DNA birkonbinatuaren teknologia

❑ Ingenieritza genetikoa:
DNAren klonazioa
• PCR: Polimerase Chain Reaction
• Murrizketa-endonukleasak
• Klonazio-bektoreak
• Adierazpen-bektoreak
• Hibridazio-teknikak
• RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
DNAren klonazioa
 DNA birkonbinatua ( plasmidoa + transgenea) organismo
batean sartuko dugu, guk aukeratutako genea adierazteko
 Zer behar dugu DNA birkonbinatua
lortzeko?
1. Ikertu nahi den DNA zatia (genea, sustatzailea…)
2. Entzimak: murrizketa-endonukleasak, ligasa…..
3. Bektoreak: plasmidoak, fagoak
4. Zelula ostalari egokiak DNA birkonbinatua anplifikatzeko
5. Gure intereseko DNA zatia identifikatzeko teknikak
(screening): koloniak…..
6. DNA birkonbinatua eta bere produktua aztertzeko teknologia
rDNA: DNA birkonbinatua
Laborategian burutzen diren metodo genetiko birkonbinanteak
erabiliz sortzen diren DNA molekulak dira. Izaki ezberdinetako
material genetikoa bateratu egiten da DNA sekuentzia berriak
osatzeko: DNA kimerikoa edo DNA birkonbinatua
 DNAren klonazioa: eskema orokorra
DNA KLONAKETA

PCR bidez
DNA zatikiaren
kopiak egin

Murrizketa entzimei esker

bai bektore plasmidikoa bai
DNA birkonbinatua intsertoa moztu, biak mutur
itsaskorrak izateko.
 DNA birkonbinatua
TRANSFORMAZIOA
(1) T. kimikoa
(2) Elektroporazioa

Zelula ostalariaren
barruan plasmidoa
Kolonia bakoitza ugaltzen da
klon bat da

Hautaketa
mekanismoak:
(1) Antibiotikoarekiko R genea
(2) Gene markatzailea
(3) Zunda baten hibridazioa
(4) Tek. immunologikoak
Plasmidoa + DNA intsertoa
 KOLONIA POSITIBOAK
AUKERATU ETA HORIEK HAZI

Plasmidoa + DNA intsertoa

DNA birkonbinatua
isolatu bakterioetatik

Proteinen
Sekuentziatu
purifikazioa
Mutagenesia
PCR: Polimerase Chain Reaction

https://www.youtube.com/watch?v=6iFDphWXjw4
 PCR: Polimerase Chain Reaction
▪ Polimerasaren erreakzio kateatua: DNA zati baten kopiak egiteko
oinarrizko teknika da. Anplifikazioaren ondorioz askoz errazagoa da DNA
horrekin lan egitea, kontzentrazioa altuagoa baita

▪ PCR teknikak aplikazio ugari ditu: bai oinarrizko ikerkuntzan, gene eta
proteina berrien azterketan, bai zientzia aplikatuan

▪ Aplikazioen artean DNAren sekuentziazioaren oinarria, herentzia-

arazoen diagnosia, markatzaile genetikoak aztertzea, hatz-marka
genetikoak identifikatzea (helburu forenseekin, aitatasun, hildakoen
identitatea), gaixotasun infekziosoak detektatzea eta diagnosia argitzea
(agentearen identifikazioa, birus zein bakterioak)…
PCRaren amaierako produktua agarosazko gel batean aztertzen da
 PCR mechanism
Zikloak

Gaur egun RT-qPCR eta qPCR erabiltzen da ere. Hauek hainbat berezitasun dituzte:
- Ez da agarosazko gelik egin behar
- Sortutako DNA kopia berri bakoitzari molekula fluoreszentea esleitzen zaio
- Ez da amaierako produktua aztertzen, baizik eta seinalea lortzeko beharrezkoak
diren ziklo minimoak
RT-qPCR en la detección del SARS-CoV2
 PCR: polimerase chain reaction

▪ DNA baten alboko sekuentziak ezagutzen direnean, DNA zati hori erraz
klonatu daiteke polimerasaren erreakzio kateatuaz (PCR)

▪ DNA polimerasa termoegonkorra erabiltzen da: TaqI polimerasa (Thermus

aquaticus). DNA zatiaren alboetan hasle gisa jardungo duten bi
oligonukleotido behar dira

▪ Tenperatura ziklikoki igoz eta berriro jaitsiz, DNAren kopia anitz lor daitezke
(termozikladorea, automazitatua)

▪ Hasle horiek endonukleasek ezagutzen dituzten itu-sekuentziak izan

ditzakete, DNAren klonazioa errazteko
PCR: polimerase chain reaction

…
 PCR: aplikazioak
• Oinarrizko ikerkuntzan: DNA zatien kopiak lortzea, ondoren DNA zatien
klonazioa plasmidoetan aurrera eramateko, haien ezaugarri biokimikoak
aztertzeko (sekuentzia, funtzio biologikoa...), produktuak aztertzeko (RNA,
prot), etab.

• Medikuntzan PCRa oso erabilia da gaixotasun hereditarioak zein

infekziosoen diagnosirako (infekzio-koadroa eragiten duten espezie
ezberdinak genotipatzeko, haien identifikaziorako)

• Paleontologia, antropologia biologiko eta medikuntza forensean ere

aplikatu da teknika hau zenbait helbururekin (iraganeko izaki bizidunen
ezagutza, gizakion eboluzioa eta aldakortasun genetikoa aztertzeko,
hildakoen identifikaziorako)
 Zenbait adibide

Aitatasun frogak Klonaziorako plasmidoak

 Transkriptomika

A) PCR bidez lortutako zebra arrainen

ehun ezberdinetan TF3aa eta ab
transkripzio-faktoreen adierazpena:
B-burmuina
O-obulutegia
M-muskulua

B) RT-qPCR bidezko TF3aa eta ab

transkripzio-faktoreen adierazpena

C) Enbriogenesian zeharreko
adierazpena PCR bidez
 DNAren klonazioa

DNA birkonbinatua
Murrizketa-endonukleasak
 Murrizketa entzimak
▪ DNA harizpi bikoitza ebakitzen dute

▪ Sekuentzia jakinak “ezagutu” eta bertan ebakitzen dute: 4-8 bp-ko

sekuentzia espezifikoa = murrizketa- sekuentziak (>100)

▪ Sekuentzia palindromikoak dira

▪ Ez da energiarik behar (ATP)

Murrizketa-endonukleasek DNA ebakitzean:
a) Mutur kamutsak (mozketa bertikala)
b) Mutur itsaskorrak (mozketa mailakatua)
Mutur itsaskorrak

Mutur kamutsak
MOZKETA MOTAK:

- Mozketa mailakatua  mutur itsaskorrak

- Mozketa bertikala  mutur kamutsak

Mutur kamutsak

Mutur itsaskorrak
Murrizketa-endonukleasen adibideak
Adibidea

BEKTOREAren sekuentzia

Transgenea:
BamHI
5´-GGCGGATCCAATGCAAAAACGGGC
….GCGTAATTGGCCTTAAGGGCC-3´
Nola lortu ahal dugu gure genearen muturretan (5´eta 3’an), murrizketa
endonukleasak ezagutu dezakeen sekuentzia gaineratzea?

Hasle bereziekin: Sekuentziaren zati bat genearekiko osagarria eta 5´

muturrean murrizketa entzimak ezagutuko duen sekuentzia daramate

PCR

Liseriketa