4.

  Phạm vi và nội dung nghiên cứu

i. Sự phát triển của mô hình in silico bao gồm mô hình 3D-pharmacophore, 2D-QSAR và mô
phỏng gắn kết phân tử (docking).
ii. Thu thập cơ sở dữ liệu về cấu trúc của các phân tử nhỏ từ các nguồn khác nhau. Sàng lọc
ảo các dữ liệu đã thu thập thông qua mô hình in silico để bước đầu xác định được các chất ức
chế monoamine oxidase-B (MAO-B) tiềm năng.
iii. Các hoạt chất tiềm năng nhất từ quá trình sàng lọc ảo sẽ được thực hiện mô phỏng động
lực học phân tử (MDs) để đánh giá thêm khả năng gắn kết với MAO-B.
iv. Thử nghiệm sinh lý và in vitro sẽ được thực hiện để xác định ái lực liên kết của các hợp
chất ‘hit’ với MAO-B và các thụ thể của chúng.
5.  Phương pháp tiếp cận

Dự án sẽ được thực hiện theo hai bước chính, bao gồm: tính toán dược lý và thử nghiệm in
vitro như Hình 3.

I. Nghiên cứu in silico 

Cấu trúc 3D của MAO-B & các thụ thể

 
Mô hình 3D-pharmacophore Mô hình 2D-QSAR Mô hình mô phỏng gắn kết phân
  tử

 
Sàng lọc ảo
 

 
Các hợp chất “HIT”
 

 
Mô phỏng động lực học phân tử (MDs)
 

Hình 3. Phương pháp nghiên cứu.

Nghiên cứu này nhằm xác định các chất ức chế tiềm năng có liên kết chọn lọc với MAO-B từ
các cơ sở dữ liệu bao gồm: ZINC, DrugBank, TCM và UNPD. Cơ sở dữ liệu có kích thước
lớn lên tới 22 triệu hợp chất, do đó cần kết hợp các mô hình khác nhau để sàng lọc các hợp
chất một cách hiệu quả nhất. Sau đó, các hợp chất có tiềm năng sẽ được thực hiện thử
nghiệm in vitro và in vivo. Quá trình sàng lọc trước tiên là xây dựng mô hình 3D-
pharmacophore, tiếp theo là ứng dụng các mô hình 2D-QSAR, mô phỏng gắn kết phân tử và
mô phỏng động lực học phân tử.

i. Mô hình 3D-pharmacophore
Nghiên cứu xây dựng mô hình 3D-pharmacophore bằng phần mềm LigandScout 4.3. Mô
hình này xây dựng dựa trên cả cấu trúc protein và phối tử. Đối với mô hình dựa trên phối tử,
nghiên cứu sử dụng cơ sở dữ liệu gồm 397 chất ức chế MAO-B từ 24 bài báo khoa học.
Những chất ức chế này có khung cấu trúc đa dạng và các hoạt động sinh học chống lại
enzyme MAO-B tái tổ hợp của con người, với các giá trị nằm trong khoảng từ 0,045 nM đến
1730 µM. Từ dữ liệu này, bốn hợp chất đã được chọn dựa trên hoạt tính vượt trội và chỉ số
chọn lọc cao đối với MAO-B. Các hợp chất này đại diện cho bốn khung cấu trúc riêng biệt:
khung indole, khung aryloxy, khung coumarin và khung chalcone được sử dụng để xây dựng
mô hình. Đối với mô hình dựa trên cấu trúc, phức hợp cấu trúc MAO-B có mã 2V5Z đã được
chọn từ Ngân hàng Dữ liệu Protein vì nó chứa chất ức chế safinamide.
ii. Mô hình 2D-QSAR
Trong số 397 chất ức chế MAO-B được sử dụng để đánh giá 3D-pharmacophore, có 107 chất
với khung cấu trúc khác nhau đã được chọn. Những chất này có các giá trị IC 50 dao động
trong khoảng từ 1,4nM đến 131µM. Để tạo thuận lợi cho việc xây dựng 2D-QSAR, các giá
trị này đã được chuyển đổi thành pIC 50 = -log(IC50). Các cấu trúc hóa học được vẽ bằng phần
mềm ChemDraw 18.1 và sau đó được chuyển sang phần mềm MOE 2015.10. Trong MOE,
các cấu trúc đã được tối thiểu hoá năng lượng và các tham số mô tả 2D đã được tính toán.
iii. Mô hình mô phỏng gắn kết phân tử
Nghiên cứu này sử dụng phần mềm AutoDock Vina để đánh giá ái lực gắn kết giữa các chất
ức chế tiềm năng với MAO-B.
Mô phỏng gắn kết phân tử là một phương pháp thiết kế thuốc dựa trên cấu trúc, nghiên cứu
khả năng liên kết của các phối tử vào vị trí hoạt động của phân tử đích (protein, enzyme,…).
Cụ thể, phương pháp mô phỏng gắn kết phân tử cung cấp thông tin về hướng liên kết, ái lực
liên kết và hoạt động của các phân tử nhỏ. Do đó, kỹ thuật này là không thể thiếu trong quá
trình thiết kế thuốc hợp lý với sự trợ giúp của máy tính [28].

