Laboratorní vyšetřovací metody hemostázy

Biologický materiál pro koagulační vyšetření

- Odběr žilní krve
- Podmínkou srážení krve = přítomnost Ca2+ iontů v plazmě
- Nesrážlivost odebrané krve
- citrát sodný 1:3
- heparin
- K3EDTA

- Vyšetření je možno provádět max do 2 hodin po odběru krve

Plazma = obsahuje všechny koagulační faktory

- centrifugace krve s protisrážlivým činidlem
- máme 2 typy :

1. Citrátová plasma
PPP
= platet poor plasma
> 1000 g / 10 min

PRP
= platet rich plasma
200 – 400 g / 10 min

2. EDTA plasma

Sérum = neobsahuje termolabilní faktor

- tekutina vytlačená rektací koagula ze sražené krve

Rektace koagula
= smrštění
- po odběru nativní krve → krev se srazí = vytvoří se koagulum → později dochází ke
smrštění koagula → vypudí se přebytečná tekutina = sérum

Zpracování materiálu pro koagulační testy

1. Správný žilní odběr – nesrážlivá krev 1:9
2. Zpracování odebraného materiálu do 2 hodin
3. Centrifugace ( PPP / PRP)
4. Normální plasma
 Trombelastografie
- koagulační metoda
- umožňuje sledovat tvorbu koagula
- z typu výsledné křivky lze usuzovat počet a funkci destiček, plasmatických koagulačních faktorů,
fibrinolýzy
- poskytuje kvalitativní a kvantitativní ukazatele hodnotící tvorbu, stabilitu a rektaci koagula

Typy koagulačních stanovení

1. Manuální
- detekce fibrinového vlákna v koagulačním mediu pomocí háčku v temperované vodní lázni

2. Přístrojové
◦ Optické
- světelný paprsek prochází kyvetou → ta propouští paprsek podle hustoty media

◦ Elektromechanické - koagulometr
▪ Háčkové
- 1 pevná a 1 pohyblivá elektroda → detekce el. Signálu

▪ Kuličkové
 Koagulační testy

1. Globální
- určení času nativní žilní krve
- N – 4 – 9 minut

Typy
- Fibrinolýza plné krve více než 120 min
- Trombelastografie
- Krvácivost do 10 minut
- Srážlivost

2. Skupinové
- PT → protrombinový čas
- APTT → aktivovaný parciální tromboplastinový test
- TT – trombinový čas
- Reptilázový test – 20 s
- Aktivovaný koagulační čas

3. Specifické
- Stanovení fibrinogenu – 2 – 4 g/l
- Vyšetření koagulační aktivity jednotlivých faktorů a fibrinolytických parametrů, D –
dimerů
- Korekční testy → stanovení specifického / nespecifického inhibitoru

4. Výzkumné metody
 Další dělení koagulačních testů

1. Screeningové
- APTT, PT, TT, AT, fbg

2. Konfirmační
- LA

3. Korekční
- směsné → PN + PP
- PP : PN ( 1:1 ) s inkubací 60 – 120 minut
- PN = poolovaná / normální plazma → zdravých dárců = REFERENČNÍ
- PP = plazma pacientů → porovnává se s plazmou normální
- výsledkem je prodloužení času → v plazmě jsou obsaženy protilátky
- nebo se znormalizuje čas → nějaké faktory chyběly a poolovanou plazmou se to doplnilo
( nejčastěji chybí VII, IX, XII)

- zde se buď :
1. APTT znormalizuje na 30 sekund → něco není, deficit koagulačního faktoru ( nejspíše
VIII. IX, XI, XII)
2. Prodlouží 65 sekund → poškození i normála, v plazmě jsou protilátky ( nic nechybí,
přebývá)
- pacient trombotizuje (naředění)
- důsledná příprava
Princip koagulačních testů
 APTT
= aktivovaný parciální tromboplastinový test
- test k vyšetření hemokoagulace → FUNKCE VNITŘNÍ KOAGULAČNÍ CESTY – XII,
XI,IX, VIII, X
- používá se i k monitorování heparinové antikoagulační terapie
- screeningový test
- sleduje tvorbu fibrinového vlákna

PLASMA + CITRÁT

- Ca+2, aktivátor kaskády – kaolín (křemičitany), fosfolipid tefalin, ( parciální tromboplastin)

- v přítomnosti Ca2+ aktivuje parciální tromboplastin koagulační faktory → zahájení vnitřní

koagulační kaskádu
- výsledkem je čas, za který dojde ke srážení plazmy → 35 – 45 s

• Patologické
- prodloužené až o 10 sekund
- u hemofiliků je prodloužené až o 150 – 180 s
- může být způsobena nedostatečnou aktivitou jednoho nebo více koagulačních faktorů

