(Nano) Th. Dung+Tr - Nghĩa

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BỘ MÔN HÓA
----------
LÊ THÙY DUNG
LÊ TRỌNG NGHĨA
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

NIOSOME METFORMIN
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC
Cần Thơ, 2015

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BỘ MÔN HÓA
----------
LÊ THÙY DUNG
LÊ TRỌNG NGHĨA
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

NIOSOME METFORMIN
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CỬ NHÂN HÓA DƢỢC
CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

TS. LÊ THANH PHƢỚC
Cần Thơ, 2015

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn tận tình của giảng
viên hướng dẫn – Thầy Lê Thanh Phước, bộ môn Hóa học, khoa Khoa học Tự
nhiên, Đại học Cần Thơ. Trong suốt thời gian thực hiện luận văn. Mặt dù gặp
phải rất nhiều khó khăn về tài chính, kiến thức và kinh nghiệm, Thầy đã luôn
nhắc nhở, đôn đốc và hỗ trợ về mọi mặt cho chúng em, giúp chúng em giải
quyết khó khăn và đạt được mục tiêu nghiên cứu khoa học của mình. Chúng
em chân thành cảm ơn Thầy.
Chúng em đặc biệt cảm ơn sự giúp đỡ, hỗ trợ nhiệt tình về vật chất và
tinh thần của cố vấn học tập - Cô Tôn Nữ Liên Hương, bộ môn Hóa học, khoa
Khoa học Tự nhiên.
Xin trân trọng cảm ơn Cô Phạm Thị Tố Liên và Cô Võ Thị Mỹ Hương,
bộ môn Hóa Dược, khoa Dược, Đại học Y Dược Cần Thơ đã hỗ trợ hóa chất
thí nghiệm và kiến thức về dược học cần thiết trong quá trình thực hiện luận
văn.
Chúng em cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong bộ môn Hóa
học, bộ môn Sinh học, khoa Khoa học Tự nhiên; bộ môn Công nghệ Hóa học,
khoa Công Nghệ cũng như các Thầy, Cô đã giảng dạy, ban chủ nhiệm khoa,
cán bộ phòng thí nghiệm đã luôn giúp đỡ chúng em trong 4 năm học qua. Sự
hỗ trợ, giúp đỡ của quý Thầy/Cô, Anh/Chị đã giúp chúng em hoàn thành luận
văn tốt nghiệp và chuẩn bị cho tương lai.
Cuối cùng, xin chân thành cảm ơn sự động viên của gia đình và bạn bè
đã tạo điều kiện thuận lợi để chúng em hoàn thành luận văn tốt nhất.
Xin chân thành cảm ơn!
Sinh viên thực hiện
Lê Thùy Dung, Lê Trọng Nghĩa
i
LỜI CAM KẾT
Chúng tôi xin cam kết luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết
quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho
bất cứ luận văn cùng cấp nào khác.
Ký tên
Lê Thùy Dung Lê Trọng Nghĩa

Ngày: …………..
ii
Trƣờng Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
Bộ Môn Hóa Học ------------
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN
1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Thanh Phƣớc
2. Đề tài: NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NIOSOME METFORMIN

3. Sinh viên thực hiện: Lê Thùy Dung MSSV: B1203429
Lê Trọng Nghĩa MSSV: B1203475
Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ hƣớng dẫn
TS. Lê Thanh Phƣớc
iii
Trƣờng Đại Học Cần Thơ Cộng Hòa Xã Hội Chủ Nghĩa Việt Nam
Khoa Khoa Học Tự Nhiên Độc Lập - Tự Do - Hạnh Phúc
Bộ Môn Hóa Học ------------
NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN
1. Cán bộ phản biện: ……………………………………………………………
2. Đề tài: NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NIOSOME METFORMIN
3. Sinh viên thực hiện: Lê Thùy Dung MSSV: B1203429

Lê Trọng Nghĩa MSSV: B1203475
Lớp: Hóa Dƣợc – Khóa: 38
4. Nội dung nhận xét:

a) Nhận xét về hình thức của LVTN:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
b) Nhận xét về nội dung của LVTN (đề nghị ghi chi tiết và đầy đủ):
 Đánh giá nội dung thực hiện của đề tài:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
 Những vấn đề còn hạn chế:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
c) Nhận xét đối với sinh viên tham gia thực hiện đề tài (ghi rõ từng nội dung
chính do sinh viên nào chịu trách nhiệm thực hiện nếu có):
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
d) Kết luận, đề nghị và điểm:
..............................................................................................................................
..............................................................................................................................
Cần Thơ, ngày… tháng… năm 2015
Cán bộ phản biện
iv
TÓM TẮT
Metformin là thuốc trị đái tháo đường sử dụng điều trị bước đầu dành
cho bệnh nhân đái tháo đường type 2 theo phác đồ điều trị của Hiệp hội Đái
tháo đường Hoa Kỳ. Tuy nhiên, thuốc thường hấp thu nhanh chóng, thời gian
bán thải ngắn. Vì vậy, nghiên cứu được thực hiện nhằm góp phần tìm kiếm
dạng thuốc mới cho metformin, giúp kéo dài thời gian tồn tại của thuốc trong
huyết tương, tăng hiệu quả điều trị và mang lại hiệu quả kinh tế. Nghiên cứu
thực hiện bào chế hệ phân tán niosome metformin bằng phương pháp hydrat
hóa film mỏng, tỷ lệ chất hoạt động bề mặt không ion/cholesterol là 1:1
(mol/mol). Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của những loại chất hoạt động bề
mặt khác nhau (tween 80, span 80, span 60), thời gian siêu âm, phương pháp
đưa metformin vào niosome đến kích thước tiểu phân (hạt) và hiệu suất
niosome hóa. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi siêu âm hệ trong 30 phút cho
kích thước hạt nhỏ hơn, hiệu quả đưa dược chất vào hệ tốt hơn khi siêu âm 15
phút. Đối với hai phương pháp đưa metformin vào niosome thì phương pháp
chủ động tạo ra các hạt có kích thước lớn hơn và hiệu suất niosome hóa tốt
hơn phương pháp thụ động. Kích thước trung bình các tiểu phân thay đổi từ
0,6 µm (span 60) đến 9,8 µm (tween 80+span 60), hiệu suất niosome hóa cao
nhất với phương pháp bị động là 19,9% (tween 80) và với phương pháp chủ
động là 36,3% (tween 80+span 80). Hầu hết các công thức tạo ra đều giữ trạng
thái nhũ ổn định hơn 30 ngày bảo quản.
v
ABSTRACT
Metformin is a drug that is recommended to treat type 2 diabetes for first
line by ADA. However, it‘s short plasma half-life and rapid administration.
So, this study was performed to find a new formulation for metformin, to
maintain the steady state of blood‘s metformin concentration, to increase
treatment efficiency and bring economical by metformin loaded in niosome.
Different nonionic surfactant (tween 80, span 80, span 60) and cholesterol
(1:1, mol/mol) were used for the preparation of metformin-loaded niosomes
by the thin film hydration method. The study survey influence of different
nonionic surfactant, sonication time, the method loaded metformin into
niosome to mean particle size and encapsulation performance. The result
showed that when the sonication time is 30 minutes has mean particle size
smaller and encapsulation efficiency better than 15 minutes. With two the
loaded method, active method create particles have mean size bigger and
encapsulation performance better than passive method. The mean particles
size ranged from 0,6 µm (span 60) to 9,8 µm (tween 80+span 60). The higgest
encapsulation performance is 19,9% (tween 80) and 36,3% (tween 80+span
80) with the active and passive method, respectively. Almost formulation were
stable over 30 days for preservent.
Key words: Niosome metformin, sustained release, the thin film hydration,
type 2 diabetes.
vi
MỤC LỤC
TÓM TẮT......................................................................................................... v
ABSTRACT..................................................................................................... vi
DANH SÁCH BẢNG ....................................................................................... x
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................... xi
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... xiii
CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU .............................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................... 1
1.3 Nội dung nghiên cứu ................................................................................... 2
1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước.................................................. 2
1.4.1 Các nghiên cứu ngoài nước ...................................................................... 2
1.4.2 Các nghiên cứu trong nước:...................................................................... 4
CHƢƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ......................................................... 4
2.1 Metformin hydrochloride ............................................................................ 4
2.1.1 Đại cương về metformin hydrochloride ................................................... 4
2.1.2 Một số chế phẩm trên thị trường .............................................................. 9
2.2 Cholesterol ................................................................................................... 9
2.2.1 Đại cương về cholesterol .......................................................................... 9
2.2.2 Định tính cholesterol............................................................................... 12
2.3 Đại cương về niosome ............................................................................... 17
2.3.1 Khái niệm và phân loại ........................................................................... 17
2.3.2 Ưu, nhược điểm ...................................................................................... 18
2.3.3 Thành phần màng niosome ..................................................................... 18
2.3.4 Kỹ thuật bào chế ..................................................................................... 24
2.3.5 Phương pháp đánh giá và phân tích ........................................................ 30
2.3.6 Một số ứng dụng trong dược phẩm, mỹ phẩm ....................................... 34
vii
CHƢƠNG 3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 38
3.1 Địa điểm, thời gian, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu.............. 38
3.1.1 Địa điểm và thời gian ............................................................................. 38
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu ...... 38
3.2 Quá trình nghiên cứu ................................................................................. 40
3.2.1 Tách cholesterol từ mô não heo .............................................................. 40
3.2.2 Đánh giá metformin sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 44
3.2.3 Bào chế niosome bằng kỹ thuật hydrat hóa film mỏng .......................... 44
3.2.4 Đánh giá niosome metformin sau bào chế.............................................. 50
3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................... 52
CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................. 53
4.1 Tách chiết cholesterol từ mô não heo ........................................................ 53
4.1.1 Hiệu suất tách chiết cholesterol .............................................................. 53
4.1.2 Định tính ................................................................................................. 54
4.2 Đánh giá metformin sử dụng trong nghiên cứu ......................................... 57
4.2.1 Độ tan...................................................................................................... 57
4.2.2 Nhiệt độ nóng chảy ................................................................................. 57
4.2.3 Phổ hồng ngoại FT-IR ............................................................................ 57
4.3 Đánh giá niosome metformin sau bào chế................................................. 58
4.3.1 Xác định hình dạng tiểu phân niosome bằng kính hiển vi ..................... 58
4.3.2 Xác định kích thước và phân bố kích thước của các tiểu phân niosome 59
4.3.3 Xây dựng phương pháp định lượng metformin bằng đo quang phổ hấp
thụ UV-Vis....................................................................................................... 62
4.3.4 Xác định hiệu suất niosome hóa metformin ........................................... 64
4.3.5 Đánh giá sơ bộ độ bền của niosome metformin ..................................... 68
4.4 Thảo luận ................................................................................................... 69
4.4.1 Về tách chiết cholesterol ......................................................................... 69
4.4.2 Về quy trình bào chế ............................................................................... 70
4.4.3 Về chất HĐBM không ion được sử dụng ............................................... 71
viii
CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................ 73
5.1 Kết luận ...................................................................................................... 73
5.2 Kiến nghị ................................................................................................... 73
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 74
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 81
ix
DANH SÁCH BẢNG
Bảng 2.1 Một số chế phẩm chứa metformin trên thị trường ............................. 9
Bảng 2.2. Hàm lượng cholesterol trong một số thực phẩm hàng ngày ........... 12
Bảng 2.3 Ảnh hưởng của HLB đến niosome ................................................... 21
Bảng 2.4 Các chất HĐBM không ion sử dụng trong bào chế niosome ........... 23
Bảng 2.5 Một số ứng dụng của niosome đã được nghiên cứu......................... 36
Bảng 3.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu ...................................... 38
Bảng 3.2 Thành phần các công thức niosome ................................................. 45
Bảng 4.1 Hiệu suất chiết tách cholesterol........................................................ 53
Bảng 4.2 Nhiệt độ nóng chảy của cholesterol ................................................. 55
Bảng 4.3 Kết quả giải phổ FT-IR của cholesterol tách được .......................... 56
Bảng 4.4 Nhiệt độ nóng chảy của metformin hydrochloride .......................... 57
Bảng 4.5 Kết quả giải phổ FT-IR của metformin hydrochloride .................... 58
Bảng 4.6. Kích thước tiểu phân niosome của các công thức ........................... 59
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến kích thước hạt niosome ....... 60
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của phương pháp đưa metformin vào niosome đến kích
thước hạt niosome ............................................................................................ 61
Bảng 4.9 Kết quả đo mật độ quang của các dung dịch metformin chuẩn ở bước
sóng 232 nm ..................................................................................................... 63
Bảng 4.10 Hiệu suất niosome hóa metformin ................................................. 64
Bảng 4.11 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất niosome hóa ....... 65
Bảng 4.12 Ảnh hưởng của phương pháp đưa metformin vào niosome ........... 67
Bảng 4.13 Tác động của việc tăng thời gian siêu âm lên kích thước niosome và
hiệu suất niosome hóa ...................................................................................... 70
Bảng 4.14 Tác động của phương pháp chủ động so với bị đông lên kích thước
niosome và hiệu suất niosome hóa .................................................................. 71
Bảng 4.15 Ảnh hưởng của chất HĐBM lên kích thước hạt ............................ 72
x
DANH SÁCH HÌNH
Hình 2.1 Công thức cấu tạo của metformin hydrochloride ............................... 4
Hình 2.2 Phương trình tổng hợp metformin hydrochloride............................... 5
Hình 2.3 Công thức cấu tạo của cholesterol .................................................... 10
Hình 2.4 Sơ đồ chuyển hóa của cholesterol .................................................... 11
Hình 2.5 Sắc ký lớp mỏng của hỗn hợp chuẩn. ............................................... 14
Hình 2.6 Sự tách và xác định cholesterol bằng việc giải ly lần lượt với hệ dung
môi A và B. ...................................................................................................... 14
Hình 2.7 Cơ chế đề nghị cho phản ứng Leibermann-Burchard ....................... 16
Hình 2.8 Phân loại niosome ............................................................................. 17
Hình 2.9 Sự liên kết giữa cholesterol và span 60 trong niosome .................... 19
Hình 2.10 Cấu trúc chất HĐBM ...................................................................... 19
Hình 2.11 Mối liên quan giữa giá trị CPP và hình dạng niosome ................... 22
Hình 2.12 Thiết bị ép qua màng qui mô phòng thí nghiệm (LipexTM) ............ 28
Hình 2.13 Thiết bị ép cầm tay với màng lọc polycarbonate ............................ 29
Hình 2.14 Bể siêu âm và que siêu âm dùng trong phòng thí nghiệm .............. 30
Hình 2.15 Sơ đồ hệ thống nạp mẫu và xác định kích thước Microtrac ba chùm
tia ..................................................................................................................... 31
Hình 2.16 Hệ thống thẩm tích quy mô phòng thí nghiệm ............................... 33
Hình 2.17 Ứng dụng của niosome trong mỹ phẩm ......................................... 37
Hình 3.1 Máy quang phổ JENWAY 6800UV/Vis .......................................... 39
Hình 3.2 Hệ thống xác định kích thước hạt bằng laser Microtrac S3500 ....... 39
Hình 3.3 Máy quang phổ hồng ngoại Thermo NICOLET 6700 FT-IR .......... 39
Hình 3.4 Túi thẩm tích MWCO 14.000 daltons .............................................. 39
Hình 3.5 Kính hiển vi Olympus CH20 ............................................................ 39
Hình 3.6 Máy li tâm lạnh Mikro 220R ............................................................ 39
Hình 3.7 Máy đo điểm nóng chảy Bibby Stuart SMP3 ................................... 39
Hình 3.8 Quy trình chiết tách cholesterol từ mô não heo ................................ 41
Hình 3.9 Khuôn và thiết bị ép mẫu chuyên dùng cho FT-IR .......................... 43
xi
Hình 3.10 Sơ đồ bào chế niosome metformin theo phương pháp thụ động .... 46
Hình 3.11 Cô quay chân không loại dung môi ................................................ 47
Hình 3.12 Lớp màng mỏng được hình thành sau khi loại hết dung môi của
công thức 4 và 5 ............................................................................................... 47
Hình 3.13 Điều chỉnh nhiệt độ ổn định ở 70±2oC ........................................... 48
Hình 3.14 Hydrat hóa ở 70±2ºC. ..................................................................... 48
Hình 3.15 Sơ đồ bào chế niosome metformin theo phương pháp chủ động ... 49
Hình 3.16 Quy trình thử nghiệm hiệu suất niosome hóa ................................. 52
Hình 4.1 Tinh thể cholesterol được hình thành trong dung dịch methanol ..... 53
Hình 4.3 Cholesterol sau khi kết tinh lại ......................................................... 54
Hình 4.2 Cholesterol trước khi kết tinh lại ...................................................... 54
Hình 4.4 Kết quả thử nghiệm theo phương pháp Leibermann-Burchard ........ 54
Hình 4.5 Kết quả TLC theo phương pháp Alexander Bilyk. .......................... 55
Hình 4.6 Phổ FT-IR của cholesterol ................................................................ 56
Hình 4.7 Phổ FT-IR của metformin hydrochloride ......................................... 58
Hình 4.8 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến kích thước hạt
niosome ............................................................................................................ 60
Hình 4.9 Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của phương pháp đưa metformin vào
niosome đến kích thước hạt ............................................................................. 62
Hình 4.10 Phổ hấp thu UV/Vis của metformin ở bước sóng 200-400 nm ...... 63
Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ dung dịch metformin
chuẩn và độ hấp thụ ở bước sóng 232 nm ....................................................... 63
Hình 4.12 Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất
niosome hóa ..................................................................................................... 66
Hình 4.13 Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của phương pháp đưa thuốc vào hệ
đến hiệu suất niosome hóa ............................................................................... 67
Hình 4.14 Các công thức A sau 15 ngày bảo quản.......................................... 68
Hình 4.15 Các công thức B sau 15 ngày bảo quản .......................................... 68
Hình 4.16 Công thức B1 sau 20 ngày bảo quản .............................................. 68
Hình 4.17 Các công thức sau 30 ngày bảo quản ............................................. 69
xii
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
CHL Cholesterol
CPP Critical Packing Parameter
DCP Dicetyl Phosphate
DOTAP 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride
ĐTĐ Đái tháo đường
FDA Foods and Drugs Admistration
FT-IR Fourier transform infrared spectroscopy
HDL High Density Lipoprotein
HĐBM Hoạt động bề mặt
HLB Hydrophilic-Lipophilic Balance
IP Indian Pharmacopoeia
LDL Low Density Lipoprotein
PBS Phosphate Buffer Saline
Sp60 Span 60
Sp80 Span 80
T80 Tween 80
TLC Thin Layer Chromatography
xiii
Chương 1. Giới thiệu
CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU
1.1 Đặt vấn đề