Phân loại mô phỏng gắn kết phân tử:

a.     Theo cách gắn kết của phối tử:

– Gắn kết thủ công

– Gắn kết tự động (ChemX, FlexX, Dock, …)

b.     Theo tính linh hoạt của phối tử và protein:

– Gắn kết cứng nhắc

– Gắn kết bán linh hoạt
– Gắn kết linh hoạt

Hầu hết các phần mềm mô phỏng gắn kết phân tử hiện nay như Gold, FlexX, Dock,
Autodock… đều là gắn kết bán linh hoạt.

Các bước của quá trình gắn kết phân tử gồm:

– Đưa cấu trúc tinh thể tia X của protein liên quan vào máy tính.
 – Giữ lại axit amin trong túi liên kết và ẩn phần còn lại của protein.
– Tìm kiếm pharmacophore của phối tử và vị trí gắn kết trên protein (chất
cho liên kết hydro, chất nhận liên kết hydro, trung tâm axit, trung tâm bazơ,
vùng kỵ nước, trung tâm vòng thơm, …).
– Phân tích tất cả các cấu hình có thể liên kết với khoang gắn kết của protein.

iv. Thu thập cơ sở dữ liệu về cấu trúc phân tử từ các thư viện hóa học khác nhau

Sự phát triển của các mô hình in silico được áp dụng để sàng lọc ảo các cấu trúc ức chế
MAO-B từ cơ sở dữ liệu hóa học được liệt kê trong Bảng 1. Đây là bước đầu tiên để xác
định các chất có khả năng ức chế MAO-B.

Phương pháp sàng lọc ảo

Toàn bộ cơ sở dữ liệu về cấu trúc phân tử nhỏ được sàng lọc thông qua các mô hình đã phát
triển theo thứ tự sau: mô hình 3D-pharmacophore, mô hình 2D-QSAR, mô phỏng gắn kết
phân tử, mô phỏng động lực học phân tử để xác định phối tử tiềm năng ức chế MAO-B.

Các bước sàng lọc ảo bao gồm:

– Chuẩn bị cơ sở dữ liệu hóa học.

– Áp dụng mô hình 3D-pharmacophore để tìm chất thỏa mãn mô hình.
– Các chất phù hợp với mô hình 3D-pharmacophore sẽ được tối thiểu hoá năng
lượng và tiến hành mô phỏng động lực học phân tử, sau đó được sàng lọc thông
qua mô hình gắn kết phân tử để xác định thêm các chất liên kết tốt với mục tiêu. 

Bảng 1. Cơ sở dữ liệu hóa học được sàng lọc cho chất ức chế MAO-B

STT Cơ sở dữ liệu Viết tắt Số lượng

hợp chất
1 ZINC ZINC 22,000,000
2 DrugBank DB 8,820
3 Traditional Chinese Medicine TCM 50,000
4 Universal Natural Product UNPD 230,000
Database

v. Mô phỏng động học phân tử

Phương pháp mô phỏng gắn kết phân tử bị giới hạn ở việc chỉ hiển thị liên kết của phối tử
với protein "tĩnh", mà không tính đến các yếu tố bên ngoài như dung môi hoặc trường lực,
v.v. Ngược lại, các thử nghiệm in vitro hoặc in vivo, bao gồm cả nghiên cứu trên người, sự
tương tác của protein với thuốc luôn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, bao gồm cả sự hiện diện
của các phân tử nước. Điểm gắn kết phân tử chỉ cung cấp thông tin về năng lượng liên kết
của protein-phối tử mà không xem xét tác động của các phân tử nước. Tuy nhiên, các phân tử
nước có thể tương tác với cả protein và phối tử, từ đó có khả năng ảnh hưởng đến ái lực liên
kết và hoạt động.

Để đánh giá thêm khả năng gắn kết của các hợp chất tiềm năng nhất, người ta tiến hành mô
phỏng động lực học phân tử bằng phần mềm GROMACS. Phương pháp này mô phỏng tương
tác giữa protein và phối tử trong hộp có trường lực và dung môi (H 2O), độ bền liên kết được
đánh giá bằng năng lượng tự do liên kết giữa phối tử và protein. Mô phỏng cho phép chuyển
động và tương tác của protein và phối tử sẽ được nghiên cứu trong một thời gian xác định, do
đó kết quả thu được gần với các thí nghiệm in vitro hơn. Phương pháp mô phỏng động lực
học phân tử được kỳ vọng sẽ giúp hạn chế số lượng các thử nghiệm, cuối cùng cung cấp một
cách tiếp cận hiệu quả hơn để phát triển nghiên cứu thiết kế thuốc.

