnikák. Ezeknek a módszereknek a lényege, hogy speciális festési eljárással a
kromoszómák különböző régiói eltérő intezitással festhetők. A kapott sávmintázat
kromoszómaspecifikus, tehát alkalmas a kromoszómák azonosítására. A leggyakrabban
alkalmazott eljárás a Giemsa-sávozás (58.2. ábra): a kromoszóma-szerelvényt tripszinnel
előkezelve eltávolítják a gyengén kötődő kromatin fehérjéket, az azt követő Giemsa-festés már
csak a heterokromatin régiókat teszi láthatóvá.

58.1. ábra: Az emberi kromoszóma-szerelvény

275
 58.2. ábra: Az emberi kromoszómaszerelvény Giemsa-sávozással nyert mintázata
Fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH). Fluoreszcens festékkel megjelölt próbával végzett
hibridizáció (l. 10. fejezet) alkalmas lehet általános centromér- vagy telomérfestésre, teljes
kromoszómák vagy akár egyetlen génpár vizualizálására. Léteznek olyan próbák, melyek a teljes
kromoszóma-szerelvényt lefedik, az egyes kromoszómapároknak megfelelő DNS-darabokhoz
azonban különböző színű fluoreszcens festéket kötöttek. A FISH-képen így minden
kromoszómapár más színnel fluoreszkál, ami egyszerűvé teszi az egyes kromoszómák
azonosítását (spektrális kariotípizálás).
Komparatív genom-hibridizáció. A hagyományos FISH-módszerek diagnosztikus célú
alkalmazásának előfeltétele, hogy a várható mutációt tartalmazó kromoszómarégió ismert legyen,
specifikus fluoreszcens próba rendelkezésre álljon. 1992-ben kidolgoztak egy új in situ
hibridizációs eljárást, mellyel ismeretlen lokalizációjú, a genomban esetleg jelenlevő többszörös
rendellenességek (deléciók és amplifikációk) is egyidejűleg, egyetlen vizsgálattal kimutathatók. A
komparatív genom-hibridizáció módszerét elsősorban daganatok kromoszóma-
rendellenességeinek vizsgálatára használják (58.3. ábra). A daganatsejtekből és kontrollsejtekből
genomiális DNS-t izolálnak, a két DNS-mintát eltérő fluoreszcenciájú festékkel jelölik meg, majd
elegyükkel normális kromoszómaszerelvényen in situ hibridizációt hajtanak végre. A hibridizáció
során a kétféle színű DNS-próbamolekulák vetélkednek egymással. A két próba-DNS-ben azonos
mértékben reprezentált kromoszómarégiók homogén fluoreszcenciát mutatnak, a daganatsejtben
deletált kromoszómarészeken viszont a kontroll-DNS-re, az amplifikált génszakaszon pedig a
tumor-DNS-re jellemző fluoreszcencia dominál. A fluoreszcencia digitális képanalízissel
mennyiségileg is jellemezhető: a deléció kiterjedése, illetve az amplifikáció mértéke
meghatározható.

276
 58.3. ábra: A komparatív genom-hibridizáció elve
Áramlási citometria. Fluoreszcens DNS-festékkel megfestett metafázikus kromoszóma-
szerelvény tagjai eltérő méretüknek megfelelő, különböző festékkötő képességük alapján FACS-
eljárással (l. 17. fejezet) elkülöníthetők egymástól. A módszer gyors kariotípus-analízisre, egyes
kromoszómapárok izolálására egyaránt alkalmas.
Molekuláris biológiai módszerek. A humán genom program befejezése óriási lehetőségeket
nyitott meg a molekuláris diagnosztika előtt. Az SNP-chipek (l. 10. fejezet) kifejlesztése lehetővé
teszi a genomukban jelenlevő több millió egyedi nukleotid polimorfizmus egyidejű kimutatását.
Az első generációs szekvenciameghatározó eljárások (Sanger-módszer, Maxam-Gilbert-módszer)
után kidolgozott második és harmadik generációs szekvenáló technikák (ezek ismertetése
meghaladja e tankönyv kereteit) lehetővé teszik azt, hogy ma (2011-ben) néhány nap alatt,
néhány ezer dollárért meghatározható egy ember genomjának teljes szekvenciája. Eljött tehát a
személyre szabott genomika ideje: már „csak” azt kell a tudománynak megfejtenie, milyen klinikai
következtetések vonhatók le ebből a hatalmas mennyiségű információból.
Funkcionális genomika
A génexpresszió során mRNS-ek, azokon pedig fehérjék képződnek. A funkcionális genomika az
egy sejtben képződő valamennyi RNS, illetve fehérje egyidejű kimutatását jelenti.
A cDNS-chipek működési elvét az 58.4. ábra mutatja be, egy daganat és a neki megfelelő normális
szövet génexpressziós profiljának összehasonlításával. Mindkét szövetből RNS-t izolálnak és a két
minta RNS-molekuláit különböző színű fluoreszcens festékkel jelölik meg, összekeverik és olyan