Bệnh Đái tháo đường (ĐTĐ) là một bệnh mạn tính vô cùng nguy hiểm,
do nó gây ra tình trạng tăng glucose máu làm tổn thương nhiều hệ thống trong
cơ thể, đặc biệt là mạch máu và hệ thần kinh (Tổ chức Y tế thế giới 2002).
Trong đó, ĐTĐ type 2 là dạng thường gặp, có nhiều biến chứng và khó phát
hiện. Nhưng nếu không điều trị kịp thời, bệnh có thể đe dọa đến tính mạng.
Một trong những thuốc ưu tiên điều trị ĐTĐ type 2 hiện nay là metformin, đặc
biệt với bệnh nhân có thể trạng béo phì[1]. Tuy nhiên, sinh khả dụng đường
uống chỉ đạt khoảng 50%, thời gian bán thải ngắn 1,5-4,5 giờ[2,3]. Vì vậy phải
sử dụng thuốc 2-3 lần/ngày, điều này khiến bệnh nhân khó tuân thủ đồng thời
cũng làm tăng tác dụng phụ của thuốc. Do đó, hiện nay có nhiều nghiên cứu
được thực hiện nhằm tăng sinh khả dụng và kéo dài thời gian phóng thích
metformin từ dạng bào chế, tăng hiệu quả điều trị, hạn chế tác dụng phụ và
giúp bệnh nhân dễ tuân thủ phát đồ điều trị hơn.
Trong sự đa dạng của các hệ mang thuốc có kích thước nano như hạt
nano kim loại, polymeric, micelle, chấm lượng tử, dendrimer, microcapsule,
cell, lipoprotein, liposome,… thì niosome là một trong những hệ mang thuốc
có nhiều ưu điểm trong vận chuyển, phân phối, phóng thích có kiểm soát và
tăng sinh khả dụng của thuốc. Niosome là một hệ mang thuốc có thành phần
chính từ cholesterol và các chất hoạt động bề mặt (HĐBM) không ion. Đây là
hệ mang thuốc có khả năng phân hủy sinh học, không độc, có độ bền tốt và giá
thành rẻ, mang được lượng lớn hoạt chất với một thể tích tương đối nhỏ[4],
giúp tăng sinh khả dụng đường uống cao[5].
Với những ưu điểm của một hệ thống mang thuốc có nhiều tiềm năng,
sự kết hợp của niosome và metformin hứa hẹn sẽ tạo ra một dạng thuốc mới
giúp cải thiện được những hạn chế chính của loại dược chất này. Tuy nhiên
chưa có nhiều nghiên cứu về niosome metformin trên thế giới được thực hiện
và chưa nhận thấy có nghiên cứu nào trong nước. Do đó, đề tài này được thực
hiện nhằm góp phần làm tiền đề để nghiên cứu phát triển dạng thuốc mới cho
metformin.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu

- Bào chế niosome metformin bằng phương pháp hydrat hóa film mỏng,
lựa chọn được thành phần màng thích hợp để tạo được các tiểu phân niosome
có khả năng mang metformin cao.
- Đánh giá được các đặc tính của niosome metformin tạo thành.
1
1.3 Nội dung nghiên cứu

- Tách cholesterol từ mô não heo và xác định hiệu suất tách.
- Đánh giá sơ bộ metformin sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: thử độ
hòa tan, quét phổ tử ngoại và khả kiến (UV-Vis), quang phổ hồng ngoại biến
đổi (FT-IR), xác định nhiệt độ nóng chảy.
- Khảo sát ảnh hưởng của các loại chất HĐBM không ion sử dụng tạo
màng niosome gồm có: tween 80 (T80), span 80 (Sp80), span 60 (Sp60).
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm lên kích thước tiểu phân
niosome và hiệu suất niosome hóa.
- Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp đưa dược chất vào hệ, bao gồm
phương pháp thụ động và chủ động dựa vào sự chênh lệch pH.
- Đánh giá niosome metformin sau bào chế, gồm:
+ Xác định hình dạng tiểu phân niosome bằng kính hiển vi
+ Xác định kích thước và phân bố kích thước tiểu phân niosome
+ Xây dựng phương pháp định lượng metformin bằng phương pháp đo
quang phổ hấp thụ UV-Vis
+ Xác định hiệu suất niosome hóa
1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc

Công thức niosome đầu tiên được nghiên cứu và được cấp bằng sáng chế
bởi L‘Oreal năm 1975[6]. Từ đó đánh dấu sự ra đời và phát triển nghiên cứu về
niosome trên thế giới. Niosome có nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khoa
học, đặc biệt là trong y dược học. Với vai trò là một hệ thống mang thuốc tới
tế bào đích và phóng thích thuốc có điều khiển, niosome đã được nghiên cứu
phát triển và phối hợp với nhiều loại dược chất, giúp khắc phục được những
hạn chế của các loại dược chất này và tăng hiệu quả điều trị. Trong đó, nhiều
nhà khoa học trên thế giới đã phát triển niosome như một hệ thống phóng
thích thuốc kéo dài cho metformin. Các nghiên cứu đã mang lại những kết quả
nhất định góp phần vào việc phát triển thành một dạng thuốc mới cho dược
chất này.
1.4.1 Các nghiên cứu ngoài nƣớc

+ Năm 2012, Nitan Bharti Gupta, Sandeep Loona và M.U.Khan đã tiến
hành bào chế và đánh giá các đặc tính của gel proniosome metformin tạo
thành. Proniosome của metformin hydrochloride được tạo ra bằng phương
pháp tách pha giọt tụ (coacervation phase separation method). Các công thức
proniosome được tạo ra với tỷ lệ khác nhau của Span 60/Span 40, cholesterol
và lecithin. Dựa trên đánh giá về khả năng mang metformin (proniosome hóa),
2
kích thước, hình dạng tiểu phân, điện thế zeta, thử nghiệm phóng thích in vitro
và độ bền của sản phẩm trong những điều kiện bảo quản khác nhau để chọn ra
công thức tối ưu nhất. Kết quả nghiên cứu cho thấy các công thức proniosome
được tạo ra từ span 60 có khả năng mang metformin tốt hơn các công thức từ
span 40. Trong đó công thức có tỷ lệ 9:2:9 của span 60/cholesterol/lecithin cho
hiệu quả mang metformin là tốt nhất (76,8%), giá trị điện thế zeta tốt (-51,9)
và lượng thuốc phóng thích chậm trong 24 giờ (75,9%). Từ kết quả nghiên
cứu cho thấy gel proniosome metformin được xem như một hệ thống phân
phối thuốc có tiềm năng phóng thích metformin kéo dài[7].
+ Anchal Sankhyan và Parvin K Pawar (2013) thực hiện nghiên cứu về
những túi cầu (vesicles) được tạo nên từ các chất HĐBM không ion có mang
metformin, nhằm bào chế một hệ phân phối thuốc mới có tác dụng phóng
thích kéo dài, giúp giảm số lần dùng thuốc trong ngày và giảm tác dụng phụ
của metformin. Các niosome với những chất HĐBM khác nhau được tạo ra
bằng phương pháp hydrat hóa film mỏng (thin film hydration technique) và
được nghiên cứu về khả năng mang thuốc, thử nghiệm phóng thích in vitro,
ảnh chụp TEM (transmission electron microscopy) và độ bền vật lý. Các yếu
tố ảnh hưởng đến kết quả như: nồng độ chất HĐBM, DCP (Dicetyl
phosphate), tỷ lệ chất HĐBM/cholesterol và thể tích hydrat hóa. Nghiên cứu
đã bào chế thành công các tiểu phân niosome có dạng hình cầu và đồng nhất.
Công thức tối ưu nhất được tạo bởi 100 mol/L của chất HĐBM và cholesterol
(tỷ lệ mol của span 60/cholesterol là 1:1), có sự hiện diện của DCP và thể tích
hydrat hóa phù hợp là 15 mL. Công thức này có tỷ lệ mang metformin là
85,5%, kích thước tiểu phân 487,6 nm và lượng thuốc phóng thích trong 8 giờ
chỉ đạt 73,89%[8].
+ Hasan A. A. và các cộng sự (2013) đã nghiên cứu bào chế thành công
hệ niosome mang metformin với thành phần màng niosome là span 40 và
cholesterol. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng kỹ thuật bốc hơi pha đảo (reverse
phase evaporation technique) để tạo ra các tiểu phân niosome có kích thước từ
223,5 đến 384,6 nm. Ngoài ra, nghiên cứu còn khảo sát ảnh hưởng của DCP
và 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane chloride (DOTAP) đến điện
thế bề mặt của các tiểu phân và sự chống kết tụ. Tất cả các công thức đều cho
hiệu suất mang thuốc cao. Sinh khả dụng của hệ niosome metformin được
đánh giá bằng cách xác định lượng metformin và glucose trong huyết tương
của những nhóm chuột Wister khác nhau[9].
3
1.4.2 Các nghiên cứu trong nƣớc:

Hiện chưa có nghiên cứu nào trong nước thực hiện nghiên cứu bào chế
hệ phân tán niosome metformin.
4
Chương 2.Tổng quan tài liệu
CHƢƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Metformin hydrochloride
2.1.1 Đại cƣơng về metformin hydrochloride

Metformin là thuốc duy nhất thuộc nhóm biguanide còn lưu hành trên thị
trường. Đây là một trong hai thuốc trị ĐTĐ dùng đường uống thuộc danh mục
thuốc thiết yếu của Tổ chức Y tế thế giới[10] và là loại thuốc dùng điều trị bước
đầu cho bệnh nhân ĐTĐ type 2, đặc biệt là ở những người thừa cân và béo phì
có chức năng thận bình thường[11,12,13]. Ngoài ra, metformin cũng có hiệu quả
trong điều trị hội chứng buồng trứng đa nang, gan nhiễm mỡ, loạn dưỡng mỡ
ở bệnh nhân HIV[14],…Nhiều bằng chứng cho thấy metformin có thể ngăn
ngừa các bệnh tim mạch[15,16]. Nó giúp giảm LDL (Low Density Lipoprotein)
cholesterol và triglyceride, không gây ra tình trạng tăng cân, thậm chí còn thúc
đẩy giảm cân ở một số trường hợp[17].
2.1.1.1 Tính chất hóa lý[18]

- Danh pháp IUPAC: N,N-dimethylimidodicarbonimidic diamide.
- Tên thuòng: metformin.
- Tên thương mại:
Glucophage.
- Công thức phân tử:
C4H11N5.HCl
- Khối lượng phân tử :165.63
- Độ tan: tan hoàn toàn trong Hình 2.1 Công thức cấu tạo của metformin
nước; không tan trong ether, hydrochloride
chloroform.
2.1.1.2 Tổng hợp

Metformin được tổng hợp lần đầu tiên vào năm 1922 bởi Werner và Bell
tại Ireland cùng với một số dẫn chất khác cũng thuộc nhóm biguanide[19]. Đến
những năm 1950, tiến sĩ Jean Sterne, một bác sĩ lâm sàng người Pháp, tìm ra
hiệu quả của metformin và sử dụng metformin để điều bệnh ĐTĐ bằng đường
uống[20].
Theo mô tả của Werner và Bell, metformin được tổng hợp từ dimethyl
amine và 2-cyanoguanidine (dicyandiamide) theo phương trình ở Hình 2.2.
4
Hình 2.2 Phương trình tổng hợp metformin hydrochloride

Đến năm 1975, metformin có thể được tổng hợp với hiệu suất 96% theo
phương pháp: lượng tương đương dimethyl amine và dicyandiamide được hòa
tan bằng toluene, làm lạnh để tạo dung dịch đậm đặc, thêm từ từ vào hỗn hợp
một lượng đẳng mol HCl. Hỗn hợp bắt đầu tự sôi, metformin hydrochloride sẽ
kết tủa sau khi làm lạnh[21].
2.1.1.3 Chỉ định

Metformin được sử dụng chủ yếu cho bệnh ĐTĐ type 2, nhưng ngày
càng được sử dụng trong hội chứng buồng trứng đa nang[22], bệnh gan nhiễm
mỡ không cồn (non-alcoholic fatty liver disease - NAFLD)[23] và dậy thì
sớm[24], đây là ba căn bệnh khác có liên quan đến khả năng kháng insulin. Tuy
nhiên, lợi ích của metformin trong NAFLD chưa được nghiên cứu rộng rãi và
có thể chỉ là tạm thời mặc dù một số thử nghiệm mù đôi ngẫu nhiên đã cho
thấy khả năng cải thiện đáng kể khi sử dụng metformin nhưng bằng chứng là
vẫn chưa đủ[25, 26, 27].
2.1.1.4 Cơ chế tác động

Metformin là một thuốc chống tăng đường huyết, cải thiện dung nạp
glucose ở bệnh nhân tiểu đường type 2, hạ đường huyết cả trước và sau ăn.
Metformin hoạt động bằng cách ức chế sản xuất glucose ở gan[28], giảm hấp
thu glucose ở ruột và cải thiện độ nhạy insulin bằng cách tăng sự hấp thu và sử
dụng glucose ở ngoại vi. Tuy nhiên cơ chế phân tử của metformin lại chưa
được hiểu rõ hoàn toàn. Cơ chế được dự đoán có thể bao gồm: sự ức chế chuỗi
hô hấp của ti thể, kích hoạt các protein kinase hoạt hóa AMP (AMPK), ức chế
mạnh glucagon cảm ứng adenosine monophosphate vòng (cAMP), kích hoạt
protein kinase A (PKA), ức chế glycerophosphate dehydrogenase, và ảnh
hưởng đến hệ vi sinh vật đường ruột đã được đề xuất như cơ chế tiềm
năng[29,30,31]. Không giống như các sulfonylurea, metformin không gây hạ
đường huyết ở bệnh nhân ĐTĐ type 2 hoặc những người bình thường (trừ
những trường hợp đặc biệt) và không gây tăng insulin.
5
2.1.1.5 Thông tin dƣợc động học của metformin

a) Hấp thu
Metformin được hấp thu chủ yếu ở ruột non[32]. Sinh khả dụng đường
uống là 50-60%. Quá trình hấp thu xảy ra hoàn thành trong vòng 6 giờ. Nồng
độ huyết tương khoảng 1-2 ug/mL trong 1-2 giờ sau khi uống liều 500-1000
mg[33].
b) Phân bố
Metformin liên kết không đáng kể với protein huyết tương, trái ngược
với các thuốc nhóm sulfonylurea khi liên kết đến 90% với protein huyết
tương. Ở liều điều trị lâm sàng, nồng độ metformin trong huyết tương ở trạng
thái ổn định đạt được trong vòng 24 đến 48 giờ và thường ở khoảng nhỏ hơn 1
g/mL. Trong các thử nghiệm lâm sàng đối với viên nén metformin
hydrocloride, nồng độ metformin trong máu tối đa không vượt quá 5 g/mL,
ngay cả ở liều tối đa. Khối lượng phân bố trung bình nằm trong khoảng 63-
276 L/kg[33].Thể tích phân phối (V/F) của metformin sau liều uống duy nhất
của viên nén metformin hydrochloride 850 mg trung bình là 654±358 L.
c) Chuyển hóa
Metformin hầu như không bị chuyển hóa bởi gan, đây là đặc tính chỉ có
ở metformin khi so sánh với các thuốc thuộc nhóm biguanide khác như
phefnormin[34].
d) Thải trừ
Metformin được nhanh chóng loại trừ qua thận. Hơn 80% được bài tiết
dưới dạng không bị biến đổi[33]. Metformin có thời gian bán thải ngắn khoảng
2 giờ[32]. Độ thanh thải thận của metformin là trên 400 mL/phút, cho thấy
metformin được loại bỏ bằng cách lọc cầu thận và bài tiết ở ống thận. Mặc dù
thời gian bán thải của metformin bị kéo dài ở những bệnh nhân bị suy thận,
tuy nhiên việc điều chỉnh liều lượng được cho là không cần thiết [35].
2.1.1.6 Liều lƣợng sử dụng[36]

- Liều điều trị:
+ Dạng phóng thích lập tức: 1000-2550 mg/ngày, 2-3 liều/ngày.
+ Dạng phóng thích kéo dài: 1.000-2.000 mg/lần, tối đa 2500 mg/ngày.
- Liều gây độc tối thiểu chưa được đưa ra chính xác:
+ Người lớn: Uống tối đa 5 g metformin có thể vẫn cho khả năng dung
nạp tốt. Độc tính nặng xảy ra khi uống từ 25 g metformin trở lên.
+ Trẻ em: trẻ khỏe mạnh có thể dùng đến 1700 mg metformin.
6
2.1.1.7 Tác dụng phụ

