Metodiky zpracování v

patologii
1. BIOPTICKÁ VYŠETŘENÍ.
Typy bioptických odběrů, způsob zasílání materiálu, princip následného zpracování odebraného biologického
materiálu.

2. FIXACE BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU.

Typy fixace pro různá histopatologická a následná specializovaná vyšetření. Základní histopatologické
zpracování tkáně (princip zpracování do podoby parafinového bloku).

3. CYTOLOGICKÁ VYŠETŘENÍ.
Typy odběrů, vyšetřovaný materiál, indikace cytologického vyšetření, různé způsoby zpracování materiálu.

4. MIKROSKOPICKÉ TECHNIKY.
Světelná mikroskopie, fluorescenční mikroskopie, elektronová mikroskopie. Principy a využití v diagnostické
patologii.

5. PEROPERAČNÍ BIOPSIE.
Indikace, princip provedení; výhody a nevýhody oproti klasickému histopatologickému zpracování tkáně.
Úskalí interpretace.

6. HISTOLOGICKÉ BARVÍCÍ METODY.

Přehled a využití barvících metod, vyšetřovaný materiál, histochemické vyšetření enzymů.

7. PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE.
Princip, vyšetřovaný materiál, využití v diagnostické patologii. Interpretace výsledků.

8. IMUNOHISTOCHEMICKÉ VYŠETŘENÍ – ZÁKLADY.

Princip reakce antigen – protilátka, typy primárních protilátek a jejich příprava, způsoby detekce vazby
primární protilátky v histologickém řezu.

9. IMUNOHISTOCHEMICKÉ VYŠETŘENÍ – VYUŽITÍ.

Indikace a využití v diagnostické patologii, vyšetřovaný materiál, konkrétní příklady. Interpretace výsledků.

10. FLUORESCENČNÍ IN SITU HYBRIDIZACE.

Princip, typy vyšetřovaného materiálu, využití v diagnostické patologii.

11. ANALÝZA NUKLEOVÝCH KYSELIN.

PCR diagnostika v patologii, typy vyšetřovaného materiálu a jeho zpracování, princip PCR technik.

12. SEKVENACE DNA.

Princip, příklady využití v patologii.

13. MIKROČIPY A LASEROVÁ MIKRODISEKCE.

Principy, materiál, využití v patologii.

14. TERAPEUTICKO-INDIKAČNÍ PATOLOGIE a prediktivní diagnostika.

Příklady konkrétních vyšetření, přínos pro onkologicky nemocné.

15. PITVA.
Typy pitev, dokumentace k pitvě, pitevní protokol, zpracování nekroptického materiálu, přínos pitev pro
výuku a ve zdravotnické péči.
 1. Bioptická vyšetření.

- bioptické vyšetření = (mikroskopické) vyšetření tkáně odebrané z živého pacienta

- odběr tkáně (biopsie v užším slova smyslu) nebo buňky (cytologické vyšetření)
- lze hodnotit architektoniku tkáně
- důvody vyšetření:
o diagnostika
▪ punkční biopsie jater
▪ zánětlivé kožní léze
▪ odběr endoskopických vzorků střevní sliznice u řady chorob
▪ odběr svalové tkáně, ledvin a mnoho dalších
▪ histologické vyšetření je někdy jediná metoda, jak lze sledovat průběh choroby (chronické záněty jater,
ledvin, reakce štěpu vůči hostiteli a mnoho dalších)
o terapeutické (odstranění tumoru)
o kontrola celistvosti odebraného materiálu (probatorní excize → kompletní excize) – potřeba správný odběr
- Všechny odebrané tkáně by měly být histologicky vyšetřeny (appendix odebraný pro akutní zánět, protože v malém počtu
případů se zachytí neočekávané patologické změny, které vyžadují další terapii: paraziti, tumor (karcinoid))
- Neprovedení histologického vyšetření může vést k poškození pacienta!

Typy biopsií:
- biopsie resekátní (přímá excize)
o kontrola a doplnění klin.dg. (okraje, resekáty)
- punkční biopsie – jehlová – diagnostická + cytologie (játra, ledviny ..)
o př.: trepanobiopsie (do kyčelních kostí – k. dřeň)
- endoskopická biopsie (ileum, žaludek, střevo, dých. cesty moč. trakt, )
- biopsie a cytologie tenkou jehlou (cíleně do patol. ložisek )
- peroperační

Nekropsie asi 35 krát méně

Způsob zasílání:
- potřeba: okraje resekátu → je celý?
o okraje nádoru – přechod epitelu? na seróze?
o okolní uzliny
- čerstvé x fixované

Průvodní list k zásilce hist. materiálu (nutné pečlivé vyplnění)

- údaje o pacientovi
- lokalizace
- místo odběru
- předchozí histol. vyšetření, předchozí terapie
- doba trvání nemoci
- klinická diagnóza
- průběh nemoci

Následné zpracování materiálu:

- druhy:
o patologická anatomie
o histopatologie
- přístupy:
o morfologie – makro x mikro x ultramikro
▪ imunohistochemie
o molekulární – FCM, PCR

světelná mikroskopie / elektronová mikroskopie (ultrastruktura)

histologie –mrazení / formolová fixace + zalévání do parafínu
 - dnes má velký význam imunohistochemie – nezkoumáme již pouze morfologii, ale dostáváme se na molekulární úroveň
(hledáme proteiny přítomné/nepřítomné ve tkáni)
- genetické metody – zkoukáme genetickou výbavu(mutace, fúzní geny, translokace, delece atd.) PCR, FISH
- když chceme zkoumat spíše jednotlivé buňky než tkáň jako celek, použijeme cytologické metody (nátěry na skla
z různých tělesných tekutin (hlen, sputum atd.), otisky tkání na sklo (přímý otisk tkáně, například u děložního čípku).
Tekutiny se někdy centrifugují (například moč). Existují i kombinované metody (například cytoblok: sediment nebo
centrifugát se zalijí do parafinu a krájí)
- Nevýhoda : nelze studovat architektoniku tkáně.