277
cDNS-chipen hajtanak végre hibridizációt, melynek mezői a különböző génekre specifikus cDNS-
szakaszokat tartalmaznak. A fluoreszcencia mikroszkópban az egyes mezők színárnyalata attól
függ, milyen arányban kötöttek meg komplementer RNS-eket a normális és daganatszövetből
származó mintákból. A cDNS-chipekkel többezer gén kifejeződése monitorozható egyidőben a
kóros szövetben és hasonlítható össze az egészséges sejtek génexpressziójával. A vizsgálatból
onkogének fokozott, illetve tumor szuppresszor gének csökkent expressziója mutatható ki.

58.4. ábra: Tumorsejt génexpressziós profiljának vizsgálata (piros fluoreszcencia: csökkent

génexpresszió a tumorban; zöld fluoreszcencia: fokozott génexpresszió a tumorban; sárga
fluoreszcencia: nincs különbség; nincs fluoreszcencia: a gén nem expresszálódik)
Bár DNS-vizsgálati módszer, a DNS-metiláció genomszintű analízise az egyes gének
expressziójának mértékére enged meg következtetéseket.
A proteomika módszerei (l. 13. fejezet) – bár jelenleg még kevésbé érzékenyek és költségesebbek
a DNS-chipeknél – még ígéretesebbek a molekuláris diagnosztikában, hiszen nemcsak az érintett
fehérjék szintjének, hanem funkcionális állapotuknak (pl. foszforiláció) az analízisére is
alkalmasak. A funkcionális genomika óriási távlatokkal rendelkezik az orvostudományban.

A génszintű diagnózis módszerei

Egyes gének szerkezetének (l. 9. és 10. fejezet), illetve expressziójának (l. 13. fejezet) vizsgálatára a
korábban már ismertetett, ma már klasszikusnak számító metodikák használatosak.
Mutáció analízis
Az érintett gén mutációjának direkt kimutatására akkor van lehetőség, ha a gént már
azonosították, legalább egy részét klónozták, így hibridizációs próba, szekvencia-információ
rendelkezésre áll. A humán genom program befejezésével (l. 10. fejezet) ezek a feltételek mind
több mutáció által okozott betegség esetében teljesülnek.
Génmutációk kimutatására kezdetben a Southern-blot módszerét alkalmazták, ezt azonban már
teljesen kiszorították a molekuláris diagnosztikából a polimeráz láncreakción alapuló módszerek.
Bizonyos mutációtípusok kimutatására a FISH is alkalmas. A diagnózis megerősítése általában
szekvencia-meghatározással történik.
Pontmutáció kimutatása
Kis kiterjedésű léziók (pontmutációk, kisméretű deléciók, inverziók) kimutatására számos
módszert dolgoztak ki, közülük csak néhányat említünk meg ebben a fejezetben.

278
Restrikciós hely képződésének vagy eltűnésének vizsgálata. Mivel a restrikciós
endonukleázok abszolút specifikusak felismerőhelyük szekvenciájára (l. 9. fejezet), egyetlen
bázispár megváltozása meg is szüntethet, de létre is hozhat hasítási helyet, ami a DNS-régióból
származó restrikciós fragmentumok méretmeghatározásával Southern blot vagy PCR
alkalmazásával kimutatható. Példaként a sarlósejtes vérszegénység említhető. A β-globin gén
pontmutációja az Mst II enzim felismerőhelyében következik be, így a mutáns génre egy nagyobb
méretű, el nem hasított DNS-fragmentum lesz jellemző, ami könnyen kimutatható (58.5. ábra). A
restrikciós fragmentumok mutációk által előidézett méretbeli polimorfizmusát RFLP-
nek(restriction fragment length polymorphism) nevezzük.

