3. UD.

Azido nukleikoen
erauzketa eta arazketa

Edukiak
L agin biologikoen aurretratamendua.
DNA erauzteko eta arazteko teknikak,
odola, biopsiak eta ehunak oinarri
hartuta.
RNAren erauzketa eta arazketa.
Azido nukleikoak erauzteko
sistema automatikoak.
Lortutako DNAren kalitatea eta
kontzentrazioa.

3.1. Erauzketa
eta arazketa:
lehenbiziko etapa
Aurreko unitatean jada ikasi dugunez, azido
nukleikoak zelulen barruan kokatuta daude, eta,
zehazki, egon daitezke bai nukleoaren barruan,
bai zitoplasmaren barruan eta bai zelulen orga-
nuluetan, hala nola mitokondrietan eta kloroplas-
toetan.
Irudietan ikus daitekeenez, beti daude ingurunetik
isolatuta edo babestuta, mintzen bidez eta horma
zelularren bidez:
Mintz zelularra zelularen kanpoaldea biltzen
duen egitura da, eta, horrezaz gain, kanpoko
ingurunearekiko erlazioa ahalbidetzen du. Ki-
mikoki, lipido-geruza bikoitz batez eratuta
dago, eta barruan proteina barietate handia du.
Horma zelularra bakterioen, legamien,
onddoen eta landare-zelula guztien berezko
ezaugarria da; mintz zelularra biltzen duen
geruza bat da, eta zurruntasuna ematen die ze-
(A)
(C)
3.1 irudia. Egiturak: zelula prokariota (A), animalia-zelula eukariota (B) eta landare-zelula eukariota (C). Lipido-geruza bikoitz
batez eratutako mintz plasmatikoaren egituraren xehetasunak, bere barruan proteina barietate handia ikusten dela.
3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 59
lulei eta babestu egiten ditu. Kimikoki, askota-
riko konposizioa dute, organismo motaren ara-
berakoa baita.
Horrenbestez, mintz eta horma horiek benetako
hesiak dira, gainditu beharrekoak azido nukleikoe-
tara iritsi ahal izateko. Horregatik guztiagatik,
biologia molekularreko tekniken bidez azido
nukleikoen analisia egiteko eta haiek manipula­
tzeko, kasurik gehienetan, lehenbiziko etapa azido
nukleikoen erauzketa eta arazketa da.
Erauzketaren bidez, zenbait teknikatan erabiltzen
diren erreaktiboak eta entzimak azido nukleikoe-
tara iristea lortzen da; arazketaren bidez, berriz,
tartean dauden substantziak eta elementuak
desa­gerrarazten dira.
Lagin biologiko batetik abiatuta azido nukleiko
araztuak lortzeko, protokolo tekniko jarraitu
bakarra jarri ohi da abian, eta protokolo horretan
hiru fase bereiz daitezke:
I. Laginaren aurretratamendua.
II. Azido nukleikoen erauzketa.
III. Azido nukleikoen arazketa.
(B)
60 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa
3.2. Lagin
biologikoen
aurretratamendua
Azido nukleikoak lagin biologiko gehientsueneta-
tik lor daitezke. Baina kasuan kasuko abiaburuko
materiala –odola, ehunak, biopsiak eta abar– mota
askotakoa eta aldakortasun handikoa izan daite-
keenez, askotan beharrezkoa izaten da kasuan
kasuko lagin biologikoaren aurretratamendu es-
pezifikoa egitea, esekidura zelularrak lortzeko, eta,
hartara, esekidura horiek erabiliz azido nukleikoen
erauzketa eta arazketa egin ahal izateko.
Esekidura zelularrak ingurune likido batean
sakabanatuta flotatzen duten zelula askeez eta
agregatu zelularrez eratuta daude.
Hurrengo lerrootan, biologia molekularrean
ohikoak diren laginak eta haien aurretratamen-
dua jorratuko ditugu:
Odola.
Kultibo zelularrak.
Animalia- edo landare-ehun freskoak.
Formolean finkatu eta parafinan sartutako
­ehunak.
Beste lagin batzuk, hala nola karkaxak, ahoko
mukosako zelulak, bakterioak eta legamiak.
3.2.1. Odola
Odola da lagin biologiko ohikoenetako bat per­
tsonen azido nukleikoak aztertzeko; horretarako,
odolaren osagai zelularrak jakin batzuk arazten
dira: leukozitoak. Odolaren osagai anitz eragozpen
dira biologia molekularreko tekniketan. Esaterako,
hemoglobinaren hemo taldea PCRaren oso inhibi­
tzaile handia da, eta, horrenbestez, aurretratamen-
duen xede ohikoa hemoglobina desagerraraztea
izaten da, hematieen lisi bidez.
Lagina lortzeari eta kontserbatzeari
buruzko oharrak
Odol-lagin baten azido nukleikoak lortzeko, ego-
kiena da EDTA konposatuarekin antikoagulatutako
odol osoa hartzea abiaburu; nolanahi ere, heparina
eta sodio zitratoa ere erabil daitezke antikoagula­
tzaile gisa.
Kontuan izan!
Odola honako hauez osatutako ehuna da:
Osagai zelularra, honako hauez osatua:
Hematieak. Nukleorik eta mitokondriarik
gabeko zelulak, barnean hemoglobina du-
tenak (burdina duten proteinak). Funtzio
nagusia arnasketa-gasak garrai­atzea da.
Leukozitoak. Hematieak baino handia-
goak diren zelula nukleodunak dira. Or-
ganismoaren defentsa-prozesuan esku
hartzen dute. Hainbat motatakoak daude,
morfologiaren eta funtzioaren arabera:
neutrofiloak, eosinofiloak, basofiloak, lin-
fozitoak eta monozitoak.
Plaketak. Nukleorik gabeko zelula zatiak.
Odolaren koagulazioan parte hartzen dute.
Osagai likidoa edo plasma, elementu asko-
ren nahaste konplexua.
Odol-lagina lortu eta 24 orduren buruan komeni
ohi da azido nukleikoak erauztea; baina hala egin
ezean, hotzean kontserbatu daiteke (4 ºC-an) bost
egunez.
Hala ere, zatitu gabeko DNA molekulak bere ho-
rretan edukitzea beharrezkoa duten teknikak
aplikatuko badira, hala nola Southern blot, odola
ez litzateke hiru egunez baino gehiagoz gorde be-
har hozkailuan, DNA degradatu eta zatikatu egin
baitaiteke hortik aurrera.
Kontuan izan!
Southern blot euskarri solidoan egiten den
hibridazioko teknika bat da; 5. Unitate di-
daktikoan landuko dugu sakonago.
Hematieen lisia
Odol-laginetan egiten den aurretratamendu
ohikoena honako hauek egitean datza:
1. Hematieen lisia. Hematieak lisirako disoluzio
edo tanpoi batekin apurtzean datza. Disoluzio
horren proportzioa 1:3 da: odol-bolumen bat,
lisirako disoluzioaren hiru bolumeneko. Gaur
egun, merkatuan lisirako disoluzio mota asko
daude, eta gehienek fenomeno osmotikoak edo-
ta detergente arinak dituzte oinarrian. (3.1 Dok.)
2. Laginaren zentrifugazioa. Behin hematieen
lisia gauzatuta, lagina zentrifugatzen da, eta
jalkin edo pellet bat eta gainjalkin bat lortzen
dira.

3.1 dokumentua
Hematieen lisirako merkatuan
dauden erreaktiboak
Eritrozitoen lisirako disoluzio estandarra
(osmosia).
Amonio kloruroa (NH4Cl): 150 mM.
Potasio bikarbonatoa (KHCO3); 10 mM.
EDTA: 1mM.
Eritrozitoen lisirako disoluzioa detergentearekin.
Tris-HCl-a: 10 mM, pH 8.
Triton X-100: % 1.
Sakarosa: % 11.
3. Gainjalkina desagerraraztea. Gainjalkin
frakzio likidoa pasteur pipeta batekin ken­
tzean datza. Hala, odol-plasmaren osagaiak eta
hemo­globina desagerrarazten dira, hematieak
apurtu ondoren askatutakoak.
4. Jalkina kontserbatzea. Azido nukleikoak
erauzteko prozesuari jarraipena eman ahal iza-
teko unea da. Izan ere, jalkinean leukozitoak
geratuko dira.
Aurretratamendu horrek hezur-muineko lagineta-
rako ere balio du.
Odol periferikoko zelula
mononukleatuak lortzea
Linfozitoak kutsatzen dituzten zenbait erretrobi-
rusen azido nukleikoak detektatzeko, isolatzeko
eta aztertzeko ere erabil daiteke odola abiabu-
rutzat; birus horietakoak dira, besteak beste, giza
immunoeskasiaren birusa (GIB) edo giza T zelulen
birus linfotropikoa (HTLV).
Halakoetan, azido nukleikoak erauzi aurretik odol
periferikoko zelula mononukleatuak (ingelesez,
PBMC: peripheral blood mononuclear cell) isola­
tzea komeni da; hau da, linfozitoak eta monozitoak
isolatzea. Hori lortzeko, dentsitate-gradientean
­zentrifugatu behar da, eta, horretarako, bereizteko
bitarteko bat erabili. (3.2 Dok.).
Hona hemen urratsak:
1. Hodi batean, bereizteko bitartekoa eta, haren
gainean, odola jartzen dira.
2. Gero, erabilitako erreaktiboaren arabera, 20-
30 minutuz zentrifugatzen da (400-800 × g).
Zentrifugazio-prozesuan:
3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 61
Polisukrosak (polisakaridoa, bereizteko bi-
tartekoaren osagaia) hematieen agregazioa
eragiten du, eta, beraz, azkar sedimentatzea.
Granulozitoak ere, bereizteko bitartekoak
baino dentsitate handiagoa dutenez, hodia-
ren hondoan sedimentatzen dira.
Zelula mononukleatuak, aldiz, bereizteko bi-
tartekoak baino dentsitate txikiagoa dutenez,
haren eta plasmaren arteko interfasean ge-
ratzen dira.
3. Behin plasma-gainjalkina kenduta, zelula mo-
nonukleatuen geruza kontu handiz xurgatzen
da pasteur pipeta batekin, hodi garbi batean
sartzen da eta gatz-disoluzio edo indargetzai-
le batekin (tanpoi) garbitzen da, plasma- eta
plaketa-hondarrak desagerrarazteko.
4. Behin zelulak garbi daudela, azido nukleikoak
erauzteko prozesuari jarraipena eman ahal
izango zaio.
Plasma
Odola
PBMCak
Bereizteko
bitartekoa
Bereizteko
bitartekoa
Hematieak
eta granulo-
zitoak
PBMC: odol periferikoko zelula mononukleatuak
3.2 irudia. Odol periferikoko zelula mononukleatuen
­bereizketa, dentsitate-gradientean zentrifugatuta.
3.2 dokumentua
PBMCen erauzketa: ­
bereizteko bitartekoa
PBMCen erauzketan erabilitako bitartekoa bi
osagai hauen nahaste bat da:
Ficoll-a: polisakarido sintetiko hidrofilikoa, oso
adarkatua, sukrosaren eta epiklorhidrinaren
kopolimerizazioaren ondorioz sortutakoa.
Sodio diatrizoatoa.
Bitarteko horrek biskositate txikia du, dentsi-
tatea, berriz, 1,077 g/ml-koa da, eta zelulen
bizigaitasunerako edo bideragarritasunerako
­
osmolalitate egokia du. Merkatuan nahaste
hori oinarri duten marka bat baino ­ gehiago
daude (Ficoll-paque®, Histopaque®, Lympho-
prep®, etab.).
62 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa

3.2.2. Kultibo zelularrak

Zelulak in vitro lortzeko metodoak dira kultibo ze-
lularrak; horretarako, kontrolpean eta ingurune
egokietan ereiten dira.

Abiapuntuko material aproposak dira, azterketa

genomikoak eta gene-adierazpenaren ingurukoak
egiteko, baldintza eta estimulu zehatzen bidez.

Lagin horien aurretratamendua honetan datza:

zelulak biltzean, azido nukleikoen erauzketa
egiten jarraitu aurretik.