Fixace: autolýza, vysychání vs. rychlost, šetrnost fixace, artefakty

- Formol (formalín) = 10% formaldehyd

2. Fixace biologického materiálu.

- fixační tekutina - 10% roztok formaldehydu (někdy s různými přísadami).
- tato fixační tekutina se však v některých případech nehodí, protože znemožňuje některá vyšetření (histochemické, vyšetření
přímou imunofluorescencí). Proto je nutné v takových případech postupovat po dohodě s patologem.
- Fixace tkáně formolem vede ke změnám konfigurace bílkovin, zejména enzymů. To vede k okamžitému zastavení
autolytických procesů. Fixace tkáně trvá (podle velikosti vzorku) zpravidla 24 hodin. Rychlost průniku fixační tekutiny do
tkáně je přibližně 1 mm za hodinu; malé vzorky jsou zfixovány rychle.
- další fixační tekutiny: Methacarn, Bouin, glutaraldehyd (ten je pro elektronový mikroskop), alkohol

- kdy nefixovat?
o zmrazit – lze hned zkoumat + zachová NK pro PCR
o pro FCM
PRIETOKOVÁ CYTOMETRIA

A)Standartní vyšetření – parafínové řezy

- FIXACE 10% Formol
- ODVODNĚNÍ Alkohol (vzestupná řada)
- Zalití do parafinu, Krájení (v mikrotomu – plátky silné 5 µm)
- DEPARAFINIZACE Xylen
- ZAVODNĚNÍ Alkohol(sestupná řada)
- BARVENÍ HE aj.(speciální barvení – Trichrom – kolagen, Kongočerveň – amyloid, Mucikarmín – hlen, atd)
- (montování → trvalý preparát, archivace)

B)Fixace zmrazením
KDY POUŽÍT?
- vyšetření spěchá (peroperační biopsie) – ale za cenu menší kvality obrazu a tlustších řezů a nemožnosti speciálních
metod
- při fixaci denaturace tkáně znemožní provedení speciálních reakcí
- při parafinovém procesu dojde k vyplavení struktur, které je třeba prokázat
FIXACE: Freon/propan butan podchlazený kapalnám dusíkem.
PRŮBĚH:
- zmražení → krájení v kryostatu

Zachování tkáňových struktur:

- Fixace a parafinový proces naruší některé tkáňové struktury. Typicky se jedná o enzymy (svalová biopsie, biopsie při
malabsorbčním syndromu a jiné), některé antigeny a další struktury.
- Dnes - protilátky, které pracují na běžně fixovaných a zpracovaných tkáních, proto pro diagnostické účely již speciální
postupy při zpracování tkání nejsou nutné

Zpracování materiálu pro TEM

Fixace:
o aldehydová (glutaraldehyd ) – fixuje rychleji, jemněji, účinněji a lépe jak formol – artefakty
o osmiová ↑ kontrastu
 o manganistanová ↑ kontrastu
- zalévání do umělých pryskyřic (parafin nelze – nutné tenčí řezy )
- krájení – ultramikrotom – krájí se pod mikroskopem
● skleněný nůž (obklopen alobalem s vodou )
● řez (60 – 80 nm) → na hladinu vody → preparát zachytneme na síťku z kovu
- kontrasty – těžké kovy

3. Cytologická vyšetření.

- Pro cytologické vyšetření se používá řada metod:

- nátěry na skla z různých tělesných tekutin (hlen, sputum, KO, gynekologické stěry, bronchiální laváž, atd.)
- otisky tkání na sklo (přímý otisk tkáně, například u děložního čípku)
- aspirace tkání (štítná žláza, kostní dřeň)
- centrifugace (například moč)
- kombinované metody (například cytoblok: sediment nebo centrifugát se zalijí do parafinu a krájí
- Výhody:
- je šetrnost vůči pacientovi (a vyšetření pro zvýšení výtěžnosti je možné opakovat)
- rychlost (odpadá parafinový proces, nátěry se po krátké fixaci ihned barví)
- cena
- menší náročnost na vybavení
- lépe se dá studovat cytologický detail ( pleomorfie hyperchromie jader, poměr cyt./jádro)
- Nevýhoda: nelze hodnotit architektoniku tkáně
- Barvení:
o dle Giemsy
o dle Papanicolaua
- stěry z děložního hrdla
- barevné komplexní
- dysplastické změny
- nevýhoda: cena
- barva neurčuje špatné x dobré → červené - keratinizace

Typy materiálu:
- deskvamativní (exfoliativní ) příkl: z pochvy a čípku děložního, bronchoalveolární laváž, spůtum
- po centrifugaci tělesných těkutin (ascites, pleurální výpotek, cysty, liquor, kloubní tekutina,…)
- krevní obraz
- punkční (tenkou jehlou) – aspirace tkáně – př. kostní dřeň, uzlina, štítná žláza

Využívá se cytospin (přístroj, jež pomocí odstředivé síly nanáší na sklíčko jemnou vrstvu buněk), cytoblok (sediment + plazma +
thrombin parafinový blok), průtoková cytometrie, otiskové preparáty, nátěry.

4. Mikroskopické techniky.
SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE

- využívá k zobrazení objektů viditelné světlo

- má rozlišovací schopnost asi 0,25 µm.
Pozorování obrazu ve viditelném světle je omezeno schopnostmi našeho zraku a vlnovou délkou světla = největší zvětšení ve
světelném mikroskopu je cca 1000x, další zvětšení je „prázdné“, tj. nepřináší zlepšení rozlišovací schopnosti.

Světelný mikroskop se skládá:

a) z mechanické části = stativ mikroskopu, tubus s revolverovým měničem objektivů a držák osvětlovací soustavy
b) z optiky = objektivy a okuláry
c) z osvětlovacího zařízení = zdroj světla + kondenzor
Zdrojem světla je zpravidla ve stativu zabudovaná klasická nebo halogenová žárovka. V některých speciálních případech jsou
mikroskopy vybaveny rtuťovou výbojkou (fluorescenční mikroskop), emitující široké spektrum světla o velké intenzitě, kde
pomocí filtrů lze získat světlo o žádoucí vlnové délce.

Lze připojit kameru - digitální obraz - možnost počítačové analýzy obrazu (využití hl. výzkumně; možné užití v diagnostice:
měření velikostí, vzdálenosti od okrajů apod.).

Typy pozorování:
a) diaskopické - pozorování v procházejícím světle
b) episkopické - pozorování v odraženém světle (fluorescenční mikroskopie; neprůhledné objekty)

Kvalitu a cenu mikroskopu určuje optika.

OBJEKTIV:
- složen z řady čoček z různých druhů skla, které se vyznačují vysokým indexem lomu a širokou spektrální propustností.
Výsledkem má být nezkreslený, jasný a ostrý obraz pozorovaného objektu.

Typy objektivů podle korekce chromatických aberací a rovinatosti obrazu (sférické aberace):
- ACHROMÁTY - korekce chromatických aberací pro dvě barvy spektra: modrou a červenou (které se pak lámou do
společného ohniska)
- FLUORITY (také SEMI-APOCHROMÁTY) - mají korekci pro dvě až tři barvy spektra. Oproti achromátům mají vyšší numerickou
aperturu (lepší rozlišovací schopnost) a lépe zobrazují barvy objektu
- PLAN-FLUORITY - fluority s korekcí do roviny
- APOCHROMÁTY - nejdokonalejší korekce + nejvyšší numerická apertura = nejlepší rozlišovací schopnost a chromatická
korekce pro 3 barvy spektra – červenu, zelenou a modrou, rozšířenou až do tmavě modré
- PLAN-APOCHROMÁTY - apochromáty s korekcí na rovinatost obrazu; v současné době nejvýkonnější objektivy.