58.5. ábra: RFLP-analízis a sarlósejtes anaemiát okozó mutáció kimutatására

(A) MstII hasítási helyek (függőleges nyilak) a normális és sarlósejtes emberi β-globin régióban.
Genomiális DNS-mintával az ábrán jelölt primerek (vízszintes nyilak) alkalmazásával PCR
reakciót végeznek, majd a termékeket MstII-vel hasítják. (B) A hasítási termékek analízise
gélelektroforézissel
Hibridizáció allélspecifikus oligonukleotidokkal. A vizsgálandó DNS-mintát hibridizációs
filterre viszik fel, majd a vizsgálandó génszakaszra specifikus vad típusú és a pontmutációt
hordozó oligonukleotid-próbával is hibridizálják. Az eljárás azon alapul, hogy a képződött duplex
stabilitását egyetlen hibás bázispár (mismatch) is csökkenti, a hibridizációs körülmények
megválasztásával így elérhető, hogy csak a tökéletes bázispárosodásra képes oligonukleotid
kötődjön (58.6. ábra). Az egyszerű eljárás neve: dot-blot hibridizáció, tájékozódó vizsgálatra
alkalmas.

58.6. ábra: Az allélspecifikus hibridizáció elve (A.) és alkalmazása sarlósejtes vérszegénység

molekuláris diagnózisára (B.)
Pontmutáció kimutatása polimeráz láncreakcióval. Ha a PCR-reakcióhoz választott egyik
primer 3’-végi nukleotidja megfelel a pontmutáció helyének, vad típusú primer csak a normális,
mutáns primer pedig csak a kóros génszakasz amplifikációját teszi lehetővé. A DNS-polimeráz
ugyanis csak akkor képes a primert rendeltetésszerűen használni, ha annak 3’-vége

279
komplementer a templáttal (l. 21. fejezet). Vad típusú és mutáns primert alkalmazva, a PCR-
termékek elektroforetikus analízisével a genotípus is meghatározható (58.7. ábra).

58.7. ábra: A vadtípusú és mutáns PCR-primerek alkalmazásának elve (A.) és a módszer

felhasználása a sarlósejtes vérszegénység diagnosztikájában (B.)

Nagyobb kiterjedésű léziók kimutatása

Deléciók, transzlokációk, inverziók, inszerciók detektálása is lehetséges molekuláris biológiai
eszközökkel. Az alkalmazandó módszert a mutáció jellegétől, kiterjedésétől függően kell
megválasztani. A cystás fibrosist okozó leggyakoribb mutáció például egy triplet kiesését jelenti a
CFTR-fehérjét kódoló gén egyik exonjában (l. 42. fejezet). Kimutatása a PCR-amplifikált termék
poliakrilamid-gélelektoforézisével, esetleg szekvenciameghatározásval lehetséges. Duchenne-féle
dystrophia muscularisban (l. 39. fejezet) a deléció gyakran nagy kiterjedésű, több exont érint.
Ilyenkor ugyanabban a PCR-reakcióban, több primerpárt alkalmazva több szomszédos exont
amplifikálnak (multiplex PCR) és az elektroforetikus csíkokból következtetnek arra, hogy melyik
exonok estek áldozatul a deléciónak (58.8. ábra).

58.8. ábra: A multiplex PCR elve. A: Exonok (E1-E4) és primerpárok (nyilak) egy génszakaszon; B: A
génszakasz multiplex PCR-reakciókban amplifikált és gélelektroforézissel szétválasztott termékei
vadtípusú (1. minta) és deléciót szenvedett (2-4. minta) DNS-preparátumok esetében
Kiterjedt, esetleg több gént is érintő deléció kimutatására a metafázikus kromoszóma-
szerelvényen végzett fluoreszcens in situ hibridizáció a legalkalmasabb módszer.
Transzlokációk kimutatása PCR módszerrel vagy citogenetikai eljárásokkal lehetséges. A
töréshelyeken érintett génekre specifikus, különböző színű próbák alkalmazásával (többszínű
FISH) metafázikus kromoszómákon, sőt interfázikus kromatinban is kimutatható a
génáthelyeződés. Az utóbbi, egyre népszerűbbé váló diagnosztikai eljárás az interfázis
citogenetika.

280
Gének vagy kromoszómarégiók amplifikációja citogenetikai módszerekkel egyaránt
kimutatható. Az amplifikáció mértéke (génkópiák száma) valós-idejű PCR segítségével állapítható
meg (l. 9. fejezet).
Génexpresszió analízis
Egyes gének expressziója az mRNS-ek és a fehérjék szintjén is vizsgálható. A Northern-blot
analízist kiszorította a molekuláris diagnosztikából a reverz transzkriptáz-PCR módszere: a
specifikus mRNS-t cDNS-be írják át, majd azt polimeráz láncreakcióval sokszorosítják. Valósidejű
PCR reakciót alkalmazva a módszer mennyiségi meghatározásra is alkalmas (kvantitatív PCR).
Egyes gének promóter-metilációjának analízise a génexpresszió intenzitására enged
következtetni.
Specifikus fehérjék diagnosztikai célú kimutatására a Western-blot, immuncitokémia és egyéb
immunológiai módszerek használatosak.

