Predmet: Medicinska mikrobiologija

(vježbe)
• Smjer- Sanitarni tehničar(2 razred)
• Pripremila:Ines Mišetić Lašić ,
• Zdravstvena škola Split
 UVOD

• Prisjetimo se: ISHODI koje smo do sada usvojili

• Važnost mikrobiološke dijagnostike – iz
biološkog uzorka izolirati i identificirati
patogenog uzročnika bolesti!
• Ponovimo:
• Koji je postupak i princip bakteriološke obrade
uzoraka ? (navesti redosljed obrade i bitne
metode i testove identifikacije patogenih vrsta)
 Postupak bakteriološke obrade:

• Pravilno uzimanje bioloških uzoraka i transport do mikrobiološkog

laboratorija
• Izrada direktnih preparata i mikroskopiranje
• Nasijavanje na sterilne hranjive podloge i inkubacija u termostatu 24 sata.
• Očitavanje porasle kulture na podlogama identifikacija morfologije
kolonija.
• Presijavanje sumnjivih kolonija za dobivanje čiste kulture.
• Izrada specifičnih testova za identifikaciju bakterijske vrste
• Izrada seroloških testova za dokaz antigene grupe bakterije
• Izrada biokemijskih testova za dokaz fizioloških osobina bakterije
• Izrada testa antibiograma identificirane bakterijske vrste
• Očitavanje antibiograma i izdavanje nalaza
 BIOKEMIJSKI TESTOVI

• U ovoj temi nastavljamo sa postupcima

identifikacije patogenih mikroorganizama i
upoznati ćemo se sa BIOKEMIJSKIM
TESTOVIMA za dokazivanje fizioloških osobina
bakterija.
DOKAZIVANJE
FIZIOLOŠKIH ili
BIOKEMIJSKIH
OSOBINA
BAKTERIJA
Pripremila:Ines Mišetić Lašić,
bacc.med.lab.dijag.,Zdravstvena
škola,Split
 Princip i važnost izvođenja testova za
dokazivanje fizioloških osobina
bakterija
• Biokemijski testovi imaju veliki značaj u
identifikaciji patogenih vrsta.
Vrste testova koji se koriste u dijagnostici:
• Jednostavni pojedinačni testovi – dokazuje se
samo jedna biokemijska osobina bakterije.
• Kombinirani testovi – dokazuje se više
biokemijskih osobina bakterijske vrste.
• Tijekom laboratorijske dijagnostike pretrage kojima se ispituju morfološke i uzgojne
osobine bakterije nisu dovoljne za identifikaciju bakterijske vrste. Stoga se moraju istražiti
njihova fiziološka svojstva tj. dokazati prisutnost ili odsutnost bakterijskih enzima po čemu
se bakterije međusobno razlikuju.

• PRINCIP DOKAZIVANJA
• Osnovni princip određivanja metaboličke aktivnosti bakterija temelji se na tome
da se bakterija uzgoji na biokemijskim hranjivim podlogama koje sadrže hranjive
tvari koje bakterijski enzimi razgrađuju. Ovisno o tome da li bakterija razgrađuje
hranjivu tvar, nakon inkubacije indikator iz podloge mijenja boju same podloge.
• Za identifikaciju bakterija određuje se njihov odnos prema :
- uglikohidratima
- bjelančevinama
- aminokiselinama
- amidima
- citratu
- nukleinskim kiseliname
- tvorba hemolizina,reduktaze i esteraze
 TVORBA HEMOLIZE
• Bakterije iz rodova Streptococcus i Staphylococcus se razlikuju po
stvaranju enzima hemolizina koji razgrađuje eritrocite iz krvi.
Različite bakterijske vrste proizvode različite hemolizine i to se
koristi pri identifikaciji vrsta.
• Postupak: bakterijska kultura se nacijepi na krvni agar i nakon
inkubacije se očita dokaz tvorbe hemolizina – vidi se prozirna zona
hemolize (razgradnje eritrocita iz podloge) oko poraslih kolonija.
• Vrste hemolize:
– Alfa hemoliza – nepotpuna razgradnja eritrocita – oko kolonija se vidi
maslinasto zelena zona
– Beta hemoliza – potpuna razgradnja eritrocita – oko kolonija je prozirna
zona
– Gama hemoliza – nema hemolize, bakterije ne luče hemolizin
DOKAZ RAZGRADNJE UGLJIKOHIDRATA
• Upotrebljavaju se tekuća hranjiva bakteriološka podloga peptonska voda koja
osim osnovnih tvari sadrži dodani ugljikohidrat i indikator npr. Andradeov
indikator ili fenolno crvenilo. Peptonska voda s ovim indikatorom je bezbojna, a
ako bakterija koju smo nacijepili u podlogu razgrađuje ugljikohidrat nakon
inkubacije promijeni se boja u crvenu. Podloga s fenolnim crvenilom je crvene
boje a razgradnjom šećera mijenja boju u žutu.

• Ako se gleda da li bakterija pri razgradnji šećera stvara plinove ( CO2 i H 2) u

tekuću podlogu se stavi Durhamova epruvetica s otvorom prema dnu
epruvete. Plin koji nastaje istiskuje podlogu iz epruvetice pa vidimo mjehurić
plina u njoj.