- Tác dụng phụ cấp tính của metformin được ghi nhận xảy ra đối với
khoảng 30% bệnh nhân. Các ảnh hưởng này bao gồm: tiêu chảy, đau bụng,
buồn nôn, miệng có vị kim loại và chán ăn. Chúng thường được giảm thiểu
bằng cách tăng liều thuốc từ từ và dùng chung trong các bữa ăn. Trong quá
trình điều trị lâu dài với metformin, khả năng hấp thu đường ruột của vitamin
B12 và folate thường bị giảm. Do đó cần bổ sung vitamin B12 định kỳ hoặc
bổ sung canxi để đảo ngược tác dụng của metformin trên sự hấp thụ vitamin
B12[37, 38].
- Giảm chức năng thận hoặc gan có thể là một dấu hiệu mạnh mẽ cho
thấy ảnh hưởng khi dùng thuốc. Tuy nhiên, cần ngưng việc dùng metformin
một cách cẩn trọng để tránh nguy cơ nhồi máu cơ tim hoặc nhiễm trùng máu
nếu ngưng thuốc ngay lập tức[32].
- Tác dụng bất lợi tiềm ẩn nghiêm trọng nhất của việc sử dụng các thuốc
thuộc nhóm biguanide là nhiễm toan acid lactic ("metformin-associated lactic
acidosis" - MALA). Mặc dù tỷ lệ MALA ghi nhận được cao nhất lên đến trên
100.000 người/năm[39], tuy nhiên số liệu này lại không khác nhiều với tỷ lệ
nền của nhiễm toan acid lactic nói chung. Báo cáo của Salpeter và cộng sự
(2003) lại cho thấy không có mối liên quan rõ ràng nào giữa metformin và
nhiễm toan acid lactic[40].
- Hạ đường huyết: là ảnh hưởng không phổ biến ở những bệnh nhân điều
trị với metformin đơn trị liệu [41].
2.1.1.8 Chống chỉ định[37]

- Người bệnh có trạng thái dị hóa cấp tính, nhiễm khuẩn, chấn thương
(phải được điều trị ĐTĐ bằng insulin).
- Giảm chức năng thận do bệnh thận, hoặc rối loạn chức năng thận
(creatinin huyết thanh ≥1,5 mg/dL ở nam giới, hoặc ≥1,4 mg/dL ở phụ nữ),
hoặc có thể do những tình trạng bệnh lý như trụy tim mạch, nhồi máu cơ tim
cấp tính và nhiễm trùng máu gây nên.
- Quá mẫn với metformin hoặc các thành phần khác.
- Bệnh gan nặng, bệnh tim mạch nặng, bệnh phổi thiếu oxygen mạn tính.
- Suy tim xung huyết, trụy tim mạch, nhồi máu cơ tim cấp tính.
- Người mang thai (phải điều trị bằng insulin, không dùng metformin).
- Hoại thư, nghiện rượu, thiếu dinh dưỡng.
7
2.1.1.9 Thận trọng

- Ðối với người bệnh dùng metformin, cần theo dõi đều đặn các xét
nghiệm cận lâm sàng, kể cả định lượng đường huyết, để xác định liều
metformin tối thiểu có hiệu lực. Người bệnh cần được thông tin về nguy cơ
nhiễm acid lactic và các hoàn cảnh dễ dẫn đến tình trạng này.
- Metformin được bài tiết chủ yếu qua thận, nguy cơ tích lũy và nhiễm
acid lactic tăng lên theo mức độ suy giảm chức năng thận.
- Metformin không phù hợp để điều trị cho người cao tuổi, thường có suy
giảm chức năng thận; do đó phải kiểm tra creatinin huyết thanh trước khi bắt
đầu điều trị[42].
- Phải ngừng điều trị với metformin 2-3 ngày trước khi chiếu chụp X
quang có sử dụng các chất cản quang chứa iod và trong 2 ngày sau khi chiếu
chụp. Do các chất cản quang có thể tạm thời làm giảm chức năng thận, gián
tiếp dẫn đến nhiễm toan lactic bằng cách gây ra sự tăng nồng độ của
metformin trong cơ thể. Chỉ dùng trở lại metformin sau khi đánh giá lại chức
năng thận thấy bình thường[43, 44].
- Phải ngừng dùng metformin khi tiến hành các phẫu thuật.
- Không dùng metformin ở người bệnh suy giảm chức năng gan.
- Người bệnh cần được khuyến cáo điều tiết chế độ ăn, vì dinh dưỡng
trong điều trị là một khâu trọng yếu trong quản lý bệnh ĐTĐ. Ðiều trị bằng
metformin chỉ được coi là hỗ trợ, không phải để thay thế cho việc điều tiết chế
độ ăn hợp lý.
2.1.1.10 Tƣơng tác thuốc[43, 45]

- Cimetidin ức chế sự bài tiết ở ống thận của metformin, giảm độ thanh
thải thận của metformin đến 27% trong 24 giờ, và có thể làm tăng đáng kể
nồng độ trong huyết tương của metformin lên 60% trong 6 giờ khi cimetidine
và metformin được sử dụng chung. Một nghiên cứu mù đôi ngẫu nhiên cũng
cho thấy rằng kháng sinh cephalexin cũng làm tăng nồng độ metformin theo
một cơ chế tương tự. Các thuốc cation khác được bài tiết bởi ống thận như:
amiloride, digoxin, morphin, procainamide, quinidine, quinine, ranitidine,
triamteren, trimethoprim, vancomycin cũng có khả năng gây tăng nồng độ
trong huyết tương của metformin hoặc gây trở ngại cho việc thanh thải của
thận. Giám sát chặt chẽ glucose máu sẽ đặc biệt thích hợp khi các loại thuốc
này được dùng chung với metformin.
- Nifedipine tăng hấp thu của metformin trong một nghiên cứu khi dùng
đơn liều, tăng 9% về diện tích dưới đường cong (AUC) và tăng 20% nồng độ
8
đỉnh trong huyết tương, tuy nhiên không có thay đổi về thời gian bán thải và
bài tiết qua nước tiểu.
- Trong một nghiên cứu khác, furosemide tăng AUC của metformin 15%
ở người tình nguyện khỏe mạnh; sự thanh thải của thận không bị ảnh hưởng.
- Những thuốc gây hạ đường huyết như là: clofibrate, ức chế monoamine
oxidase, probenecid, propranolol, rifabutin, rifampin, salicylate, sulfonamide
tác dụng kéo dài, sulfonylurea có thể kết hợp với metformin trong điều trị
ĐTĐ type 2, giúp giảm liều metformin cần sử dụng.
2.1.2 Một số chế phẩm trên thị trƣờng

Bảng 2.1 Một số chế phẩm chứa metformin trên thị trường
STT Chế phẩm Dạng bào chế Hàm lƣợng Xuất xứ

Viên nén bao 500 mg, 800 mg, Merck Serono
1 Glucophage
film 1000 mg (Pháp)
Viên nén bao 500 mg, 850 mg,
Glucophage Merck Serono
2 film – giải 1000 mg, 2000
XR (Pháp)
phóng kéo dài mg, 2250 mg
Dung dịch uống
3 Riomet – giải phóng 500 mg/mL Ranbaxy (Ấn Độ)
kéo dài
Viên nén – giải 500 mg, 1000 Watson
4 Fortamet
phóng kéo dài mg Laboratories (Mỹ)
Viên nén bao Pharimexco (Việt
5 Glucomet 500 mg, 850 mg
film Nam)
Metformin Viên nén bao STADA-Việt
6 500 mg, 850 mg
STADA film Nam
Metformin Viên nén bao Savipharm (Việt
7 500 mg
Savi film Nam)
2.2 Cholesterol
2.2.1 Đại cƣơng về cholesterol

Danh pháp: IUPAC: (3β)-cholest-5-en-3-ol.
Tên khác: (10R,13R)-10,13-dimethyl-17-(6-methylheptan-
2-yl)-2,3,4,7,8,9,11,12,14,15,16,17-dodecahydro-1H-cyclopenta-
[a]phenanthren-3-ol.
9
Cholesterol (tiếng Hi Lạp:

chole- (mật) và stereos (rắn), vì nó
được phát hiện lần đầu ở dạng rắn
trong sỏi mật) là một chất
béo steroid được sinh tổng hợp ở
các tế bào động vật và là một
thành phần cấu trúc quan trọng
của tất cả các màng tế bào động
vật, cần thiết để duy trì cấu trúc và
tính linh động của lớp màng kép ở
tế bào. Cholesterol đóng vai trò
trung tâm trong nhiều quá trình
sinh hoá, nhưng lại được biết đến
nhiều nhất do liên hệ đến bệnh tim
mạch khi nồng độ cholesterol
Hình 2.3 Công thức cấu tạo của cholesterol
trong máu tăng.
Cholesterol có 256 đồng phân lập thể xoay quanh 8 tâm lập thể. Mặc dù
vậy chỉ có 2 đồng phân có ý nghĩa về mặc sinh hóa bao gồm nat-cholesterol và
ent-cholesterol (tương ứng là natural và enantiomer) và chỉ có đồng phân nat-
cholesterol hiện diện trong tự nhiên[46], [47].
2.2.1.1 Thông tin dƣợc động học của cholesterol

a) Hấp thu
Cholesterol được hấp thu chủ yếu ở phần đầu ruột non qua mạch bạch
huyết[48]. Hầu hết cholesterol vào cơ thể dưới dạng ester hóa và được hấp thu
kém. Tuy nhiên, khi một lượng cholesterol được hấp thu, cơ thể sẽ bù trừ bằng
cách giảm tổng hợp cholesterol[49].
b) Phân bố
Cholesterol được tìm thấy ở tất cả các mô trong cơ thể, đặc biệt là trong
não, tủy sống, và trong mỡ động vật. Cholesterol còn là thành phần chính của
sỏi mật[50].
Trung bình, ở một người trưởng thành có cân nặng khoảng 68 kg thì sẽ
tổng hợp được 1g cholesterol mỗi ngày và trong cơ thể người này sẽ chứa
khoảng 35 g cholesterol – hầu hết được tập trung ở màng tế bào.
10
c) Chuyển hóa
Cholesterol được chuyển hóa ở gan qua các con đường chuyển hóa để
tạo ra hai acid mật chủ yếu là acid cholic và acid chenodeoxycholic[51].
Cholesterol
Acid mật Pregnenolon Vitamin D

e
Glucocorticoid Mineralocorticoids Androgens

s
Corticosterids Estrogens
Hình 2.4 Sơ đồ chuyển hóa của cholesterol
d) Thải trừ
Cholesterol được gan đào thải dưới dạng không este hóa (thông qua mật)
vào đường tiêu hóa. Thông thường, khoảng 50% lượng cholesterol được bài
tiết sẽ tái hấp thu qua ruột non trở lại vào máu. Ngoài ra, cholesterol còn được
đưa ra ngoài thông qua nước tiểu và tuyến sữa[49].
2.2.1.2 Sinh tổng hợp

Tất cả các tế bào động vật đều xảy ra quá trình sinh tổng hợp cholestrol ở
mức tương đối khác nhau phụ thuộc vào loại tế bào và chức năng của cơ quan
đó. Khoảng 20-25% tổng lượng cholesterol được tổng hợp tại trong gan mỗi
ngày; các vị trí khác cũng tổng hợp lượng lớn cholesterol như ruột, tuyến
thượng thận, và các cơ quan sinh sản.
Trong tế bào, cholesterol được sinh tổng hợp thông qua một quá trình
phức tạp bắt đầu từ chu trình mevalonate sau đó qua 19 bước để chuyển
lanosterol thành cholesterol[52].
2.2.1.3 Vai trò của cholesterol với cơ thể

