KLONIRANJE, REKOMBINANTNA DNA TEHNOLOGIJA,

GENETIČKO INŽENJERSTVO

• Klon = populacija stanica ili organizama koji su genetički

identični, a nastali su binarnom diobom (bakterije) ili
mitozom iz jedne stanice ili vegetativnim razmnožavanjem
zajedničkog pretka
• Nespolno razmnožavanje u prirodi = kloniranje:
• Jednostanični eukarioti (npr. praživotinje)
• Jednostanične alge
• Biljke
• Čovjek; monozigotni, jednojajčani
blizanci
• Vegetativno razmnožavanje u biljaka – razmnožavanje
pomoću vegetativnih organa koji se odvajaju od roditeljske
biljke i iz njih se razvije nova biljka
• Vegetativno razmnožavanje povezano je s mogućnošću
neograničenog rasta i diobama meristemskih stanica
• Jagode – vriježe; đurđica – podanci; luk – lukovice, kalanhoe –
na rubovima lisne plojke razvijaju se male biljčice koje se
nakon odvajanja od majčinske biljke razvijaju u novu biljku
• Iz pojedinih dijelova biljke (stabljika, korijen, list) mogu se
razviti (regenerirati) čitave biljke – razmnožavanje ukrasnih
biljaka i voćaka reznicama; npr. afrička ljubica
• Poseban način nespolnog razmnožavanja su
apomiksija i partenogeneza
• APOMIKSIJA = razvitak sjemenke bez oplodnje,
sjemenka se može razviti iz neoplođene jajne
stanice ili iz bilo kojeg diploidnog dijela tučka
(maslačak)
• PARTENOGENEZA = razvoj embrija iz neoplođene
jajne stanice; u nekih zadružnih kukaca (pčele)
• Neke životinjske vrste razmnožavaju se
partenogenezom samo u nepovoljnim životnim
uvjetima, dok se druge isključivo razmnožavaju
partenogenezom, pa su sve jedinke ženskog spola –
pri tome se nakon mejoze udvostručuje broj
kromosoma u jajnoj stanici koja se razvije u zigotu
(neke vrste guštera, moljci, oblići itd.)
 KLONIRANJE BILJAKA U LABORATORIJSKIM UVJETIMA

• Tehnikama kulture biljnih stanica i tkiva in vitro mnoge biljne

vrste mogu se klonirati u laboratoriju
• In vitro = uzgoj u staklenim posudama
• U sterilnim i strogo kontroliranim uvjetima moguće je iz
malih dijelova biljke ili čak iz pojedinih stanica uzgojiti
čitavu biljku
• 1952. F.C. Steward – mrkva
• Stanice u kulturi se intenzivno dijele stvarajući nakupine
nediferenciranih stanica ili kalusno tkivo iz kojega se može,
ovisno o sastavu hranidbene podloge, potaći razvitak
izdanaka i/ili korijena, dakle novih biljčica
• Takve se biljčice mogu iz epruvete prenijeti u zemlju
• Na taj se način neka majčinska biljka može klonirati u veliki
broj genetički identičnih potomaka
• Stewardov pokušaj regeneracije mrkve iz jedne
diferencirane stanice - dokaz totipotentnosti biljne stanice
 KLONIRANJE ŽIVOTINJA U LABORATORIJSKIM
UVJETIMA

• Totipotentnost je puno teže pokazati u životinja

• Pokusi na vodozemcima (Xenopus levis)
• Sposobnost razvoja novog organizma prvenstveno ovisi o fazi
razvoja stanica koje se koriste kao donori diploidne jezgre
• Ako je donor nediferencirana stanica embrija iz većine će se jajnih
stanica s transplantiranom jezgrom razviti punoglavci
• Ukoliko se koriste diferencirane stanice punoglavca (npr. stanice
crijeva) u manje od 2% slučajeva će doći do razvoja punoglavca
• Jezgre stanica rane embrionalne faze razvitka još uvijek su
totipotentne, dok je to rijetkost u već diferenciranih stanica
• Iako diferencirane stanice imaju identičan genetički materijal kao i
embrionalne, očito je da su neki geni nepovratno inaktivirani, te je
potrebno poznavati uvjete pod kojima bi se aktivnost gena vratila
PRESAĐIVANJE JEZGRE U VODOZEMACA
• Prvi sisavac kloniran iz diferencirane stanice odrasle
životinje bila je ovca Dolly (škotski znanstvenici s Instituta
Roslin, 1996.)
• Uzeli su tri različite diferencirane stanice kao stanice
donore nasljedne tvari: 1. stanice mliječnih žljezda 6-
godišnje ovce u posljednjem trimestru trudnoće; 2. stanice
fetusa starog 26 dana; 3. stanice embrija starog 9 dana
• Najbolje su rezultate dobili s jezgrama stanica mliječnih
žlijezda
• Janje Dolly prvi je sisavac kloniran iz diferencirane stanice
• Znanstvenicima je uspjelo reprogramirati genetički materijal
već diferencirane somatske stanice te iskoristiti njen
embriogeni potencijal za razvitak novog organizma
 REKOMBINANTNA DNA TEHNOLOGIJA ILI GENETIČKO
INŽENJERSTVO