Bi teknika hauek baliatu ohi dira, batez ere:

3.3 irudia. Flaskoaren hormari itsatsita hazitako zelulak
Kultiboak esekiduran. Zelulak esekiduran askatzeko espatula.
hazten badira kultibo-ingurunean, hau da ja-
rraitu beharreko prozedura:

1. Hodi batean bildu. 3.2.3. Animalia- edo

2. Kultibo-ingurunea desagerrarazi, zentrifuga-
zioaren bidez.
3. Zelulak disoluzio indargetzailearekin (tanpoi)
edo serum fisiologikoarekin garbitu, DNA
edota RNA erauzten eta arazten hasi aurretik.
Kultiboak geruza bakarrean. Zelulak geruza
bakarrean kultibo-flaskoaren hormari itsatsita
hazten badira, bi aukera daude:
Flaskoa bera erabiltzea erauzketa-prozesuan.
Horretarako:
1. Kendu flaskotik kultibo-ingurunea.
2. Garbitu geruza bakarra disoluzio indarge­
tzailearekin edo gatz-disoluzioarekin.
3. Hasi in situ, flaskoan bertan, erauzketa-
prozesua.
Geruza hori hodi batean jartzea. Horretarako:
1. Askatu flaskoaren hormatik zelulen geruza
bakarra. Bi modu daude:
– Mekanikoki, espatula batekin.
– Bitarteko entzimatikoen bidez. Flasko-
tik kultibo-ingurunea kendu eta geruza
bakarra disoluzio indarge­ tzailearekin
edo gatz-disoluzioarekin garbitu on-
doren, zelulak tripsina disoluzioarekin
(% 0,05-% 0,25) inkubatzen dira.
2. Bildu zelulak hodi batean.
3. Garbitu zelulak, erauzketa-prozesua egi-
ten jarraitu aurretik.
landare-ehun freskoak
Animalia- edo landare-ehun freskoetatik azido
nukleikoak lortzeko, nahitaezkoa da homogenei-
zazioa deritzon aurretratamendua.
Homogeneizazioa ehunari aplikatzen zaion
tratamendu mekanikoa edo kimikoa da, bere
baitan dituen zelulak aska ditzan.
Zenbateko ehun kantitateri aplikatuko zaion
erabakitzeko, kontuan izan behar dira ehun
mota, homogeneizaziorako metodoa eta azido
nukleikoak erauzteko zein arazteko prozedura.
Esate baterako, animalia-ehuna bada, nahikoa
izaten da 10-25 mg ehun, 10-40 µg DNA lortze-
ko. Landare-ehuna baldin bada, kantitate han-
diagoa behar izaten da DNA kantitate berbera
lortzeko; zehazki, 100 mg-tik 1 g-era bitarteko
kantitatea.
Homogeneizazio mekanikoa
Homogeneizazio mekanikoa ehunari jardue-
ra birrintzailea o urratzailea aplikatzean datza,
hura xehatzeko.
Jarduera hori bi motatakoa izan daiteke: automa-
tizatua edo eskuz eragindakoa.
Homogeneizazio mekaniko automatizatua
Ehunaren homogeneizazioa hainbat makina edo
elementu mekaniko erabiliz lortzen da. Honako
hau da jarduteko modua:

1. Ehuna, lehenbizi, zati txikitan mozten da,
eta, gero, homogeneizatu egiten da tresna
­mekanikoak erabilita (makina birrintzaile meka-
nikoak baliatuz, besteak beste), agente urratzai-
leak gehitu eta eraginda, oszilazio-­mugimendu
baten bidez laginaren aurka talka bortizki egin-
go duten beirazko zein zeramikazko esferak ba-
liatuta edo sonikazioa erabilita.
2. Behin ehuna homogeneizatuta dagoela, hodi
garbi batean jartzen da, erauzketa-prozesuari
ekiteko.
Kontuan izan behar da, ehuna mekanikoki apur­
tzeko prozesuan, zelulen osagaiak degradatzea
eragin dezaketen proteasak eta entzimak aska
daitezkeela. Hortaz, komeni da prozesu horiek
hotzean eta azkar egitea, edo, bestela, inhibitzaile
entzimatikoak gehitzea.
Almaiz batekin eskuz eragindako
homogeneizazio mekanikoa
Degradazioaren arazoa minimizatzen duen meto-
do bat da. Hau da prozedura:
1. Ehun-zatiak almaiz batean jarri eta nitroge-
no likidoz estaltzen dira. Nitrogeno likidoaren
tenperatura oso baxua denez, ehuna berehala
izozten da, eta, beraz, zelula barruan ez dira
kristalak eratzen (beste hozte-sistemaren bat
erabiliz gero, kristalak eratzen dira, zelulen lisia
eragiten dute, eta, horren ondorioz, entzimak
askatzen dituzte eta ehunak degradatzen has-
ten dira).
2. Gero, almaiz-eskuarekin hauts bihurtzen dira
lehen izoztutako zatiak, hauts fin-fina lortu
3.4 irudia. MagNa Lyser (Roche Life Science). Zeramikaz­
ko esferen bidez ehunak erabat homogeneizatzeko mahai-
lanabesa.
3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 63
arte; eta azkenik, nitrogeno likidoa lurruntzen
uzten da.
3. Lortzen den hautsa hodi batean sartzen da,
erauzketa-prozesuari ekiteko.
Zenbait protokolotan, homogeneizazio meka-
nikoa lisirako tanpoi batean egiten da zuzenean,
eta, beraz, erauzketa-prozesuaren lehenbiziko
urratsa ere bada.
Homogeneizazio kimikoa
Homogeneizazio kimikoa ehuna proteasen
eta detergenteen eraginpean jartzean datza,
osagai tisularrak degradatzeko eta zelulak dis-
gregatzeko.
Lagin txikietarako eta kriostato baten bidez
izoztutako ehun-zatietarako baliatu ohi da homo-
geneizazio kimikoa.
Hau da prozedura:
1. Ehunen digestiorako proteasak eta detergen-
teak dituen inkubazio-nahastea gehitzen zaio
laginari.
2. Lagina inkubagailura eramaten da. Inkuba-
zioak tenperatura altuan (37-56 ºC) egiten
dira, 12-24 orduz.
3. Behin inkubazio-denbora igarota, lagina atera
eta erauzketa-prozesua egiten jarraitzen da.
Inkubazio-nahasteari mintz zelularrak dese-
gonkortzen eta apurtzen dituzten entzimak eta
detergenteak gehituz gero, aldi berean egin dai-
tezke ehunaren homogeneizazioa eta erauzketa-
prozesuaren lehenbiziko urratsa.
3.2.4. Formolean finkatu eta
parafinan sartutako ehunak
Formolean finkatu eta parafinan sartutako ehu-
nak (ingelesez, FFPE: formaline-fixed paraffin-
embedded) oso baliagarriak dira atzera begirako
azterketak egiteko, nahiz eta berreskuratutako
azido nukleikoen kalitatea kaskarragoa izan ehun
freskoetatik araztutakoena baino.
Kalitatearen galera hori gertatzen da, hain zuzen
ere, finkatze-prozesuak dirauen bitartean DNA
zatitu eta RNA partzialki degradatu daitekeelako,
lagina lortu eta finkatzen den arte igarotako den-
boraren arabera.
64 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa

Argizari-kentzea 2. Zati horiek, guztira 5-10 mg inguru, Eppendorf

FFPE ehunetatik azido nukleikoak erauzteko beha-
rrezkoa da aurretratamendua, eta kasu horretan,
zehazki, argizaria kentzean datza.
Argizari-kentzea FFPE ehunei parafina ken­
tzean datza.
Horretarako, hau da prozedura:
1. Mikrotomo izeneko tresnarekin, ehuna zati txi-
kitan (5-10 µm) mozten da.
hodi batean jartzen dira.
3. Modu sekuentzialean inkubatzen da xilol edo
parafina kentzeko beste agente batekin, kon­
tzentrazio beherakorreko etanolekin eta ur des-
tilatuarekin (3.3 Dokumentuan deskribatu da).
4. Eta azkenik, ehunari parafina kendu eta hura
berhidratatu ondoren, homogeneizazio ki-
mikoa aplikatzen zaio, ehun freskoentzako
deskribatutakoaren antzera, aldi berean azido
nukleikoak erauzteko lehenbiziko urratsari ha-
siera emanda (3.3 atalean landuko dugu).

3.3 dokumentua F
 ormolean finkatu eta parafinan sartutako ehunen
aurretratamendurako protokoloa

FFPE ehuna 1 µm-eko hiru zati Gehitu 1 ml xilol. Inkubatu

1,5 ml-ko Eppendorf hodi batean. 5 minutuz giro-tenperaturan.

Minutu 1 zentrifugatu
Gainjalkina 14.000 g-an.
Gehitu 1 ml xilol.
kendu.
Berreseki pelleta. Inkubatu
Minutu 1 zentrifugatu 5 minutuz giro-tenperaturan.
Gainjalkina 14.000 g-an.
Gehitu 1 ml xilol.
kendu.
Berreseki pelleta. Inkubatu
Minutu 1 zentrifugatu 5 minutuz giro-tenperaturan.
Gainjalkina 14.000 g-an.
Gehitu 0,5 ml etanol (% 100).
kendu.
Berreseki pelleta. Inkubatu
Minutu 1 zentrifugatu 5 minutuz giro-tenperaturan.
Gainjalkina 14.000 g-an.
Gehitu 0,5 ml etanol (% 100).
kendu.
Berreseki pelleta. Inkubatu
Minutu 1 zentrifugatu 3 minutuz giro-tenperaturan.
Gainjalkina 14 .000 g-an.
Gehitu 0,5 ml etanol (% 96).
kendu.
Berreseki pelleta. Inkubatu
Minutu 1 zentrifugatu 3 minutuz giro-tenperaturan.
Gainjalkina 14.000 g-an.
Gehitu 0,5 ml etanol (% 70).
kendu.
Berreseki pelleta. Inkubatu
Minutu 1 zentrifugatu 3 minutuz giro-tenperaturan.
Gainjalkina 14.000 g-an.
Gehitu 0,5 ml H2O destilatu.
kendu.
Berreseki pelleta. Inkubatu
Minutu 1 zentrifugatu 3 minutuz giro-tenperaturan.
Gainjalkina 14.000 g-an.
kendu.
Homogeneizazio kimikoa
egiten hasi
 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 65

3.2.5. Beste lagin batzuk

Hauek dira azido nukleikoak erauzteko beste
­lagin batzuk: bakterioen eta legamien kultiboak,
ahoko mukosako zelulak eta karkaxak.

Bakterioen eta legamien kultiboak

Bakterioak eta legamiak esekidurako tanpoi ba-

tean jartzean datza aurretratamendua. (3.4 Dok.)

Abiaburuko materiala ingurune likidoan edo soli-

doan egon daiteke.

Kultiboak ingurune likidoan:

1. Hodia zentrifugatzen da, kultibo-inguruneko
gainjalkina desagerrarazteko.
2. Jalkina berreseki egiten da, esekidurako tan-
poian.

Ingurune solidoan isolatutako koloniak (agar

plaka):
3.5 irudia. Ahoko mukosako zelulak lortzeko eskuila.
1. Plaka gaineko kolonia biltzen da, ereite-
uztai esteril batekin.
2. Kolonia berreseki egiten da esekidurako Ahoko mukosako zelulak erauzi aurreko aurre­
tanpoian. tratamendua honako honetan datza: esekidura
zelularra zentrifugatzean eta gainjalkina desage-
rraraztean.
3.4 dokumentua
Bakterioak eta legamiak esekitzeko Karkaxa
disoluzio indargetzailea (GTE tanpoia)
TRIS-a: 25 mM, pH 8. Karkaxa abiaburuko material gisa erabil daiteke,
arnas infekzioak eragiten dituzten mikroorga-
EDTA: 10 mM. nismo patogenoak detektatzeko edo badaudela
Glukosa: 50 mM. baieztatzeko.

Aurretratamendua fluidizatzean datza, horreta-

Ahoko mukosako zelulak
Mota honetako zelulak lortzeko eta kontserbatze-
ko disoluzioak eta kitak badira merkatuan. Hona
hemen ahoko mukosako zelulak lortzeko siste-
mak:
rako N-azetil-L-zisteina motako agente mukolitiko
bat erabilita sodio zitrato disoluzio batean. Detek­
tatu nahi den mikroorganismoa mikrobakterio bat
bada, sodio hidroxidoa ere gehitu dakioke diso-
luzioari, lagina deskontaminatzeko. (3.5 Dok.)