Cholesterol giữ vị trí quan trọng trong hình thành và duy trì tính ổn định
của màng tế bào. Nhóm hydroxyl của cholesterol tương tác với các đầu phân
cực của các phospholipid màng và sphingolipid, trong khi các steroid cồng
11
kềnh và các chuỗi hydrocarbon được đưa vào trong màng, cùng với chuỗi acid
béo không phân cực của các chất béo khác. Thông qua sự tương tác với các
chuỗi acid béo phospholipid, cholesterol làm tăng khả năng kết hợp và làm
giảm tính lưu động của màng[53]. Các cấu trúc của vòng tetracyclic cholesterol
góp phần vào việc làm giảm sự linh động, tính thấm của màng tế bào với các
chất tan trung tính[54], các ion hydro, và các ion natri[55]. Bên cạnh đó,
cholesterol còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp các
hormone steroid, acid mật và vitamin D[56].
2.2.1.4 Cholesterol trong một số thực phẩm

Hàm lượng cholesterol trong một số loại thực phẩm được trình bày ở
Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Hàm lượng cholesterol trong một số thực phẩm hàng ngày
Thực phẩm Hàm lƣợng Thực phẩm Hàm lƣợng

(mg/100g) (mg/100g)
Não bò 3.011 Thịt lợn 94
Não heo 2.195 Phô mai 90
Não cừu 1.352 Thịt cừu 89
Gan gà 631 Thịt bò 84
Gan ngỗng 485 Cá ngừ 80
Trứng gà 480 Cá hồi 80
Gan bò 338 Tôm hùm 70
Thận bò 413 Sữa mẹ 15
Trứng cá 374 Sữa bò tươi 10
Bơ 260 Sữa chua 5
2.2.2 Định tính cholesterol

Cholesterol có màu trắng hoặc có ánh vàng nhạt dạng hạt nhỏ hoặc dạng
tinh thể, hầu như không mùi, có điểm nóng chảy là 148,5ºC và điểm sôi
khoảng 360ºC[57].
12
2.2.2.1 Phƣơng pháp đo nhiệt độ nóng chảy

Một chất được cho là cholesterol phải không chênh lệch quá nhiều với
nhiệt độ nóng chảy của chất này được công bố trong các tài liệu nghiên cứu
trước đó, hay nhiệt độ nóng chảy của cholesterol tinh khiết.
Nhiệt độ nóng chảy của cholesterol là 148,5ºC.
2.2.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng

Alexander Bilyk và cộng sự (1991)[92] đã tiến hành tách cholesterol,
acylglycerol béo, acid béo và amide béo bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng
(TLC – Thin Layer Chromatography). Phương pháp cho thấy hiệu quả tách
tốt, nhanh chóng và có thể áp dụng định lượng thành phần hỗn hợp lipid tự
nhiên sau khi thủy phân.
Thí nghiệm hòa tan 25 mg từng chất tinh khiết gồm triolein, 1,3-diolein,
1,2-diolein, 1-monoolein, oleic acid, N-butylpalmitamide và cholesterol vào
2,5 mL chloroform để đạt được nồng độ 1,67 mg/mL mỗi chất. Chấm dung
dịch mẫu chuẩn lên bản mỏng có chiều dài 14 cm và chiều ngang 2 cm. Tiến
hành cho giải ly với 2 hệ dung môi. Giải ly bản mỏng với hệ A
(toluene:diethyl ether:ethyl acetate:acetic acid, 75:10:13:1.2, theo tỷ lệ thể
tích) đến độ cao 8 cm, làm khô bản bằng khí nitrogen. Tiếp tục giải ly với hệ
B (hexane:diethyl ether:formic acid, 80:20:2, tỷ lệ về thể tích) đến vạch giới
hạn (tương đương đường đi của dung môi B là 14 cm). Sau khi được làm khô
ngoài không khí, mẫu được hiện hình bằng cách phun dung dịch acid sulfuride
60% trong nước và than hóa bằng nhiệt.
13
Hình 2.5 Sắc ký lớp mỏng của hỗn hợp chuẩn; dãy 1-hỗn hợp chuẩn chỉ được
giải ly bằng dung môi B; dãy 2-hỗn hợp chuẩn chỉ được giải ly bằng dung môi A;
dãy 3 và 4-hỗn hợp chuẩn được giải ly lần lượt trong dung môi A và B. Vị trí các vế
trên dãy 3 và 4: (a) 1-monoolein, (b) N-butyl palmitamide, (c) 1,2-diolein, (e) 1,3-
diolein, (f) acid oleic, (g) triolein.
Khi so sánh với bản mỏng chỉ được chấm bằng dung dịch cholesterol
trong choloform và hỗn hợp chuẩn được giải ly lần lượt bằng dung môi A và
B, cholesterol sẽ nằm giữa 1,2-diolein và 1,3-diolein.
Hình 2.6 Sự tách và xác định cholesterol bằng việc giải ly lần lượt với hệ dung
môi A và B. Dãy 1-dung dịch chỉ có cholesterol; dãy 2-hỗn hợp dung dịch chuẩn (a)
monoolein, (b) N-butylpalmitamide, (c) 1,2-diolein, (e) 1,3-diolein, (d) cholesterol,
(f) acid oleic, (g) triolein.
14
Đây là phương pháp đơn giản, có thể dễ dàng xác định sự có mặt hay
không của choleterol trong hỗn hợp lipid và cũng là phương pháp giúp xác
định sự tinh khiết của choleterol sau khi tách chiết từ mô não động vật.
2.2.2.3 Phƣơng pháp Liebermann-Burchard

Trong số nhiều phản ứng màu của cholesterol, phản ứng Liebermann-
Burchard là phản ứng được sử dụng nhiều nhất để định tính cholesterol. Phản
ứng này được mô tả lần đầu tiên bởi Liebermann (1885)[58] và được Burchard
áp dụng để phân tích cholesterol[59]. Theo đó, chất thử nghiệm được hòa tan
vào chloroform, sau đó thêm một vài giọt anhydride acetic và 2 giọt sulfuric
acid đậm đặc, lắc đều. Phép thử dương tính khi hỗn hợp xuất hiện màu tím,
sau đó chuyển nhanh sang màu hồng, đến xanh lá hoặc xanh đậm hơn. Sau khi
phản ứng kết thúc, nồng độ cholesterol có thể được đo bằng cách sử dụng
quang phổ.
Một trong những nghiên cứu sớm nhất về cơ chế của phản ứng, Lange và
các cộng sự (1949) đã chỉ ra rằng cholesterol được hòa tan trong chloroform
cùng với một lượng tương đương acid perchioric hoặc hexafluorophosphoric
sẽ tạo thành muối sterol không màu[60]. Các muối này sẽ bị thủy phân ngay lập
tức khi tiếp xúc với nước, làm phục hồi lại số lượng của cholesterol trong
dung dịch. Tuy nhiên, khi thêm vào một lượng acid vượt mức cân bằng hóa
học sẽ làm chậm quá trình thủy phân của các tinh thể muối không màu, tiếp
theo đó là sự hình thành các sản phẩm màu tím được xem là muối halochromic
của cholestadiene. Ở các nghiên cứu tiếp theo, Dulou (1951)[61] và bởi
Brieskorn và Capuano (1953)[62] cho rằng bước đầu trong phản ứng
Liebermann-Burchard là sự mất nước của cholesterol để tạo thành bis-
cholestadiene, sản phẩm cuối cùng được xác định là các dimer
monosulfonated. Những nghiên cứu sau của Watanabe (1959)[63], đã hỗ trợ giả
thuyết trên. Theo đó Watanabe đã phân lập được 3,3'-bis-3,5-cholestadiene
bằng sắc ký cột từ hỗn hợp phản ứng Liebermann-Burchard. Tuy nhiên, ở một
nghiên cứu tiếp theo Brieskorn và Hofmann (1964)[64] chỉ ra rằng sự hình
thành dimer không phải là phản ứng chính trong hệ thống Liebermann-
Burchard mà thay vào đó là một cơ chế liên quan đến quá trình oxy hóa
cholesterol thành một pentaene liên hợp.
15
Hình 2.7 Cơ chế đề nghị cho phản ứng Leibermann-Burchard
2.2.2.4 Phƣơng pháp quang phổ FT-IR

Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kỹ thuật
phân tích rất hiệu quả, cung cấp thông tin về cấu trúc phân tử nhanh, không
đòi hỏi các phương pháp tính toán phức tạp. Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng
đơn giản là: các hợp chất hoá học có khả năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng
ngoại. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại, các phân tử của các hợp chất
hoá học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất hiện dải phổ hấp thụ gọi
là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ
hồng ngoại tương ứng với các nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong
phân tử hợp chất hoá học. Bởi vậy phổ hồng ngoại của một hợp chất hoá học
được xem như "dấu vân tay" và có thể căn cứ vào đó để nhận dạng chúng.
16
2.3 Đại cƣơng về niosome
2.3.1 Khái niệm và phân loại
2.3.1.1 Khái niệm

Niosome là một hệ thống lưu giữ và phân phối thuốc có khả năng bao
bọc cả những phân tử thân nước hoặc kỵ nước. Niosome được tạo thành từ
thành phần chính là chất HĐBM không ion. Ngoài ra, người ta thường kết hợp
chất HĐBM không ion với cholesterol. Cholesterol cung cấp độ bền vững
cũng như góp phần vào việc tạo hình dáng cho hạt niosome. Trong khi đó, các
chât HĐBM không ion đóng vai trò quan trọng trong sự hình thành của
niosome. Các chất HĐBM không ion thường được sử dụng trong bào chế
niosome như span (20, 40, 60, 80) và tween (20, 60, 80).
2.3.1.2 Phân loại

a) Theo số lớp
- Niosome đa lớp (Multilamellar Vesicle-MV): có cấu trúc gồm nhiều
lớp màng kép hình cầu đồng tâm với kích thước từ 1 đến 5 m.
- Niosome đơn lớp (Unilamellar Vesicle) có cấu trúc gồm chỉ một lớp
màng kép hình cầu:
+ Niosome đơn lớp lớn (Large unilamellar Vesicle-LUV): kích thước
0,5-1 m.
+ Niosome đơn lớp nhỏ (Small Unilamellar Vesicle-SUV): kích thước
25-500 nm.
SUV LUV MLV
Hình 2.8 Phân loại niosome
17
b) Theo kích thƣớc

- Niosome có kích thước lớn: 2-4 m.
- Niosome có kích thước trung bình: 800-900 nm.
- Niosome có kích nhỏ: 100-200 nm.
2.3.2 Ƣu, nhƣợc điểm [65,66]

Với vai trò là một dạng mang thuốc vào cơ thể, niosome thể hiện một số
ưu điểm và nhược điểm như sau:
a) Ƣu điểm
- Niosome có thể vận chuyển được cả dạng thuốc thân nước, lẫn kỵ nước
và có cơ chế bao bọc thuốc tương tự liposome.
- Niosome có tính thẩm thấu và độ bền cao, giúp cải thiện độ tan, tăng độ
bền và độ ổn định của hoạt chất được bao bọc.
- Có khả năng phân hủy sinh học, tương đối không độc, có độ bền cao và
rẻ hơn so với liposome.
- Là một hệ thống mang thuốc giúp cải thiện sinh khả dụng đường uống,
tiêm cũng như thuốc tác dụng tại chỗ. Do chúng có thể dung nạp bằng nhiều
đường sử dụng khác nhau như: đường tĩnh mạch, đường uống, qua da, qua cơ.
- Niosomes cải thiện hiệu quả điều trị của các phân tử thuốc bằng cách
làm chậm quá trình giải phóng ra khỏi hệ tuần hoàn, kéo dài thời gian lưu
thông dược chất trong hệ tuần hoàn, bảo vệ thuốc khỏi những tác động của
môi trường sinh lý bên trong cơ thể.
- Đặc tính của niosome có thể được điều khiển bằng cách thay đổi thành
phần tạo niosome, kích thước các lớp màng, điện tích bề mặt, thể tích các lô
mẻ và nồng độ.
- Niosome giúp bảo vệ thuốc khỏi các enzyme chuyển hóa.
b) Nhƣợc điểm
Trong một số công thức bào chế, niosome dễ bị kết tụ với nhau hoặc bị
vỡ dẫn đến rò rỉ dược chất. Đôi khi các chất HĐBM không ion tương tác với
các thành phần khác trong công thức gây ra hiện tượng đồng nhất hóa hoặc
xuất hiện kết tủa.
2.3.3 Thành phần màng niosome
2.3.3.1 Cholesterol và vai trò của cholesterol trong niosome