Példák a molekuláris diagnosztika alkalmazására

A fentiek alapján a molekuláris diagnosztika „célbetegségei” azok a kórképek lehetnek, melyeket
valamilyen nukleinsav-változás okoz. Az öröklődő betegségekben ez csírasejt-mutációt, a
rosszindulatú daganatokban általában szomatikus mutációkat és epigenetikai változásokat, a
fertőző betegségekben pedig idegen nukleinsav megjelenését jelenti. Az érintett szövet
génexpressziójának változása azonban szinte bármilyen betegségben előfordulhat.
Molekuláris diagnosztika öröklődő betegségekben
A molekuláris biológiai módszerek sokrétűen alkalmazhatók az öröklődő betegségek
diagnózisában. A már kialakult betegség esetében a klinikai tünetek alapján felállított diagnózis
megerősítését szolgálják. Recesszív kórképek esetében fontos lehet a tünetmentes hordozók
kiszűrése egy családban vagy populációban.
A molekuláris diagnosztika egyik legfontosabb felhasználási területe a prenatális diagnózis.
Öröklődő betegség gyanúja esetén amniocentézis vagy korionbiopszia segítségével magzati
sejteket nyernek, a belőlük izolált DNS-ben a kérdéses génszakaszt PCR-ral amplifikálják, majd
elvégzik a diagnosztikai analízist. Pozitív eredmény esetén a terhesség első harmadában
mérlegelhető a művi abortusz lehetősége.
A legmodernebb eljárás a preimplantációs genetikai diagnózis. Erre a módszerre az in vitro
fertilizációs („lombikbébi”) programok elterjedése nyitott lehetőséget. A nagyobb siker
érdekében általában több petesejtet termékenyítenek meg és kezdenek tenyészteni. Az embriók
8–12 sejtes stádiumában a sejtek még totipotensek: mikromanipulációval egyikük eltávolítható,
hiányát a többiek maradéktalanul pótolják. Az embrió-biopsziával nyert sejtből DNS-t izolálnak és
PCR-alapú módszerrel elvégzik a diagnosztikai analízist, esetleg 20–30 különböző, gyakori
öröklődő betegségre is. A genetikai szempontból legegészségesebb embriókat ültetik be az anya
méhébe.
Daganatok molekuláris diagnózisa
A rosszindulatú daganatok kialakulásáért protoonkogének és tumor szuppresszor gének
szomatikus (ritkábban örökölt) mutációi felelősek (l. 55–56. fejezet).
A molekuláris biológiai módszerek pontos diagnózist tesznek lehetővé, ami gyakran
elengedhetetlen a leghatásosabb kezelés megtervezéséhez. Figyelemmel kísérhető a tumor
progressziója is, megállapítható a kezelés hatékonysága, reziduális tumorsejtek kimutatása.
Mikroszatelliták szomatikus mutációjának detektálása általános genetikai instabilitásra, mutátor
gének inaktiválódására utal (l. 56. fejezet).

281
Fertőző betegségek molekuláris diagnózisa
Egyes fertőző betegségek kórokozói nehezen vagy egyáltalán nem tenyészthetők, a betegség
diagnózisa a klinikai tüneteken, esetleg antitestek megjelenésén alapul. A kórokozó
nukleinsavainak kimutatása gyorsabb és érzékenyebb módszer.
A kórokozóktól függően in situ hibridizációt, polimeráz láncreakciót, reverz transzkriptáz-PCR-t
lehet alkalmazni. A diagnózis órák vagy akár percek alatt felállítható. (Összehasonlításképpen: a
Mycobacterium tuberculosis kitenyésztéséhez hetekre van szükség!) Számos kórokozó (pl.
Neisseria gonorrhoeae, M. tuberculosis, herpes simplex vírus, hepatitis B vírus, humán
papillomavírus) kimutatására már diagnosztikus kitek vannak kereskedelmi forgalomban. A
molekuláris diagnosztika számára elérhető fertőző betegségek köre minden bizonnyal tovább fog
szélesedni, kialakulóban van a molekuláris mikrobiológia tudománya.