Ahoko mukosa torunda edo eskuila batekin

igurtziz. Zuzenean karratuta lortutako lagina
(torunda edo eskuila) disoluzio kontserbagarri
batean sartzen da, zelulak askatzeko.
Disoluzio kontserbagarri batekin ahoa garbituz.
Zuzenean listua hartuz.
3.5 dokumentua
Disoluzio mukolitiko eta
deskontaminatzailea karkaxentzat
N-azetil-L-zisteina: 0,375 g.
Trisodio zitratoa· 2 H2O: 14,5 g.
Sodio hidroxidoa (NaOH): 20,0 g.
Ur destilatua: gehienez, 1.000 ml.
66 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa
3.3. Azido nukleikoen
erauzketa
Abiaburuko laginaren aurretratamendua egin on-
doren, jada lortu dugu esekidura zelularra, proka-
riota edo eukariota, eta, beraz, azido nukleikoak
erauzteari ekin diezaiokegu.
Erauzketa-prozesua, oro har, honako bi prozesu
hauetan datza:
Zelulen lisia, azido nukleikoak askatzeko.
Zeluletako nukleasen inaktibazioa (DNAsak eta
RNAsak), azido nukleikoen degradazioa era-
gozteko.
Bi prozesuak, zelulen lisia eta nukleasen inaktiba-
zioa, esekidura zelularra lisirako disoluzio batekin
inkubatuta lortzen dira.
Horma zelularra duten zeluletan –bakterioak, le-
gamiak, onddoak eta landare-zelulak–, gainera,
beharrezkoa izango da tratamendua aldatzea, lisi-
prozesuko zenbait arazori irtenbidea emateko.
Erauzketa-prozesua itxura homogeneoko li-
satu zelularra (lisiaren ondoriozko substantzia)
lortzean datza; lisatu horretan, ezinbestekoa da
azido nukleikoak isolamendurako baliatzen di-
tuzten egitura zelularretatik erabat aske egotea.
3.3.1. Lisirako disoluzioa
Lisatuko den zelula motaren mende dago lisirako
disoluzioaren konposizioa, eta detergenteak, EDTA,
proteasak eta agente kaotropikoak izan ditzake.
Detergenteak
Lisirako disoluzioaren osagai nagusia dira. Mintzen
lipido-geruza bikoitza desegituratzea eta han txer-
tatzen diren proteinak desnaturalizatzea da bere
funtzioa.
Hartara, zelulen lisia eragiten dute eta, horren
ondorioz, eduki zitoplasmikoa eta nuklearra
erreakzio-ingurunera askatzen dute.
Sodio-dodezil-sulfatoa (SDS) konposatu ten­
tsioaktibo anionikoa da, eta zelulen lisirako gehien
erabiltzen den detergentea da, batez ere gizakien
eta animalien laginetarako baliatzen da, EDTArekin
konbinatuta.
EDTA
EDTA katioi dibalenteen kelatzaile bat da, bes-
teak beste, kaltzio eta magnesioarena. Magnesioa
DNAsa entzimaren kofaktorea da, beharrezkoa
haren funtzionamendurako.
Horrenbestez, erreakzio-ingurunean dauden mag-
nesioaren katioiak harrapatzen dituenez, EDTAk
DNAsa entzimen jarduna inhibitzen du.
Proteasak
Lisirako disoluzioan proteasak ere gehi daitezke,
hala nola K proteinasa, proteinak digeritzen baiti-
tuzte, bai mintz zelularrekoak bai zitoplasmikoak,
eta mintzak apurtzea zein desegiteaz gain,
nukleasak desagerraraztea eragiten baitute. Ehun
freskoen eta FFPE ehunen laginetan erabiltzeko
bereziki baliagarriak dira proteasak, aldi berean
gauzatu ahal izateko ehunaren digestioa eta azi-
do nukleikoen erauzketa.
Kontuan izan!
Nukleasak inaktibatzea oso garrantzitsua da,
zatitu gabeko azido nukleikoen kopuru handia
lortu nahi bada. Bi arrazoi hauengatik gerta­
tzen da hori:
RNA mezulariaren (mRNA) batez besteko bi-
zitza baldintza fisiologikotan oso laburra da,
kodetzen duen proteina etengabe sintetiza
ez dadin beharrezko RNAsa zitoplasmikoak
oso azkar degradatzen duelako.
Zelulen lisia dela eta, DNA bere egituretatik
askatu egiten da, eta horren ondorioz DNAsa
zitoplasmatikoekin kontaktuan jartzen du.
3.6 dokumentua
Lisirako disoluzioak
Leukozito eta animalia-zelulen lisia egi-
teko disoluzioa
Sodio-dodezil-sulfatoa (SDS):% 2.
EDTA: 25 mM.
pH-a: 8,0.
Lisirako disoluzioa K proteinasarekin
Tris-HCl-a: 10 mM, pH 8.
NaCl-a: 400 mM.
EDTA: 2 mM.
SDS-a: % 2.
K Proteinasa: 0,5 mg/ml.
 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 67

Agente kaotropikoak edo, bestela, aldi berean, zelulen lisirako diso-

Agente kaotropikoak gehitzea ere oso eraginkorra
da nukleasak inaktibatzeko. Izan ere, makromole-
kulak desnaturalizatzen dituzte, eta, hala, aktiboak
izan daitezen eragotzi. Agente horietako bat gua-
nidinio isotiozianatoa da, RNAsak inaktibatzeko
ahalmen handikoa, eta RNA araztu nahi dugunean
beti komeni da erabiltzea. (3.7 Dok.)
3.3.2. Horma zelularra duten
zelulak: tratamenduak
Bakterioek, onddoek eta landare-zelulek duten
horma zelularrak nekezago egiten du zelulen lisia.
Horma horiek degradatzeko, beharrezkoak dira
beste tratamendu batzuk, hala nola tratamendu
entzimatikoak, tratamendu mekanikoak edo zetil-
trimetil-amonio bromuroa (ingelesez, CTAB).
Tratamendu entzimatikoa
Horma hori degradatzeko, hormaren osagaiak di-
geritzen dituzten entzima espezifikoak erabiltzen
dira:
Lisozima edo lisostafina, degradatzeko
bakterio gram-positiboen horma.
Litikasa edo zimolasa, landare-zelulentzat, le-
gamientzat eta onddoentzat.
Detergentea duen lisirako disoluzioa erabili au-
rretik jar daiteke abian tratamendu entzimatikoa,
luzioari entzimak gehituta.
Tratamendu mekanikoa
Bakterioetan, tratamendu espezifikoa ez den bes-
te aukera bat da horma bitarteko mekanikoekin
apurtzea, hala nola ur destilatuan edo indarge­
tzailean irakinda, izoztu-desizostu zikloen bidez,
­sonikazioa baliatuz eta abar.
Tratamendua CTAB erabiliz
Horma zelularra duten zelulen berezko beste
ezaugarri bat da polisakaridoetan eta deribatu
polifenolikoetan oso aberatsak direla. Konposa-
tu horiek biologia molekularrean erabiltzen diren
prozesu entzimatikoak eragozten dituzte. Ho-
rrenbestez, SDSa erabili ordez, beste detergente
ioniko bat, CTABa, erabiltzen da askotan, arazte-
prozesuan konposatu horiek desagerraraztea
errazten baitu.
3.8 dokumentua
Landare-zelulen
lisirako disoluzioa
Zetil-trimetil-amonio bromuroa (CTAB): % 2
(p/b).
Sodio kloruroa (NaCl): 1,4 M.
EDTA: 20 mM.
Tris-HCl-a: 0.1M, pH 8.

3.7 dokumentua Gatz kaotropikoak

Ur molekulen antolaketan eta makromolekulekiko (hala nola proteinekiko eta azido nukleikoekiko) elka-
rrekintzan eragina duten konposatuak dira gatz kaotropikoak. Haiei esker lortzen da, batetik, substan-
tzia apolarren disolbagarritasuna handitzea, eta bestetik, proteinen egitura sekundarioari eta tertziarioari
eusten dioten molekula barneko elkarrekintza ez-kobalenteak aldatzea (hidrogeno-zubiak, Van der Waals
indarrak, elkarrekintza hidrofobikoak), eta, hortaz, desegonkortzea.
Hofmeister seriea esaten zaion segida honek adierazten du zenbatekoa den gatz horiek eragiten duten
efektu kaotropikoaren intentsitatea:

KATIOIAK NH4+ K+ Na+ Li+ Mg++ Ca++ (NH2)3C+

(guanidinioa)

Efektu Efektu
kaotropiko kaotropiko
txikiagoa handiagoa

ANIOIAK SO42– HPO42– Azetato– Zitrato– Cl– NO3– ClO3– I– ClO4– SCN–
(Isotiozianatoa)
68 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa
3.3.3. Lisiaren emaitzen
egiaztapena
Behin erauzketa-fasea amaituta, zelulen lisia egi-
teko prozesua eraginkorra izan dela adierazten
duen disoluzio homogeneoa lortu den egiaztatu
behar dugu.
Zelulen lisia ez bada nahikoa, protokoloa luzatu
egin behar da, lagina erabat homogeneizatzea
lortu arte. Esate baterako, lisia ez bada homo-
geneoa, hau da, pikorrak, zelula-gorputzak eta
antzekoak daudela hautemanez gero, protoko-
loko inkubazio-denbora estandarra igarotakoan,
lisirako disoluzio gehiago gehitu eta lagina berriro
inkubatuko da, tenperatura altuan (37-65 ºC) be-
harrezkoa bada.
3.6 irudia. Disoluzio homogeneoa lortuz gero, lisiaren
emaitza ona izan dela jo daiteke.
3.3.4. DNA erauztean kontuan
hartu beharrekoak
DNA bakarrik araztu nahi denean, RNAk enba-
razu egin dezakeelako ondorengo azterketetan,
zelulen lisia amaitutakoan eta arazten hasi baino
lehen, ezinbestekoa da RNA desagerraraztea lisa-
tutik. Horretarako:
Erreakzio-ingurunean A RNAsa gehitu behar da.
37 ºC-an inkubatu behar da, 15-45 minutuz.
Urrats hori ez da beharrezkoa izaten odol peri-
ferikoko edo hezur-muineko laginetan, RNA bi-
dezko kutsadura minimoa delako; nolanahi ere,
komeni da hori egitea beste lagin mota batzuekin
(listua, zelula-ehunak eta igurtziz lortutakoak).
3.4. Azido nukleikoen
arazketa
Lisia amaitutakoan, zelula-erauzkin konplexu ba-
tean daude azido nukleikoak, eta haiekin batera
proteinak, gatz mineralak, zelulen osagai disolba-
garriak, bai eta erauzketa-prozesuan erabilitako
erreaktiboak berak ere.
Arazteko prozesua honako honetan datza: azi-
do nukleikoak eta lisatuko gainerako osagaiak
bereiztean.
Hurrengo azpiataletan, arazteko zenbait teknika
ikasiko ditugu; teknika horiek azido nukleikoen
ezaugarri fisiko-kimiko batzuk dituzte oinarri.
Hauek dira, zehazki, teknikak:
Disolbatzaile organikoen bidez araztea.
Gatzekin hauspeatzea (salting-out).
Ioi-trukearen kromatografia.
Adsortzio-kromatografia.
Esfera magnetikoen bidez araztea.
Ultrairagazpena.
Plasmidoak arazteko teknika batzuk ere ikasiko
ditugu, eta RNA arazteko bereziki kontuan hartu
beharrekoak ere adieraziko ditugu.
3.4.1. Disolbatzaile
organikoen bidez araztea
Oinarria
Disolbatzaile organikoen bidez arazteak
­zelulen lisatua osatzen duten konposatuek
disolba­tzaile organikoetan duten disolbagarrita-
suna du oinarri.
Prozedura
Lau fase bereiz daitezke:
I. Konposatu disolbagarriak desagerraraztea di-
solbatzaile organikoetan.
II. DNA hauspeatzea.
III. DNA garbitzea.
IV. DNA berresekitzea.