Steroid có vai trò quan trọng trong thành phần màng tế bào và sự hiện
diện của chúng làm thay đổi đáng kể độ bền, sự linh động và tính thấm của lớp
18
màng kép. Cholesterol là một steroid tự nhiên thường được sử dụng nhất để
thêm vào thành phần màng niosome và nó có thể được kết hợp với tỷ lệ cao.
Tuy nhiên cholesterol không có khả năng hình thành nên lớp màng kép mà nó
chỉ là thành phần hỗ trợ, giúp cho lớp màng kép rắn chắc hơn, giảm sự hình
thành các vết nứt và giảm rò rỉ thuốc ra môi trường bên ngoài. Nhiều nghiên
cứu cho thấy tỷ lệ mol của chất HĐBM không ion/cholesterol thích hợp là
1:1[6, 9, 67]. Nếu cholesterol được dùng với tỷ lệ lớn hơn sẽ làm phá hủy cấu trúc
cân bằng của lớp màng kép, tăng thể tích của các tiểu phân niosome và làm
giảm hiệu suất niosome hóa thuốc (hiệu suất mang thuốc), tăng sự rò rỉ thuốc
qua các vết nứt. Còn khi cholesterol được dùng với một tỷ lệ thấp sẽ làm tăng
tỷ lệ của chất HĐBM trong cấu trúc của niosome, vì vậy số lượng các vết nứt
trong cấu trúc sẽ tăng lên làm giảm độ bền của niosome[68].
Hình 2.9 Sự liên kết giữa cholesterol và span 60 trong niosome[69]
2.3.3.2 Chất HĐBM không ion

a) Chất HĐBM
Chất HĐBM là chất khi cho vào dung dịch sẽ làm giảm sức căng bề mặt
của hệ. Cấu trúc của chất HĐBM gồm 2 phần: đầu ưa nước (có thể nằm ở một
đầu, hai đầu hoặc giữa phân tử) và đầu kỵ nước (mạch parafin thẳng hoặc
nhánh, vòng benzene hay napthalene).
Đầu ưa nước Đầu kỵ nước
Hình 2.10 Cấu trúc chất HĐBM
19
b) Chất HĐBM không ion

Chất HĐBM không ion là thành phần chính tạo nên cấu trúc kép của lớp
màng niosome. Các chất HĐBM không ion có nhóm hữu cơ không ion hóa
trong dung dịch nước. Phần kỵ nước gồm dãy chất béo, phần ưa nước chứa
những phân tử oxygen, nitrogen hoặc lưu huỳnh không ion hóa. Sự hòa tan là
do sự tạo thành liên kết hydrogen giữa các phân tử nước và một số nhóm chức
trong phần ưa nước. Các chất HĐBM không ion được ứng dụng rộng rãi vì nó
có thể hoạt động trong môi trường có chứa lượng lớn các chất điện ly, trong
môi trường nước cứng, môi trường acid, môi trường có chứa các ion kim loại
nặng.
c) Giá trị HLB và chỉ số CPP
Giá trị HLB (hydrophilic-lipophilic balance)[70]
HLB là sự cân bằng tương ứng giữa phần ái nước và phần kỵ nước trong
chất HĐBM. Giá trị HLB biểu thị mối quan hệ của chất HĐBM với nước và
với dầu cũng như khuynh hướng nhũ hóa của chất HĐBM đó.
Đặc biệt, giá trị HLB của các chất HĐBM không ion không bị ảnh hưởng
bởi sự có mặt của các chất điện ly trong môi trường.
Giá trị HLB có thể được xác định bằng thực nghiệm hoặc có thể tính
theo công thức tùy theo bản chất của chất HĐBM, tính chất của đầu ưa nước,
kỵ nước:
+ Hầu hết các ester của các acid béo của các polyhydric alcohol có giá trị
HLB được tính theo công thức:
( )
Trong đó: A: chỉ số acid.

S: chỉ số xà phòng hóa của ester.
+ Những ester của acid béo không thể xác định chỉ số xà phòng hóa S
một cách chính xác thì giá trị HLB được tính theo công thức:
Trong đó: E: % khối lượng oxyethylene chứa trong hợp chất.

P: % khối lượng alcolpolyhydric chứa trong hợp chất.
+ Tính theo khối lượng các phần thân nước, kỵ nước:
20
Trong đó: Mn: khối lượng phân thân nước trong phân tử chất HĐBM.
Md: khối lượng phần kỵ nước trong phân tử chất HĐBM.
+ Tính theo cấu trúc của chất HĐBM:
HLB = 7 + (giá trị HLB các nhóm thân nước) – (giá trị HLB các nhóm kỵ nước)
+ Trong trường hợp hệ chất nhũ hóa phức hợp thì giá trị HLB được tính
theo công thức:
Trong đó: A, B: giá trị HLB của chất HĐBM A, B.

x: % khối lượng của chất A.
Giá trị HLB rất có ích trong việc nhận định tác động của các chất HĐBM
khác nhau trong công thức như: tính bền, tính chảy. Từ đó có thể có sự lựa
chon các chất HĐBM phù hợp cho từng công thức phối trộn.
Đối với niosome, giá trị HLB của một chất HĐBM có ảnh hưởng rất lớn
đến khả năng hình thành và bao bọc dược chất của niosome.
Bảng 2.3 Ảnh hưởng của HLB đến niosome [67]
Giá trị HLB Ảnh hƣởng đến việc bào chế niosome
14-16 Không hình thành niosome
8,6 Tăng hiệu suất bao bọc của niosome
1,7-8,6 Giảm hiệu suất bao bọc của niosome
Từ bảng số liệu trên ta có thể thấy được giá trị HLB của một chất
HĐBM hoặc của hỗn hợp chất HĐBM bằng 8,6 sẽ tốt nhất cho việc bào chế
hệ phân tán niosome.
Chỉ số CPP (critical packing parameter)
Ngoài giá trị HLB, cấu trúc không gian của phân tử chất HĐBM còn có
ảnh hưởng rất lớn đến khả năng tạo nhũ tương và độ bền vững của nhũ tương
tạo thành. Do đó người ta đã sử dụng chỉ số CPP để đánh giá tính chất này của
chất HĐBM.
21
Chỉ số CPP được tính theo công thức sau[71]:
Hình 2.11 Mối liên quan giữa giá trị CPP và hình dạng niosome
22
d) Các chất HĐBM không ion sử dụng trong nghiên cứu
Bảng 2.4 Các chất HĐBM không ion sử dụng trong bào chế niosome
Tính chất Tween 80 Span 80 Span 60

Polyoxyethylene sorbitan monooleate, Sorbitan stearate, sorbitane
Danh pháp Sorbitane monooleate, sorbitan oleate
polysorbate 80 monostearate
Công thức
C64H124O26 C23H44O6 C24H46O6
phân tử
Công thức cấu

tạo
Khối lượng
1309,68 428,60 430,618
phân tử
Chỉ số HLB 15 4,3 4,7
Nhiệt độ
- 12 oC 53 oC
chuyển dạng
Trạng thái Dạng lỏng, sánh, màu vàng nhạt Dạng lỏng, sánh, màu vàng nhạt Dạng hạt, dẻo, màu trắng đục
23
2.3.4 Kỹ thuật bào chế
2.3.4.1 Các phƣơng pháp bào chế niosome

a) Phƣơng pháp hydrat hóa film mỏng
Phương pháp hydrat hóa film mỏng để bào chế niosome được tiến hành
tương tự như phương pháp do Bangham đưa ra từ năm 1965 trong bào chế
liposome. Đây là phương pháp đơn giản, có thể dễ dàng thực hiện ở nhiều
phòng thí nghiệm, tiến hành qua các bước như sau:
- Chuẩn bị dung dịch tạo màng: cholesterol, chất HĐBM và các chất phụ
khác (DCP, DOTAP,…) được hòa tan vào dung môi hữu cơ (diethyl ether,
chloroform,…) trong một bình cầu đáy tròn.
- Tạo màng mỏng: Dung môi hữu cơ được loại bỏ bằng cách cô quay áp
suất thấp ở nhiệt độ thích hợp (tùy thuộc vào nhiệt độ chuyển dạng của hỗn
hợp tạo màng). Hỗn hợp sẽ tạo thành một lớp màng mỏng bám trên bình cầu,
tiếp tục loại tối đa lượng dung môi còn lại bằng cách sục kí nitrogen hoặc cho
vào tủ hút để qua đêm.
- Hydrat hóa: Môi trường hydrat được cho vào bình cầu, lắc hoặc khuấy
ở nhiệt độ và tốc độ thích hợp để phân tán đều lớp màng.
Phương pháp này thường tạo ra các niosome nhiều lớp và có kích thước
lớn khiến cho hỗn hợp dễ lắng động và tách lớp, do đó, cần làm nhỏ kích
thước sau bào chế[8,72,73,74].
b) Phƣơng pháp tiêm ether
Thành phần màng niosome được hòa tan trong dung môi ether. Dược
chất được hòa tan trong môi trường nước. Phương pháp này dựa trên việc bơm
thật chậm dung dịch ether vào môi trường nước ở nhiệt độ cao. Khi gặp nhiệt
độ cao, ether sẽ bốc hơi tạo thành niosomes.
Điển hình là hỗn hợp chất HĐBM và cholesterol (150 µmol) được hòa
tan trong 20 mL ether và được bơm từ từ vào pha nước (4 mL) bằng kim tiêm
cỡ 14. Nhiệt độ được duy trì ở 60ºC trong suốt quá trình thí nghiệm. Kết quả
là hình thành các niosome đa lớp có kích thước lớn[29,75] .
c) Phƣơng pháp Handjani-Vila
Một lượng đương tương của các chất HĐBM không ion (tổng hợp) được
phối trộn với dung dịch nước có chứa hoạt chất. Lơp film mỏng đồng nhất
được hình thành bằng sự lắc. Sau đó, hỗn hợp được đồng nhất bằng cách siêu
li tâm và sự khuấy trộn ở một nhiệt độ thích hợp[76].
24
d) Phƣơng pháp bốc hơi pha đảo