282
 59. Molekuláris medicina II.: Génterápia
Napjainkban az orvostudomány kétségkívül legdivatosabb ága a molekuláris medicina másik
területe, a molekuláris terápia vagy elterjedt nevén génterápia. Ez az elnevezés minden olyan
beavatkozást takar, melynek célja specifikus gének manipulálása: pótlásuk, kiirtásuk, kijavításuk,
expressziójuk befolyásolása. Ebben a fejezetben azokkal az eljárásokkal foglalkozunk, melyeket a
fenti célok elérésére dolgoztak ki. Bár a génterápia éppen csak belépett a klinikai kipróbálás
fázisába, és eddig a várakozásoknál kevesebb eredményt hozott, a kísérletek újabb és mind
kidolgozottabb protokollokkal nagy intenzitással folynak (2009-ig több mint 1300 kísérleti
génterápiás protokollt fogadtak el). Bár eddig (2011) génterápiás „gyógyszer” forgalmazását még
nem hagyták jóvá, szakértők véleménye szerint a nem túl távoli jövőben rutinszerűen fognak
alkalmazni valóban hatékony génterápiás kezeléseket. Indokolt tehát a jövő lehetőségeinek rövid
áttekintése.
A kipróbálás alatt álló terápiás eljárásokat két nagy csoportba lehet sorolni. Az egyik esetében az
érintett sejtekbe kisméretű, ismert szekvenciájú nukleinsavakat juttatnak be, melyekkel
specifikus gének expresszióját módosítják (oligonukleotid terápia). A valódi génterápia
funkcióképes gén bejuttatását, vagy specifikus endogén gén célzott manipulációját, átalakítását
jelenti.

Oligonukleotid terápia
Antisense inhibitorok
Az antisense oligonukleotidok specifikus mRNS-ek meghatározott régiójával komplementer
rövid nukleinsavak, melyek a sejtbe juttatva cél-mRNS-ükhöz kötődnek és annak működését
gátolják (l. 12. fejezet). Elvileg bármely gén expressziója blokkolható, melynek kódoló
szekvenciája – legalább részben – ismert.
Humán antisense terápiás kísérletek 1992 óta folynak, egyelőre szerény sikerekkel. Elvileg
minden betegség, melyet specifikus gének abnormális működése, vagy expressziója okoz,
célpontja lehet oligonukleotid terápiának. Philadelphia-kromoszóma pozitív krónikus myeloid
leukaemiás sejteket sikerrel tisztítottak meg szövettenyészeti körülmények között anti-bcr/abl
oligonukleotiddal a fúziós mRNS-ektől. Részsikerekről számoltak be ovarium daganatban
szenvedő nők, AIDS-es betegek antisense terápiájáról is (59.1. ábra). Számos betegség kezelésének
protokollja a kidolgozás stádiumában van: onkogénspecifikus oligonukleotidok különböző rákos
betegségek, antivirális nukleinsavak vírusfertőzések (pl. influenza, hepatitis stb.), a növekedési
hormon mRNS-ét megcélzó oligonukleotidok az acromegalia kezelésére jönnek szóba. A
baktérium mRNS-ek Shine-Dalgarno szekvenciájával vetélkedő oligonukleotidokkal – a
fehérjeszintézis szelektív gátlásán keresztül – különböző bakteriális fertőzéseket lehetne
leküzdeni toxikus hatásoktól mentesen. A trypanosoma (az álomkór kórokozója) mRNS-eiben
jelenlevő közös leader-szekvencia hasonló elv alapján kínál célpontot antisense terápiás
beavatkozására.
Ribozimek
Rekombináns DNS-technológia segítségével olyan katalítikus RNS-ek állíthatók elő, melyek
specifikus mRNS-eket képesek megkötni és elhasítva hatástalanítani (l. 12. fejezet). A HIV-RNS-re
specifikus ribozimek klinikai kipróbálása már megkezdődött és a tapasztalatok biztatóak.

283
 59.1. ábra: A HIV-fertőzés gátlása antisense oligonukleotiddal

siRNS-ek
Az antisense oligonukleotidok és ribozimek mellett újabban nagy terápiás lehetőségeket látnak az
RNS-interferencia jelenségében is (l. 12. fejezet). Kisméretű kettősláncú RNS-ekkel (siRNS-ek)
szekvencia-specifikus poszttranszkripciós géncsillapítás érhető el. Az siRNS-ek majdani terápiás
alkalmazásának indikációs területe megfelel az említett oligonukleotid inhibitorokénak.
Különösen reménytkeltőek a daganat-terápiában tesztelt célzott géncsillapítást előidéző siRNS-
kezelések (a teljesség igénye nélkül: humán papillomavírusok onkogénjei, a bcr/abl fúziós gén,
pontmutációt szenvedett ras és B-raf gének, fokozottan expresszálódó β-katenin és multidrog
rezisztencia gének kifejeződésének gátlása).