I. Konposatu disolbagarriak desagerrarazi
disolbatzaile organikoetan
DNA genomikoa arazteko protokolorik
ohikoenean erabiltzen den disolbatzailea fenol,
kloroformo eta isoamil alkohol konbinazio bat da,
25:24:1 proportziokoa.
Hau da prozedura:
Lisatuaren eta erreaktiboaren bolumen berdi-
nak nahasi eta vortex batean ondo irabiatu.
Lisatuak fase akuosoa ematen du. Klorofor-
moak lipidoak disolbatzen ditu eta nahasteari
fase organikoa ematen dio. Fenolak lisatuak
dituen proteinak desnaturalizatu eta disolba-
tu egiten ditu, eta fase organikoan integra­
tzen da.
Zentrifugatu. Zentrifugazioaren bidez, ira-
biatutako nahastea bi fasetan bereizten
da: akuosoa, hodiaren goiko aldean, azido
nukleikoekin, gatzekin eta lisatuaren osagai
hidrodisolbagarriekin; eta organikoa, hodiaren
beheko aldean, proteinekin eta lipidoekin.
II. DNA hauspeatzea
Fase akuosoa hodi garbi batean jartzen da, eta
DNA hauspeatzen da, sodio azetato eta isopropa-
nol edo etanol (% 100) hotza gehituta.
3.7 irudia. DNA genomikoa fenol/kloroformo/isoamil bidez arazteko eskema.
3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 69
DNA molekula polianioniko bat da; hau da, oso
karga negatiboa du, helize bikoitzaren kanpoal-
dean dauden fosfato taldeen eraginez. Ingurune
akuoso batean, karga garbi negatiboa dutenez,
DNA molekulek elkar aldaratzen dute, eta ur mo-
lekulen geruza hidratatzaile batez inguratzen dira,
eta, hala, egonkortu. Horregatik da DNA disolba-
garria uretan, nahiz eta molekula handiak dituen.
Alkohola (agente deshidratatzailea) gehitzen zaio-
nean ingurune akuosoari, DNA molekula inguratzen
duen geruza hidratatzailea desegiten da. Erreakzio-
inguruneko sodio katioiek (sodio azetatoa baitu)
DNAren fosfato taldeen karga negatiboa neutra-
lizatzen dute. Horregatik DNA molekulek ez dute
jada elkar aldaratzen; aitzitik, beren artean batu eta
harizpi fin zurixken multzo bat eratzen dute.
Zentrifugazioaren bidez, hauspeatutako DNA
­hodiaren behealdean sedimentatzen da, eta hasie-
rako lisatuko kutsatzaile hidrodisolbagarri guztiak
gainjalkinean geratzen dira.
III. DNA garbitzea
Behin gainjalkina kenduta, DNA pelleta etanola-
rekin (% 70-95) garbitu eta berriro zentrifugatzen
da. DNA disolbaezina da etanoletan, eta hodiaren
behealdean geratzen da (sedimentatuta); baina
DNArekin batera hauspeatutako gatzak eta kutsa­
tzaile posibleak disolbagarriak dira etanoletan, eta,
beraz, gainjalkinarekin batera kentzen dira.
70 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa

IV. DNA berresekitzea I. Proteinak hauspeatzea

Etanola oztopo bat da biologia molekularreko ia tek­
nika guztietan, eta, beraz, erabat desagerrarazi be-
har da DNA berreseki aurretik. Hodiaren hormetan
geratzen diren hondarrak hodia material xurgatzaile
batean (hala nola iragazpaperean) behekoz gora ja-
rrita ken daitezke; gero, DNA pelleta lehortzen uzten
da giro-tenperaturan, hodia zabalik utzita.
Lehortu ondoren, berreseki egiten da, ur destila-
tuan (kantitate egokian) edo indar ioniko txikiko
disoluzio indargetzailean edo tanpoian (pH neu-
troa edo pixka bat alkalinoa duela), hala nola Tris-
EDTA (TE) tanpoian. (3.9 Dok.)
DNAren berhidratazioa oso prozesu motela
da. Aukeretako bat da lehenbizi 55-65 ºC-an
inkubatzea, eta, gero, giro-tenperaturan leun-
leun ­irabiatzea pelleta erabat disolbatu arte, edo,
bestela, hozkailuan inkubatzea 4 ºC-an, hurrengo
egunera arte.
Lisatuari haren bolumen bereko gatz-disoluzio
kon­tzentratuaren bolumena gehitzen zaio (pro-
teinak hauspeatzeko disoluzio gisa jarduten
du) eta vortex batean ondo irabiatzen da 20-30
­segundoz. (3.11 Dok.)
Gero, nahastea zentrifugatzen da, eta, hartara,
proteinak hodiaren behealdean sedimen­tatzen
dira, kolore arreko pellet gisa, eta gainjalki-
nean, azido nukleikoak, gatzak eta lisatuaren
osagai hidrodisolbagarriak geratzen dira.
3.10 dokumentua
Proteinak hauspeatzeko disoluzioa (I)
NaCl 6M.
Proteinak hauspeatzeko disoluzioa (II)
Amonio azetatoa 10M.

3.9 dokumentua II. DNA hauspeatzea

TE tanpoia, DNA berresekitzeko
Gainjalkina hodi garbi batean jartzen da, haren
Tris HCl-a: 10 mM, pH 8. bolumen bereko isopropanol bolumena gehi­
EDTA: 1 mM. tzen zaio, eta nahasi egiten da hodia zenbait aldiz
buruz behera jarrita. DNA harizpi zurixken multzo
baten forman hauspeatzen da, eta sedimentatu
egiten da zentrifugazioaren bidez.
3.4.2. Gatzekin hauspeatzea
(salting-out)
Oinarria

Gatzekin hauspeatzea honako honetan datza:

proteinak gatzen kontzentrazio handia duen di-
soluzioan hauspeatzean.

Gatzen kontzentrazio handiek indar ioniko han-

diko inguruneak eratzen dituzte. Horrenbestez,
proteinen arteko elkarrekintza hidrofobikoak are-
agotu egiten dira, eta ingurune akuosoan haien
disolbagarritasuna izugarri gutxitu, eta, hala, haus-
peatu egiten dira. (3.10 Dok.)

Prozedura 3.8 irudia. DNA hauspeatuaren harizpi zurixken itxura.

Aurreko metodoak bezala, protokoloak zenbait

fase ditu:
III. DNA garbitu eta berresekitzea
I. Proteinak hauspeatzea.
Gainjalkina kendu eta DNA etanolarekin (% 70-95)
II. DNA hauspeatzea.
garbitzen da, eta ur destilatuan edo TE disoluzio in-
III. DNA garbitu eta berresekitzea. dargetzailean berresekitzen da, aurrekoa bezala.
 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 71

3.11 dokumentua Gatzekin hauspeatzeko protokoloa

Azido nukleikoen arazketa, EDTArekin antikoagulatutako odol periferikoa abiaburu hartuta

Gehitu 9 ml eritrozitoen lisirako di-
Jarri 3 ml odol, tapoi hariduna duen soluzio, eta nahasi buruz behera ja-
15 ml-ko hodi koniko batean. rrita. Inkubatu 10 min giro-tenpera.

Zentrifugatu 3 minutuz, 2.000 rpm-an.

Kendu Gehitu 3 ml zelulen lisirako diso-
gainjalkina. luzio. Berreseki pelleta, 4-5 aldiz
Inkubatu 30-60 minutuz, 37 ºC-an. indar handiz pipeteatuta.

Gehitu 1 ml proteinak
hauspeatzeko disoluzio. Irabiatu
Zentrifugatu 5 minutuz, 2.000 rpm-an. indar handiz vortex batean.
Bota pelleta
duen hodia.
Jarri gainjalkina beste hodi batean.

Gehitu 3 ml isopropanol.
Nahasi leunki, buruz behera jarrita,
Kendu DNA harila eratu arte.
isopropanola,
DNA galdu gabe.
Gehitu 3 ml etanol (% 70).
Nahasi leunki, buruz behera jarrita,
Kendu etanola, DNA garbitzeko.
DNA galdu gabe.

Jarri DNA harila hodiaren behealdean, eta utzi

lehortzen, etanol hondarrak desagertu arte.
Gehitu 50-150 µl H2O
destilatu edo TE tanpoi.
Inkubatu 65 °C-an ordu batez, leunki irabiatuta
tarteka, edo sartu hozkailuan 4 °C-an gau batez.

Irabiatu, eta purutasuna eta kontzentrazioa kuantifikatu.

3.9 irudia. DNA genomikoa gatzak hauspeatuta arazteko eskema.

72 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa
3.4.3. Ioi-trukearen
kromatografia
Oinarria
Ioi-trukearen kromatografia disoluzioan dau-
den ioien eta talde funtzional kargatuen arteko
lotura elektrostatiko itzulgarrian datza; talde
funtzional horiek kobalenteki atxikita daude fase
geldikor bati.
Fase geldikorreko talde funtzionalek karga garbi
positiboa baldin badute, trukatzaile anionikoak
esaten zaie, modu itzulgarrian lotuko baitituzte
disoluzioan dauden ioi negatiboak (anioiak). Fase
geldikorreko talde funtzionalek karga garbi nega-
tiboa badute, berriz, trukatzaile kationikoak de-
ritze, disoluzioan dauden ioi positiboak (katioiak)
lotuko dituzte eta.
3.10 irudia. Ioi-trukearen kromatografiaren oinarria. Di-
soluzioan dauden ioak kontrako zeinuko karga duten eta
fase geldikorrean gelditu diren funtzio taldeei atxikitzen
zaizkie.
MAE: metilaminoetanola
Lotunea
Matrizea
3.11 irudia. Trukatzaile anioniko gisa gehien erabiltzen diren talde funtzionalak.
Azido nukleikoak arazteko, silizezko zein
zelulolaz­ko matrizeak erabiltzen dira (fase gel-
dikorra), polipropilenozko zutabetan paketatuta.
Matrizeari trukatzaile anioniko bat batzen zaio
kobalenteki, azido nukleikoak fosfato taldeen on-
dorioz karga negatibo handiko polianioi linealak
baitira. Hauek dira gehien erabiltzen diren bi talde
funtzionalak: metilaminoetanola (MAE) eta dieti-
laminoetila (DEAE).
Kontuan izan!
Ioi-trukearen kromatografian, fase geldikorraren
eta talde funtzionalaren arteko lotura kobalen-
tea da, eta talde funtzionalari atxikitzen zaion ioi
mota inguruneak duen gatzen kontzentrazioaren
eta pH-aren mende dago.
3.12 irudia. Ioi-trukeko zutabe motak.
DEAE: dietilaminoetila
Lotunea
Matrizea
 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 73

Prozedura Metodo honek aukera ematen du banaka arazteko

azido nukleiko motetako bakoitza; molekula mota
Kromatografiaren prozeduran hiru urrats nagusi bakoitzaren karga garbi negatiboaren arabera araz-
bereiz daitezke: ten baitira.

1. Lehenik eta behin, kromatografiaren zutabea Garbitzeko erabiltzen diren disoluzio indar­
lisatuaren diluzio batekin kargatzen da, gazita- getzaileen gatz-kontzentrazioa aldatuta, posible
sun txikiko eta pH neutroko disoluzio indarge­ da pisu molekular handiko mRNA eta RNA erribo-
tzailean. Baldintza horietan, azido nukleikoek somikoak eluitzea eta DNA, berriz, zutabeari atxi-
karga garbi negatiboa dute eta trukatzailea- kita uztea.
ren talde funtzionaletara batzen dira, karga
positiboa baitute. Proteinak, polisakaridoak
eta karga positiboa duten lisatuko gainerako BEREIZITAKO
kutsatzaileak ez dira batzen truka­tzailera, eta MOLEKULAK
zutabetik eluitzen dira.
DNA genomikoa
DNA plasmidikoa
2. Bigarrenik, gatz-kontzentrazio gorakorreko DNA (150 bp)
disoluzio indargetzaileekin garbitzen da zu-
mRNA
tabea, karga negatibo txikiko kutsatzaileak
rRNA 16S eta 23S
desa­gerrarazteko. rRNA 5S
tRNA
3. Eta hirugarrenik, gazitasun maximoko eta pH
Proteinak,
handiko disoluzio indargetzaile batekin elui­
polisakaridoak,
tzen da DNA zutabetik. metabolitoak

Arazte-prozesuari amaiera emateko, azido 0.5 M 1.0 M 1.5 M

nukleikoak hauspeatzen dira eluitutakotik, isopro-
panola edo etanola erabilita. Hala, eluziorako in-
dargetzaileko gatzak desagerrarazten dira; gero,
etanolarekin garbitu, eta ur destilatuan edo TE tan-
poian berresekitzen dira. Hiru urrats horiek lehen
adierazitako metodoetan bezala gauzatzen dira.
Gatz-kontzentrazioa
3.14 irudia. Zelulen lisatu batean dauden molekulen
eluzio-sekuentzia, grafiko baten bidez adierazita, ioi-
trukearen zutabea erabiliz eta garbitzeko indarge­tzailearen
gatz-kontzentrazioa gehitu ahala lortutakoa.