Kỹ thuật bốc hơi pha đảo được sử dụng để tạo nhiều hệ thống mang
thuốc khác nhau như archaeosome, liposome, nanoliposome và niosome.
Đối với phương pháp này, hỗn hợp của chất HĐBM không ion và
cholesterol được hòa tan vào dung môi hữu cơ (chloroform, hỗn hợp diethyl
ether-chloroform,…) và dung dịch đệm PBS sẽ nhũ hóa để đạt được nhũ
tương nước trong dầu (W/O). Sau đó, hỗn hợp được siêu âm để tạo nhũ tương
mịn. Dung môi hữu cơ được loại bỏ bằng cách cô quay với áp suất thấp tạo
thành một dạng gel và sau đó được hydrat để tạo niosome[77].
Một ví dụ điển hình về phương pháp này được thực hiện bởi Hasan và
cộng sự (2013) trong bào chế niosome mang metformin. Dung dịch lipid
(cholesterol và span 40, có hoặc không có DCP, DOTAP hòa tan trong 5 mL
diethyl ether và 5 mL chloroform) được nhũ hóa với 2 mL pha nước có chứa
dược chất bằng đầu siêu âm Microson XL-2000 ở 4˚C trong 5 phút. Dạng gel
hình thành sau khi thêm một lượng nhỏ (1 mL) dung dịch đệm (PBS, pH 6,8)
và tiếp tục siêu âm. Dung môi hữu cơ được bốc hơi bằng cách khuấy hỗn hợp
ở nhiệt độ phòng để đạt được dạng gel đặc. Gel bị phá vỡ bằng cách thêm vào
2 mL PBS trong lúc khuấy hỗn hợp. Các tiểu phân niosome được hình thành
sau khi dung môi được loại bỏ hoàn toàn bằng cách cô quay áp suất thấp ở
40˚C trong 10 phút và đun điều nhiệt cách thủy ở 60˚C trong 10 phút. Với
phương pháp này nhóm nghiên cứu đã tạo ra các tiểu phân đồng nhất, có kích
thước nhỏ và cho hiệu suất niosome hóa cao[9].
e) Phƣơng pháp gia nhiệt (Heating method)
Đây là phương pháp không độc, có thể thay đổi và là phương pháp được
thực hiện trong một bước dựa trên quy trình đã được cấp bằng sáng chế của
Mozafari M.R. (03/03/2005). Hỗn hợp của chất HĐBM, cholesterol, có hoặc
không có các chất sinh điện tích được thêm vào môi trường nước (chẳng hạn
như dung dịch đệm, nước cất,…) trong sự hiện diện của một polyol như là
glyceryol. Hỗn hợp được gia nhiệt trong khi khuấy (với lực làm biến dạng
thấp) mãi cho đến khi các tiểu phân niosome được hình thành[78].
f) Niosome đƣợc hình thành từ proniosome
Đầu tiên, proniosome sẽ được bào chế trước. Trong thành phần tạo
proinosome ngoài cholesterol và chất hoạt động bề mặt thì các chất mang tan
trong nước như sorbital cũng được thêm vào với một tỷ lệ thích hợp. Sau đó
niosome sẽ được hình thành bằng cách thêm vào pha nước ở nhiệt độ lớn hơn
nhiệt độ chuyển dạng của hỗn hợp màng và khuấy trong khoảng thời gian
thích hợp[79].
25
Các phương pháp bào chế niosome chủ yếu được hình thành dựa trên
phương pháp bào chế liposome. Do sự tương đồng về cấu trúc mà các phương
pháp bào chế liposome đều có thể áp dụng cho niosome.
2.3.4.2 Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự hình thành niosome

a) Trạng thái tự nhiên của chất hoạt động bề mặt
Chất HĐBM sử dụng để bào chế niosome phải có một đầu thân nước và
đuôi kỵ nước. Đuôi kỵ nước có thể có một hoặc hai nhóm alkyl hoặc nhóm
perfluoroalkyl hoặc trong một số trường hợp chỉ có một nhóm steroid[80]. Các
chất HĐBM ether với một chuỗi alkyl thì có nhiều độc tính hơn loại có hai
chuỗi dialkylether. Chất HĐBM có liên kết ester mặt dù ít độc, nhưng có độ
bền thấp hơn loại chứa liên kết ether cho chúng dễ bị phân hủy bởi enzyme
esterases thành triglyceride và acid béo trong thử nghiệm in vivo[81]. Theo
nghiên cứu của Ozer A.Y. và cộng sự (1991) thì các chất HĐBM có chuỗi
alky dài từ 12 đến 18 carbon phù hợp cho sự bào chế niosome[82]. Ngoài các
yếu tố trên thì chỉ số HLB cũng là hai yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự
hình thành niosome (tham khảo mục 2.3.3.2).
b) Cấu trúc của chất HĐBM
Cấu trúc chất HĐBM sẽ ảnh hưởng đến dạng hình học của các tiểu phân
niosome và nó liên quan chặt chẽ với chỉ số CPP. Dựa trên chỉ số CPP có thể
đoán trước được hình dạng của niosome được tạo thành.
c) Thành phần tạo màng niosome
Chất HĐBM không ion là thành phần chính tạo nên lớp màng kép, tuy
nhiên, sự hiện diện của các chất khác là cần thiết giúp điều chỉnh độ bền, tính
thấm, độ cứng và đặc tính của lớp màng. Trong nghiên cứu của
Arunothayanun P. và cộng sự (2000) trường hợp của niosome đa diện được
hình thành từ C16G2 (hexadecyl diglycerol ether), hình dạng của các niosome
này được duy trì khi được thêm vào một lượng nhỏ solulan C24 (cholesterol
poly-24-oxyethylene ether) được xem như là ―chướng ngại không gian‖ giúp
ngăn chặn sự kết tụ của các tiểu phân niosome. Kích thước trung bình của
niosome cũng bị ảnh hưởng bởi thành phần tạo lớp màng kép như là các
niosome đa diện được hình thành bởi C16G2: solulan C24 với tỷ lệ 91:9 có kích
thước lớn hơn (8,0±0,3 mm) các niosome hình cầu hay hình ống được hình
thành bởi C16G2: cholesterol: solulan C24 với tỷ lệ 49:49:2 (6,6±0,2 mm)[83].
Cholesterol là thành phần phụ thường được thêm vào cấu trúc màng niosome
giúp điều chỉnh độ cứng, tính thấm và giúp lớp màng có cấu trúc chặt chẽ hơn.
26
d) Trạng thái tự nhiên của hoạt chất

Các đặc tính hóa-lý của hoạt chất cũng làm ảnh hưởng đến điện tích và
độ cứng lớp màng kép của niosome. Hoạt chất tương tác với các đầu thân
nước của chất HĐBM và sinh ra lực đẩy lẫn nhau giữa lớp màng kép chất
HĐBM và do đó làm tăng kích thước niosome[84]. Khi hình thành điện tích
trên bề mặt lớp màng kép sẽ giúp niosome chống lại hiện tượng kết tụ.
e) Nhiệt độ hydrat hóa
Nhiệt độ hydrat hóa ảnh hưởng đến hình dạng và kích thước của
niosome. Điều kiện lý tưởng là khi nhiệt độ này lớn hơn nhiệt độ chuyển pha
từ trạng thái gel qua lỏng của hỗn hợp. Nhiệt độ chuyển pha của hỗn hợp tạo
màng niosome ảnh hưởng đến sự sắp xếp của các chất HĐBM hình thành các
túi cầu và cũng sinh ra sự thay đổi hình dạng của niosome[82,86]. Trong nghiên
cứu năm 2000 của Arunothayanun P. cũng cho thấy rằng các niosome đa diện
được hình thành từ C16G2:solulan C24 (91:9) ở 25ºC và bị chuyển đổi thành
dạng hình cầu ở 48ºC. Nhưng khi làm lạnh từ 55ºC, niosome sinh ra một
cụm hình cầu có cấu trúc nhỏ hơn ở 49˚C trước khi chuyển thành cấu trúc đa
diện ở 35ºC. Ngược lại, các niosome được hình thành từ C16G2: cholesterol:
solulan C24 (49:49:2) cho thấy không có sự thay đổi hình dạng khi gia nhiệt
hoặc làm lạnh[86].
Cùng với các yếu tố được đề cập ở trên thì thể tích của môi trường hydrat
hóa, thời gian hydrat hóa cũng là những yếu tố then chốt có ảnh hưởng đến sự
hình thành niosome. Việc lựa chọn không phù hợp những yếu tố này sẽ dẫn
đến sự hình thành các niosome dễ nứt vỡ và tạo ra các kẻ hở gây rò rỉ hoạt
chất.
2.3.4.3 Các phƣơng pháp đồng nhất hóa kích thƣớc niosome
Các hạt niosome nhiều lớp thu được từ các phương pháp trên cần được
tiếp tục xử lý để thu được các hạt có kích thước nhỏ và đồng nhất hơn. Nhất là
niosome dùng để tiêm tĩnh mạch cần có kích thước từ 50-150 nm để có thể lọc
vô khuẩn và giảm thực bào, tăng cường đưa thuốc tới đích. Có nhiều phương
pháp đồng nhất hóa kích thước hạt, mỗi phương pháp có ưu, nhược điểm và
phạm vi áp dụng riêng. Sản phẩm thu được sau khi tiến hành đồng nhất hóa
thường là các hạt niosome nhỏ, đơn lớp. Tuy nhiên, quá trình đồng nhất hóa sẽ
phá vỡ một tỷ lệ nhất định niosome, gây rò rỉ dược chất. Do đó, cần phải xác
định lại hàm lượng dược chất cũng như đánh giá lại hiệu suất niosome hóa sau
khi tiến hành đồng nhất hóa kích thước.
27
a) Phƣơng pháp nén (ép/đùn) qua màng lọc

Đây là phương pháp làm đồng nhất niosome bằng cách nén hỗn dịch
niosome qua màng lọc có đường kính lỗ lọc thích hợp. Có thể dùng thiết bị
đẩy cầm tay với thể tích từ 1-10 mL hoặc thiết bị có qui mô lớn hơn có thể nén
ở áp suất khoảng 5 bar, niosome sẽ bị bóc từng lớp đến khi đạt được kích
thước mong muốn. Phương pháp này thường được sử dụng vì dễ thực hiện, ít
ảnh hưởng đến độ ổn định của niosome, thu được niosome có kích thước đồng
nhất, có thể kết hợp với lọc cản khuẩn. Hiện đã có thiết bị chuyên dụng bán
trên thị trường.
Hình 2.12 Thiết bị ép qua màng qui mô phòng thí nghiệm (LipexTM)
Cơ chế đồng nhất hóa qua màng lọc: Khi bị nén qua lỗ lọc hình trụ,
niosome có đường kính nhỏ hơn lỗ lọc sẽ dễ dàng đi qua màng lọc. Niosome
có kích thước lớn hơn đường kính lỗ lọc, một số sẽ bị biến dạng để đi qua lỗ
lọc, một số chịu tác động của lực trượt sẽ bị bóc lớp ngoài sau khi qua lỗ lọc.
Tỷ lệ niosome bị nứt vỡ phụ thuộc vào bản chất màng kép, đường kính lỗ lọc,
môi trường hydrat hóa, áp suất nén. Niosome được hydrat hóa bằng dung dịch
đệm hoặc hệ đẳng trương dễ bị biến dạng (thành hình oval hoặc trứng dài) và
dễ bị nứt vỡ hơn niosome được hydrat hóa bằng nước cất do tác động của áp
suất thẩm thấu. Khi tiến hành ép, thêm vào hỗn dịch 10-25% ethanol sẽ giúp
giảm độ nhớt, tăng tốc độ lọc, giảm áp suất nén và tạo ra niosome có kích
thước đồng nhất hơn.
28
Hình 2.13 Thiết bị ép cầm tay với màng lọc polycarbonate