Typy objektivů dle druhů média mezi objektivem a preparátem (v důsledku snahy o sjednocení indexu lomu):
- SUCHÉ OBJEKTIVY
- IMERZNÍ OBJEKTIVY - užívají vodní či olejovou imerzi

SPECIÁLNÍ TYPY MIKROSKOPŮ:

MIKROSKOP S FÁZOVÝM KONTRASTEM

- využívá zpomalení a odchylky světelných paprsků při průchodu skrz struktury s různou lomivostí (tj. fázový kontrast) x fázové
rozdíly oko nepozná
- fázový objektiv převádí fázový posun v amplitudový rozdíl = vnímáme jako rozdíl v intenzitě světla

APLIKACE v diagnostické patologii:

- studium neobarvených preparátů nebo živých buněk a tkání (tkáňové kultury)

POLARIZAČNÍ MIKROSKOPIE
- využívá lineárně polarizovaného světla, které kmitá v jedné rovině
- polarizace je uskutečněna filtry (polarizátorem a analyzátorem)
- jsou-li roviny těchto filtrů k sobě kolmé (filtry jsou zkřížené), je zorné pole mikroskopu temné
- jednolomné látky (voda, cytoplasma, buněčné jádro aj.) zůstávají při zkřížených filtrech tmavé = nejsou tedy zobrazeny
- dvojlomné látky (krystaly aj.) mění rovinu kmitu procházejícího světla, a proto jsou při zkřížených filtrech zobrazeny světle
na temném pozadí.

APLIKACE v diagnostické patologii:

- detekce cizorodých látek ve tkáni (např. krystaly SiO2 u silikózy)
- diagnostika amyloidózy (zelený dichroismus v polarizovaném světle)

FLUORESCENČNÍ MIKROSKOP
- Princip: ultrafialové paprsky se při dopadu na některé látky mění v záření s delší vlnovou délkou; což lze pozorovat jako
zelenou, žlutou, červenou nebo modrou fluorescenci.

APLIKACE v diagnostické patologii:

1. FISH
2. Imunofluorescence (protilátky značené fluorochromem - FITC, GFP, Cy3...)
- nefropatologie - diagnostika glomerulopatií - patologická depozita Ig, komplementu atd.
- myopatologie - diagnostika svalových dystrofií - analýza sarkolemálních proteinů svalového vlákna
3. detekce autofluorescence (např. lipopigmenty)

KONFOKÁLNÍ MIKROSKOP
= laserový skenovací konfokální mikroskop (LSCM)
Princip:
- mikroskopický obraz objektu vytváří počítač na základě intenzity fluorescence měřené bod po bodu, které postupně ozařuje
zaostřený laserový paprsek, přičemž fluorescence z míst nad a pod ozářeným bodem je clonou potlačena
= poskytuje obraz zaostřené roviny bez rozmazaného pozadí okolních rovin
= postupně vzniká série zaostřených optických řezů vzorkem - lze vytvořit trojrozměrné obrazy, kterými lze i otáčet a pozorovat
objekt z různých pohledů.

ELEKTRONOVÁ MIKROSKOPIE
- dva základní typy elektronových mikroskopů:
1) Prozařovací (transmisní) elektronový mikroskop - TEM
2) Rastrovací (řádkovací) elektronový mikroskop - SEM

V diagnostické patologii se využívá TEM.

TRANSMISNÍ ELEKTRONOVÝ MIKROSKOP

Rozdíly mezi světelným a elektronovým mikroskopem:

- k vytvoření obrazu u prvního slouží viditelné světlo, u druhého paprsek elektronů emitovaný z rozžhaveného wolframového
vlákna čočky světelného mikroskopu jsou ze skla, kdežto "čočky" elektronového mikroskopu jsou ve skutečnosti
elektromagnetická pole zatímco světlo se šíří vzduchem, pro nerušený prostup elektronů je zapotřebí vytvořit v tubusu
elektronového mikroskopu vakuum zatímco obraz ze světelného mikroskopu lze pozorovat po výstupu paprsků z okuláru
přímo okem, obraz v elektronovém mikroskopu se pozoruje nepřímo, projekcí na fluorescenční stínítko nebo jako
digitalizovaný obraz (kamera) podložním sklům odpovídají v elektronové mikroskopii kovové síťky (z mědi), průchod
elektronů síťkou je možný pouze skrz volné otvory

- rozlišovací schopnost až 0,25 nm (využitelná jen v technických aplikacích, při vyšetřování biologických objektů: cca 5 nm)
- zvětšení: až 800 000 x (v diagnostické patologii stačí 2 000 až 50 000 x).

Příprava vzorků pro vyšetření v TEM

- Odběr materiálu - velikost bločku by v případě odběru pro elektronovou mikroskopii neměla přesáhnout 1 mm3
- Fixace materiálu - nejčastěji aldehydy (glutaraldehyd a formaldehyd) či oxid osmičelý. Má-li být fixace dokonalá, musí
fixační tekutina prosytit tkáň dříve, než je poškozena hypoxií = fixaci je třeba zahájit v co nejkratší době po odběru
- Zalévání materiálu - musí se zalít do dostatečně tvrdých a přitom krájitelných hmot či materiálů = např. plastické hmoty
typu epoxidů
- Krájení ultratenkých řezů - řezy tenčí než 100 nm ( = ultramikrotomy)
- Kontrastování („barvení“) ultratenkých řezů - sloučeniny některých těžkých kovů (uran, olovo, wolfram atd.) =
„elektronová barviva“.

APLIKACE v diagnostické patologii:

- nefropatologie - diagnostika glomerulopatií a tubulopatií
- diagnostika myopatií (zejm. kongenitální + metabolické myopatie)
- diagnostika periferních neuropatií (demyelinizace, detekce depozit paraproteinu, amyloidu; diabetická neuropatie)
- (onkopatologie)

5. Perioperační biopsie.

INDIKACE:
- v časové tísni. Operace je přerušena dokud patolog nevyhodnotí tkáňový vzorek. Taková situace nastane například pokud
je při operaci objeven proces, podezřelý z malignity. Podle charakteru procesu je modifikován rozsah operace.
- při operaci maligních tumorů chirurg po odstranění tumoru odebírá vzorky z resekčních okrajů. Pokud vyšetření okrajů
prokáže residua tumoru, chirurg excisi rozšíří.
- při mastektomii pro maligní tumor - lymfatické uzliny v axille. Podle výsledku průběžného vyšetření odebraných uzlin
chirurg v odebírání uzlin dále pokračuje nebo výkon ukončí (sentinelová uzlina)