3.13 irudia. DNA ioi-trukearen kromatografia bidez arazteko faseen eskema. Zutabea lisatuarekin kargatzen da (1), eta,
hartara, karga negatiboko molekulak zutabean geratzen dira, eta proteinak, berriz, karga positiboa dutenez, zutabetik
eluitzen dira (2). Zutabea, gero, goranzko indar ionikoa duten indargetzaileekin garbitzen da (3), eta, beraz, karga negatibo
txikiko kutsatzaileak eluitu egiten dira (4). Eta azkenik, gazitasun maximoko indargetzaile batekin garbitzen da zutabea (5),
eta, horren ondorioz, DNA trukatzailetik aldendu eta eluitu egiten da (6).
74 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa
3.4.4. Adsortzio-
kromatografia
Oinarria
Adsortzio-kromatografiak azido nukleikoek
beirari eta silizeari atxikitzeko duten adsortzio-
ahalmena du oinarri, horretarako gatz kaotro-
pikoak erabilita.
Beira, batez ere, silikatoz osatuta dago (SiO44–),
egitura molekular tetraedrikoa du, eta gai da ur
molekulekin hidrogeno-zubiak eratzeko. Ho-
rrenbestez, beira, urarekin kontaktuan, geruza
hidratatzaile batez estaltzen da. Disoluzio akuoso
batean, azido nukleikoak ere hidrogeno-zubien
bidez fosfato taldeei batutako ur molekulez era-
tutako geruza hidratatzaile batekin estaltzen dira.
Biek dituzten geruza hidratatzaileek beren arteko
interakzioa eragozten diete. (3.15 irudia [1])
Ingurune akuosoari gatz kaotropikoren bat gehi-
tuz gero, gatzak ur molekulak erakartzen ditu eta
bi egituren geruza hidratatzailea kentzen du, eta,
hartara, ingurune hidrofobikoa eratu eta silizearen
eta azido nukleikoaren arteko interakzioa ahalbi-
detzen da. (3.15 irudia [2 eta 3])
3.15 irudia. Azido nukleikoek silizearekiko duten adsortzioaren oinarria, gatz kaotropikoak erabilita.
Prozedura
Azido nukleikoak adsortzio-kromatografiaren
bidez arazteko, beira-zuntzaren mintzak edo si-
lizezko perlak erabiltzen dira, Eppendorf motako
hodi biltzaileetan ahokatzen diren polipropilenoz­
ko zutabetan paketatuta.
1. Agente kaotropiko bat duen indargetzaile ba-
tean diluitutako lisatuarekin zutabea kargatu eta
zentrifugatu egiten da; hala, azido nukleikoak
zutabeko mintzari atxikita (adsortzioa) geratzen
dira, eta proteinen eta zelulen osagai kutsa­
tzaileen ingurune likidoa hodi biltzailean bildu
eta desagerrarazi egiten da.
2. Gero, mintzari atxikita geratutako azido
nukleikoak etanolarekin (% 70) garbitzen
dira, kutsatzaile-hondarrak desagerrarazteko.
Horretarako, zutabea etanolarekin kargatu,
zentrifugatu eta hodi biltzaileko edukia desa-
gerrarazten da. Alkohol-hondarrak gera daite-
zen eragozteko, zutabe hutsa berriro zentrifu­
gatzen da eta etanol-hondarrak dituen hodi
biltzailea baztertzen da.
3. Eta azkenik, Eppendorf hodi garbi batean
ahokatzen da zutabea, eta mintzari ur desti-
latua edo TE tanpoia gehitzen zaio, dagokion

3.16 irudia. Silizearekiko adsortzioko zutabeak baliatuta, azido nukleikoen arazketaren eskema.
kantitatean. Hartara, bai mintzaren gainazalak
eta bai azido nukleikoen molekulek ur moleku-
len geruza hidratatzailea berreskuratzen dute,
eta bereizi egiten dira (desortzioa) (3.15 Irudia
[1]). Azido nukleikoa berreseki dadin bultza­
tzeko denbora labur batez inkubatu ondoren
(3-5 min), dena zentrifugatu eta zutabea baz-
tertzen da. Eppendorf hodian azido nukleiko
araztua biltzen da.
3.4.5. Esfera magnetikoen
bidez araztea
Oinarria
Esfera magnetikoen bidezko arazketa ho-
nako honetan datza: azido nukleikoak mikroes-
fera magnetikoei batzean, eta iman baten bidez
azido nukleikoei eustean.
Mikroesferak matrize inerte batean kapsulatu-
tako magnetitazko nanopartikulez osatuta egon
3.17 irudia. Mikroesfera magnetikoak baliatuta, azido nukleikoen arazketaren oinarria.
3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 75
ohi dira, eta azido nukleikoak bi modutara batzen
zaizkie partikula magnetiko horiei: adsortzioz eta
afinitatez.
Adsortzio bidezko
bereizketa magnetikoa
Kasu horretan, azido nukleikoekiko afinitate han-
dia duten talde funtzionalez edo silizez inguratzen
dira mikroesferak.
1. Esferak lisatuari gehitzen zaizkio, agente
kaotropiko batekin batera, eta, hala, azido
nukleikoak esferen gainazalari atxikita gera­
tzen dira (adsortzioa).
2. Nahastea duen hodia imandun euskarri batean
(bereizgailu magnetikoa) jartzen da, eta, horren
ondorioz, azido nukleikoetara batutako esferak
imanak erakarri eta harekin kontaktuan dagoen
hodiaren hormaren eremuan pilatzen dira.
76 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa
3. Lisatuaren gainerakoa, proteinekin eta zelulen
osagai kutsatzaileekin batera, hoditik desage-
rrarazten da, pipeteatuz edo dekantatuz.
4. Azido nukleikoak garbitzeko, hodia bereizgailu
magnetikotik atera, etanola gehitu (% 70) eta
irabiatu egiten da. Bereizgailu magnetikoan
jarrita, esferak berriro aglutinatu egiten dira,
eta garbitzeko erabilitako disoluzioa eta kutsa­
tzaileen hondarrak pipeteatuz edo dekantatuz
desagerrarazten dira.
5. Azido nukleikoak hauspeatzeko, hodia bereiz-
gailutik atera, ur destilatu edo TE tanpoi kan-
titate egokia gehitu, eta behar beste denbora
inkubatzen da (10 minutu, gutxi gorabehera),
azido nukleikoak esferetatik bereiz daitezen
(desortzioa) eta ingurunean berreseki daite-
zen. Desortzioa, nahi izanez gero, propio era-
gin daiteke, irabiatuz inkubatuta edo tenpera-
tura altuan (55 ºC-an) inkubatuta.
6. Eta azkenik, hodia bereizgailu magnetikoan
jartzen da, esferak hodiaren horman pilatzeko,
azido nukleikorik gabe; disoluzioan dauden
azido nukleikoak pipeteatu eta hodi garbi ba-
tean jartzen dira.
Afinitate bidezko bereizketa magnetikoa
Esferak azido nukleiko mota jakin batzuekiko
afinitate handia duten polimero sintetikoz edo
naturalez inguratzen dira. Adibidez, poli-T oligo-
nukleotidoz inguratutako esferak poli-A isatsa
duen mRNA eukariota arazteko erabiltzen dira.
Halakoetan, hau da prozedura:
1. T oligo-mikroesferak lisatuari gehitzen zaizkio,
eta horiez gain, RNA mezularien A-Poli isatsa-
ren eta T-oligoaren arteko hibridazio espezi-
fikoa eragiten duen disoluzio indargetzaile bat.
3.18 irudia. Adsortzio bidezko bereizketa magnetikoa, azido nukleikoen arazketaren eskema.
2. Hodia bereizgailu magnetikoan jartzen da, ho-
rrek aukera ematen baitu lisatuaren osagaiak
desagerrarazteko eta RNA mezularia (RNAm)
esferei atxikita eusteko.
3. Gero, esferak etanolarekin garbitzen dira,
aurreko kasuan bezala, eta RNA mezularia
(RNAm) eluitzen da. Horretarako, esferak ur
destilatuarekin edo TE tanpoiarekin nahasten
dira, eta tenperatura igotzen da, RNAm bereiz-
teko T-oligotik, desnaturalizazio termiko bidez.
4. Eta azkenik, esferak bereizgailu magnetikoare-
kin kentzen dira, eta disoluzioan dagoen RNA
mezularia (RNAm) hodi garbi batean jartzen da.
Teknika horren aldaeretako bat esferak estrep-
tabidinarekin inguratzean datza. Kasu horretan,
zelulen lisatua aurretik inkubatzen da, biotinaz
hibridazio-baldintzetan markatutako poli-T oligo-
nukleotidoekin.
Behin poli-T oligonukleotidoak batu direnean
RNA mezulariaren (mRNA) poli-A isatsera, estrep-
tabidinarekin inguratutako esferak gehitzen dira.
Estreptabidinak afinitate handia duenez biotinare-
kiko, esferetara batzen da mRNA-poliTa. Hori da
abiapuntua, eta, gero, aurreko kasuarena beza-
lako arazketa-prozesuari ekiten zaio.
Kontuan izan!
Biotinaren eta estreptabidinaren
arteko elkarrekintza
Estreptabidina pisu molekular handiko protei-
na tetramero bat da, Streptomyces generoko
zenbait espezietatik isolatzen da eta lau lotune
ditu biotinarentzat. Estreptabidinaren eta bioti-
naren arteko lotura ezagutzen den elkarrekin­
tza ez-kobalente handienetako bat da.

3.4.6. Ultrairagazpena
Oinarria
Ultrairagazpena honako honetan datza:
poro t­amaina jakin bateko mintzen bidez azido
nukleikoen molekulak tamainaren arabera be-
reiztean.
Mintzak hodi biltzaileetan ahokatzen diren zutabeen
oinarrian jartzen dira. Metodo hori PCR t­eknikaren
bidez lortutako produktuak arazteko erabiltzen da,
baldin eta 150 bp-tik gora badituzte.
Prozedura
Hau da jarraitu beharreko prozedura:
1. Lagina (PCR erreakzio-nahastea) zuzenean
zutabean kargatu eta zentrifugatu egiten da,
iragazkian PCR bateko produktu anplifikatuak
geratzeko eta kutsatzaileak (primer esaten
zaienak, nukleotidoak, gatzak eta abar) hodi
bil­tzailera igarotzeko.
2. Iragazkia etanolarekin garbitzen da, kutsatzaile-
hondarrak desagerrarazteko.
3. PCR teknika aplikatu osteko produktuak
berreseki­
tzeko, zutabeari ur destilatua edo
TE tanpoia gehitzen zaio, giro-tenperaturan
inkubatzen da zenbait minutuz, eta, gero, hodi
garbi batean jartzen da, pipeteo bidez.
3.19 irudia. Azido nukleikoen arazketa, ultrairagazpena-
ren bidez.
3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 77
3.4.7. Plasmidoen
arazketa
DNA birkonbinatua lortzeko teknologian oso bi-
tarteko baliagarriak dira plasmidoak, bektore gisa
erabiltzen baitira intereseko gene-sekuentziak
klonatzeko.
Arazoa plasmidoak araztea da; izan ere, DNA kro-
mosomiko bakterianotik eta RNA bakterianotik
bereizi behar dira.
Plasmidoak arazteko bi teknika hauek ikasiko di-
tugu: dentsitate-gradientean zentrifugatzea eta
lisi alkalinoa.
Kontuan izan!
Gogoan izan bakterioek beren kromosomatik
kanpo dituzten DNA molekula zirkular txikiak
direla plasmidoak, eta askotan antibiotikoei eta
birulentzia-faktoreei erresistentzia egiteko ge-
neak dituztela.
Dentsitate-gradientean
zentrifugatzea
Tradizionalki, bi molekula mota horien dentsi-
tatearen aldea izan du oinarri bereizketak. Bes-
te modu batera esanda, behin bakterioen DNA
guztia (kromosomikoa + plasmidikoa) araztuta,
ultrazentrifugatu egiten zen zesio kloruroz auto-
sortutako dentsitate-gradientean.
DNA plasmidikoaren dentsitatea txikiago denez
DNA kromosomikoarena baino, bi DNA motak
banda banatan bereizten ziren.
Nolanahi ere, oso teknika nekeza izateaz gain,
zenbait egun irauten zuen.
Lisi alkalinoa
Gaur egun, plasmidoak arazteko metodorik
e­rabiliena lisi alkalinoa da, eta bi molekula mota
horien desnaturalizazio/birnaturalizazio prozesuko
aldeak baliatzean datza.
Hauek dira faseak:
I. Lisi alkalinoa
II. Neutralizazio azkarra
III. DNA plasmidikoaren arazketa. (3.12 Dok.)
78 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa

I. Lisi alkalinoa rean, DNA desnaturalizatzen da pH alkalinoaren

Bakterioak esekitzeko disoluzio batean berreseki
ondoren, lisirako disoluzioa gehitzen da, oso alka-
linoa (pH 11) eta SDS detergente anionikoz eta
sodio hidroxidoz osatutakoa.
Inkubazio-aldi horretan, bakterioen lisia gauza­
tzen da SDS detergentearen eraginez, eta, aldi be-
eraginez.
II. Neutralizazio azkarra
Nahasteari potasio azetato kontzentrazio handiko
disoluzio bat gehitu, pH azidoa duena ­(zehazki,
4,8 pH); izan ere, bi ondorio hauek eragiten ditu
osagaietan:

3.12 dokumentua Plasmidoak lisi alkalinoaren bidez arazteko protokoloa

1,5 ml-ko Eppendorf hodi batean

berreseki kolonia bat, 100 µl
GTE disoluzioan.

