Genetika Molekularra

6. gaia. Analisi molekularrerako teknikak.

Teknologia genetikoa

6.1 DNAren analisirako lanabes entzimatikoak

6.2 Hibridazioan oinarritutako teknikak:
* RFLPak
* FISH eta SKY
6.3 Klonazio zelularra: DNA birkonbinatuaren teknologia
- DNA errekonbinantearen molekulen eraketa eta bektoreak
- E.colin egindako klonazioa
- Liburutegiak edo genotekak
6.4 Klonazio azelularra: polimerasaren erreakzio kateatua
6.5. Azido nukleikoen sekuentziazioa Begoña Jugo irakaslea
Genetika arloa
6.1 Lanabesak. DNAren maneiua ahalmentzen duten
entzimak
Nukleasak
Ligasak
Polimerasak
Entzima modifikatzaileak
Topoisomerasak
(1) Nukleasak.
1.1 Exonukleasak: DNA molekula baten mutur batetik nukleotidoak banan banan kentzen dituzte muturretik
1.2. Endonukleasak; DNA molekula baten barneko fosfodiester loturak apurtzeko gai dira barnetik

(2) Ligasak. Azido nukleikoen molekulak lotzen dituzte.

(3) Polimerasak
Molekulen kopiak egiten dituzte; DNA edo RNA erabil dezakete molde moduan.
3.1 I DNA polimerasa. DNA polimerizatu edo anderatu dezake
3.2. Klenow zatia. Polipeptidoaren 323 aminoazido kenduta, nukleasa aktibitaterik gabeko polimerasa
3.3. Taq DNA polimerasa. Thermus aquaticus bakterioaren polimerasa, termoegonkorra da.
3.4. Alderantzizko transkriptasa. RNA erabiltzen du molde gisa. Oinarrizkoa cDNAren klonazioan

(4) Entzima modifikatzaileak.

4.1. Fosfatasa alkalinoa: DNA molekulen 5´ muturraren fosfato taldea kentzen du
4.2. Polinukleotido kinasa: 5’ muturrean fosfato talde bat gehitzen du
4.3. Terminal deoxinukleotidil transferasa: DNA molekularen 3’ muturrean desoxirribonukleotido bat edo
batzuk gehitzen ditu.

(5) Topoisomerasak
DNA zirkular itxiaren konformazioak aldatzeko gai dira. 2
6.1. Errestrikzio-entzimek DNA ebakitzen
dute ezagumendu-sekuentzia
espezifikoetan.

*sekuentzia espezifikoak
ezagutu
*errestrikzio-patroi
espezifikoa sortu
*errestrikzio-zatiak sortu
3
Figure 19-3 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
Errestrikzio-entzima arruntak

4
Iturri desberdinetako DNArekin sortutako molekula errekonbinantea
Molekula errekonbinanteen eraiketa

5
Figure 19-4 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
Errestrikzio-entzimak eta Cas9

6
 Errestrikzio-entzimak eta Cas9

CRISPR:Clustered Regularly Interspaced

Short Palindromic Repeats,
“Repeticiones Palindrómicas Cortas
Agrupadas y Regularmente
interespaciadas.

Cas9: CRISPR associated system

Ondorioa: Funtzioaren galera
7
Genomaren edizioa bi etapatan

Arazoak:
(1) RNA gidak
beste leku baten
hibridatu ahal du
AAATGGCAATC

(2) Cas9-k gidarik

gabe ebaki ahal du.

8
Gaixotasunetan ere-Mintegiak
9
DNA-SEKUENTZIA ESPEZIFIKOAK
AZTERTZEKO PROZEDURAK

10
6.2 Hibridazioa: harizpi bikoitzeko DNA molekulen
eraketa, harizpiak jatorri desberdinekoak izanik
Bi osagai:
-itu-sekuentzia azido nukleikoen laginean
-zunda bat: oligonukleotido bat sekuentzia ezagunekoa eta
markatuta, bere detekzioa ahalmentzeko. Detektatu nahi
den itu-sekuentziarekiko osagarria izan beharko luke.
Hibridazioak:
(a) Fase likidoan
(b) euskarri solidoan
- Southern hibridazioa edo “Southern blot”
- Northern hibrazioa edo “Northern blot
- Dot-blot
(c) In situ hibridazioa
11
 Southern
blot

1. Liseriketa errestrikzio-entzimekin
2. Elektroforesia
3. Transferentzia mintzera
4. Hibridazioa markatutako zundarekin
5. Garbiketa eta autoradiografia

12
Figure 19-24 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
Xingolen patroiak:

Errestrikzio-guneen
eta zundaren
araberakoak

Errestrikzio-zatien
Luzera-polimorfismoa
(Restriction fragments
Length Polymorphysm,
RFLPak)