Phương pháp này sẽ được áp dụng cho các hoạt chất mạnh nhất từ kết quả gắn kết phân tử để
đánh giá thêm khả năng gắn kết của chất này với MAO-B. Mô phỏng động lực học phân tử
dự kiến sẽ dẫn đến kết quả gần hơn với in vitro và giảm số lượng xét nghiệm sinh học được
thực hiện.

B. Xác định hoạt tính enzym MAO-B và đánh giá ái lực của chất ức chế đối với MAO-B

Xác định hoạt tính enzym MAO-B

a. Xét nghiệm cặp peroxidase

Vai trò sinh học của MAO là xúc tác quá trình khử amin – oxy hóa của các monoamin nội
sinh tạo ra aldehyd tương ứng và giải phóng hydro peroxide (H 2O2) hình 4 [29]. Sản phẩm
tiếp theo được tạo ra với số lượng tương ứng với mức tiêu thụ cơ chất amin và sản phẩm
aldehyde; do đó, nó có thể được sử dụng để đo hoạt tính MAO và kiểm tra chất ức chế
enzyme [30, 31]. Điều này đạt được bằng cách kết hợp phản ứng MAO và horseradish
peroxidase (HRP) với sự có mặt của H 2O2, từ đó chuyển đổi các thuốc thử thành các hợp chất
có thể dễ dàng phát hiện như các chất đo quang phổ hoặc huỳnh quang [32].

Hình 4. Sơ đồ của thử nghiệm MAO kết hợp với HRP bằng cách sử dụng các đầu dò
hóa học nhạy cảm với H2O2 khác nhau. Giống như tất cả các oxydase phụ thuộc vào
FAD, MAO cũng tạo ra H2O2 đồng thời với phản ứng khử amin – oxy hóa, bởi vì trong
quá trình luân chuyển enzyme xúc tác, FADH2 bị oxy hóa lại bởi oxy phân tử tạo ra
H2O2 như sản phẩm thứ cấp. Nếu trong phản ứng, hỗn hợp còn chứa HRP, H2O2 được
sử dụng ngay lập tức để oxy hóa các đầu dò thành các sản phẩm có thể phát hiện được

Xét nghiệm đo quang phổ kết hợp HRP

Với sự có mặt của H2O2, HRP có thể xúc tác phản ứng oxy hóa liên kết của 4-
aminoantipyrine (AAY) và 5-dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid (DCHBS) tạo ra một
sản phẩm có màu (dung dịch màu tím) có thể được theo dõi ở bước sóng 515nm (ε 515 =
26.000 M-1 cm-1) bằng máy đo quang phổ Hình 5. Đây là một phương pháp rất thuận tiện và
nhạy [33] thường không can thiệp vào chất nền, chất ức chế và khá kinh tế khi so sánh với
các phương pháp khác hiện có.

Hình 5. Sơ đồ của thử nghiệm so màu kết hợp HRP với thuốc thử DCHBS và AAY

Xét nghiệm huỳnh quang kết hợp HRP

Một phương pháp thay thế để đánh giá hoạt động của enzym MAO là thông qua thuốc thử
Amplex® Red, một chất huỳnh quang và H 2O2 - một đầu dò nhạy [34]. Thuốc thử là chất nền
rất thích hợp để thực hiện phản ứng peroxidase theo tỷ lệ 1:1 với H 2O2 để tạo ra sản phẩm
huỳnh quang resorufin Hình 6. Sản phẩm này có bước sóng cực đại kích thích và phát xạ lần
lượt là khoảng 570 nm và 585 nm, nhưng do hệ số tắt quang cao (ε568 = 56.000 M-1 cm-1),
Amplex Red cũng có thể được áp dụng để đo quang phổ. Ngoài ra, do độ nhạy cao, phương
pháp này được các nhà hóa dược sử dụng rộng rãi trong sàng lọc thông lượng cao các chất ức
chế MAO, thường sử dụng đĩa 96 giếng hoặc 384 giếng. Điều này làm cho nó trở thành một
phương thức rất linh hoạt và thuận tiện, trong đó hoạt động ức chế MAO có thể được theo
dõi không chỉ bằng cách sử dụng cuvette trong máy đo quang phổ cổ điển hoặc máy đo
huỳnh quang, mà còn rất phù hợp với đầu đọc vi bản. Mặt khác, trái ngược với phương pháp
AAY/DCHBS, dung dịch gốc Amplex Red phải được hòa tan trong dimethyl sulfoxide
(DMSO) đôi khi có thể ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme hoặc tính ổn định của một số
chất ức chế.