Inkubatu 5 minutuz giro-tenperaturan. Gehitu 200 µl lisi

alkalinorako disoluzio
prestatu berria.
Nahasi leunki, buruz
behera jarrita.
Inkubatu 5 minutuz 4 °C-an.
Gehitu 150 µl
neutralizaziorako
disoluzio. Nahasi zenbait
Inkubatu 5 minutuz 4 °C-an aldiz, buruz behera jarrita.
eta zentrifugatu 15 minutuz
12. 000 g-an.
Bota pelleta
duen hodia.

Jarri gainjalkina beste

hodi batean.

Gehitu 1 ml etanol (% 70)

4 °C-an, eta nahasi buruz
Inkubatu 15 minutuz 4 °C-an behera jarrita.
eta zentrifugatu 15 minutuz
12. 000 g-an.
Kendu Gehitu 1 ml etanol (% 70)
gainjalkina. 4 °C-an, eta nahasi buruz
behera jarrita.
Zentrifugatu 10 minutuz 12. 000 g-an.

Kendu
gainjalkina.
Utzi lehortzen pelleta.

Gehitu 50µl TE tanpoi.

Berreseki plasmidoen
hauspeakina. Beharrezkoa bada,
tratatu RNAsa baliatuta.
 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 79

Batetik, pH-aren bat-bateko neutralizazioak DNA 3.4.8. RNA arazteko

molekula kromosomikoetan berrelkarketa alea-
torioak eragiten ditu kateen barruan zein ­kateen
artean, eta hauspeatzen diren makroagregatu
disolbaezinak sortzen dira. DNA plasmidikoa,
aitzitik, askoz ere txikiagoa denez, primeran bir-
naturalizatzen da, jatorrizko egitura superkiribila
berreskuratu eta disoluzioan geratzen da.
Eta bestetik, oso gatz-kontzentrazio handia
duenez, proteinak hauspeatzen dira, dodezil-
sulfatoaren potasio-gatzarekin batera, disol-
baezina baita. Proteinak eta detergentea haus-
peatzeak agregatuak sortzea eragiten du, eta
horiek ere bereganatzen dute birnaturalizatu
gabeko DNA kromosomikoaren multzoa. Zen-
trifugatuta, osagai disolbaezin guztiak sedi-
mentatzen dira, eta DNA plasmidikoa jatorrizko
konfigurazioan geratzen da gainjalkinean.
III. DNA plasmidikoaren arazketa
Gainjalkina hodi garbi batean jartzen da, RNAsa ba-
liatuz tratatzen da RNA kutsatzailea desagerraraz-
teko, eta lehen deskribatutako metodoren baten
bidez arazten da (adsortzio-kromatografia, esfera
magnetikoak, isopropanolarekin hauspeatu, etab.).
bereziki kontuan
hartu beharrekoak
RNA oso sentikorra da RNAsa entzimen akzioare-
kiko, eta oso azkar degradatzen da haien eraginez.
Zoritxarrez, RNAsa entzimak erresistentzia han-
dikoak dira, eta gainazal zein material guztietan
daude, bakterioen, onddoen eta larruazalaren des-
kamazioko zelulen bidezko kutsaduraren ondorioz.
Materiala tenperatura altutan esterilizatuta ere
ez dira desagertzen; izan ere, nahiz eta beroare-
kin desnaturalizatzea lortu eta aktibitatea galdu,
tenperaturak behera egiten duenean jatorrizko
konformazioa berreskuratu eta aktibo bilakatzen
dira. Horrezaz gain, ez dituzte magnesio katioiak
kofaktore gisa behar, eta, beraz, EDTAk ere ez ditu
inaktibatzen.
Horrenbestez, RNA baldintza berezietan araztu
behar da:
Eskularruak jantzita egin behar da lan fluxu la-
minarreko kabinetan, kutsadurak eragozteko.
RNAsa entzimak inaktibatzen dituzten merka-
tuko disoluzioekin garbitu behar dira gainazalak.

3.13 dokumentua Erabiliko diren material guztiek (Eppendorf

Plasmidoak arazteko erabiltzen ­hodiak, pipeta-puntak, etab.) RNAsa gabeak di-
diren disoluzioak relako ziurtagiria izan behar dute.

Lisi alkalinorako disoluzioa Lisirako disoluzioak RNAsa entzima inaktiba­

Sodio-dodezil-sulfatoa (SDS): % 1. tzeko agente kaotropiko bat eduki behar du.
Sodio hidroxidoa (NaOH): 0,2 N. Erabiliena guanidinio isotiozianatoa da.

Neutralizaziorako disoluzioa Prozesuan erabiliko diren erreaktibo guztiek eta

Potasio azetatoa (KCH3CO2): 3M, pH-a: 4,8. ur destilatuak RNAsa entzimarik gabeak izan
behar dute. (3.14 Dok.)

3.14 dokumentua L aborategian RNAsa entzimarik gabeko ur destilatua

lortzeko metodo estandarra
Bada metodo estandar bat laborategian RNAsa entzimarik gabeko ur destilatua lortzeko. Metodo hori
­dietilpirokarbonatoa (DEPC) % 0,1 proportzioan erabiltzean datza.
DEPCak modu kobalentean eraldatzen ditu proteinen hainbat aminoazido, gehienbat histidina, eta neurri
txikiagoan lisina, zisteina eta tirosina. Eraldaketa horrek iraunkorki inaktibatzen ditu RNAsa entzima eta
beste entzima batzuk. Ura DEPCarekin tratatu behar da, gutxienez bi orduz irabiatuz 37 ºC-an, edo gau
osoz giro-tenperaturan.
Erabili aurretik, jada tratatu den ura autoklabean sartu behar da 20 minutuz 120 ºC-an, DEPCa inaktibatzeko
eta desagerrarazteko; izan ere, tenperatura horretan degradatu eta CO2 eta etanol bilakatzen da.
Urak DEPC aztarna txikiak baditu, txikiak badira ere, biologia molekularrean erabiltzen diren erreakzio en-
tzimatikoak inhibitu ditzakete.
80 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa

3.5. Erauzteko eta Esfera magnetikoak konpartimentu batetik beste-

ra igarotzeko, pistoi metalikoak dituzte, muturrean
arazteko prozesuen elektroimana dutela; horiek irabiagailu funtzioa ere
betetzen dute.
automatizazioa
Aurreko ataletan deskribatu ditugun metodolo-
gietako batzuk automatizatu eta optimizatu egin
dira; izan ere, erauzketarako robot automatikoak
eta ia lagin mota orotarako erreaktibo espezi-
fikoen kitak diseinatu dira. Gaur egun, biologia
molekularreko laborategi gehienetarako daude
soluzio automatizatuak, edozein dela prozesatu
beharreko laginaren bolumena –izan lagin indibi-
dualak, izan aldibereko 96 lagin– eta edozein dela
lagin mota: odola, FFPE ehunak, animalia- edo
landare-ehunak, bakterioen kultiboak, auzitegiko
3.20 irudia. Azido nukleikoak esfera magnetikoen bidez
laginak, etab. arazteko automatizazioaren oinarria.

3.5.1. Automatizazioaren
Adsortzio-kromatografia oinarri dutenak
alde onak
Adsortzio-kromatografia (zutabetan silizezko gela
Erauzte-prozesua automatizatzearen alde onak erabilita) automatizaziora oso ondo egokitzen den
nabarmenak dira: beste metodologietako bat da. Kasu horretan, zu-
tabeak pipeteo automatikoz kargatzen dira, eta
Purifikazio-maila handiko azido nukleikoak
erreaktiboak zutabean barrena igarotzeko, hutse-
lortzea bermatzen da.
ko sistema edo zentrifugazioa erabiltzen da.
Proteinen bidezko kutsadura minimizatzen da.

Lagin arteko kutsadura gurutzatua eragozten da.

Azkar egiten da, ordubete baino gutxiago be-
har baita azido nukleiko araztuak lortzeko.

3.5.2. Tresna automatiko

motak
Tresna automatiko gehienetan partikula magne-
tikoak erabiltzen dira. Baina horiez gain, badira
adsortzio-kromatografia oinarri dutenak ere, bai
eta modularrak ere, zenbait metodologiatara ego-
kitzeko gai direnak.

3.21 irudia. Azido nukleikoak zutabeen eta hutseko siste-

Partikula magnetikoen erabilera oinarri maren bidez arazteko automatizazioaren oinarria.
dutenak

Partikula magnetikoen erabilera oinarri duten Tresna modularrak

tresnetan, erreaktiboen kartutxo itxiak erabiltzen
dira. Kartutxo horiek konpartimentu bat dute
tek­nikaren urrats bakoitzeko, eta konpartimentu
horietako bakoitzean dagokion erreaktibo espezi-
fikoa: lisia / lisirako disoluzioa, garbitu / garbitzeko
disoluzioa, berreseki / berresekitzeko disoluzioa.
Fabrikatzaile batzuek metodologietara egokitzen
diren robot modularrak garatu dituzte; horretarako,
beso maneatzaileak gehitu dizkiete, bai eta modulu
espezifikoak ere, irabiatzeko, hutseko sistemarako,
esfera magnetikoetarako, zentrifugatzeko...
 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 81

3.6. Araztutako sartzeak DNA zatitzea eragiten du. Lagin mota

horretan, horrenbestez, ez du zentzurik osota-
azido nukleikoen suna elektroforesi bidez neurtzeak, beti ikusiko
baita orban edo smear bat.
kalitatea
Hiru parametroren bidez neurtzen edo baloratzen
da araztutako azido nukleikoen kalitatea:

Osotasuna.

Purutasuna.

Kontzentrazioa.

Kalitate oneko azido nukleikoak lortzea

funtsezkoa da ezbairik gabe, haien funtzionalita-
tea egokia izan dadin aplikatu beharreko biologia
molekularreko teknikan, edozein dela ere teknika.

Hurrengo ataletan aztertuko dugu nola balo-

ratzen diren araztutako azido nukleikoen kalita-
tearen parametroak; horrezaz gain, egiaztatuko
dugu kontrol-proba batzuek adieraz dezaketela
haien funtzionalitatea.
3.6.1. Azido nukleikoen
osotasuna
3.22 irudia. DNA genomiko araztuaren elektroforesia.
1) DNA markatzailea. 2) Ondo araztutako lagina, DNA-
ren osotasunari eutsi diona. 3) DNA pixka bat degradatu-
ta duen lagina, goialdeko banda zabalago eta orban edo
smear txiki bat ikusten baita. 4) Oso lagin degradatua, or-
banak kale guztia hartzen duela ikusten baita.