• Niz molekularno-genetičkih metoda uz pomoć kojih je

moguće mijenjati nasljednu tvar stanice
• Razdoblje rekombinantne DNA tehnologije započelo je
otkrićem restrikcijskih enzima, 70.-tih godina prošlog
stoljeća
• 1978. Nobelova nagrada za fiziologiju i medicinu: W. Arber,
H. Smith i D. Nathans – rad na otkriću restrikcijskih enzima
(endonukleaza)
• Restrikcijske endonukleaze su enzimi koje bakterija koristi
za razgradnju strane DNA (virusne)
• Enzim prepoznaje određenu nukleotidnu sekvencu
(restrikcijsko mjesto) od 4 do 8 nukleotidnih parova, te
cijepa na tom mjestu (ili u neposrednoj blizini) dvolančanu
DNA
• Poznata su tri tipa restrikcijskih endonukleaza (prema vrsti
sekvence koju prepoznaju, prirodi cijepanja DNA i strukturi
enzima)
• Restrikcijske endonukleaze tipa I i III nisu pogodne za
kloniranje gena jer cijepaju DNA na mjestima koja nisu
restrikcijska
• Tip II endonukleaze prepoznaje točno određena mjesta
(restrikcijska mjesta); obrnuto ponavljajuće sekvence
(palindromi – čitaju se isto i slijeva i s desna npr. HANNAH)
• DNA stanice domaćina ima ista restrikcijska mjesta, ali su
ona zaštićena od restrikcijskih enzima zbog metilacije
• Tehnologija rekombinantne DNA bazira se na ugradnji
stranog gena od posebnog interesa u genom prokariotske ili
eukariotske stanice
• To se radi uz pomoć plazmida ili faga koje nazivamo
vektorima
• Postupak: izolacija strane DNA i izrezivanje željenih gena
pomoću restrikcijskih enzima, ugradnja u vektorsku DNA
(enzim ligaza), vektor ulazi u stanicu domaćina gdje se
umnožava stvarajući mnogobrojne kopije strane DNA, geni
strane DNA koji su ugrađeni u vektor mogu se prepisati i
prevesti u željeni polipeptidni produkt
• Kao stanica domaćin najčešće se koristi bakterija E. coli u
koju se unose vektori sa željenim genima čijom ekspresijom
nastaju velike količine proteinskih produkata
• Takve genetički promijenjene bakterije koriste se za
proizvodnju lijekova (antibiotici), cjepiva i drugih supstancija
za liječenje i laboratorijska istraživanja
• Također se koriste za čišćenje okoliša od zagađivača, za
obogaćivanje tla, za ubijanje kukaca nametnika, za otkrivanje
minskih polja itd.
• Prokariotski vektori – rekombinantni plazmidi (hibridni
plazmidi, hibridni vektori, himerični plazmid)
• Kozmidi – plazmidi sa cos mjestom (12 baza, jednolančana
DNA, kohezivni ili ljepljivi krajevi, λ fag)
• Kozmidi se prenose u bakterijsku stanicu uz pomoć
bakteriofaga λ (u glavi faga nalazi se linearna molekula, a
kada uđe u domaćina onda postane kružna sljepljivanjem
kohezivnih krajeva)
• Kozmidi dozvoljavaju kloniranje velikih dijelova DNA (do 50
kb) jer se mali kozmidi ne mogu upakirati u glavu faga
Kozmid, plazmid sa cos mjestom koji se prenosi u bakteriju
preko bakteriofaga λ. Cos mjesta su jednolančana.
Selekcija hibridnog vektora
• Ponekad u prokariotskoj stanici nije moguće potpuno
eksprimirati neke eukariotske gene jer stanica nema enzime
za postranskripcijsku i posttranslacijsku modifikaciju; stoga
se koriste eukariotski vektori
• Kvasac, S. cerevisiae, ima prirodni plazmid oko 2 mm dužine
• Konstruira se bakterijski plazmid sa CEN regijom i izvorom
replikacije kvasca (Takav plazmid može imati i telomernu
sekvencu (YAC), a može nositi veliki dio strane DNA (800 kb
i više) što je vrlo pogodno upravo za eukariotske geneARS)
koji se prenosi iz generacije u generaciju u stanici kvasca
E. coli plazmid pBR322 modificiran za kvasce. Ovaj plazmid se može
replicirati i u stanici kvasca i u E. coli jer ima oba izvora replikacije te
CEN regiju. Ako se linearizira te se na krajeve dodaju telomerne
sekvence nastaje umjetno stvoreni kromosom kvasca (YAC) koji se koristi
za kloniranje velikih dijelova DNA.
 ŽIVOTINJSKI VEKTORI