Valódi génterápia
A szó igazi értelmében vett génterápia célja normális funkciójú gén expressziójának elérése a
beteg célsejtekben. Ez megvalósítható a hiányzó vagy elégtelen működésű gén pótlásával, illetve
a túlzott aktivitású gén kiirtásával, vagy normálisra cserélésével.
A génterápia típusai
Ex vivo génterápia. A jelenleg folyó klinikai kísérletek többségében a beteg szervezetéből kivett
kóros célsejteket szövettenyészeti körülmények között manipulálják, majd a génterápiában
részesített sejteket visszajuttatják a páciens szervezetébe.
In situ génterápia. Számos humán terápiás kísérletben lokálisan alkalmazzák a terápiás gént:
nyálkahártyák felszínén, erek falában, tumorba fecskendezve.
In vivo génterápia. A terápiás gént megfelelő vektorhoz kötve, a keringésbe juttatják, a
célsejteket a véráram útján éri el. A kezelés ezen formájában az eredményesség előfeltétele, hogy
a vektor ismerje fel a célsejteket és a terápiás gént csak ezekbe juttassa be. Ez elérhető például
úgy, hogy a vektort egy specifikus liganddal jelölik meg, melynek receptora csak a célsejt felszínén
expresszálódik.
In utero génterápia. A magzatvízbe fecskendezett génterápiás vektorral a magzat bizonyos
szövetei (pl. a légutak nyálkaháryája) „megcélozhatók”. Az eljárás előnye az lenne, hogy éretlen
őssejteket lehetne korrigálni, ezek utódai már normális sejtek lennének, a beavatkozást így nem
kellene megismételni. (Differenciált sejtek génterápiája a sejtek korlátozott élettartama miatt csak
átmeneti eredményt hozhat.) Az in vivo és in utero génterápia állatmodellekben biztató
eredményeket adott; humán alkalmazásokról még nem számoltak be.

284
Génterápiás vektorok
A terápiás gént a hatásos dózis előállítása és hatékony transzfer érdekében célszerű valamilyen
vektorhoz kötni. A humán kísérletek többségében három vektorrendszer valamelyikét
alkalmazták: a virális vektorok közül a retrovírusok és az adenovírusok, a nem virális vektorok
közül pedig a liposzóma-komplexek a legnépszerűbbek. Számos egyéb vektorrendszer
kidolgozásával és tesztelésével is foglalkoznak.
A vírus-vektorokkal szemben támasztott legfontosabb követelmény, hogy a terápiás gént anélkül
legyenek képesek bejuttatni és működtetni a célsejtben, hogy ott a vírus maga szaporodna.
Retrovírus vektorok. Manipulációjuk a provírus szintjén történik (59.2. ábra): a gag, pol és env
géneket cserélik ki a terápiás génre, majd a vírus-DNS-t transzfekcióval beviszik egy becsomagoló
sejtvonalba. Ezek a sejtek egy helper provírusról termelik a Gag, Pol és Env fehérjéket és a
rekombináns vírus-RNS-t becsomagolva a terápiás gént tartalmazó fertőző vírusokat termelnek.
A retrovírusokat eddig elsősorban ex vivo terápiára használták. A célsejtben provírus képződik,
integrálódik és expressziója a terápiás fehérje termelését eredményezi.

59.2. ábra: Génterápia retrovirális vektorral

285
Adenovírus vektorok. Az adenovírus lineáris DNS-ében a korai régió egy részét cserélik ki a
terápiás génre (59.3. ábra); a vírus így replikálódásra képtelenné válik. Elszaporítása olyan
becsomagoló sejtekben történik, melyekbe előzőleg bejuttatták a vírusreplikációhoz szükséges
fehérjék génjeit. A termelődő, terápiás gént tartalmazó adenovírus partikulumok a célsejtbe egy
integrinreceptor által közvetített endocitózissal jutnak be. A vírusok kitörnek az endoszómákból
és a sejtmagban extrakromoszomális-DNS formájában expresszálják a terápiás gént. Integráció
hiányában az adenovírus vektor által kiváltott terápiás hatás csak átmeneti lehet. Az adenovírus
vektorok elsősorban in situ és in vivo beavatkozásoknál jöhetnek szóba. (Az adenovírus-vektorok
ritkán okoznak mellékhatásokat, a génterápiás kísérletek első halálos szövődményét mégis egy
ilyen vektor okozta. 1999-ben egy fiatal beteg immunrendszere túlzott módon reagált az
adenovírussal végzett génterápiás beavatkozásra.)