VÝHODY/NEVÝHODY: Vzhled preparátů připravených technikou nazmrzlo (tekutý N – lepší než mrazák, nepotrhá se to; je to
rychlé) se liší od běžných formol parafinových preparátů. Řezy jsou zpravidla silnější, orientace je horší a diagnostické
hodnocení nemusí být vždy jednoznačné a s definitivní diagnózou je nutné vyčkat na trvalé preparáty.
+ trochu fixace formolem + dobarvení HE (10-15 min)
- nedají se dělat speciální metody, jen orientační

6. Histologické barvící metody.

- Na formalinem fixovanou tkáň lze použít řadu barvení. Rutinní barvení je barvení hematoxylinem-eosinem
- Speciální barvení se používají především v situacích, kdy barvení hematoxylin-eosin dává pro různé látky stejné výsledky.
- Kromě toho je k dispozici řada protilátek vůči různým tkáňovým antigenům, ať normálním nebo antigenům přítomným pouze
za patologických okolností.
- Hematoxylin-eosin: rutinní barvení, jádra modrá, cytoplasma růžová, patrné jsou i některé pigmenty (hnědě
hemosiderin, melanin, nažloutlá je žluč, černý je anthrakotický pigment); hlen, bílkoviny, fibrin, hyalin atd. se barví
v různých odstínech růžové
- van Gieson se někdy používá na rozlišení svalu (žlutě) a vaziva (červeně)
- trichrom
- PAS barvní karmínově polysacharidy (hlen, vlákna plísní) a glykogen; dále některá depozita bílkovin
- Grammovo barvení na mikrorganismy funguje na řezech podobně jako na nátěrech
- Ziehl Nielsen barví karmínově mykobakteria
- Grocott: plísně se barví černě
- Warthin-Starry: tmavě hnědě barví některé bakterie (např. spirochety, Helicobacter)
- Gömöry barvní černě retikulinovou kostru tkáně (vhodné u některých tumorů nebo jaterní cirrhózy)
- Kongo červeň barví cihlově červeně amyloid (který v tomto barvení jeví i zelený dvojlom v polarizovaném světle)
- barvení podle von Kossy se používá na depozita kalcia
- Perlsova reakce vede ke vzniku berlínské modři za přítomnosti hemosiderinu

- protilátky (ať již monoklonální nebo purifikované polyklonální) se používají na znázornění velkého množství antigenů.
- Některé antigeny jsou typické pro určité tkáně (imunohistochemie):
- Hladkosvalový aktin (diag. nedif. sarkomů)
- Neuronální antigeny (neuroblastomy,..)

- markery:
- proliferace buněk: jaderná exprese Ki67 (nereaguje u buněk v G0 fázi)
- v séru → onkologický screening (například PSA, prostate specific antigen, je zvýšený u tumorů prostaty v séru pacientů)

ENZYMOVÁ HISTOCHEMIE

- Histochemie = hraniční obor mezi histologií a biochemií - zjišťování charakteru a distribuce chemických látek „in situ“, tzn. v
buňkách a tkáních histologických řezů
- Princip enzymové histochemie: enzym převede substrát na barevný produkt
- = lokalizaci a aktivitu enzymu zjišťujeme nepřímo, tj. na základě výsledku jeho činnosti (katalytická histochemie)
- v současnosti lze in situ prokázat asi 150 enzymů
- enzymu je třeba při jeho průkazu nabídnout vhodný substrát, optimální pH a optimální reakční teplotu
- příprava vzorků pro histochemické vyšetření vyžaduje zachovat enzym v co možná nezměněné aktivitě na místech, kde je in
vivo - používají se zmražené řezy
- (svalová biopsie = mražení v izopentanu vymraženém v tekutém dusíku)

APLIKACE v diagnostické patologii:

1. SVALOVÉ BIOPSIE - diagnostika myopatií
2. PATOLOGIE GIT (Hirschsprungova choroba a hypoganglionózy)

AD 1: Typy enzymů prokazovaných ve svalové biopsii

AD 2: Diagnostika aganglionóz a hypoganglionóz

- NADH-tetrazolium reduktáza
- Acetylcholinesteráza
= detekce gangliových buněk v my enterických plexech pro jejich kvantifikaci
- provádí se i peroperačně!

7. Průtoková cytometrie.

- moderní metoda ke zkoumání fyzikálních i chemických vlastností buňky

- identifikace různých buněčných typů uvnitř smíšené populace, analýza jednotlivých subpopulací v rámci jedné populace
- potřeba vždy VITÁLNÍ BUŇKY

- PRINCIP: suspenze buněk protéká tenkou kapilárnou, jednotlivé buňky jsou prosvicovány laserovým paprskem a na základě
odraženého záření je určována stavba buněk
- materiál:
- periferní krev
- mozkomíšní mok
- kostní dřeň
- bronchoalveolární laváž
- nativní bioptický materiál (př.: lymfatické uzliny) – nejprve potřeba připravit

- příprava:
 - bioptický vzorek (uzlina) → homogenizátor → uvolňování buněk do suspenze
- b. suspenze → promytí → značení monoklonálními fluorescenčně značenými Ab → odmýt zbytek → lýza Ery (chceme
jen lymfocyty – dělá to chyby) → promýt → analýza

- stanovujeme:
- velikost
- granularitu – boční odrazy – co víc odráží, to je víc granulární
- intenzitu fluorescence
- lze vyšetřit jak povrchové znaky, tak IC

- u FC se dá prokázat koexprese molekul (lze použít 8 protilátek najednou) → výhoda oproti IHCH – 1 preparát – 1 Ab

- Imunofenotypizace – buňky označíme protilátkou (např. proti CD4 receptoru) s navázaným fluorochromem –rozlišímě
jednotlivé subpopulace
- Výhody:
- rychlost – 2-3 h
- analýza velkého počtu buněk (PC to zvládne) → výhoda u k. dřeně – najde i malinko (0,1 %) patologických buněk ve
velkém počtu – patolog ne
- současné vyšetření více znaků na b. → koexprese?
- stačí malé množství bilogického materiálu – př. 30ml krve
- nízké náklady na reagencie (fluorescenčně značené protilátky) – jen některé
- Nevýhody:
- vysoké náklady na výbavu
- nelze současně posoudit morfologii buněk
- nutno pracovat s nativním, čerstvým materiálem!!! – potřeba pracovat hned (na mrtvé se buňky vážou nespecificky, dá
se i zmrazit, ale není to ideální

VYUŽITÍ:
- Imunofenotypizace leukemií a lymfomů – jaký typ? malignita?
- DNA analýza
- Funkční vyšetření leukocytů
- Stanovení intracelulárního vápníku
- Diagnostika defektů imunity
- Cytometrické vyšetření solidních nádorů
- Diagnostika a monitorování autoimunních chorob
- Transplantační imunologie
- Analýza buněčného cyklu – proliferace nádoru?
 8. Imunohistochemické vyšetření – základy.

- využití specifické vazby mezi ANTIGENEM (Ag)a PROTILÁTKOU (Ab) a vhodné vizualizace proběhlé reakce mezi Ab/Ag
- potřeba NATIVNÍ TKÁŇ!!!