Hình 6. Phản ứng được xúc tác bởi peroxidase của quá trình chuyển đổi Amplex® Red thành sản
phẩm huỳnh quang resorufin

Xác định đường cong Michaelis-Menten trên MAO B

Để xác định kcat và km bằng phần mềm PRISM, các ứng dụng giá trị tính toán khác nhau
của kcat được có thể được trang bị như một hàm của nồng độ cơ chất theo phương trình
Michaelis-Menten. Để đạt được mục tiêu này, hãy chọn phương trình Michaelis-Menten hồi
quy phi tuyến tính. Ví dụ về đường cong Michaelis-Menten trên MAO B được gửi sẵn trong
Hình 7. Sau khi khớp, chương trình đưa ra các giá trị kcat và Km. Về mặt biểu thị, các giá trị
thu được cho MAO B phải xấp xỉ kcat là 50 phút-1 và Km là 0,1 mM.

Hình 7. Đường cong Michaelis-Menten cho MAO B sử dụng benzylamine làm cơ chất

Đánh giá sự ức chế MAO B bởi một hợp chất

Để đánh giá các chất ức chế MAO, chúng tôi so sánh k cat rõ ràng (the apparent kcat) khi có và
không có hợp chất. Để tính phần trăm ức chế, hãy sử dụng công thức sau:

trong đó ứng dụng kiểm soát kcat tương ứng với kcat rõ ràng khi không có chất ức chế.
Nếu phát hiện thấy sự ức chế lớn (ví dụ: ức chế 50% với hợp chất 50 μM trong hỗn hợp xét
nghiệm), hằng số ức chế (Ki) bằng cách thực hiện một loạt phép đo như mô tả ở trên ở các
nồng độ cơ chất và chất ức chế khác nhau để phù hợp với phương trình thích hợp cho cạnh
tranh , loại ức chế không cạnh tranh (uncompetitive), không cạnh tranh (noncompeti- tive)
hoặc hỗn hợp [35]. Thông thường, ít nhất bốn nồng độ cơ chất được sử dụng để có được
đường cong Michaelis-Menten đầy đủ Hình 7 và ít nhất bốn nồng độ chất ức chế (không bao
gồm chất ức chế) nên được chọn sao cho có thể quan sát thấy sự ức chế rõ ràng nhưng có thể
phát hiện hoạt tính của enzyme để cho phép đo lường.
b. Xét nghiệm trực tiếp quang phổ
Các xét nghiệm sử dụng mẫu dò như 4-aminoantipyrine hoặc Amplex® Red (xem ở trên)
được sử dụng rất rộng rãi; tuy nhiên, chúng được kết hợp với horseradish peroxidase (HRP)
mà hoạt động của chúng thường bị ảnh hưởng bởi các chất nền MAO như catecholamine
hoặc bởi các hợp chất được thử nghiệm làm chất ức chế enzym đích. Theo đó, có một số xét
nghiệm trực tiếp sử dụng cơ chất MAO như kynuramine [36] hoặc benzyla-mine [37] cũng
như cơ chất amin bậc ba MAO allyl amin 1-metyl-4-(1-metyl-1 H-pyrrol -2-yl)- 1,2,3,6-
tetrahydropyridin (MMTP), sản phẩm của nó có thể được phát hiện bằng đo quang phổ. Điều
thú vị là chức năng của MMTP như một chất nền MAO đã được báo cáo bởi các nghiên cứu
về thuốc gây hội chứng parkinson 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tet-rahydropyridin (MPTP) và
hoạt tính sinh học của nó bởi MAO B [38]. Ban đầu, MPTP được mô tả là có liên quan đến
cơ chế oxi hóa khử liên quan đến các chất chuyển hóa thúc đẩy tổn thương nghiêm trọng đối
với các tế bào thần kinh dopaminergic của sub-stantia nigra [39, 40]. Những nghiên cứu này
đã được chứng minh là hữu ích để tiết lộ rõ hơn về các cơ chế phản ứng liên quan đến MAO.
Nó cho thấy MMTP là một công cụ có giá trị để theo dõi hoạt động của enzyme.
Xét nghiệm quang phổ Kynuramine
Kynuramine có thể được chuyển đổi thành aldehyde tương ứng của nó khi có mặt MAO A
hoặc MAO B. Sự hình thành sản phẩm cuối cùng (4-hydroxyquinoline) có thể được theo dõi
bằng quang phổ ở bước sóng 316 nm (ε316 = 12.000 M-1 cm-1) sử dụng máy quang phổ
Hình 8. Đây là một phương pháp thay thế tốt khi có mặt các hợp chất cản trở HRP. Tuy
nhiên, nó có thể không phù hợp với các chất ức chế hấp thụ tia cực tím vì chúng dẫn đến độ
hấp thụ cao và đầu dò bão hòa. Ngoài ra, quá trình oxy hóa kynuramine cũng có thể được
theo dõi bằng phương pháp đo huỳnh quang vì sản phẩm cuối cùng 4-hydroxyquinoline có
bước sóng kích thích và phát xạ lần lượt là 320 nm và 380 nm trong môi trường kiềm (phải
thực hiện đường cong hiệu chuẩn của 4-hydroxyquinoline).