Behin arazte-prozesua amaituta, komeni zaigu ja-

kitea ea azido nukleikoak lehen zuen tamaina duen
prozesuaren ostean, edo zatitu zein degradatu DNA plasmidikoa. Egokiena elektroforesian
den. Hau da, azido nukleikoen osotasun-maila jaki- banda bakarra lortzea da, jatorrizko egitura
tea komeni zaigu. duen plasmidoari dagokiona. Askotan, beste
banda lauso bat ere agertzen da, egitura lasaia
Azido nukleikoak jatorrizko tamainari eusten duen plasmidoari dagokiona; eta zenbaitetan,
dion baloratzeko parametroa osotasuna da. hirugarren banda bat ere bai, dimeroei dago-
kiena.
Osotasuna neurtzeko modurik onena agarosaz­
ko gel-elektroforesia (p/b %0,7-%1,2) egitea
da. Zein den araztu dugun azido nukleiko mota,
­halakoa izango da elektroforesian lortutako emai­
tza. Zehazki:
Dimeroak
DNA genomikoa. Lagineko DNAk osotasunari Egitura lasaia
eutsi badio, agarosazko gelaren goialdean oso Jatorrizko egitura
garbi eta ondo ikusiko da DNA banda bakarra.
Lagineko DNA zatitu edo degradatu egin bal-
din bada, berriz, orban fluoreszente edo smear
(ingelesez) bat ikusiko da elektroforesiaren ka-
lean; orbanaren luzera eta intentsitatea ere
adierazgarria da, laginaren degradazio-maila
adierazten baitu.
Patroi elektroforetiko hori ezin zaie aplikatu
FFPE ehuna abiaburu hartuta erabilitako lagin
araztuei; izan ere, ehuna finkatu eta parafinan 3.23 irudia. DNA plasmidiko araztuaren elektroforesia.
82 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa
RNA: normala izaten da smear txiki bat ager­
tzea, RNA mezulariaren eraginez (hainbat ta-
mainatako molekula anitzen multzoa), bi ban-
da garbi ikusten direla, rRNA 28S eta 18S-ei
dagokiena. Batzuetan, hirugarren banda bat
ere agertzen da, lausoago ikusten dena, rRNA
5.5S eta 5S eta tRNA molekulei dagokiena.
rRNA 28S
rRNA 18S
rRNA 5.5S, 5S, tRNA
3.24 irudia. RNA araztuaren elektroforesia. 1) Tamainen
markatzailea. 2) Lagin degradatua. 3) eta 4) Ondo araztu-
tako laginak.
3.6.2. Azido nukleikoen
purutasuna
Azido nukleikoek beren funtzionalitateari eusteko
biologia molekularreko tekniketan, purutasun-
maila jakin bat eduki behar dute, hau da, ahalik
eta kutsatzaile gutxien (proteinak, polisakaridoak,
gatzak, erauzketan eta arazketan erabilitako
erreaktiboak).
Azido nukleiko baten purutasuna da kutsatzai-
lerik baden edo ez baloratzeko erabiltzen den
parametroa.
Purutasun-maila neurtzeko, azido nukleikoek du-
ten propietateetako bat hartzen da oinarri: gehie-
neko absorbantzia 260 nm-ko uhin-luzeran.
A260/A280 zatidura
Purutasuna neurtzeko parametro erabiliena ho-
nako hau da: 260 nm eta 280 nm (A260/A280) uhin-
luzeretako absorbantzien arteko zatidura. Hala
neurtzen da, azido nukleikoen kutsatzaile nagu-
sien (proteinak eta deribatu fenolikoak) gehieneko
­absorbantzia delako uhin-luzera 280 nm denean.
Horrenbestez, bi absorbantzia horien arteko erla-
zioak adieraziko du laginaren kutsadura-maila.
Akatsak eragozteko, neurtu beharreko absorban-
tziak espektrofotometroaren neurri-tarte linea-
Azido
nukleikoak
Absorbantzia
Proteinak
260 280 nm
Uhin-luzera
3.25 irudia. Azido nukleikoen eta proteinen absorbantzia-
kurbak.
lean egon behar du. Oro har, neurri hori 0,1etik
1,0ra artekoa izatea gomendatzen da. Beraz,
­laginak normalean ur destilatuan edo TE tanpoian
(disoluzio i­ndargetzailean) diluitzen dira neurtu
ahal izateko. Horrezaz gain, neurtzen hasi aurre-
tik, absorbantzia zeroan jartzen da espektrofoto-
metroan, erabilitako diluitzailearekin.
A260/A280 zatidura-balioak DNAn
eta konponbide posibleak
Purutasun-maila egokitzat hartzen da A260/A280
zatidura 1,7 eta 2 arteko balioetan baldin ba-
dago.
Balioak 1,6 baino txikiagoak badira, lagina pro-
teinen eta fenolen bidez kutsatuegia dagoela
adierazten du.
Proteinek eragindako kutsadura konpon dai-
teke, K proteinasarekin tratatuz. Kutsadura
fenolek eragindakoa bada –ohikoa izaten da
disolbatzaile organikoak oinarri hartutako
arazte-metodoren bat erabili bada–, arazte-
prozesua berriro egin behar da kloroformo/­
isoamil alkoholarekin, eta, gero, DNA hauspea-
tu isopropanola edo etanola erabilita.
Balioak 2,0 baino handiagoak badira, RNA
kontzentrazio handia du, RNAren absorbantzia
260 nm-ra handiagoa baita DNArena baino.
RNAk eragindako kutsadura RNAsa entzimekin
tratatuta desagerrarazi daiteke.
A260/A280 zatidura-balioak RNAn
RNA molekulari dagokionez, purutasun-maila
egokitzat hartzen da A260/A280 zatidura 1,8 eta 2,1
arteko balioetan baldin badago.

A260/A230 zatidura
Azido nukleiko baten kalitatea neurtzeko beste pa-
rametro bat 260 nm eta 230 nm uhin-luzerako ab-
sorbantzien arteko zatidura da. Izan ere, 230 nm-ra
detektatzen da kutsatzaile ahulagoen gehieneko
absorbantzia, hala nola karbohidrato eta gatzena.
Azido nukleiko purutzat hartzen da A260/A230
zatidura 1,5 eta 2,2 arteko balioetan baldin ba-
dago.
Balioa 1,5 baino txikiagoa bada kutsatzaileak
egon daitezkeela esan nahi du, eta, beraz, kome-
ni da azido nukleikoa hauspeatu, berriro etanola-
rekin garbitu, lehortzen utzi eta berresekitzea.
Zatidura hori ez da aurrekoa bezain espezifikoa
azido nukleikoaren purutasuna neurtzeko, eta,
batez ere, kontzentrazioa oso txikia bada eta be-
rresekitzeko tanpoia gatzekin erabili bada.
Absorbantzia 320 nm-ra
320 nm-ra lortzen da absorbantziak uhin-luzeran
disoluzioaren uhertasuna neurtzea; hau da, par-
tikula esekien presentzia. Nahiz eta premiazkoa ez
izan, balio hau 260 nm, 280 nm eta 230 nm-ra
neurtu eta lortutakoari kendu beharko litzaioke,
kasuan kasuko zatidurak kalkulatu aurretik.
3.6.3. Azido nukleikoen
kontzentrazioa
Erreakzio batean erabilitako azido nukleikoen
kantitatea garrantzi handiko faktorea da biologia
molekularreko teknika gehienetan. Horrenbes-
tez, araztu eta berreseki eta gero, kontzentrazioa
neurtu behar da amaierako disoluzioan, biltegira-
tu baino lehen.
Kontzentrazioa azido nukleikoen kantitatea da
,amaierako disoluzioaren bolumen-unitateko.
Disoluzio bateko azido nukleikoen kontzentrazioa
neurtzeko metodo erabilienak honako bi hauek
dira: absorbantzia 260 nm-ra eta fluoreszentzia.
Absorbantzia 260 nm-ra
Lehen ere adierazi dugunez, azido nukleikoen
gehieneko absorbantzia 260 nm-ra lortzen da.
Lambert-Beer legearen arabera, disoluzio baten
absorbantzia zuzenki proportzionala da solutuak
3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 83
disoluzioan duen kontzentrazioarekiko eta neur-
keta egin den kubetaren bide optikoarekiko. Lege
hori azido nukleikoei aplikatuta, baliokidetasun
edo konbertsio-faktore hauek lortzen dira, 10
mm-ko bide optikodun kubetetan absorbantzia
260 nm-ra neurtuz gero:
Absorbantzia unitate bat honako honen balio-
kidea da: 50 ng/μl (edo 50 μg/ml) dsDNA.
Absorbantzia unitate bat honako honen balio-
kidea da: 33 ng/μl (edo 33 μg/ml) ssDNA.
Absorbantzia unitate bat honako honen balio-
kidea da: 40 ng/μl (edo 40 μg/ml) RNA.
Purutasuneko zatidurak kalkulatzeko bezalaxe,
lagin araztu baten diluzioak erabiltzen dira absor-
bantzia kalkulatzeko. Hain zuzen ere, diluzio ber-
bera erabil daiteke bai kontzentrazioa bai zatidurak
kalkula­tzeko.
Lortutako absorbantzia-neurriak espektrofoto-
metroaren neurri-tarte linealean egon behar du.
Irakurketa neurri-tarte linealetik gora badago,
laginaren diluzio handiagoa egin behar da. Di-
luzioaren faktorea kontuan hartu behar da, azido
nukleikoen kontzentrazioa kalkulatzeko jatorrizko
disoluzioan.
Horrezaz gain, ahalik eta zehatzen kalkulatu be-
har baldin bada, absorbantzia-balioa zuzendu be-
har da, eta, horretarako, 260 nm-ko balioari, 320
nm-koa kendu behar zaio.
Hori guztia gorabehera, azido nukleiko baten di-
soluzioaren kontzentrazioa formula honen bidez
kalkula daiteke:
Azido nukleikoaren kontzentrazioa ng/μl
edo μg/ml-tan = (A260 – A320) × diluzio faktorea ×
konbertsio-faktorea.
Araztutako azido nukleikoaren guztizko kantitatea
(ng) lortzeko, disoluzioaren kontzentrazioa (ng/μl)
bider berresekiduraren bolumena (μl) egin behar da.
3.1 adibide praktikoa
Sagu baten odolaren DNA genomiko araztu bat
100 μl TE tanpoian berreseki da. Haren kon­
tzentrazioa kalkulatzeko, 1/50 diluzio bat egin
da TE tanpoian. Diluzio horren absorbantzia
260 nm-ra 0,326 da. Absorbantzia 320 nm-ra,
berriz, 0,006.
DNAren kontzentrazioa hasierako disoluzioan =
= (0,326 – 0,006) ∙ 50 ∙ 50 = 800 ng/μl.
DNA araztuaren guztizko kantitatea =
= 800 ∙ 100 = 8.000 ng.
84 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa
Fluoreszentziaren metodoa
Batez ere dsDNA kontzentrazioa neurtzeko erabil­
tzen da, eta DNArekin konbinatuta fluoreszentzia
igortzen duten koloratzaile espezifikoak erabil­
tzean datza; hauek dira koloratzaileetako batzuk:
PicoGreen, SYBR Green I eta Bisbenzimidazol.
Teknika horretan beharrezkoa da kalibrazio-kurba
bat egitea DNA kantitate jakin batzuekin. Hain
zuzen, patroiak zein laginak koloratzailearekin
erreakzionarazten dira, uhin-luzera egokira ki-
tzikatu eta igorritako fluoreszentzia neurtzen da.
Aztergai den laginean lortutako fluoreszentzia-
balioa kalibrazio-kurban tartekatzen da, DNA
kontzentrazioa jakiteko.
Unitate-konbertsioa
Biologia molekularreko protokoloetan, azido
nukleikoen kontzentrazioa batzuetan μg-tan
adierazten da, eta beste batzuetan pikomoletan.
Unitate horien arteko konbertsioa egiteko, kon-
tuan izan behar da base-pare baten (1bp) batez
besteko pisu molekularra 660 dela, eta nukleo-
tido baten batez besteko pisu molekularra 330
dela. Balio horiek izanik, bi unitateen arteko kon-
bertsioa formula hauen bidez kalkulatzen da:
sdDNA, base-pareen kopurua N izanik:
Pikomoletatik μg-etara: μg = pmol × N × 660 / 106.
μg-etatik pikomoletara: pmol = μg × 106 / N × 660.
ssDNA, nukleotidoen kopurua N izanik:
Pikomoletatik μg-etara: μg = pmol × N × 330 / 106.
μg-etatik pikomoletara: pmol = μg × 106 / N × 330.
3.6.4. Azido nukleiko
araztuen funtzionalitatea
Lehen ere adierazi dugunez, azido nukleiko araztu
batean kalitateko parametro onak lortzea azido
nukleiko horien funtzionalitatea ona izango de-
lako seinale da.
Nolanahi ere, azido nukleiko araztuen funtziona-
litatea egiaztatu daiteke kalitateko parametroak
neurtu gabe ere; hain zuzen, PCR bat eginda edo
RT-PCR kontrola eginda jakin daiteke. Polimerasa
batek azido nukleiko araztu bat molde gisa erabili
ahal izate hutsa funtzionalitate ona duelako sei-
nale da.
Proba horien prozedura xehetasun handiagoz lan-
duko dugu 6. unitate didaktikoan.
3.7. Azido nukleiko
araztuen biltegiratzea
Biologia molekularrean oso ohikoa da azido
nukleiko araztuen lagin alikuotak biltegiratzea;
izan ere, ezin konta ahala xede izan ditzakete.
Edonola ere, biltegiratzeko sistemak, edozein dela
sistema, funtsezko bi helburu bete behar ditu, la-
ginekiko:
Haien osotasuna bermatzea.
Haien erabateko trazabilitatea ziurtatzea.
3.7.1. Laginen osotasunari
eusteko baldintzak
Laginen osotasuna bermatzeko, denboraren joa-
nean degradatzea eragotzi behar da, edo, bestela,
degradazioa ahalik eta maila txikienera murriztu.
Horretarako:
Eppendorf motako hodiak edo hotzean gorde­
tzeko hodiak erabili behar dira, itxitura herme-
tikoa dutenak eta nukleasarik (DNAsa eta RNAsa)
gabeak.
Hotzean biltegiratu behar dira (normalean):
DNA laginak, baldin eta 4-5 egunen buruan
erabiliko badira, hozkailuan gorde daitezke
4 ºC-an. Egun gehiagoz gorde behar badira,
izoztu egin behar dira –20 ºC-an, edo ahal
bada –80 ºC-an.
RNA laginak izozkailuan gorde behar dira beti,
–20 ºC-an denbora laburrerako, eta denbora
luzerako –80 ºC-an.
Komeni da biltegiratzeko erabiltzen diren izoz­
kailuek hainbat segurtasun-sistema edukitzea:
Alarma-sistema bat, gaizki baldin badabil
ohartarazteko.
CO2 segurtasun-sistema, matxuraren bat
gertatuz gero tenperaturari eusteko, laginak
beste izozkailu batera eraman bitartean.
Tenperatura monitorizatzeko sistema, ten-
peraturan gora-beherak izan diren egiaztatu
ahal izateko.
Gaur egun, izozkailu robotizatuak daude; hau
da, laginak kudeatzeko software bat eta laginak
­izozkailutik hartzeko edo han sartzeko sistema ro-
botizatu bat eta guzti dituzte, ahalik eta gehien
eragozteko giza akatsak.
 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 85