Využití protilátek
DAGNOSTIKA: sledování průběhu onemocnění, imunitní odpověď na etiologické agens, autoprotilátky, infekčního původce,
toxinu, enzymu
- imunochemické precipitační metody, RIA, enzymatické metody (ELISA), gelové difuze – jednoduchá, radiální, dvojitá, elfo,
koaglutinace, imunoflorescence, KFR
- separační metody- např. afinitní chromatografie, semikvantitativní průkaz
- Imunohistochemické metody – určují lokalizaci Ag
o typing nádoru, prognostické markry
- terapeutické (profylaktické) použití – vakcinace, hyperimunní imunoglobuliny

Imunogenicita Ag
- imunogenní = schopný vyvolávat tvorbu specifických protilátek (kt. dobře váží daný antigen – epitop Ag)
- dobře imunogenní jsou velké molekuly, proteiny ( i nukleoproteiny a lipoproteiny)
- horší imunogeny jsou sacharidy
- hapten- částice sama osobě neimunogenní, imunogenní po vazbě na větší částici
- adjuvans-podporuje imunitní odpověď na imunogen (často chrání Ag před časnou degradací)

Reakce Ag a Ab
Epitop = Ag determinanta (4 – 6 AK n. cukrů) ← prostorově přístupná část
- podstata vazby: -slabé vazebné interakce (elektrostatické, vodíkové vazby, hydrofóbní interakce, van der Waalsove síly) –
reverzibilní
síla vazby závisí na koncentrací solí v roztoku, na teplotě a pH

POZOR! Nevhodná fixace zničí imunoreaktivitu proteinů

- někdy může při imunohistichemii docházet k nespecifickému zbarvení pozadí proto je potřeba negativní/pozitivní kontrola.

Primární protilátky – rozdělení a aplikace

Polyklonální –směs protilátek z více klonů plazmatických buněk
o vznik na podkladě imunitní reakce proti více epitopům ( i v rámci 1 polypeptidu)
Příprava: naočkování antigenu laboratornímu zvířeti

Monoklonální – z (nádorových) buněk vzniklých z 1 klonu

Příprava monoklonálních protilátek:
- lymfocyty, resp. plazmatické buňky se prakticky nedají efektivně kultivovat→ fúze s nádorovou nesmrtelnou myelomovou b.
(vznik hybridomu, HAT medium) → možná kultivace, hybridní buňky produkují specifické Ig.
- Protilátky se připravují většinou z hybridomů, dnes moderně i genovým inženýrstvím. Pomocí PCR jsou namnoženy DNA
části, odpovídající variantním řetězcům Ig. Ty jsou pak zakomponovány do genomu bakteriofága a získá se tak množství
chtěných protilátek. Tím je poté zalit agar s detekovaným antigenem a vyselektovaný Ig se naváže. Ostatní protilátky se
odmyjí

Způsoby detekce
- Potřeba zviditelnit → barevný precipitát (označeno peroxidázou)

9. Imunohistochemické vyšetření - vyšetření.

- Imunohistochemie umožňuje průkaz exprese určitého proteinu ve tkáni nebo v buňce.

- reakce se specifickou protilátkou, která je značená. Ta reaguje s epitopem antigenu, kterým je právě ona detekovaná látka.
- Výhoda: detekovaný protein může být i intracelulární (buňka je řez, Ig sem proto pronikne).
- Využívá se jen fragment Ab (štěpí se pepsinem).
- Ig se většinou používají monoklonální, polyklonální málo
- Nevýhodou monoklonálních je však to, že se při fixaci preparátu často poškodí epitop a značená protilátka se na něj nemusí
navázat.

- nutná deparafinace, poté se musí odstranit proteiny, které kryjí žádaný epitop (pomocí enzymů, změnou tepoty, pH,…).

Detekce: přímé a nepřímé.

- Přímé spočívají v protilátce, která je přímo značená, např. fluorescenčně.
- U nepřímé se na protilátku naváže další Ig (ta je již polyklonální, pro silnější signál) která je značená (většinou však ne
fluorescenčně, spíše chromogenně). Preparát je tak lépe vidět. Detekci je navíc možné stále více a více zesilovat
terciálními protilátkami.
o Dnes se většinou používá kombinace biotin + avidin. Někdy je biotin již ve tkáni (např. ledviny). Proto se
využívají polymery, obsahující fragmenty Ig, vážící se na primární Ig, a zároveň chromogen.
- Dalšími enzymatickými metodami je využití např. křenové peroxidázy (substrátem je diaminobenzidin. S H2O2 dává
hnědé zabarvení. Může však imitovat pigment), alkalické fosfatázy (substrát je tetrazoliová modř),…
- Lze použít i více barev najednou, např. u hojně pigmentované tkáně nebo smíšených nádorů. Možno použít i 2
protilátky na 2 antigeny jednoho typu buňky (např. určení typu nádoru a díly proliferace u proliferačních markerů).

Hodnocení výsledků:
- lokalizace ve tkáni – nádory mohou např. zmnožit organely
- intenzita reakce
- počet pozitivních buněk – Ki-67 → proliferační aktivita
- abnormální pozitivita – např. exprese molekul de novo nebo zvýšená exprese
- abnormální lokalizace – např. defektní protein, který se octnul v jiném kompartmentu buňky

Využití:
- diagnostika: např. určení typu nádoru, který nejde rozpoznat morfologicky, původ
metastázy – exprese:cytokeratinu – karcinom
● vimentin – sarkom
● desmin – myom (myosarkom)
● GFAP, neurofilamenta – neurogliomy
● CD hlavně pro lymfomy.
- S100 – melanocyty, adipocyty, myoepitelie. Jedná se o regulátor pochodů v těle, jež vyžadují Ca2+.
- PSA – prostata
- Thyreoglobulin – gl. thyreoidea
- Myogenin – nutný pro zrání svalových vláken. V normálních není, jen v nádorových.
- prognostika: např. průkaz catherinu (adhezin) - pro epitelie je typický catherin E. Když jej karcinom nemá, může snáze
invadovat.
- Dále proliferační aktivita:
o molekuly (Ki67, BCNA)- se exprimují v buněčném cyklu, ale ne v G0 fázi.
o Bcl2 - blokátor apoptózy. Zvýšená exprese v nádorech. terapie: chirurgie, radio a chemoterapie, specifická
terapie.
- specifická terapie: monoklonální protilátky – lze ji navázat např. na typickou nádorovou buňku a zablokovat některé její
molekuly. Často to vede k apoptóze nebo alespoň zástavě proliferace. Protilátka může navíc vyvolat imunitní reakci
v místě nádoru. nízkomolekulární inhibitory – např. kompetitory ligandů (tamoxifen inhibuje funkci estrogenů, čehož lze
využít při ca mammy).
- Př.: svalová biopsie, GIT (Hirschprungova choroba, celiakie)

