‫کروماتوگرافی ستونی‬

‫در کروماتوگرافی ستونی جسم بین فازهای مایع و جامد پخش میشود‪ .‬فاز ساکن جسم جامدی است و این جسم اج زای م ایعی‬
‫را که از آن میگذرد به طور انتخابی در سطح خود جذب میکند و آنها را جدا میکند‪ .‬اثرهایی که باعث جذب سطحی میش وند‬
‫همان اثرهایی هستند که موجب جذب در مولکوله ا میش وند‪ .‬این اثره ا عبارتن د از‪ :‬جاذب ه الکترواس تاتیکی‪ ،‬ایج اد کمپلکس‪،‬‬
‫پیوند هیدروژنی‪ ،‬نیروی واندروالس و غیره‪.‬‬

‫برای جدا کردن یک مخلوط با کروماتوگرافی ستونی‪ ،‬ستون را با جسم جامد فعالی (فاز ساکن) مانند آلومینا یا س یلیکاژل پ ر‬
‫میکنند و کمی از نمونه مایع را روی آن میگذارند‪ .‬نمونه ابتدا در باالی ستون جذب میشود‪ .‬سپس حالل استخراج کننده ای را‬
‫در داخل ستون جریان میدهند‪ .‬این فاز مایع متحرک‪ ،‬اجزای مخلوط را با خود میبرد‪ .‬ولی به علت نیروی جاذبه انتخابی ف از‬
‫جامد‪ ،‬اجزای مربوط میتوانند با سرعتهای مختلفی به طرف پایین ستون حرکت کنند‪ .‬ترکیبی که با نیروی کم تری ج ذب ف از‬
‫ساکن شود سریعتر خارج میشود زیرا که درصد مولکولی آن در فاز متحرک از ترکی بی ک ه ب ا ن یروی زی ادتری ج ذب ف از‬
‫ساکن میشود بیشتر است‪.‬‬

‫اجزای تفکیک شده را میتوان مجددا به دو روش به دست آورد‪:‬‬

‫‪ )1‬مواد جامد ستون را میتوان خارج کرد و قسمتی از آنرا که حاوی باند مورد نظر است بری د و ب ا حالل مناس ب اس تخراج‬
‫کرد‪.‬‬

‫‪ ) 2‬چون باندها با زمانهای مختلفی خارج میشوند میتوان آنقدر حالل را از ستون عبور داد تا باندها از انتهای آن خارج ش وند‬
‫و در ظرف جداگانه ای بریزند‪.‬‬

‫معموال روش دوم کاربرد بیشتری دارد‪.‬‬

‫در مورد اجسام رنگین میتوان باندهایی را که به طرف پایین ستون می آیند مستقیما مشاهده کرد‪.‬‬

‫‪ ‬اما در مورد اجسام بیرنگ نمیتوان تغییرات را مس تقیما مش اهده ک رد‪ .‬ب ا این ح ال بس یاری از اجس ام در هنگ ام ت ابش ن ور‬
‫ماورای بنفش فلوئورسانس پیدا میکنند و در چنین مواردی از این خاصیت جهت مشاهده باندها استفاده میشود‪ .‬معم وال ب رای‬
‫پی بردن به جریان عمل کروماتوگرافی ستونی حجمهای کوچ ک و ث ابتی (مثال ‪ 25‬میلی لی تر) از محل ول اس تخراج ش ده را‬
‫جمع آوری میکنند‪ .‬سپس حالل آنها را تبخیر میکنند تا ببینند جسمی در آنها وجود دارد یا خیر‪ .‬گرچه ممکن اس ت ی ک جس م‬
‫در چند ظرف پخش شود‪ ،‬ولی اگر حجم هر ج زء نس بتا کم گرفت ه ش ود (مثال کم تر از ‪ %10‬حجم س تون) معم وال بان دهای‬
‫مختلف در ظروف مختلف جمع آوری میشوند‪ .‬روش دیگری که برای پی بردن به وضع تفکی ک مناس ب اس ت آن اس ت ک ه‬
‫محلول استخراج شده در فاصله زمانی مختلف با کروماتوگرافی الیه نازک مورد بررسی قرار گیرد‪.‬‬