APTT pacienta
APTT −R=
APTT normála

norma → 0,80 – 1,20

patologie > 1, 20
 PT
= protrombinový čas
- laboratorní koagulační test
- MONITORUJE ZEVNÍ KOAGULAČNÍ CESTU
- měří se čas, za který se vytvoří koagulum
- přidává se tromboplastin do zkumavky v plazmě
- přepočítává se na protrombinový poměr a na normalizovaný poměr (INR)
- umožňuje zjistit změny ve srážlivost krve (např po podání warfarinu, po poškození jater i po
snížení hladiny vitamínu K)
- sleduje správnou funkci koagulačních faktorů → TF, II, V, VII, X + fibrinogen

• Screeningový test
- 12 – 15 s
- INR → 0,8 – 1,2
- nejčastěji v krevní plazme → citrát

PT pacienta ISI
INR=( )
PT kontrola

- ISI → mezinárodní index citlivost ( 1,0 (u zdravého) – 2,0 / 3,0 (u úspěšně léčeného
warfarinem = ideál → když je to méně dávají málo warfarinu, když je to více dává se velká dávka
warfarinu))
- INR → mezinárodní normalizovaný poměr
- slouží ke kontrole účinnosti léčby
 PFA 200
- vyšetření funkce destiček
- simulace poškozeného cévního endotelu
- měří se za jak dlouho se vytvoří FIb a neprojde žádná krev v porovnání s normálem
- měří se tzv. uzavírací čas
 ANTI – Xa
- kontrola léčby nízkomolekulárním heparinem (účinnost) přes antitrombin, který se naváže na
faktor X
- na zbylé faktory X na které se nenaváže = zbytková aktivita
- jsou to enzymy→ štěpí se → vzniká z něho para-nitrol-anilin→ ten se měří
- čím méně je roztok barevný, tim více je zablokováno faktoru X → tim více je učinná léčba
- měří se zabarvení
- štěpí se substrát na produkt (paranitrolanilin)
- chromogenní metoda

Heparin
- lék proti srážení krve
- maximální účinek na FII
- zvýšená dávka heparinu (celý řetězec)→ zvýšené navázání antitrombinu a zablokuje se FII
→ zbytek se přemění na FIIa → účastní se procesu krevního srážení
- vedlejší účinky : krvácivé

LMWH – nízkomolekulární heparin

- pentasacharidová molekula
- pacient je účinně léčen → nepředávkuje se
- nedochází k úplnému zablokování FII
- podává se tabletkami → VÝHODA!
- nelze stanovit metodou APTT → APTT se mění
→ používá se test AntiXa → heparin se naváže na antitrombin → zabkokuje faktor X → Xa je
oslaben
- díky LMWH se X → Xa a II (heparin) → FIIa
→ Fb na Ia
→ aktivuje antitrombin a reakce neproběhne – prodlužuje se APTT
 Euglobulinová fibrinolýza
- Po odběru nativní krve → krevní koagulum→ retrakce koagula → rozpuštění krevní zátky delší
než 180 minut

Agregometrie
– používá se při ní PRP → platet rich plasma
- výsledek je graf (chceme, aby stoupal ↑)
- vyšetření funkce destiček
- k PRP se přidávají fyziologické mediátory, které agregaci spouští
• kyselina arachidonová
• ADP
• Kolagen
• Ristocetin

- hodnotí se pohotovost destiček se shlukovat

 Vyjadřování výsledků
- čas pacienta, čas normála (sekundy)
- poměr času pacienta a normála
- % koagulační aktivity z kalibrační křivky
- koncentrace v plasmě (g/l)
- aktivita v mezinárodních jednotkách → také poměr

Speciální vyšetřovací panely

• Trombofilní
- detekce systému APC

• APS
- přítomnost LA

• Von Willebrandovy choroby

• DIC
 Antikoagulační léčba
1. Přímé
- Xabany a Gatrany
- podávají se v tabletkách

Xabany
- fungují na faktor Xa – blokuje se faktor X, aby nebyl Xa
- jsou drahé a nejsou dostupné
- nemají antidotum (protilátku) → proto se dává pacientovi čerstvě mražená plazma
- kontroluje se také anti – Xa → musí se kalibrovat na tu metodu

Gatrany
- mají antidotum → Praxbind
- dilutovaný trombinový čas
- dilutovaný → rozředěný
- vzorek se musí ředit

2. Nepřímé
- heparin → funguje přes antitrombin (bez něj by nic nezablokoval)
- viz poznámky nahoře

3. Warfarin
- blokuje K – dependentní faktory
- zabraňuje recidivě trombózy
- podává se v tabletkách
- látka pumarin soutěží s vitamínem K
- užívá se, aby se trombóza neopakovala
- nejprve se faktory setkají s vitamínem K → aby se zaktivovaly
→ pak blokují protein S a C → proto se k tomu přidává nejdříve heparin
- díky zablokování proteinů se ještě zhoršuje krvácení, protože hlídají tu kaskádu
- je to jed na krysy
- účinná warfarinace → INR 2,0 – 3,0 → můžeme přestat dávat heparin
 Leidenská mutace
- mutace v jádře na chromozomu v pozici 506 → tvoří se zde jiná struktura (jiná bílkovina než je
faktor V)
→ hyperkoagulační stav
- syntetizuje faktor V v jádře → protože v jádře je schované DNA