Vyšetření imunistochemické (enzymatické)

- průkaz enzymů → specifikace tkáně, průkaz enzymatických deficiencí (například u některých metabolických vad).
- Podstata: enzymy se nechají reagovat ve tkáňových řezech.
o Modifikovaný substrát - po reakci s enzymem dojde k barevné změně
- vyžadují zpracování čerstvé tkáně (nazmrzlo), protože většina enzymů při fixaci ztrácí aktivitu (denaturace spojená se
změnou konfigurace bílkoviny enzymy deaktivuje)
- využití: při zpracování biopsií kosterního svalu (typizace vláken, defekty reaktivity NADH tetrazolium reduktázy u ragged
red fibres aj.), u průkazu enzymatických deficiencí u malabsorpčních syndromů a jinde
- Enzymatické metody se rozsáhle využívají u imunohistochemických vyšetření ke značení protilátek: protilátky, značené
enzymem, se navážou na odpovídající antigeny ve tkáni. K jejich vizualizaci se použije modifikovaný substrát tak, jak bylo
popsáno výše. Protože enzymy jsou navázány až na reagující protilátky, vyšetřovanou tkáň je možné běžným způsobem
fixovat.
 10. Fluorescenční in situ hybridizace.

Princip:
Značená sonda, tvořená specifickým známým úsekem nukleové kyseliny, reaguje ve tkáni. Sonda navázaná na komplementární
úsek nukleové kyseliny ve tkáni se poté různými metodami prokazuje. Metoda je analogická metodám protilátkovým.

Metoda:
1. parafinové řezy se natáhnou na skla, odparafinují, zavodní
2. tkáň se natráví proteinázou K, vypere a vysuší
3. tkáň se pokryje značenou sondou (ke značení se použije biotin nebo dioxigenin-11-dUTP)
4. tkáň (resp. příslušná DNA) se denaturuje při 95 stupních asi 5 minut
5. pak probíhá hybridizace denarurované DNA se sondou při 37 stupních (až několik hodin)
6. tkáň se propere od nenavázané sondy
7. nanese se enzymem protilátka proti biotinu nebo dioxigeninu a nechá reagovat
8. tkáň se propere aby se odstranila nenavázaná protilátka s enzymem
9. přidá se speciální substrát s navázaným (ale skrytým) barvivem, který je navázaným enzymem zpracován tak,
že dojde k uvolnění barviva
10. tkáň se opět propere a barví (eosinem, aby bylo možné se ve tkáni lépe orientovat)
11. tkáň se dehydratuje atd. a připraví se klasické preparáty
Takto se prokazují antigeny některých tumorů, virová nukleová kyselina a další.
Lze použít i archivní preparáty.

FISH
- Při této metodě lze použít více sond značených různými fluorochromy. Hodnotí se vzájemná poloha a počet navázaných sond
v buněčném jádře.
- Při této metodě se vážou různé sondy na různá místa genomu, přičemž každá sonda je značena jiným fluorochromem (a svítí
jinou barvou). Tak je možné hodnotit vzájemnou polohu prokazovaných úseků DNA. Mikroskop musí mít více
fluorescenčních filtrů pro odpovídající fluochromy.
- Hodnocení je založeno na barevném skladu: pokud jeden z fluochromů svítí např. zeleně a druhý červeně, tak pokud se ocitají
po translokaci v sousedství, výsledný bod svítí jinou barvou (žlutě) nebo jsou aspoň oba body těsně u sebe. Takové vyšetření
vyžaduje speciální fluorescenční mikroskop s automatickou výměnou fluorescenčních kombinací filtrů. Kamera sejme dílčí
obrazy při různých vlnových délkách a výsledný obraz je složen počítačem.

- jako vzorek cílové DNA využíváme chromozómy (metafázická jádra), nebo interfázická jádra ( v patologii častěji interfázická )

- nevýhoda: odřezaná jádra – může vypadat negativně, je potřeba prohlížet větší kus preparátu pro potvrzení
- tlustý řez → pro konfokální mikroskop – projede to jako mřížku – odstíní určité oblasti + posune se → nafotí → PC to složí

Vyšetření – Indikace:
- diagnostické
o potvrzení dg.- morfologické, imunohistochemické, z průtokové cytometrie
o screening pro PCR
o konečná Dg. – translokace
- volba terapie – pomocí FISH upřesnění již stanovené Dg.

Možnosti využití FISH v patologii:

- chromozomální vyšetření nádorových buněk (karyotyp leukemických buněk)
- detekce translokací – zejména u leukemií a lymfomů
o specifické sondy pro translokované oblasti obou chromozomů
▪ oddělené – normální
▪ těsně u sebe (aditivní smíšení barev – červená + žlutá = oranžová) – translokace
- detekce zlomů – sonda před a za zlomem (norm: oba signály, event. aditivní barva)
- submikroskopické chromozomální aberace( zejména mikrodelece event. delece tumor-supresorových genů )
- vyšetření amplifikace onkogenů zejm. karcinomy (pozn. lépe otisky tkání – zachováno celé jádro)
- detekce minimální reziduální choroby
- výhody:
- vyšetření bez kultivace
- dlouhé sondy
- archivní materiál
- vyšetření malého místa → víc sond
- morfologie tkáně
- porovnání s expresí proteinů
 11.Analýza nukleových kyselin.
- materiál:
- nativní tkáň
- jde izolovat i z parafínových řezů
- formol – nepufrovaný degraduje NK
PCR:
- Cíl: namnožení specifických úseků nukleové kyseliny vyšetřovaného vzorku.
- Je možné vycházet i z nepatrných množství vzorku (izolované buňky). Existují metody, jak z histologického řezu získat jednu
buňku určitého typu a její nukleovou kyselinu podrobit PCR amplifikaci.
Metoda:
Reakční směs:
- vyšetřovaná DNA
- primery (v nadbytku)
- deoxyribonukleotidy
- termostabilní DNA – polymeráza
- pufr
( u RT – PCR navíc – reverzní transkriptáza)

denaturace vyšetřované DNA při vysoké teplotě (94 stupňů)

- kyselina se rozdělí na dva prameny
hybridizace pramenů se známým startovacím primerem při 45--60 stupních
- startovací primer je krátký úsek syntetické NK, který se váže specificky na začátek úseku nukleové kyseliny, kterou
chceme aplikovat (tyto startery jsou komerčně dostupné)
extenze úseků nukleových kyselin při 72 stupnich (teplotní optimum pro Taq-DNA-polymerázu)
- dochází k syntéze komplementární části DNA k denaturací rozděleným pramenům

Taq-DNA-polymeráza je DNA polymeráza pocházející z bakterie Thermophilus aqueus, která žije v horkých pramenech. Její
pracovní optimum je na rozdíl od lidských polymeráz vysoké (72 stupňů) a polymeráza odolá vysoké teplotě při denaturaci DNA.
- Cyklus se opakuje v průběhu asi 2 hodin až 30×, což vede k exponenciálnímu nárůstu specifických úseků nukleové kyseliny
ve vyšetřovaném vzorku. Průkaz těchto úseků se provádí gelovou elektroforézou (vždy spolu s kontrolními vzorky a
negativní kontrolou).