3.7.2. Laginen Barra-kodea (1D) edo puntuena (2D) izatea

trazabilitatea
Trazabilitateak berekin dakar laginetako bakoitza
behar bezala identifikatzeko sistema bat. Hemen
zenbait aukera, konplexutasuna kontuan hartuta:
Hodian zuzenean errotulua jartzea. Tinda eza-
baezinak erabili behar dira, disolbatzaile organiko
eta oso tenperatura hotzekiko erresistenteak.
Kode alfanumerikodun etiketak erabiltzea, eta
etiketa horiek –80 ºC-an irauteko modukoak
izatea.
etiketek, eta etiketa horiek oso tenperatura
hotzekiko erresistenteak izatea.
Hodian bertan kodea 2D-n grabatuta duten ho-
diak erabiltzea. Halako sistemek aukera ematen
dute 96 hodiko kaxak edo euskarriak berehala
identifikatzeko, eta eskaner bidez eta deskode­
tzeko software espezifiko batez irakurtzeko.
Hodiak gordetzeko kaxak edo euskarriak ere
behar bezala identifikatu ahal izatea, eta, be-
raz, barra-kodea edo puntuena izatea, etiketek
zein grabatuek.

Ariketak
1. Adierazi zer aurretratamendu mota aplikatuko zenukeen lagin hauetan, azido nukleikoen erauzte-
zein arazte-prozesuari ekiteko. Adierazi, halaber, zer material edo erreaktibo erabiliko zenituzkeen.
a) Kultibo zelularra geruza bakarrean.
b) Karkaxa.
c) Odola.
d) Landare-ehun freskoa.
e) Formolean finkatu eta parafinan sartutako animalia-ehunaren biopsia.

2. Azido nukleikoen erauzketari dagokionez, izendatu:

a) Behar bezala erauzteko funtsezko bi prozesuak.
b) Zelulen lisirako disoluzioetan erabiltzen diren bi detergente.
c) Nukleasak inaktibatzeko bi agente.
d) Bakterioen horma edo landareena digeritzen duten bi entzima.

3. Disolbatzaile organikoen bidezko arazketaren teknika erabilita araztu nahi ditugu ahoko mukosako
zelulen lisatu bateko azido nukleikoak. Horretarako, hodi garbi batean 1 ml lisatu nahasi dugu 1 ml
fenol/kloroformo/isoamil alkoholaren nahastearekin (25:24:1 proportzioan). Irabiatu eta zentrifugatu
ondoren, bi fase lortu ditugu. Egin zure koadernoan hemen dagoen marrazki baten antzekoa,
eta idatzi fase bakoitzaren izena eta osagai nagusiak, bai eta beharrezkoak diren prozesuak (lauki
berdeak) eta erreaktiboak (lauki urdinak) ere, azido nukleiko araztuak disoluzioan lortzeko.
86 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa

4. Lotu zure koadernoan azido nukleikoak arazteko metodo hauetako bakoitza eta haietako bakoitzari
dagokion oinarria:
Metodoa Oinarria
1. Adsortzio-kromatografia a. Ioen eta talde funtzionalen arteko lortura elektrostatiko
itzulgarria.
2. Disolbatzaile organikoak b. Proteinak gatz-kontzentrazio handiekin hauspeatzea.
3. Ioi-trukearen kromatografia c. Adsortzio bidezko bereizketa magnetikoa edo afinitate
bidezko lotura.
4. Salting-out d. Silizearekiko adsortzioa gatz kaotropikoak erabilita.
5. Ultrairagazpena e. Lisatuaren osagaiek disolbatzaile organikoetan duten
disolbagarritasuna.
6. Esfera magnetikoak f. Azido nukleikoen molekulak tamainaren arabera bereiztea.

5. Idatzi zure koadernoan zer funtzio betetzen duten erreaktibo hauek plasmidoen arazketan, lisi
alkalinoaren bidezko metodoa erabiliz gero:
a) Sodio-dodezil sulfatoa, lisirako disoluzioan.
b) Sodio hidroxidoa, lisirako disoluzioan.
c) Potasio azetatoa (pH 4,8), neutralizaziorako disoluzioan.
d) RNAsa.

6. Idatzi zure koadernoan zuzenak ala okerrak diren esaldi hauetako bakoitzean adierazitakoak, eta
arrazoitu erantzunak:
a) RNAsa entzimak desagerraraz daitezke, autoklabean esterilizatuta.
b) Lisirako disoluzioak agente kaotropiko bat izan behar du, hala nola guanidinio isotiozianatoa.
c) Lanerako disoluzioek EDTA eduki behar dute, RNAsa entzimak inhibitzen baitituzte.
d) Erabiliko diren erreaktibo guztiak DEPCrekin tratatutako urarekin prestatu behar dira.
e) DEPCrekin tratatutako ura autoklabean sartu behar da, erabili aurretik.

7. Idatzi zure koadernoan zuzenak ala okerrak diren azido nukleikoak araztu ondorengo haien
osotasunari buruzko esaldi hauek, eta arrazoitu erantzuna:
a) Agarosazko gel-elektroforesia da teknikarik onena azido nukleikoen osotasuna egiaztatzeko.
b) Organismo eukariota baten RNA oso eta degradatu gabeko lagin baten elektroforesian,
rRNA 28S-ri eta 18S-ri dagozkien bi banda garbi ikusten dira, bai eta smear txiki bat ere, RNA
mezulariaren (mRNA) eraginez.
c) DNA arazteko lagin onena formolean finkatu eta parafinan sartutakoa da, formolean finkatuta
oso ondo kontserbatzen baita azido nukleikoen osotasuna.
d) DNA degradatuta baldin badago, elektroforesian smear bat ikusten da, eta haren intentsitatea
DNAren zatitze- eta degradazio-mailaren araberakoa da.
e) DNA plasmidiko osoaren elektroforesian, banda anitz ikusten dira, dimeroak, trimeroak,
tetrameroak eta abar eratu direlako.

8. Aztertu lagin hauen purutasuna:

1. lagina: dsDNA 2. lagina: dsDNA 3. lagina: RNA
A230 = 0,182 A230 = 0,235 A230 = 0,229
A260 = 0,352 A260 = 0,436 A260 = 0,312
A280 = 0,265 A280 = 0,248 A280 = 0,166
A320 = 0,025 A320 = 0,020 A320 = 0,029
Zure ustez kutsatuta dauden laginei dagokienez, azaldu zein izan daitezkeen kutsatzaileak, eta,
horrezaz gain, proposatu haiek desagerrarazteko irtenbideak.
 3. UD. Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa 87

9. Eppendorf hodi batean, giza DNA genomiko baten disoluzioaren 50 μl dauzkagu. Haren
kontzentrazioa kalkulatzeko, 195 μl TE tanpoiarekin diluitu ditugu disoluzioaren 5 μl, eta diluzioaren
absorbantzia neurtu dugu 260 nm, 280nm eta320 nm uhin-luzeretan. Balio hauek lortu ditugu:
A260 = 0,469. A280 = 0,265. A320 = 0,019.
Kalkulatu:
Hasierako disoluzioaren kontzentrazioa ng/μl-tan.
DNAren purutasuna.
Hasierako disoluzioaren guztizko DNA kantitatea μg-tan.

10. Biologia molekularreko teknika bat aplikatzeko, erreakzio-nahaste bati 600 ng RNA gehitu dizkiogu. Hodi
batean, 100 μl RNA disoluzio bat daukagu, baina ez dakigu haren kontzentrazioa. 196 μl ur destilaturekin
diluitu ditugu disoluzioaren 4 μl, eta 260 nm-ra neurtu haren absorbantzia, 0,125 balioa emanez.
Hasierako RNA disoluzioaren zenbateko bolumena gehitu beharko diogu erreakzio-nahasteari?

3.1 jarduera
Azido nukleikoen erauzketa eta arazketa,
odol periferikoa abiaburu hartuta
Azalpena
Jarduera honen xedea azido nukleikoen erauzketa- eta arazketa-prozeduretan trebatzea da, bai eta
horretarako beharrezko materiala, bitartekoak eta erreaktiboak prestatzen eta tresnak erabiltzen
ohitzea ere. EDTA konposatuarekin antikoagulatutako odol periferikoaren lagin bat izango duzue
abiaburu, eta gatzekin hauspeatutako metodoa (salting-out) baliatuko duzue.

Tresneria eta erreaktiboak

Materialei eta erreaktiboei buruz testuan emandako jarraibideak hartu behar dituzue kontuan.

Garapena
Hiru edo lau laguneko taldetan egingo duzue jarduera. Lanean hasi aurretik, planifikatu zer lan
egin behar diren, kontuan hartuta betiere zer material beharko duzuen. Gero, lanak edo egitekoak
banatu.
Prestatu jarduera egiteko behar dituzuen materialak, disoluzioak edo erreaktiboak.
Lan egitean, bete segurtasuneko arauak eta arriskuen prebentziorako arauak beti.
Kontuan izan, besteak beste, honako hauek: biologia molekularreko laborategietan bete beharreko
kalitate-irizpideak; materialak eta erreaktiboak esterilizatuta manipulatzeko arauak; kasuan kasuko
lanari buruzko protokoloa; eta sortutako hondakinak desagerrarazteko prozedurak.
Egin odol periferikoaren laginaren aurretiazko prozesua.
Jarraitu unitatean xehetasunez deskribatutako protokoloari. (3.11 dokumentua)
Nahi izanez gero, DNA araztua lortu ondoren, adierazi haren kontzentrazioa eta neurtu haren
kalitatea egiaztatzeko baliatzen diren parametroak.

Balorazioa
Deskribatu lana egitean izan dituzuen arazoak.
Izan al da akatsik? Deskribatu DNA araztuaren disoluzioak zer itxura zuen.
Deskribatu zer egin duzuen DNA araztua kontserbatzeko.