59.3. ábra: Génterápia adenovírus vektorral

286
Liposzóma-vektorok. A terápiás gént tartalmazó rekombináns plazmidot pozitív töltésű
kationos liposzómával komplexálják és így juttatják a célsejtbe. A géntranszfer gyenge hatásfokú,
de mivel a komplex nagy dózisban adható, elérhető terápiás hatás. Megfelelő liganddal ellátott
liposzómavektoroktól in vivo génterápiás sikereket remélnek.
A legtöbbet igérő vektorok néhány jellemző tulajdonságát az 59.1. táblázat foglalja össze.
A génterápia lehetőségei
Az alkalmazandó génmanipuláció fajtáját a gént károsító mutáció funkcionális következménye
határozza meg. Funkcióvesztő mutáció esetén a gén pótlása a megoldás, ami technikailag
viszonylag egyszerű eljárás: az érintett génnek megfelelő cDNS-t promóterrel látják el és vektorba
építve bejuttatják a célsejtbe. Szerencsés esetben a gén optimális szinten expresszálódik és
meggyógyítja a sejtet. A jelenleg folyó humán génterápiás próbálkozások ebbe a típusba tartoznak.
Funkciónyerő mutáció által okozott betegségekben a kóros gén célzott kiirtása (K.O. mutáció, l. 12.
fejezet) vagy korrekciója a járható út. Többféle módszert dolgoztak ki az ilyen típusú
génmanipulációra. Ezek közül a legígéretesebbek génsebészeti eljárásokkal létrehozott
szekvencia-specifikus nukleázokat alkalmaznak. A cinkujj-nukleázok mesterségesen előállított
fúziós fehérjék. DNS-kötő doménjük cinkujj fehérje, mely génjét úgy manipulálták, hogy a
transzkripciós faktor tetszés szerinti DNS-szekvenciát ismerjen fel. Katalítikus doménjük egy
restrikciós enzim nukleáz régiója, mely a cinkujj domén által kiválasztott helyen hasítja el a DNS-
t. A kettősláncú törés kijavítása során tetszés szerinti változtatás idézhető elő a régió DNS-
szekvenciájában. A cinkujj-nukleáz stratégia segítségével 2011-ben a IX. alvadási faktor
hiányában szenvedő egereket részesítették sikeres génterápiában. A technikai feltételek tehát
már rendelkezésre állnak, a humán génkorrekcióra azonban még várni kell.
Klinikai génterápiás tapasztalatok
Az első humán géntranszfer kísérletet 1989-ben, majd az első valódi génterápiát 1990-ben
hajtották végre. Azóta számos génterápiára specializálódott biotechnológiai cég alakult, a több
ezer humán génterápiás beavatkozás eredményei azonban némileg csalódást keltettek. A
kezelések során mellékhatások csak elvétve jelentkeztek ugyan, és az esetek egy részében a várt
pozitív biológiai hatásokat is észlelték, a génterápia gyógyulást vagy tartós, jelentős javulást
azonban csak néhány klinikai kísérletben hozott. Bizakodásra az adhat okot, hogy az összegyűjtött
tapasztalatok alapján új, hatékonyabb vektorokat és kezelési protokollokat fejlesztettek ki.
Az alábbiakban néhány fontosabb klinikai kísérlet eredményeivel foglalkozunk.

Vektor Előnyök Hátrányok

retrovírusok integráció a genomba, tartós inszerciós mutagenezis, csak
hatás osztódó sejteket fertőznek
adenovírusok sokféle sejt transzdukálható, nagy átmeneti hatás, immunválasz
hatásfokkal kiváltása
adeno-asszociált integráció a genomba, nem kisméretű inszert
vírusok kórokozók
liposzómák betegséget nem okoznak, kis hatásfokú sejtbe jutás
nagyméretű fragmentum
csupasz DNS betegséget nem okoz, kis hatásfokú sejtbe jutás,
nagyméretű inszert bomlékonyság, instabilitás