Metoda má mnohostranné použití:

- průkaz mikroorganismů (HPV, HSV, mykobakterie, borrelie)
- průkaz bodových mutací (analýza namnožené nukleové kyseliny nebo přímý průkaz známé mutační sekvence vhodným
primerem)
- průkaz klonality T lymfocytů
- a další

UŽITI: DNA (PCR) –detekce mutací –p53, Rb1,…

- detekce translokací (fúzních genů) t(11;14) bcl 1/ IgH
t(14;18) bcl 2/ IgH
- detekce genomu virů: EBV, CMV
- detekce přestaveb: Ig H , TCR – sledování Min. Reziduální Nemoci
- detekce exprese – myoD1 , fúzní geny
- detekce translokací (př. t(2;5) t(11;18) –MALT lymfom)
RNA
- detekce exprese
- detekce translokací – fúzní gen (BCR/ABL)

Typy:
- Kvalitativní- např. viry, dg. translokací
- Kvantitativní – hodnocení minimální reziduální nemoci, reakce na léčbu
- Semikvantitativní – hodnocení intenzity proužku v gelu
- Kompetitivní PCR
- RQ – PCR – užití fluorescenčním barvivem označené specifické sondy, porovnání s house-keeping genem (ABL,
beta-2-mikroglobulin)

UŽITÍ KVANTIFIKACE
- minimální reziduální nemoc – sledování terapii uniklých maligních buněk a počátek relapsu
- monitoring reakce na léčbu (RQ – PCR)
 12.Sekvence DNA.

- Jedná se o nejjemnější metodu analýzy DNA. Stanovíme tak primární sekvenci nukleotidů studovaného fragmentu DNA. Lze
toho využít pro přesné určení mutace nebo umělou modelaci proteinu. Pro analýzu jsou zapotřebí krátké homogenní úseky
DNA ve velikém množství, např. plasmidy, rRNA, mtDNA nebo fragmenty DNA. Tyto úsek jsou přečteny a poskládány do
řetězce podle překryvů.
- Materiál:
- PCR amplifikace
- naklonované krátké úseky DNA
- dostatečně krátké úseky – do 500 pb

Metody:
Sangerova enzymatická metoda.
- Využívá se zablokování syntézy vlákna DNA dideoxyribonukleotidem. Ty postrádají OH skupinu na uhlíku na pozici 2 a 3.
🡪 Studovaný fragment je naklonován do vektoru. Na jednovláknité DNA se pak od primeru pomocí DNA
polymerázy nasyntetizuje komplementární vlákno DNA.
- Reakční směs obsahuje množství fragmentů a dideoxynukleotidfosfátů. Poměr musí být pečlivě zvolen, jinak může
dojít k terminaci syntézy moc brzo nebo pozdě.
- Po proběhnutí reakce tak směs obsahuje různě dlouhé jednovláknité řetězce DNA, končící příslušným dideoxydem.
Každý dideoxyribonukleotid je fluorescenčně označený, jiná barva pro každý nukleotid. V sekvenátoru pak fragmenty
procházejí gelem rychle dle jejich velikosti a v detekčním místě je detekován příslušný fluorochrom.

Maxam-Gilbertova: chemické štěpení (T-C). Poslední báze v NK je radioaktivně označená a konec se pak detekoval. Seřazení
elektroforeticky
Pyrosekvenování: během skládání nukleotidů se detekuje uvolněný pyrofosfát, který je následně přeměněn na ATP a luciferázou
na světlo.
Microarray

Získané sekvence pak lze analyzovat, porovnat s databází na internetu a zjišťovat příbuznost sekvencí nebo mutace. Dále
určování rezistentních mutant virů a plasmidů, sestavení fylogenetických stromů, určení specifických mutací pro nemoci a
nádory,… Dále tzn. mutační analýza – určení rezistence k lékům, která byla vytvořená na základě známé mutace.

13.Mikročipy a laserová mikrodisekce.

DNA microarrays (DNA čipy)

- Jedna z nejnovějších technologií, kde na nosiči (zpravidla na podložním skle) je naneseno velké množství vzorků (sond)
DNA. RNA z testované tkáně se nechá se vzorky hybridizovat a vazba se prokazuje fluorescenčně nebo radiograficky.
- Tato metoda je prozatím v počátcích, předpokládá se však, že v horizontu 10 let povede k zpřesnění diagnostiky a bude mít
zásadní přínos i při léčbě.

- Výsledky se analyzují statisticky metodami shlukové analýzy. Tak je možné sledovat přítomnost a stav genů kódujících
nejrůznější celulární struktury (enzymy, receptory, regulátory atd.).

DNA čipy:
- skleněné deštičky eventuálně nylonové membrány, plastikové mikročipy
- na nich je zakotveno stovky až několik desítek tisíc c DNA, nebo
- oligonukleotidů specifických pro jednotlivé geny
- na tyto čipy je hybridizována flouorescenčně značená komplexní c DNA sonda
- (kompletní populace m RNA studovaného vzorku )
- vyhodnocení čtecím zařízením – analýza počítačem

Hodnocení:
- jak silně jsou určité geny v dané tkáni / buňce exprimovány
- další užití: detekce mutací, genotypizace, sekvenace

- Pozn.: na deštičce mohou být zakotveny i proteiny (využití reakce s protilátkou)

- Mikročipy:
o aktivní – jednotlivé pracovní plošky lze ovládat individuálně (různé podmínky)
o pasivní – reakční podmínky všude stejnéň

- MAKROARRAY – několik set genů – lze odčítat pouhým okem

- MIKROARRAY –nutný software (tisíce genů)

Mikrodissekce
- Mikrodissekční metody umožňují vyjmout z tkáňového řezu určité oblasti (v ideálním případě jednotlivé buňky) a takto
odejmutý materiál použít pro další zpracování metodami molekulární patologie (například amplifikace a další zpracování
DNA takto vybraných buněk).
- výhoda je přesné cílení na buněčný typ ve tkáni, skládající se ze směsi buněčných typů (nádorových i nenádorových).
- spojuje mikroskopii a molekulární analýzou → zisk přesně definovaných buněk + pozorování b. struktur pod mikroskopem
- využití:
- analýza ojedinělých buněk, rozptýlených menšinových buněk infiltrací
- analýza jednotlivých chtomozomů (mikrodisekce i pod imerzí)
- analýza živých buněk → kultivace
- postup:
- příprava – barvení – jen hematoxylin (eosin ničí NK)
- vložení
- výběr
- disekce – oříznutí jak v malování
- využítí:
- 2 typy nádorů v 1 tkáni
- nízké procento buněk v nádoru
● laserová mikroinjekce léčiv → do živých b.
● fúze b. laserově indukovaná
● separace jednotlivých buněk
● kriminalistika

14.Terapeuticko-indikační patologie a prediktivní diagnostika.