• U životinja se kao vektori

najčešće koriste tumorski
DNA virusi poput SV40 virusa
(simian vacuolating virus, prvi
puta izoliran u majmuna) koji
može transformirati normalne
stanice miša, kunića i hrčka u
tumorske stanice
• Kao i λ fag i SV40 virion može
nositi dio strane DNA
• Strana DNA može se ubaciti u eukariotsku stanicu metodom
sličnoj bakterijskoj transformaciji, no to se zove
transfekcija (transformacija u eukariota – promjena
normalne stanice u tumorsku)
• Eukariotski organizmi s ugrađenim stranim genima su
transgeni organizmi i vrlo su korisni za istraživanje
ekspresije stranih gena
• 1988. patentiran je prvi transgenični miš koji je podložan
nastanku tumora
• Do danas su miševi uspješno transfecirani štakorskim genom
za hormon rasta, a ovce humanim genom za faktor
zgrušavanja krvi
• Transfekcija se najčešće radi direktnim ubrizgavanjem
strane DNA u oocite ili jedno/dvostanične embrije sisavaca
(miševi) – uspješnost transfekcije je 15%
• Transfekcija se može raditi i uz pomoć retrovirusa (RNA
virusi s genom za reverznu transkriptazu)
 BILJNI VEKTORI

• Najbolji način za unošenje stranih gena u biljnu stanicu je

prirodni sistem transformacije – indukcija “crown-gall” tumora
• Bakterija tla Agrobacterium tumefaciens uzrokuje tumore
vrata korijena (“crown-gall”) mnogih dvosupnica
• “crown-gall” tumor čine biljne stanice transformirane
plazmidom Ti (tumor inducing) iz bakterije A. tumefaciens
• Biljne stanice su transformirane plazmidnom T-DNA
(transferred DNA) koja se ugrađuje u kromosom stanice
domaćina
• Stanice tumora proizvode derivate aminokiselina, opine, koje
koriste bakterije
• Ovaj sistem je vrlo pogodan za manipulaciju stranim genima u
biljnoj stanici
“Crown-gall” bolest na lukovicama
vrste Gladiolus sp.
 PRIMJENA REKOMBINANTNE DNA TEHNOLOGIJE

MEDICINA
• Proizvodnja velikih količina različitih supstancija za
liječenje različitih bolesti (inzulin, interferon, hormon
rasta, faktori rasta, faktori zgrušavanja te cjepiva
protiv hepatitisa B, herpesa, bjesnoće)
• Dijagnostika (proizvodnja različitih protutijela)
• Sekvenciranje humanog genoma – identifikacija gena za
različite bolesti
• Genska terapija – odobrena na ljudima 1990. od
Američkog instituta za zdravlje (prvi pacijent
četverogodišnja djevojčica s nasljednim imunološkim
poremećajem – gen za enzim adenozin deaminazu); u
budućnosti se očekuje liječenje različitih, danas
neizlječivih, bolesti poput AIDS-a, hemofilije, cistične
fibroze, dijabetesa i dr.
GENSKA TERAPIJA
 POLJOPRIVREDA

• Proizvodnja biljaka otpornih na herbicide, sušu,

hladnoću, visoku temperaturu, preveliku količinu
soli, loše uvjete skladištenja i transporta; biljke
bolje prehrambene vrijednosti
• Prva transgenična rajčica (“Flavr Savr”) na tržištu
je od 1994. godine – ima ugrađen gen s
reduciranom aktivnošću enzima poligalakturonaze
(normalna aktivnost enzima uzrokuje prerano
sazrijevanje ploda)
• Trenutno su na tržištu dostupne različite vrste
genetički preinačenih biljaka poput soje, riže,
rajčice, kukuruza, krumpira, duhana, pamuka, dinje,
papaje i dr.
 INDUSTRIJA

• Genetički modificirane bakterije koje razgrađuju

toksični otpad
• Genetički modificirani kvasci koji koriste celulozu
za proizvodnju glukoze i alkohola za gorivo
• Uzgoj alga u marikulturi
• Poboljšanje metoda u prehrambenoj industriji
KLONIRANJE GENA – VAŽNO ZA:

• Kloniranje sisavaca – rutinska procedura

• Istraživanje razvojnih procesa u organizmu
• Stvaranje mnogobrojnih genetički identičnih organizama,
posebice transgeničnih organizama
• Istraživanje ekspresije gena
• Istraživanje procesa starenja
• Interakcija genoma i citoplazme

• REKOMBINANTNA DNA TEHNOLOGIJA

ZAHTIJEVA VELIKI OPREZ i POSTAVLJA MNOGA
ETIČKA PITANJA