‫تعدادی از جاذبهای جامدی که عموما مصرف میشوند عبارتند از‪ :‬آلومینا‪ ،‬سیلیکاژل‪ ،‬فلورسین‪ ،‬زغال چوب‪ ،‬منیزیم اکس ید‪،‬‬
‫کلسیم کربنات‪ ،‬نشاسته و شکر‪ .‬معموال شیمیدانهای آلی از آلومینا‪ ،‬سیلیکاژل و فلورسین بیشتر استفاده میکنند‪.‬‬
‫آلومینا (‪ )Al2O3‬ترکیب قطبی بسیار فعالی است که قدرت جذب زیادی دارد و به سه صورت موج ود اس ت‪ :‬خن ثی‪ ،‬شس ته‬
‫شده با اسید و شسته شده با باز‪ .‬آلومینای بازی برای ترکیبهای اسیدی و آلومینای اسیدی برای ترکیبهای بازی ق درت تفکی ک‬
‫خوبی نشان میدهد‪ .‬در ترکیبهایی که به شرایط اسیدی و بازی حساسیت دارند و واکنش شیمیایی دارند باید از آلومینای خن ثی‬
‫استفاده کرد‪ .‬آلومینا با قطبیت زیادی که دارد ترکیبهای قطبی را به شدت جذب میکند و در نتیج ه ممکن اس ت اس تخراج آنه ا‬
‫از ستون را مشکل کند‪ .‬فعالیت (قدرت جذب) آلومینا را میتوان با افزایش کمی آب کاهش داد‪ ،‬درجه فعالیت آلومینا با درص د‬
‫وزنی آب موجود مشخص میشود‪ .‬سیلیکاژل و فلورسین هم قطبی هستند ولی قطبیت آنها از آلومینا کمتر است‪.‬‬

‫برای اینکه جاذبهای جامد نیروی موثر تری داشته باشند‪ ،‬باید اندازه ذرات آنها یکنواخت و سطح مخصوص آنها زی اد باش د‪.‬‬
‫چنین سطحی باعث تسریع تعادل جسم در دو فاز میشود‪ .‬این حالت در ایجاد باندهای باریک اهمیت دارد‪.‬‬

‫در تعیین شرایط یک تجربه کروماتوگرافی باید به ماهیت فاز مایع (حالل) مص رفی توج ه ک رد‪ .‬حالل ن یز میتوان د در جس م‬
‫جامد جذب شود و به این وسیله برای جذب مواضع جذبی که در سطح جامد وجود دارند‪ ،‬با جسم حل شده رقابت کند‪ .‬چنانچه‬
‫حالل قطبی تر باشد و شدیدتر از اجزای مخلوط جذب شود‪ ،‬تقریبا تمام اجزاء در فاز مایع متحرک باقی میمانند و تفکیکی که‬
‫در ضمن تجربه ص ورت میگ یرد ن اچیز خواه د ب ود‪ .‬در نتیج ه ب رای این ک ه تفکی ک خ وب انج ام ش ود بای د قط بیت حالل‬
‫استخراجی به طور قابل مالحظه ای کمتر از اجزای مخلوط باشد‪ .‬به عالوه باید اجزای مخلوط در حالل حل شوند‪ ،‬زی را در‬
‫غیر این صورت اجزا به ط ور دایم در ف از س اکن س تون ج ذب میش وند و در آن ب اقی میمانن د‪ .‬ق درت اس تخراجی حالله ای‬
‫مختلف (یعنی توانایی آنها در انتقال یک جسم معین به پایین ستون) بترتیب زیر از باال به پایین زیاد میشود‪:‬‬

‫هگزان ‪ ,‬کربن تترا کلرید ‪  ,‬تولوئن ‪ ,‬بنزن ‪ ,‬دی کلرومتان ‪ ,‬کلروفرم ‪ ,‬اتیل اتر ‪ ,‬اتیل استات ‪ ,‬استون‬

‫پروپانول‪ ,‬اتانول ‪ ,‬متانول ‪ ,‬آب‬

‫در یک کروماتوگرافی ستونی ساده نمونه را در باالی ستون میگذارند و در ط ول تفکی ک از حالل واح دی اس تفاده میکنن د‪.‬‬
‫بهترین حالل انتخابی‪ ،‬حاللی است که بیشترین فاصله را در باندها ایجاد کند‪ .‬چون احتماال بهترین حالل در اثر تجربه بدست‬
‫می آید‪ ،‬گاهی راحتتر است که در انتخ اب حالل ب رای کروم اتوگرافی س تونی از روش کروم اتوگرافی الی ه ن ازک اس تفاده‬
‫شود‪ .‬تعداد زیادی از تجربه های کروماتوگرافی الیه نازک را میتوان با استفاده از حاللهای مختلف‪ ،‬در زمان نس بتا کوت اهی‬
‫انجام داد‪ .‬معموال بهترین حالل یا مخلوط حاللی که به این روش به دست می آید برای کروماتوگرافی ستونی مناسب است‪.‬‬