13
Figure 22-22 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
Geneen bilaketa eta mapaketa:
Lotura-analisiak RFLP bidez
Markatzaile genetikoa:_edozein
sekuentzia mapa genetiko edo fisikoan
kokapen bat identifikatzeko

*Ezaugarri dominantea
*RFLPa bi alelorekin: xingola-patroia?
** Alelo mutantea eta B aleloa kromosoma berean daude 14
Figure 22-23 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
Variable Number of Tandem Repeats (VNTRak)

Minisateliteak eta mikrosateliteak

Markatzailea Izendapena Errepiken Aleloen luzera Analisia Aplikazioa

egitura
Minisateliteak Variable Number of 15-100 bp 1-5 kb RFLPren parekoa Hatz-marka
Tandem Repeats Errestrikzio- genetikoa
(VNTRs) entzimen bidezko
liseriketa,
Southern,
elektroforesia eta
zunda bidezko
detekzioa
Mikrosateliteak Short Tandem Repeats 2-6 bp 100-500 bp PCR bidez Aitatasunak,
(STRak) laginen
identifikazioa,
Populazioen
analisia

15
VNTRak

16
Figure 22-27 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
DDNA profilak VNTRtan oinarritutaA
profilak

17
Figure 22-28 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
In situ hibridazioa: FISH eta SKY

18
Kromosomen margoketa edo SKY

19
DNA SEKUENTZIA ESPEZIFIKOAK
AZTERTZEKO PROZEDURAK

20
6.3 Klonazio zelularra:
DNA birkonbinatuaren
teknologia
Bektoreak: klonatu beharreko DNAren
eramaleak
(a) Plasmidoak
(b) Lambda fagoa
(c)Kosmidoak
(d)Kromosoma bakteriar artifizialak (BAC) (BAC)
(e) Legamien kromosoma artifizialak (YAC)
(f) Adierazpen-bektoreak 21
 Bektoreak: beharrezko osagaiak

Errestrikzio-entzimen
ezagumendu-lekuak

Erreplikazio-
jatorria

Markatzaile hautakorrak 22
 Bektoreak: (a) pUC18 plasmidoa

-Txikia (2686 bp)

- erreplikazio-jatorria
- Polilinkerra
- Hautespenarako lacZ
E. colitik isolatutako plasmidoen molekula
genea
zirkularren mikrografia elektronikoa.
- Hautespenarako
DNA klonatzeko genetikoki eraikitako plasmidoak
erresistentzia genea
erabiltzen dira.

23
Figure 19-6 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
Bektoreak: (b) Lambda (λ) fagoa

Plakak osatzen dituzte.

24
5Bektoreak:
(c ) Kosmidoak- Bektore hibridoak

(d) Bakterioen kromosoma artifizialak (BAC)

25
Bektoreak:
(e ) Legamien kromosoma artifizialak (YAC)

26
Bektoreak:
(f ) Adierazpen-bektoreak

27
Bektore desberdinen arteko erkaketa

28
6.3 Klonazio zelularra E. colin egindako klonazioa
Helburua: sekuentzia espezifikoen klonatutako kopiak egitea

29
 Klonazio zelularra

1. Bektorearen eta azterpeko

DNAren liseriketa
2. Ligazioa: molekula
birkonbinatuen sorrera
3. Bakterio konpetenteetara
transferentzia
4. Bakterioen ereinketa eta
kolonien hautespena

Hautespen bikoitza:
1) Anpizilina
2) X-Gal +IPTG
30
Polilinkerra= Multiple Cloning Site (MCS)
31
 Klonazio zelularra

Insertzio bidezko inaktibazioa

Identifikazio kromogenikoa
Zuri/urdin entseiua

32
DNA birkonbinatuaren teknologia:
Replica plating
Bektorea: pBR322 plasmidoa bi markatzaile hautakorrekin,
biak antibiotikoekiko erresistentzia ematen diotenak.
Klonazioa pBR322rekin
Adibidez, DNA zati bat PstI errestrikzio-
lekuan txertatzen bada, anpizilinarekiko
erresistentzia genea inaktibatuko du.
Plasmidoak tetraziklinarekiko erresistentzia
izango du, baina ez anpizilinarekiko.
Ezaugarri hau zelula ostalarien hautespena
egiteko izango da erabilgarri.
Bahaketa “replica plating” bidez

Belus esterilez egindako

transferentziarako tresna erabil
daiteke jatorrizko kolonien
kopiak egiteko.