Imunohistochemie – využití:
- Dg – typ nádoru, původ
- prognóza:
- invazivní/metastatický potenciál
- kadheriny → čím víc, tím se ty buňky víc drží u sebe
- proliferační aktivita
- Ki-67 → proliferace
- PCNA → reparace NK
- apoptotická aktivita
- BCL-2 → blokuje apoptózu (na membráně mitochondrií, ER)
- terapeuticko-indikační
 - typy terapie maligních nádorů:
- chirurgická
- radioterapie – přesné zacílení,…
- chemoterapie – na buňky, co se dělí
- specifická terapie – aby neničila i ten zbytek
- nízkomolekulární inhibitory
- méně specifické než monkl. Ab
- hormonální terapie → antiestrogenní terapie
- monoklonální protilátky
- nejlepší u nádorů na látky, které tvoří de novo → označení („opsonizace“) → pro NK →
zabije
- spojený s enzymem/radionuklidem (cílené ozařování)/toxinem

RT-PCR:
- využití při monitoraci léčby, zjištění minimální reziduální nemoci
- zjištění relapsu onemocnění ještě před klinickou manifestací → lepší prognóza
- nejprve se vybere látka, která se vyskytuje i normálně, ale u nádorového onemocnění je jí víc → pacient chodí na kontroly
→ když to zjistí, ihned začne léčba
- lze to zjistit i použitím FC nebo mikroskopicky, ale RT-PCR je nejcitlivější

FISH:
- diagnostické
- potvrzení dg.- morfologické, imunohistochemické, z průtokové cytometrie
- screening pro PCR
- konečná Dg. – translokace
- volba terapie – pomocí FISH upřesnění již stanovené Dg.

15.Pitva.

DEF.: posmrtné vyšetření pacienta

Typy:
- Anatomické – pro studijní účely, používají se fixovaná těla.
- Patologické – zjištění příčiny úmrtí pacienta zemřelého v nemocnici. (provádí ho patologické oddělení příslušné nemocnice)
- Soudní – zjištění příčiny a okolnosti smrti člověka v souvislosti s trestným činem (vražda, sebevražda) nebo jinak související
s prací Policie ČR.
- Zdravotní – lidé zemřelí mimo nemocnici, zemřelí násilnou smrtí (nehody) nebo non lege artis postupem.

Kdy je pitva povinná :

- Děti do 18 let (lze žádat vyjímku v případě zjevné příčiny smrti)
- Ženy zemřelé při porodu/během šestinedělí
- Iatrogenní zavinění
- Pitva dárců orgánů
- Kontrolované infekce

V průběhu pitvy patolog hodnotí změny orgánů. V případě potřeby odebírá vzorky pro mikroskopické zhodnocení, pro
mikrobiologické vyšetření a také pořizuje fotodokumentaci. Výsledek pitvy srovná s klinickými údaji. O průběhu pitvy sestaví
pitevní protokol.

Pitevní protokol se skládá z několika částí:

- popis pitvy a makroskopických změn
- popis histologického nálezu
- výsledky mikrobiologických vyšetření
- epikríza, stručné zhodnocení pitvy a korelace klinického a pitevního nálezu

Epikríza (vlastní výsledek pitvy) má čtyři části:

1. základní onemocnění
2. komplikace
3. příčina smrti
4. vedlejší nález

Základní onemocnění ze (zpravidla stručná) charakteristika hlavní choroby, kterou zemřelý trpěl, a která (zpravidla) souvisí s
příčinou smrti. Pokud je nalezen maligní tumor, uvádí se zpravidla rovněž.

Komplikace základního onemocnění je nejdůležitější částí epikrízy. Zde je základní onemocnění podrobně rozvedeno a uvedeny
jsou i další závažné nálezy (makroskopické, mikroskopické i laboratorní, též klinické informace).

Příčina smrti je proces, který bezprostředně vede k úmrtí. Je nutné si uvědomit, že stanovení příčiny smrti není hlavním smyslem
patologcko-anatomické pitvy. Při stanovení příčiny smrti je třeba zachovat určitou míru vztahu příčiny a základního onemocnění
nebo jeho komplikací. Tak například uvádět jako příčinu smrti srdeční selhání nebo respirační selhání není vhodné (jedná se o
proces, který postihuje většinu umírajících). Proto je vhodnější jako příčinu smrti uvádět infarkt myokardu, thrombembolizaci
plicních arterií, zánět plic atd.

Vedlejší nález obsahuje změny, které byly při pitvě nalezeny a které nemají souvislost se základním onemocněním ani s příčinou
smrti.

Klinicko-patologická korelace vyjadřuje stupeň shody mezi klinickým a pitevním nálezem ve stupnici 1--4: 1 pro plnou shodu
základního onemocnění a příčiny smrti, 2 pro menší diskrepanci, 3 pro výrazný rozdíl (zejména pokud měla nesprávná diagnóza
vliv na léčbu) a 4 pro výraznou diskrepanci (například klinik diagnostikuje infarkt myokardu a pitva prokáže perforovaný
žaludeční vřed).

1) Celková ateroskleróza.
2) Celková ateroskleróza (Ce II.b, Co III.b, Re II.a, Ao III.a). Hypertrofie a disperzní fibróza myokardu levé komory
srdeční. Kalcifikující ateromový plát r. interventricularis levé koronární arterie. Čerstvý transmurální infarkt myokardu
přední stěny levé komory srdeční. Trombóza endokardu v místě infarktu.

- Alveolární edém plic.

- Aterosklerotická encefalopatie: atrofie mozku, status lacunaris bazálních ganglií. Postnecefalomalatická pseudocysta
velikosti 5 mm v oblasti capsula interna vlevo. Pravostranná hemipareza dle klinické dokumentace.

- Čerstvý hemorrhagický infarkt kůry levé ledviny.

3) Infarkt myokardu.
4) Nodulární hyperplázie prostaty. Hypertrofie svaloviny močového měchýře. Stav po dávno provedené appendektomii.
Nodózní struma. Antrakóza pleury a mediastinálních lymfatických uzlin.

- Závěr: 67 let starý pacient s celkovou atherosklerózou umírá na infarkt myokardu.

- Klinicko-patologická korelace: I.
- Pro nekroptické mikroskopické vyšetření se používá stejných metod jako při vyšetřeních bioptických. Je nutné vzít v
úvahu, že mikroskopický vzhled tkání je do různé míry ovlivněn autolytickými změnami tkání po smrti.