‫معموال از روشی ک ه ب ه اس تخراج ت دریجی (ی ا ج زء ب ه ج زء) مع روف اس ت اس تفاده میش ود‪ .‬در این روش ب رای ظه ور‬
‫کروماتوگرام از یک سری حاللهایی استفاده میکنند که قطبیت آنها مرتبا رو به افزایش میرود‪ .‬در شروع ب ا ی ک حالل غ یر‬
‫قطبی (معموال هگزان) ممکن است یک باند به طرف پ ایین س تون ح رکت کن د و از آن خ ارج ش ود و در این ح ال بان دهای‬
‫دیگر در نزدیکی ابتدای ستون باقی بمانند‪ .‬سپس حاللی که قطبیت آن اندکی بیشتر است به کار میبرند‪ .‬در حالت ای ده آل بای د‬
‫یک باند دیگر خارج شود و در این حال بقیه باندها در عقب آن باقی بمانند‪ .‬چنانچه قطبیت حالل یکباره زیاد باال رود‪ ،‬ممکن‬
‫است تمام باندهایی که باقی مانده اند یکباره از ستون خارج شوند‪ .‬بنابر این باید در هر مرحله قطبیت حالل به مق دار کم و ب ا‬
‫قاعده معینی افزایش یابد‪ .‬بهترین راه انجام این کار آن است که از حاللهای مخلوط استفاده شود و تعویض کامل حالل چن دان‬
‫مناسب نسیت‪.‬‬

‫طریقه پر کردن ستون بسیار اهمیت دارد زیرا ستونی که خوب پر نشود اجزاء را هم خوب تفکیک نمیکند‪ .‬جسم پرش ده بای د‬
‫همگن باشد و در آن هوای محبوس یا حباب بخار وجود نداشته باشد‪.‬‬

‫کروماتوگرافی روی کاغذ‬

‫انواع جداسازی های مختلف و ساده بر روی کاغذ به عنوان پیشروان کروماتوگرافی کاغذی توصیف شده اند‪.‬‬

‫در این روش فاز ثابت یک محیط آبی است که مولکولهای آن با رش ته ه ای س لولی کاغ ذ کروم اتوگرافی پیون دهای محکمی‬
‫دارد و فاز متحرک یک حالل آلی اس ت ک ه ب ا خاص یت م وئینگی از خالل کاغ ذ عب ور می کن د‪ .‬در این روش قط ره ای از‬
‫محلول حاوی مخلوطی که باید جدا شود را روی سک صفحه یا نوا کاغذ صافی در محل عالمت گذاری شده ق رار می دهن د‪.‬‬
‫در این محل‪ ،‬قطره به صورت یک لکه حلق وی پخش می‌ش ود‪ .‬وق تی ک ه لک ه خش ک ش د‪ ،‬کاغ ذ را در ی ک ظ رف مناس ب‬
‫سربسته طوری قرار می دهند که یک سر آن در حالل انتخاب شده به عنوان فاز متحرک ف رو رود (لک ه نبای د ت وی محل ول‬
‫قرار گیرد چون لکه از کاغذ شسته می شود)‪ .‬حالل از طریق الیاف کاغذ در نتیجه کاغ ذ در نتیج ه عم ل م وئینگی نف وذ می‬
‫کند و اجزا مخلوط را به میزانهای مختلف در جهت جریان حمل می کند‪ .‬نکته مهم این است که سطح کاغذ نباید کامالً بوسیله‬
‫حالل پوشانده شود‪ ،‬زیرا در این صورت اصالً جداسازی صورت نمی گیرد و یا نواحی خیلی پخش می شوند‪ .‬وقتی که حبهه‬
‫حالل مسافت مناسبی را طی کرد یا بعد از یک زمان قابل قبول‪ ،‬کاغذ را از تانک ب یرون آورده‪ ،‬جبه ه حالل را ب ا عالم تی‬
‫مشخص می کنند و مهلت می دهند تا کاغذ خشک شود‪.‬‬

‫اگر اجسام رنگی؛ باشند به صورت نواحی یا لکه هایی مجزا مشخص شوند‪ .‬هدف این است که لک ه ه ا فش رده و ج دا از هم‬
‫باشند‪ .‬اگر لکه رنگی نب وده بای د ب ه روش های ش یمیایی ی ا ف یزیکی آن را تش خیص داد‪(.‬اس تفاده از واکنش گر مک ان ی اب ی ا‬
‫ماورابنفش) ساده ترین روش شناسایی بر اساس ‪ Rf‬یعنی نسبت فاصله طی شده بوسیله لکه تقسیم ب ر فاص له طی ش ده جبه ه‬
‫حالل است‪.‬‬

‫‪ ‬‬

‫‪ ‬‬

‫ب رای تفکیکی مطمئن ت ر‪ ،‬از کروم اتوگرافی کاغ ذی دو بع دی اس تفاده می ک نیم‪ .‬در این ح الت پس از اینک ه مرحل ه اول‬
‫کروماتوگرافی تمام شد‪ .‬کاغذ صافی را با زاویه ‪ 90‬درجه می چرخانیم و مجدداً با حالل دیگری عمل گروم اتوگرافی را پی‬
‫می گیریم در نتیجه این عمل تفکیک مخلوط مورد نظر‪ ،‬بسیار دقیق تر صورت می گیرد‪.‬‬