59.1. táblázat: Génterápiás vektorok jellemzői

287
Szomatikus sejtek génterápiája. A jelenleg folyó klinikai kísérletek kivétel nélkül ebbe a
kategóriába tartoznak: a célsejtek testi sejtek, manipulációjuk nem érinti a csírasejtvonalat, így a
genetikai változás az esetleges utódokra nem öröklődhet.
Az első szomatikus génpótlást adenozin-dezamináz (ADA)-hiányban szenvedő gyermekeknél
hajtották végre. Az enzim hiányában toxikus adenin-nukleozidok szaporodnak fel a sejtekben,
amelyek a limfocitákat károsítva halálos immunhiányos állapotot okoznak. 1990-ben két ADA-
hiányos kislány T limfocitáiba ex vivo ADA-cDNS-t vittek be. A betegek ma is élnek, mivel azonban
párhuzamosan enzimterápiában is részesültek, a génterápia eredményessége nem ítélhető meg.
Az ADA-hiányhoz hasonlóan súlyos immunhiányos állapot jellemzi az X-SCID (X-linked severe
combined immun deficiency) kórképben szenvedő gyermekeket is. Egy interleukin-receptor
alegységének hiánya következtében sem a B-, sem a T-limfociták nem alakulnak ki, ami már
kisgyermekkorban halálos fertőzésekhez vezet. A betegség két szempontból is mérföldkőnek
bizonyult a génterápia történetében. Ez volt az első igazi siker: 2000-ben 20 génterápiában
részesített kisfiú közül 18 esetében tartós javulást értek el. Másrészt viszont ez volt az első
génterápiás kísérlet, melyben bekövetkezett a rettegett szövődmény, az inszerciós mutagenezis. A
gyermekek közül ötnek az ex vivo kezelt hematopoietikus őssejtjeiben a vektorként alkalmazott
retrovírus provírusa egy, a vérsejtek fejlődésében fontos szerepet játszó protoonkogén
transzkripciós faktor génjébe integrálódott, annak túlzott expressziója pedig akut T-sejtes
leukaemiát idézett elő a betegekben. A génterápia tehát működik, de génbeviteli módszerei még
finomításra szorulnak.
Cystás fibrosisban (l. 42. fejezet) az életet a légutak ismétlődő fertőzései veszélyeztetik. A jelenleg
folyó kísérletekben a CFTR-gént adenovírus vektorban, aeroszol formájában probálják bejuttatni
a légutak hámjába, váltakozó, klinikailag nehezen megítélhető sikerrel. Biztató megfigyelés, hogy
K.O. egérmodellben egyetlen in utero génkezeléssel jelentős javulást értek el.
A génterápiás próbálkozások nagyobb része daganatos betegekben folyik. Többféle kezelési
protokollt dolgoztak ki, ezek közül a legbíztatóbb talán az ún. öngyilkos gének alkalmazása, melyek
a célsejtet érzékennyé teszik valamilyen, egyébként hatástalan szerrel szemben. Öngyilkos
génként működhet például a herpeszvírus timidinkináz génje (tkHSV; l. 12. fejezet). A timidinkináz
enzim a ganciklovir nevű szert ganciklovir-trifoszfáttá foszforilálja, ami a dGTP helyett beépül a
DNS-be és gátolja a replikációt. A daganatba adott tkHSV-injekció után glioma-betegben jelentős
tumorregressziót értek el ganciklovir-kezeléssel.
Klinikai kísérletek folynak familiáris hypercholesterinaemiában (l. 35. fejezet) szenvedő
betegeknél is. Parciális hepatektomiával nyert májsejtekbe ex vivo géntranszferrel juttatják be az
LDL-receptor génjét, majd a sejteket reinfundálják a betegbe. A páciensek egy részénél a vér LDL-
koleszterinszintjének csökkenéséről számoltak be.
Fertőző ágensekkel szembeni immunitás érhető el DNS-vakcinák alkalmazásával. Az antigén
génjét tartalmazó csupasz DNS-vektort sejtek felveszik, az expresszálódó fehérjével szemben
pedig a szervezetben humorális és celluláris immunválasz is kialakul. Génterápiás protokollok
kidolgozása folyamatban van herpes, malária, AIDS, tuberculosis, hepatitis és más fertőzések, sőt
daganatok elleni immunizálásra.
Csírasejt génterápia. A transzgénikus, illetve K.O. egerek létrehozásához hasonló módszerrel (l.
11. és 12. fejezet) elvileg emberben is elképzelhető olyan génterápiás beavatkozás, mellyel
betegségek átörökítését meg lehetne akadályozni. A csíravonal genetikai manipulációjának
jelenleg megjósolhatatlan kockázatai és etikai megfontolások alapján a tudományos világ
álláspontja azonban ma az: a csírasejt génterápia emberben nem engedélyezhető. Ilyen jellegű
kísérletek ma minden a beavatkozás végrehajtására tudományosan felkészült országban tiltottak.

288