Bài 1.

1.1. Điện di một chiều

 Nguyên lý:
Dựa trên chuyển động của các phân tử tích điện trong dung dịch dưới
tác dụng của dòng điện. Trong quá trình điện di phân tử tích điện sẽ di chuyển
về điện cực có điện tích trái dấu với nó phân tách nhau theo khối lượng. Một
hỗn hợp các phân tử có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác
nhau và được phân tách.

 Ứng dụng:
- Kiểm tra kết quả PCR của DNA ( điện di trên gel argarose).
- Kiểm tra biểu hiện protein ( điện di biến tính hoặc không biến tính trên gel
polyarcrylamide).
- Tinh sạch protein.

1.2. Điện di hai chiều

 Nguyên lý:
Phân tích protein theo hai chiều dựa vào hai đặc tính: chiều thứ nhất
phân tích protein theo điểm đẳng điện của nó (PI) - isoelectric focusing (IEF);
chiều thứ 2: phân tích protein theo khối lượng phân tử (SDS-PAGE). Chúng ta
 có thể xác định điểm đẳng điện của nó dựa trên mức độ pH mà tại đó protein
trở nên trung tính. Trong điện di 2D-Gel, lúc đầu, protein di chuyển qua một
gradient pH đã đặt. Sau đó, protein được phân tách bằng cách sử dụng điện di
trên gel polyacrylamide. Kết quả là, ở chiều thứ hai, các protein phân tách dựa
trên trọng lượng phân tử của chúng.

 Ứng dụng:
- Kiểm tra biểu hiện của protein và tinh sạch protein.

1.3. ELISA
 Nguyên lý:
Dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể. Các mẫu có số lượng
kháng nguyên chưa biết được cố định trên một bề mặt vững chắc- giá thể rắn
(thường là một tấm polystyrene vi chuẩn) hoặc không đặc hiệu (thông qua hấp
phụ lên bề mặt) hoặc đặc hiệu (thông qua chụp bằng kháng thể khác đặc hiệu
với kháng nguyên tương tự trong thí nghiệm ELISA sandwich). Sau khi kháng
nguyên được cố định, các kháng thể phát hiện được thêm vào, tạo thành một
phức hợp với các kháng nguyên. Các kháng thể phát hiện có thể liên kết với
một loại enzyme, hay chính nó có thể được phát hiện bởi một kháng thể thứ
cấp liên kết với một loại enzyme thông qua liên kết cộng hóa trị giữa các phân
tử sinh học. Giữa mỗi bước, các đĩa thường được rửa bằng dung dịch tẩy nhẹ
 để loại bỏ các protein hoặc các kháng thể không gắn. Sau bước rửa cuối cùng,
cơ chất của enzyme được thêm vào để tạo ra tín hiệu có thể nhìn thấy, giúp chỉ
ra số lượng kháng nguyên trong mẫu.

 Ứng dụng: Kiểm tra biểu hiện của protein, xét nghiệm.

1.4. Phân tích khối phổ

 Nguyên lý:
Khối phổ là một công cụ phân tích để đo tỷ lệ khối lượng trên điện tích
( m/z ) của một hoặc nhiều phân tử có trong mẫu. Các phép đo này thường có
thể được sử dụng để tính toán trọng lượng phân tử chính xác của các thành
phần mẫu. Mỗi khối phổ kế bao gồm ít nhất ba thành phần: nguồn ion hóa,
máy phân tích khối lượng, hệ thống phát hiện ion. Các phân tử được chuyển
đổi thành các ion pha khí để chúng có thể di chuyển và điều khiển bằng điện
trường và từ trường bên ngoài. Sau khi bị ion hóa, các ion được sắp xếp và
phân tách theo tỷ lệ khối lượng trên điện tích ( m/z ). Các ion đã tách ra sau đó
được đo và gửi đến một hệ thống dữ liệu nơi các tỷ lệ m/z được lưu trữ cùng
với độ phong phú tương đối của chúng.
 Ứng dụng: Kiểm tra biểu hiện của protein, giải trình tự protein.
Bài 2.

 Nguyên lý:

Sắc ký trao đổi ion là phương pháp tách chiết các chất khác nhau dựa
vào hiện tưởng trao đổi thuận nghịch giữa các ion linh động trong pha tĩnh rắn
( giá thể - chứa chất trao đổi ion hay còn gọi là ionit ) với ion trong pha động
(dung dịch cần phân tích hay chiết rút ) khi cho dung dịch cần phân tích đi qua
cột chứa đầy chất trao đổi ion (ionit). Nguyên tắc của phương pháp này là dựa
vào sự khác nhau về điện tích tổng của các protein, enzyme hay nói cách khác
là dựa trên cơ sở phản ứng trao đổi ion giữa protein chứa trong pha động với
tác nhân trao đổi ion ở pha tĩnh (những chất trao đổi có pI càng gần giá thể thì
tương tác càng yếu và ra trước; những chất trao đổi có pI càng xa giá thể thì
tương tác càng mạnh và ra sau).
 Hình ảnh thiết bị:

 Ứng dụng: Phân tách protein dựa trên độ tích điện (pI); tinh sạch protein; cô
đặc mẫu.
 Ví dụ:
Link: https://doi.org/10.2144/000114575
- Chuẩn bị mẫu: Các mẫu nước ối được lấy từ những phụ nữ mang thai sau
đó ly tâm ở 300xg (10’); 3000xg(20’); 17000xg(25’) và 100000xg(2h).
Pellet cuối cùng được huyền phù bằng dung dịch đệm Tris-HCL 0.05M,
pH 7.6
- Phương pháp
Giá thể: DEAE Sephadex A-50
Dung dịch rửa giải Tris-HCL 0.05M, pH 7.6 chứa NaCL 0.05M, 0.1M,
0.2M và 1M.
Quá trình rửa giải được theo dõi bằng xét nghiện liên kết với lectin bằng
cách sử dụng Convanavalin A và CD63, CD9, CD81.
 Kết quả:
Tách các túi ngoại bào nước ối (afEVs) bằng phương pháp sắc ký trao đổi ion (IEC).
afEV với số lượng lớn (viên 100.000 × g ) đã được xử lý theo tiêu chuẩn IEC
trên cột Sephadex DEAE A-50 được rửa giải bằng dung dịch đệm Tris–HCl 50
mM, pH 7,6 (a) chứa nồng độ muối tăng dần: 50 mM NaCl (b), 100 mM NaCl
(c), 200 mM NaCl (d) và 1 M NaCl (e). (A) Quá trình rửa giải của các phân số
afEV phân giải điện tích được theo dõi bằng cách đo liên kết của các phâần cố
định pha rắn với concanavalin A. OD: mật độ quang. (B) Quá trình rửa giải
afEV được theo dõi bằng cách đo khả năng phản ứng của các phần cố định với
các kháng thể kháng CD63, kháng CD9 và kháng CD81. Một cấu hình đại diện
thu được bằng phép đo mật độ cường độ tín hiệu chấm được hiển thị. ADU:
đơn vị đo arbitrary densitometry. (C). Ảnh hiển vi điện tử TEM của các phần
được rửa giải bằng 200 mM NaCl (1) và 1 M NaCl (2). (D) Các mẫu được
chọn từ mỗi phần afEV được phân tích bằng điện di biến tính SDS-PAGE. Mũi
tên và số chỉ vị trí của tiêu chuẩn khối lượng phân tử - kDa. Đầu mũi tên chỉ vị
trí của albumin.