• Ugljikohidrati koji se najčešće ispituju i dodaju u podlogu su glukoza, saharoza,

laktoza, manoza, arabinoza.
Razgradnja šećera u tekućoj podlozi
 VOGES PROSKAUEROV POKUS
• Ovim pokusom dokazuje se sposobnost bakterija da pri
fermentaciji glukoze u bujonu tvore spoj acetoin
( acetilmetilkarbinol).
• Nakon završenog uzgoja u podlogu se doda reagens koji
promijeni boju podloge u boju višnje ako je pozitivan rezultat.
• Pri negativnoj reakciji mijenja se boja podloge u žutu.
 TVORBA INDOLA
• Neke bakterije sposobne su svojim enzimima ( triptofanaze )
razgraditi aminokiselinu triptofan iz tekuće podloge, a pri
tome nastaje spoj indol.
• Nakon uzgoja u podlogu se doda Kovačev reagens i stvaranje
indola se vidi kao pojava crvenog prstena na vrhu tekuće
podloge.
• Negativan rezultat – smeđi prsten.
 HIDROLIZA UREE
• Neke bakterije imaju sposobnost da stvaraju enzim ureazu koji
razgrađuje ureu.
• Podloga: Christensenova podloga u vidu kosog agara žute boje

• Pozitivan rezultat - indikator promijeni boju podloge u

ciklama.
• Negativan rezultat - boja podloge se ne mijenja.
 ISKORIŠTAVANJE CITRATA
• Gleda se da li bakterija koristi citrat iz podloge kao izvor ugljika
i energije.
• Podloga: Simmonsova – kosi agar zelene boje koji sadrži citrat
i indikator brom timol modrilo koji mijenja boju podloge u
modru ako se koristi citrat.
• Negativan rezultat-boja podloge ostaje nepromijenjena.
 KOMBINIRANE PODLOGE /Testovi/ZA
DOKAZIVANJE FIZIOLOŠKIH OSOBINA
BAKTERIJA ( za dokazivanje više osobina
istodobno)

• KLIGLEROV AGAR

• API –niz
 KLIGLEROV AGAR
• Kosi agar crvene boje(dvostruki šećer po
Kligleru)
• Sadrži glukozu, laktozu i željezo sulfat.
• Nakon uzgoja gleda se da li bakterija razgrađuje
glukozu i laktozu i stvara li plin sumporovodik.
• Razgradnjom šećera podloga mijenja boju u
žutu, a stvaranje H2S vidi se po pojavi crnog
taloga na dnu epruvete.
Potpuna razgradnja glukoze i laktoze
Laktoza – neg.
Glukoza – poz.
Laktoza i glukoza – poz. + H2S
Glukoza – poz. + H2S
 API –niz
• Radi brže i jednostavnije dijagnostike bakterija koriste
se minijaturni nizovi od 10 ili 20 mini dehidriranih
biokemijskih podloga kojima se identificiraju
bakterijske vrste. Određuje se više fizioloških osobina
bakterije odjednom, npr. API 10 i API 20
• API 20 –koristi se u dijagnostici enterobakterija. Taj se
niz sastoji od plastičnog podloška s 20 mini udubljenja
(epruvetica) s 20 različitih biokemijskih dehidriranih
podloga koje sadrže različite hranjive tvari i indikatore.
Api – 10

Api - 20
Api zraka sa priborom za apliciranje
 Princip i postupak rada
• Napravi se suspenzija čiste bakterijske kulture koju ispitujemo, u 5 ml
destilirane vode.
• Pomoću pasterove pipete ukapa se suspenzija u sva udubljenja, zatvori se
plastični podložak i Api niz se stavi na inkubaciju. Na ovaj način se
dehidrirana podloga otopi i nacijepi se bakt. kultura.
• Postupak nacijepljivanja – u sva udubljenja ukapa se suspenzija do pola, a u
podloge označene kvadratićem do vrha epruvetice. U podloge koje su
pocrtane dokapa se kap mineralnog ulja.
• Očitavanje – Nakon inkubacije uz pomoć uz upute dobivene uz test i tabele
za očitavanje pozitivnog ili negativnog rezultata očita se rezultat. Ako
bakterija razgrađuje tvar iz podloge ona obično promijeni boju. Ovako
odredimo više fizioloških osobina bakterije odjednom i identificiramo
bakterijsku vrstu, jer se bakterijske vrste razlikuju po fiziološkim osobinama.
Priprema
bakterijske
suspenzije za
nacjepljivanje
Nacjepljivanje
suspenzije u
api traku
Nalaz za upis
rezultata
Tabela za očitavanje
rezultata
 Zadatak za
učenike

• Nakon što proučite

prezentaciju,
prepoznajte vrstu ovih
biokemijskih podloga
(na slici),te navedi
njihov sastav i
namjenu?

Nastavnik:Ines Mišetić
Lašić
 ZAKLJUČAK(važno)
• Biokemijski testovi su jako važni u identifikaciji
patogene bakterijske vrste.
• Značaj tih testova je činjenica da se bakterijske
vrste razlikuju po fiziološkim osobinama koje
odredimo testovima.
• Ovim načinom lakše identificiramo patogenu
bakterijsku vrstu .
• Kombinirani testovi ubrzavaju tijek pretrage i
identifikacije patogenih vrsta.
 Pitanja za ponavljanje i vrednovanje za učenje

• Što su to biokemijske hranjive podloge?

• Što sadrže biokemijske podloge?
• Navedi osnovno načelo dokazivanja fizioloških osobina
bakterija?
• Objasni kako razlikujemo bakterije po sposobnosti razgradnje
eritrocita?
• Objasni kako dokazujemo da li bakterija tvori spoj indol?
• Objasni kako se dokazuje sposobnost bakterija da tvore spoj
indol?
• Što su kombinirani biokemijski testovi,navedi koje znaš?
• Objasni važnost, te način izvođenja i očitavanja API-testova?