Hình 1. Kynuramine chuyển đổi thành aldehyde tương ứng của nó, 4-hydroxyquinoline, với sự có mặt
của MAO.

Xét nghiệm quang phổ Benzylamine

Benzylamine dễ bị oxy hóa bởi MAO B nên nó là chất nền phù hợp hơn kynuramine để đo
hoạt tính của isozyme này. Sự biến đổi của benzyla-mine thành benzaldehyde có thể được
quan sát bằng quang phổ ở bước sóng 250 nm (ε250 = 12.800 M-1 cm-1) Hình 9.

Hình 2. MAO B oxy hóa benzylamine thành aldehyde tương ứng của nó, benzaldehyde. Phản ứng có
thể được theo dõi bằng quang phổ ở bước sóng 250 nm

Xét nghiệm trực tiếp MMTP

Một xét nghiệm trực tiếp thay thế để theo dõi hoạt động của enzyme dựa vào một cơ chất
khác của MAO, MMTP. Nó rất thuận tiện vì nó có thể được thực hiện ở phần nhìn thấy được
của quang phổ (nghĩa là ít nhiễu hơn) và nó cũng nhạy như xét nghiệm đo quang phổ HRP.
Tuy nhiên, MMTP không có sẵn trên thị trường và phải được tổng hợp trong nơi kín (in-
house) [38]. Họ các hợp chất này tuân theo một cơ chế hóa học bao gồm sự chuyển một
electron ban đầu từ nitơ của MMTP sang flavin bị oxy hóa, tạo ra gốc trung gian 2. Gốc
trung gian này trải qua quá trình oxy hóa một electron thứ hai để tạo ra chất chuyển hóa
iminium 3 và flavin khử FADH2 Hình 10. Hiệu ứng đồng vị deuterium sơ cấp đã được báo
cáo đối với việc chuyển đổi MMTP thành MMTP+ [38]. Phản ứng có thể được theo dõi bằng
quang phổ ở bước sóng 420 nm (ε420 = 24.000 M-1 cm-1).

Figure 3. Cơ chế sinh hóa được đề xuất cho quá trình oxy hóa MMTP được xúc tác bởi
MAO B