‫موارد استعمال کروماتوگرافی کاغذی‪:‬‬

‫‪ -1‬جداسازی آمینو اسید ها و پپتیدها در بررسی ساختارهای پروتئین ها‬

 ‫‪ -2‬آزمایش روزمره ادرار و سایر مایعات بدن برای اسید آمینه ها و قندها‬

‫‪ -3‬جداسازی بازهای پورین و نوکلئوتیدها در آزمایش اسید نوکلئیک‬

‫‪ -4‬جداسازی استروئیدها‬

‫‪ -5‬جداسازی ترکیبات عالمت دار بوسیله رادیوایزوتوپ ها‬

‫مواردی که در جداسازی بوسیله کروماتوگرافی کاغذی موفق نبودند‪:‬‬

‫‪ -1‬جداسازی اجسام فرار غیر فعال مانند هیدروکربن ها‬

‫‪ -2‬اسیدهای چرب فرار‬

‫‪ ‬‬

‫کروماتوگرافی الیه نازک‬

‫در این روش که همان کروماتوگرافی اصالح شده است‪ ،‬جاذب به صور الیه نازکی ب ا ض خامت یکن واخت روی ی ک تکی ه‬
‫گاه صت بی اثر پخش می شود که معم والً از ص فحات شیش ه ای اس تفاده می کنن د‪ .‬ج اذب جام د ب ه ص ورت پ ودر ری ز را‬
‫معموالً با آب و گاهی با یک مایع آلی فرار به صورت خمیز در می آورند و آن را بوسیله دستگاههای پخش کننده تج اری ی ا‬
‫یک پخش کننده خانگی یا حتی با دست روی صفجه پخش می کنند‪( .‬ح تی ب ا پاش یدن ی ا ف رو ب ردن ن یز امک ان پ ذیر اس ت)‬
‫صفحه پوشیده از خمیر را خشک و با گرم کردن آن در حدود ‪ 100‬درجه به مدت از قبل تعیین شده‪ ،‬آن را فعال می کند‪.‬‬

‫محلولی از نمونه در یک حالل فرار را به وسیله پیپت یا روی صفحه قرار می دهند‪.‬‬

‫وقتی که لکه خشک شد صفحه را به طور عمود در تانک سرنگ طوری ق رار می دهن د ک ه لب ه پ ایینی آن در ف از متح رک‬
‫انتخاب شده فرو رود‪ ،‬بدین ترتیب جدا سازی با استفاده از کروماتوگرافی صعودی انجام می شود‪.‬‬

‫در پای ان‪ ،‬حالل را از ص فحه تبخ یر می کنن د و لک ه ه ای ج دا ش ده را بوس یله روش های ف یزیکی ی ا ش یمیایی ش بیه روش‬
‫کروماتوگرافی کاغذی آشکار و شناسایی می کنند‪.‬‬

‫کروماتوگرافی کاغذی (‪: ) P.C‬‬

‫این روش بر پایه حرکت حالل روی نوارهایی از کاغذ صافی استوار است ( چون کاغذ از سلولز ساخته شده قطبی و دارای‬
‫مقدار زیادی ‪  OH‬می باشد )‬

‫با این روش می توان رنگ های تشکیل دهنده جوهر سیاه را جدا سازی و شناسایی کرد ‪ .‬در این روش فاز ث ابت عکس ف از‬
‫متحرک است یعنی اگر فاز متحرک قطبی باشد فاز ثابت باید غیر قطبی باشد ‪.‬‬
‫برای انجام کروماتوگرافی کاغذی یک یا چند قطره از محلول آن را نزدیک انتهای قطعه ای از کاغذ صافی می چکاند ( لکه‬
‫گذاری ) بعد از خشک شدن قطره ها‪  ‬کاغذ را از قسمت لکه گذاری شده در حالل مناسبی فرو می برند بدون اینکه لکه وارد‬
‫حالل شود حالل هم زمان با حرکت خود در طول کاغذ م واد را از لک ه ح ل ک رده ب ا خ ود ب اال می ب رد ه ر دو ب ا س رعتی‬
‫متفاوتی نسبت به بقیه حرکت می کنند جریان حالل تا مدت زمان معینی ادامه می یابد سپس کاغذ را خش ک می کنن د و م واد‬
‫جدا شده در صورت رنگی بودن بی رنگ مشاهده می شوند‬

‫عالوه بر جداسازی رنگ ها ‪   ,‬جدا سازی و شناسایی آمینو اسید ها موجود در آب میوه و ج دا س ازی و شناس ایی قن د ه ا ب ه‬
‫طور مجزا از طریق کروماتوگرافی امکان پذیر است‬