Intereseko koloniak anpilizina

duten plaketan hasiko ez
direnak izango dira.
Klonazioa pBR322rekin
BamHI lekuan klonatuko
balitz:

 Plasmidorik gabeko zelulak

antibiotiko biekiko sentikor.
 Plasmido osoak dituzten zelulak
erresistenteak antibiotiko biekiko.
 Plasmido birkonbinatuak
dituztenak erresistente
anpizilinarekiko baina sentikor
tetraziklinarekiko.
Klonazio zelularra:
Errestrikzio-mapaketa
Helburua:
Molekulak karakterizatzea

Informazioa.
-Ebaketa-leku kopurua
-Ordena
-Euren arteko distantzia

Liseriketa bikoitzak:
2 errestrikzio-entzimez
aldiberean

37
 38
Figure 19-23 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
6.3. Liburutegiak: klonatutako
sekuentzien bildumak.
(a) Liburutegi genomikoak
(b) Liburutegi kromosoma-espezifikoak

39
Liseriketa partzialak

40
Liburutegien bahaketa zunda baten bidez

41
6.4 Klonazio azelularra Polimerasaren erreakzio kateatua

* Osagaiak

•Anplifikatu beharreko DNA (itua)

•hasleak (18-25 nuc.)

•DNA polimerasa termoegonkorra

•dNTPak
90-92C
* Prozedura

Termoerregulatzaileak
DNA kopiatu
Hasle hibridatuak izateko

42
POLIMERASA TERMOEGONKORRAK

Pol termoegonkorrak:
•Aktiboak 95ºC-tara egon ondoren
•Optimoa 75ºC-tara

Taq: Thermus aquaticus

Tli: Thermococcus litoralis
Pfu: Pyrococcus furiosus
Tth: Thermus thermophilus
43
POLIMERASAREN ERREAKZIO KATEATUA (PCR)

Termoziklatzailea

Desnaturalizazioa Hasleen hibridazioa Luzapena (DNAren sintesia)

44
6.4 Klonazio azelularra
Hasleak
diseinatu behar dira hasle batzuk zeinak alboko nukleotidoak
hibridatuko dituzten polimerizazioa jhasteko

45
46
PCRren ekoizpena = (hasierako DNA kopurua) x (1 + % efizientzia) ziklo-kop

Efizientzia:DNA moldetik produkturako konbertsio-portzentaia zikloko

Adibidez. 70% efizientziaz pg batetik µg bat lortzen da 26 ziklotan

ZIKLOAK KOPIAK

1 2

2 4

4 16

10 1,024

15 32,768

20 1,048,576

25 33,554,432

30 1,073,741,824

BIDEOA
48
6.4 PCRak DNAren kopiak
egiten ditu zelula ostalaririk
gabe
PCRaren mugak:
- Sekuentziaren informazioa behar da aldez aurretik
- Kutsatzea erraza da; beti kontrolak erabili behar dira
- 1000 bprainoko zatiak anplifikatzeko egokia

PCRaren aplikazioak:
- Genetika: Markatzaile genetikoen genotipazioa
- Genomika: Eskualde ezezagunen karakterizazioa
- Auzitegi genetika: Identifikazio indibiduala
- Auzitegi genetika: Aitatasunak

49
 Short Tandem Repeats (sTRak)
Minisateliteak eta mikrosateliteak

Markatzailea Izendapena Errepiken Aleloen luzera Analisia Aplikazioa

egitura
Minisateliteak Variable Number of 15-100 bp 1-5 kb RFLPren parekoa Hatz-marka
Tandem Repeats Errestrikzio- genetikoa
(VNTRs) entzimen bidezko
liseriketa,
Southern,
elektroforesia eta
zunda bidezko
detekzioa
Mikrosateliteak Short Tandem Repeats 2-6 bp 100-500 bp PCR bidez Aitatasunak,
(STRak) laginen
identifikazioa,
Populazioen
analisia

50
Mikrosateliteak: identifikaziorako markatzaileak

Markatzaile genetikoa:_edozein
sekuentzia mapa genetiko edo
fisikoan kokapen bat identifikatzeko

migrazio elektroforetikoa markatzen duten

pikoak (lehenengo zati txikiak, gero handiak)

51
 2001eko irailean
New York hirian

3000 pertsona hil ziren

DNAren teknologia erabili
zen

13 STR locus, CODIS

datu-basekoak

Hildakoen erdiak identifikatu

zituzten.

PCRaren aplikazioak: World Trade Center (Twin Towers) eraikinetan

hil zirenen identifikazioa 52
6.5. Sekuentziazioa da metodorik informatiboena
Katea-bukaeraren metodoa

53
Figure 19-26 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
https://www.youtube.com/watch?v=3M0PyxFPwkQ

54
Figure 19-27 Copyright © 2006 Pearson.
Sekuentziazioa
fluoreszenteki
markatutako
dideoxinukleotidoekin:
Oinarrian berdina,
detekzioa desberdina

55
Figure 19-28 Copyright © 2006 Pearson Prentice Hall, Inc.
Dideoxi
sekuentziazioa
automatizatu
daiteke.

56
Elektroferograma: elektroforesi analisi bateko emaitzen grafikoa

57
SEKUENTZIAZIO BELAUNALDI BERRIAK
GENETIKAREN
AURRERAKUNTZAK AZKEN
URTEOTAN