c. xét nghiệm phóng xạ

Hầu hết các phương pháp đo lường MAO liên tục có thể đạt được thông lượng cao, giống
như phương pháp sử dụng Amplex Red, được kết hợp thông qua HRP. Thật không may, các
thử nghiệm như vậy không tương thích với sự hiện diện của các phối tử có thế oxy hóa khử
thấp có thể cạnh tranh với tư cách là chất cho hydro trong phản ứng peroxidase [32, 41], dẫn
đến việc tạo ra các nhóm không màu. Các phối tử như vậy bao gồm các cơ chất:
- MAO noradrenaline
- Erotonin (5-HT)
- Dopamine
trong khi phenelzine, và có thể là các hydrazine khác, dường như không đóng góp vào quá
trình tạo fluorophore trong các thử nghiệm có chứa Amplex Red [42]. Ngoài ra, các phối tử
có thế oxy hóa khử thấp có thể làm giảm trực tiếp chất fluorophore hoặc chất mang màu
được tạo ra thông qua quá trình oxy hóa qua trung gian HRP, gây ra sự mất cân bằng hóa học
giữa sự hình thành H2O2 và chất fluorophore/sự tạo ra chất mang màu. Sự hiện diện của
catalase trong nhiều chế phẩm mô thô càng làm phức tạp thêm việc thiết kế và giải thích các
điều kiện được kết hợp với HRP. Vì những lý do này và những lý do khác, đôi khi cần phải
thử nghiệm hoạt động MAO bằng một phương pháp thay thế và quy trình hóa phóng xạ
không liên tục được cho là lựa chọn nhạy cảm nhất hiện có.
MAO từ nguồn mong muốn được ủ với chất nền amin, một phần trong số đó chứa 14C hoặc
3H nằm trong phân tử sao cho đồng vị phóng xạ sẽ được giữ lại trong sản phẩm imine (và
aldehyde). Sau khi một phần nhỏ amin bị oxy hóa, phản ứng dừng lại và sản phẩm aldehyde
được tách ra khỏi cơ chất amin. Điều này thường đạt được thường xuyên nhất thông qua quá
trình axit hóa hỗn hợp xét nghiệm để proton hóa amin chưa phản ứng, sau đó chiết các sản
phẩm không tích điện vào dung môi hữu cơ.
Độ phóng xạ liên quan đến các sản phẩm aldehyde (và có thể là rượu và/hoặc axit) sau đó
được đo bằng máy đếm nhấp nháy và lượng sản phẩm tạo thành được tính toán. Nếu các điều
kiện thí nghiệm được lựa chọn cẩn thận sao cho có thể giả định một cách hợp lý rằng phản
ứng đã diễn ra (giả) tuyến tính trong suốt thời gian ủ, thì việc tính toán sản phẩm được tạo
thành trên một đơn vị thời gian thể hiện một xấp xỉ hợp lý của tốc độ phản ứng ban đầu, v,
trong khảo nghiệm đó. Phương pháp này có độ nhạy cao và có ưu điểm là nó có thể được sử
dụng với các nguồn enzyme, chẳng hạn như các chất đồng nhất của mô, có thể khó đánh giá
bằng máy đo quang phổ.
2. Tương tác phối tử và ức chế MAO-B
a. Quang phổ
Các monoamine oxidase chứa FAD (MAO A và MAO B; E.C. 1.4.3.4), được tìm thấy trên
màng ngoài của ty thể, xúc tác quá trình oxy hóa của nhiều loại amin. Thật thú vị, trong
MAO, sự gần gũi của các phối tử với flavin, được chôn sâu trong vị trí hoạt động, gây ra
những thay đổi nhỏ trong phổ FAD có thể được sử dụng để theo dõi sự gắn kết của chất ức
chế [43]. MAO oxy hóa amin bằng cách chuyển hydrua, kết quả lại là quá trình khử hai
electron của đồng sáng lập FAD tạo ra dạng khử FADH− sau đó được oxy hóa lại bằng oxy
phân tử. Các dung dịch MAO bị oxy hóa có màu vàng với cực đại hấp thụ ở 456 nm, được
tẩy trắng bằng cách trộn với chất nền khi không có oxy và được phục hồi bằng cách bổ sung
oxy, chất nền thứ hai. Khi bị khử về mặt hóa học, một số semiquinone anion đã khử một
electron được hình thành, chất này có bước sóng hấp thụ cực đại ở 412 nm.
Có ba loại thí nghiệm kiểm tra quang phổ của MAO:
- Loại thứ nhất ghi phổ cân bằng để kiểm tra tương tác phối tử với MAO [43, 44].
- Loại thứ hai ghi lại phổ cân bằng để kiểm tra thế oxy hóa khử đối với sự khử một và
hai electron của MAO [38, 45].
- Ở loại thứ ba, quang phổ động học được sử dụng để kiểm tra cơ chế enzyme [46-49].
b. Kỹ thuật liên kết phóng xạ Receptor thông thường
Thuật ngữ liên kết phối tử phóng xạ thường đề cập đến một kỹ thuật dược lý trong đó các đặc
tính của phối tử thụ thể thuận nghịch - thường (receptor ligands – usually), mặc dù không
phải lúc nào cũng là chất đối kháng - được khai thác để thu được ái lực liên kết và hằng số
tốc độ, thông tin liên quan đến vị trí vị trí liên kết, cơ chế liên kết, và/hoặc (thay đổi) mật độ
thụ thể trong các mô quan tâm để đáp ứng với bệnh lý hoặc điều trị bằng phương pháp trị
liệu. Nó phổ biến đối với tất cả các phương pháp thử nghiệm liên kết phối tử phóng xạ là ủ
trong dung dịch đệm chứa phối tử phóng xạ liên kết với ái lực cao với vị trí đích trên protein
quan tâm (được gọi là liên kết đặc hiệu), ngoài ra còn có ái lực thấp hơn nhiều so ái lực với
các thành phần mô khác có mặt (được gọi là liên kết không đặc hiệu). Tổng số liên kết đặc
hiệu với các vị trí đích và liên kết không đặc hiệu với các thành phần mô khác đo theo cách
này được định nghĩa là tổng giá trị liên kết cho hỗn hợp cân bằng của protein đích và phối tử
phóng xạ, và tổng giá trị liên kết này sẽ thu được trên ủ một protein mục tiêu với một phối tử
phóng xạ trong trường hợp không có bất kỳ phối tử nào khác.
Sự tham gia của liên kết không đặc hiệu được xác định bằng cách thiết lập các quá trình ủ
song song. Quá trình đó có nồng độ bão hòa của phối tử dịch chuyển cạnh tranh, không được
gắn nhãn lúc đưa vào để ngăn chặn liên kết cụ thể của phối tử phóng xạ với các vị trí quan
tâm đích nhưng không ảnh hưởng đến liên kết không đặc hiệu có ái lực thấp với các vị trí
protein và lipid khác thường có mặt.
Nếu phối tử phóng xạ được sử dụng liên kết với ái lực cao với nhiều hơn một vị trí trong
phần đồng nhất của mô hoặc phần ty thể (ví dụ: phối tử phóng xạ liên kết với vị trí hoạt động
của cả hai dạng đồng phân MAO), thì có thể cần phải bao gồm một hợp chất ngăn chặn liên
kết của phối tử phóng xạ với (các) vị trí được/không được quan tâm. Phối tử chặn này sẽ
được đưa vào tất cả các ống xét nghiệm. Ví dụ, việc định lượng khả năng gắn kết với vị trí
hoạt động của MAO B bằng phối tử phóng xạ cũng gắn kết với MAO A có thể được tạo điều
kiện thuận lợi bằng cách ủ sơ bộ chất đồng nhất mô với chất ức chế MAO A không thể đảo
ngược clorgyline [50], hoặc bằng cách đưa vào nồng độ bão hòa của chất có thể đảo ngược.
MAO Một chất ức chế moclobemide trong ống nghiệm [51].
Sau khi tách thành phần mô chứa protein đích khỏi phối tử phóng xạ không liên kết theo cách
giảm thiểu sự mất phối tử phóng xạ liên kết khỏi protein đích, phép đo hoạt độ phóng xạ liên
kết với thành phần mô khi không có và có mặt phối tử chuyển vị cung cấp các giá trị tương
ứng cho tổng và liên kết không đặc hiệu của phối tử phóng xạ với mẫu sinh học. Phép trừ
liên kết không đặc hiệu khỏi tổng liên kết tạo ra một giá trị cho liên kết cụ thể của phối tử
phóng xạ với protein đích, mà thường có mối quan hệ hyperbol với nồng độ phối tử.
Mối quan hệ này được mô tả một cách toán học bằng phương trình Hill-Langmuir bốn tham
số Eq.1 và theo phiên bản ba tham số đơn giản hóa của phương trình (trong đó giả định rằng
nH = 1) được điều chỉnh cho phương trình cạnh tranh Eq.2.

Eq. 1

Eq. 2

Trong các phương trình này,

- Bmax đề cập đến tổng số thụ thể có trong xét nghiệm
- b là số lượng thụ thể bị phối tử chiếm giữ ở nồng độ [L] sau khi đạt đến trạng thái cân
bằng
- KD là hằng số phân ly cho tương tác thuận nghịch giữa thụ thể và phối tử (cung cấp
một giá trị bằng số cho ái lực liên kết)
- nH là hệ số Hill
- [I] và Ki lần lượt là nồng độ và hằng số phân ly đối với phối tử cạnh tranh thứ hai, [I].
Về mặt thực nghiệm, các biến độc lập trong xét nghiệm liên kết phối tử phóng xạ là [L] và [I]
và biến phụ thuộc là b. Các giá trị Bmax, KD và Ki, cũng như hệ số Hill cho tính hợp tác của
ràng buộc, có thể thu được từ các đồ thị thích hợp.
Đánh dấu MAO bằng chất ức chế không thể đảo ngược propargylamine, [3H]pargyline, đã
được sử dụng để định lượng các vị trí hoạt động của enzyme trong mô của chuột và người
[52], mặc dù có thể cần thời gian ủ dài nếu nồng độ enzyme không được đánh giá thấp [53].
Tương tự, các phối tử thuận nghịch như [3H]MPTP [54], [3H]isatin [55] và [3H] lazabemide
[56] đã được sử dụng trong các nghiên cứu chụp ảnh tự động.
c. Kỹ thuật sắc ký
Các xét nghiệm truyền thống đo các sản phẩm khử amin bằng cách phát hiện độ hấp thụ,
huỳnh quang hoặc phát quang trực tiếp. Các xét nghiệm khác đo lượng hydro peroxide
(H2O2) được tạo ra trong phản ứng oxy hóa các chất nền amin bằng cách sử dụng các
enzyme peroxidase. Những phương pháp này nhanh chóng và có thể xử lý nhiều mẫu mang
lại kết quả chấp nhận được. Tuy nhiên, những kết quả này độ chọn lọc và độ đặc hiệu thu
được với các xét nghiệm đó bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất bao gồm các chất ức
chế riêng cản trở phép đo dẫn đến kết quả kém. Ngoài ra, các sản phẩm của MAO như H2O2
 không đặc trưng cho MAO và có thể được tạo ra từ các nguồn khác. Những hạn chế này có
thể đặc biệt liên quan nếu làm việc với các chất ức chế từ các hỗn hợp phức tạp như các sản
phẩm tự nhiên hoặc chiết xuất sinh học. Có thể tránh được những vấn đề này bằng cách sử
dụng các xét nghiệm MAO dựa trên phân tích các sản phẩm khử amin MAO bằng các
phương pháp sắc ký như HPLC-DAD và HPLC-MS [57-59]. Các phương pháp sắc ký có thể
đạt được độ chọn lọc, độ đặc hiệu và độ chính xác cao. Đồng thời, phân tích sắc ký có thể
cho phép sàng lọc các chất chuyển hóa của MAO cùng với phân tích các chất ức chế và kết
quả của chúng [58, 59]. Hơn nữa, những xét nghiệm đó có thể được điều chỉnh để sàng lọc
thông lượng cao trong nghiên cứu dược phẩm [60]. Mặc dù các phương pháp HPLC tốn
nhiều thời gian, nhưng chúng có nhiều ưu điểm hơn so với các xét nghiệm khác do phân tách
và phân tích chọn lọc các chất nền, sản phẩm oxy hóa, chất ức chế và các chất khác có thể
cản trở việc xác định trực tiếp bằng độ hấp thụ hoặc huỳnh quang [61]. Về vấn đề này, người
ta đã chứng minh rằng một số chất chống oxy hóa can thiệp vào phép đo H2O2 trong xét
nghiệm MAO dẫn đến sự ức chế sai có thể được giải quyết bằng HPLC [61].
Xét nghiệm MAO dựa trên phân tích HPLC-DAD và MS về các sản phẩm oxy hóa như 4-
hydroxyquinoline từ quá trình khử amin kynuramine và cation pyridinium từ quá trình oxy
hóa chất độc thần kinh MPTP [62, 63]. Các xét nghiệm HPLC đại diện cho một giải pháp
thay thế thuận tiện để nghiên cứu sự ức chế MAO trong trường hợp không có chất cản trở với
độ chọn lọc cao và độ tin cậy tốt vì chúng dựa trên sự phân tách và phân tích các sản phẩm
MAO [61]. Ngoài ra, phương pháp sắc ký cũng có thể được kết hợp với xét nghiệm MAO cổ
điển để xác định H2O2 bằng cách ghép với peroxidase để thu được thông tin bổ sung [62].
6. Kế hoạch triển khai

STT Nội dung, công việc Sản phẩm cần Thời gian Người phụ trách
chủ yếu đạt (bắt đầu – (tên và số ngày làm việc)
(các mốc đánh giá kết thúc)
chủ yếu)

1 Tổng hợp tài liệu Chuẩn bị tài liệu

tham khảo liên quan

2 Xây dựng các mô Mô hình dự đoán

hình in silico (bao
gồm mô hình 3D-
pharmacophore, 2D-
QSAR và mô hình
lắp ghép phân tử)

3 Thu thập cơ sở dữ Cơ sở dữ liệu về

liệu cấu trúc phân tử cấu trúc hóa học
từ các thư viện hóa
học khác nhau

4 Sàng lọc ảo cơ sở dữ Kết quả sàng lọc

liệu hóa học thông
qua mô hình in silico
để xác định các chất
 ức chế MAO-B tiềm
năng ban đầu

5 Mô phỏng động lực Kết quả MD và

học phân tử trên các năng lượng tự do
chất ức chế hoạt
động mạnh nhất từ
kết quả sàng lọc ảo
với MAO-B

6 Tái tổ hợp enzyme Enzyme MAO-B

MAO-B của con người tái tổ hợp
người

7 Xét nghiệm sinh lý kết quả xét

và trong ống nghiệm nghiệm sinh học
xác định các hoạt
động ức chế MAO-B
và MAO-A của các
cấu trúc được tổng
hợp.
Xác định hằng số ức
chế IC50 của chất
tiềm năng

8 Viết báo cáo và tài Báo cáo và bài

liệu nghiên cứu. báo nghiên cứu
Báo cáo nghiệm thu

7. Dự kiến kết quả đề tài

7.1. Dự kiến kết quả nghiên cứu
- Mô hình 3D-pharmacophore, mô hình 2D-QSAR, mô hình lắp ghép phân tử
- trong các chất tiềm năng silico, đã vượt qua thành công 3D-pharmacophore, 2D-
QSAR và lắp ghép phân tử.
- Sự tương tác giữa các chất tiềm tàng và protein thông qua mô phỏng động học phân
tử. Các giá trị năng lượng tự do ràng buộc được tính toán giữa hit và protein.
- Enzyme MAO-B người tái tổ hợp có hoạt tính sinh học.
- Giá trị hằng số ức chế.
7.2. Dự kiến công trình công bố

Số Kết quả công bố Số lượng Ghi chú

1
 2

3
7.3. Dự kiến kết quả đào tạo

Số Kết quả đào tạo Số lượng Cơ sở đào tạo

1 Thạc sỹ Đại học Y Dược thành phố Hồ

Chí Minh

2 Tiến sỹ