Độ đồng nhất cũng như chất lượng của hạt niosome sau khi tiến hành
phụ thuộc vào màng lọc, nhiệt độ và áp suất ép:
- Nhiệt độ ép: được tiến hành trên nhiệt độ chuyển dạng của lớp vỏ
niosome, khi chất HĐBM ở trạng thái lỏng, vỏ niosome linh động, độ nhớt
thấp, do đó sẽ dễ đi qua màng lọc làm tăng tốc độ lọc, giảm áp suất lọc. Nhờ
vậy, tỷ lệ nứt vỡ hạt niosome sẽ giảm đáng kể. Nếu tiến hành ép ở nhiệt độ
dưới nhiệt độ chuyển dạng, thời gian lọc bị kéo dài, dễ gây tắc màng lọc. Để
điều chỉnh nhiệt độ ép, người ta có thể dùng thiết bị có vỏ điều nhiệt.
- Màng lọc: thường ép qua màng polycarbonate có đường kính lỗ lọc từ
100-400 nm. Để tăng tốc độ lọc và giảm nứt vỡ hạt quá trình ép nên được tiến
hành tuần tự nhiều lần từ màng lọc thô rồi đến màng lọc có kích thước lỗ lọc
nhỏ hơn.
b) Phƣơng pháp đồng nhất hóa ở áp suất cao
Về cơ bản, nguyên tắc hoạt động cũng như ưu, nhược điểm của phương
này tương đối giống với phương pháp ép qua màng lọc. Tuy nhiên, phương
pháp này có thể nén niosome qua các khe hẹp có kích thước xác định trong
thiết bị với áp suất cao khoảng 200 bar. Thường nén tuần hoàn nhiều vòng cho
đến khi thu được các hạt có kích thước 50-100 nm.
Đây là phương pháp dễ được áp dụng trong sản xuất, ít ảnh hưởng đến
độ ổn định của niosome. Mặc khác, nhiều hạt niosome sẽ bị phá vỡ khi nén
dưới áp suất cao dẫn đến hao hụt dược chất, làm xuất hiện các mảnh vỡ của
lớp màng trong hỗn dịch.
29
c) Phƣơng pháp siêu âm

Đây là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi. Xử lý hỗn
dịch niosome nhiều lớp bằng siêu âm (ở tần số khoảng 20 kHz) trong từ 5-10
phút có thể thu được niosome có kích thước đồng nhất hơn. Còn khi siêu âm
hỗn dịch trong nhiều giờ thì có thể thu được các hạt đơn lớp, có kích thước 15-
50 nm có thể dùng để tiêm tĩnh mạch. Có thể dùng bể siêu âm hoặc que siêu
âm, tuy nhiên dùng que dễ đưa tạp chất vào sản phẩm.
Hình 2.14 Bể siêu âm và que siêu âm dùng trong phòng thí nghiệm
Nhược điểm của phương pháp siêu âm là làm tăng sự thủy phân và oxy
hóa, ảnh hưởng đến một số dược chất không bền với nhiệt.
2.3.5 Phƣơng pháp đánh giá và phân tích
2.3.5.1 Phân bố kích thƣớc và độ đồng đều kích thƣớc tiểu phân
Đối với các hệ phân tán, yêu cầu phải có sự phân bố kích thước càng hẹp
càng tốt. Trên thực tế, đây là một tiêu chí rất khó đạt được, nhất là sự đồng
nhất về phân bố kích thước giữa các lô mẻ. Sự phân bố kích thước và độ đồng
đều kích thước của niosome cũng được xác định theo các phương pháp tương
tự với các tiểu phân nano khác (liposome, nanoemulsion,…). Kích thước tiều
phân có thể đo trực tiếp bằng các thiết bị như: kính hiển vi điện tử quét (SEM:
scanning electron microscopy), hiển vi điện tử truyền qua (TEM: transmission
electron microscopy), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (ARS: atomic resonance
spectroscopy), các thiết bị bắt ánh sáng động, thiết bị laser,… Kích thước hạt
niosome thay đổi trong phạm vi khá rộng, từ hàng chục đến hàng nghìn
nanomet. Do đó, ứng với từng loại niosome khác nhau như đơn lớp, đa lớp có
thể chọn phương pháp phân tích kích thước phù hợp. Với niosome có kích
30
thước hàng micromet, việc xác định kích thước tiểu phân và phân bố kích
thước có thể được tiến hành dưới kính hiển vi thông thường.
a) Kính hiển vi quang học
Kính hiển vi quang học là thiết bị sử dụng ánh sáng khả kiến và một hệ
thấu kính để phóng đại hình ảnh vật mẫu cần quan sát, giúp quan sát, ghi nhận
và đo đạc các thông số, tính chất của mẫu vật mà không thể nhìn thấy bằng
mắt thường.
Độ phóng đại của kính hiển vi quang học là tích số giữa độ phóng đại
của thị kính và độ phóng đại của vật kính. Thông thường kính hiển vi có thị
kính 10X còn vật kính có độ phóng đại 4X, 10X, 40X, 100X.
b) Hệ thống xác định kích thƣớc hạt bằng laser Microtrac S3500
Hệ thống phân tích kích thước hạt Microtrac S3500 hoàn chỉnh bao gồm
một hệ thống nạp và phân phối mẫu (tuần hoàn mẫu ướt và/hoặc thiết bị phân
phối mẫu khô), hệ thống phân tích S3500 và một máy tính có phần mềm ứng
dụng Microtrac.
Nguyên lý hoạt động: Sau khi nạp mẫu thông qua hệ thống nạp, mẫu sẽ
được bộ phận phân phối đẩy tuần hoàn liên tục trong hệ thống. Các hạt khi đến
bộ phận xác định kích thước, hệ thống sẽ đo đạc ánh sáng tán xạ từ chùm tia
laser sau khi qua các hạt. Số lượng và hướng của ánh sáng tán xạ bởi các hạt,
được đo bởi các mảng dò quang học, sau đó được phân tích để xác định sự
phân bố kích thước hạt.
Hình 2.15 Sơ đồ hệ thống nạp mẫu và xác định kích thước Microtrac ba chùm tia
31
Các thông số hệ thống Microtrac S3500 cung cấp để xác định kích thước
hạt và độ đồng đều kích thước tiểu phân:
- MV (mean volume diameter): là đường kính của sự phân bố thể tích,
trong thang micromet. Đây là một loại của đường kính trung bình.
- MA (Mean Area diameter): Đường kính diện tích trung bình trong
thang đo micromet được tính toán từ sự phân bố thể tích. Đại lượng này đại
diện cho kết quả đo lường dựa trên diện tích bề mặt hạt.
- MN (mean number diameter): trong thang đo micromet, là đường kính
trung bình của sự phân bố theo số lượng. Đây là một loại kích thước hạt trung
bình liên quan đến số lượng hạt.
- SD (Standard Deviation): mô tả chiều rộng của sự phân bố kích thước
hạt.
- Percentiles: kích thước hạt được lựa chọn theo tỷ lệ phần trăm. Giá trị
kích thước hạt tại 50% được xem là như là kích thước hạt trung bình. Giá trị
này có thể thay thế cho các loại kích thước khác.
2.3.5.2 Hiệu suất niosome hóa

Hiệu suất niosome hóa hay phần trăm dược chất niosome hóa là tỷ lệ
dược chất liên kết với chất mang so với lượng dược chất dùng khi bào chế:
Trong đó:
H: Hiệu suất niosome hóa (hay hiệu suất mang metformin của niosome).
m0, m: Khối lượng metformin tổng và lượng metformin tự do.
Giá trị này thay đổi rất nhiều theo bản chất và loại niosome cũng như
kích thước của hạt niosome tạo thành. Để xác định khả năng niosome hóa cần
xác định hàm lượng dược chất trong niosome hoặc xác định phần dược chất
không được niosome hóa sau khi đã tách riêng niosome bằng một số phương
pháp như: thẩm tích, li tâm,…
- Phương áp thẩm tích: phải lựa chọn túi thẩm tích có kích thước lỗ xốp
phù hợp nhằm loại được dược chất tự do nhưng vẫn còn giữ lại được các tiểu
phân niosome. Trong quá trình thẩm tích, hệ cần được giữ ở nhiệt độ ổn định,
có thể thay môi trường nhiều lần hoặc có thể bơm nhu động để loại bỏ hết
phần dược chất tự do. Dung dịch sau khi thẩm tích được định lượng bằng
phương pháp thích hợp. Phương pháp này thường áp dụng với dược chất tan
trong nước.
32
Hình 2.16 Hệ thống thẩm tích quy mô phòng thí nghiệm

- Phương pháp li tâm: thường được áp dụng cho các dược chất không tan
trong nước để loại bỏ phần dược chất tự do kết tủa. Tuy nhiên, phương pháp
này đòi hỏi lực li tâm lớn nên dễ dẫn đến vỡ các hạt niosome gây rò rỉ dược
chất, ảnh hưởng không tốt đến hiệu suất niosome hóa.
- Ngoài ra, người ta có thể tách dược chất tự do bằng phương pháp lọc
gel (Sephadex). Phương pháp này thực hiện nhanh và có độ chính xác cao, tuy
nhiên, chi phí thực hiện khá cao.
2.3.5.3 Độ ổn định của niosome

Vấn đề quan trọng nhất liên quan đến độ ổn định của niosome là sự kết
tụ của các hạt niosome và khả năng các hạt bị vỡ gây rò rỉ dược chất do lớp vỏ
niosome bị tăng tính thấm trong quá trình bảo quản[71]. Các hiện tượng này sẽ
làm thay đổi động học giải phóng dược chất khi sử dụng. Do đó cần nghiên
cứu kỹ tính ổn định của niosome trong quá trình bảo quản.
Độ bền của niosome cũng được đánh giá ở những điều kiện khác nhau
như dùng tia UV, ánh sáng huỳnh quang chiếu vào hệ phân tán sau những
khoảng thời gian nhất định[85]. Để tăng độ ổn định và kéo dài tuổi thọ của chế
phẩm, niosome có thể được bảo quản ở nhiệt độ thấp hoặc bào chế ở dạng
đông khô.
2.3.5.4 Giải phóng dƣợc chất

Đối với các tiểu phân nano được dùng làm giá mang dược chất phục vụ
cho mục đích điều trị. Do vậy, khi đưa vào cơ thể theo các đường khác nhau
33
các tiểu phân này thường giải phóng dược chất theo mô hình có kiểm soát.
Tương tự, đối với niosome cũng hình thành hai dạng:
- Giải phóng kéo dài: thường gặp ở các loại niosome dùng ngoài da.
- Giải phóng tại đích điều trị: hay gặp ở các loại dùng ở niêm mạc (mắt,
đường tiêu hóa,…) do khả năng kết dính niêm mạc và giải phóng dược chất.
Cơ chế giải phóng dược chất của niosome chủ yếu là do sự phân hủy, rò
rỉ dần dược chất của lớp màng kép. Do đó, sự giải phóng phụ thuộc vào cấu
tạo, kích thước của niosome, vào thành phần màng và môi trường giải phóng.
Các hạt niosome nhiều lớp giải phóng dược chất chậm và kéo dài hơn niosome
đơn lớp.
Để đánh giá khả năng giải phóng dược chất từ niosome (cũng như các
tiểu phân nano khác như liposome, nanoemulsion,…) người ta thường dùng
các phương pháp như:
- Phương pháp thẩm tích: lấy một thể tích chính xác hỗn dịch niosome,
cho vào túi thẩm tích có kích thước lỗ xác định. Túi thẩm tích được đặt trong
một thể tích xác định của môi trường hòa tan, duy trì ở 37±0,5ºC, lắc hoặc
khuấy môi trường ở tốc độ thích hợp. Sau từng thời điểm, mẫu hòa tan được
lấy và định lượng bằng phương pháp phù hợp với từng dược chất.
- Phương pháp phân tán: được thực hiện đơn giản bằng cách phân tán
một thể tích chính xác hỗn dịch niosome trong môi trường hòa tan ở 37±0,5ºC,
lắc hoặc khuấy môi trường ở tốc độ thích hợp. Sau từng thời điểm, mẫu được
lấy và li tâm với tốc độ cao để kết tủa niosome. Định lượng phần dược chất ở
dịch li tâm hoặc phần còn lại trong niosome bằng phương pháp phù hợp với
từng dược chất. Hạn chế của phương pháp này là trong quá trình li tâm với tốc
độ cao, sẽ có một phần niosome bị vỡ gây ảnh hưởng đến việc xác định chính
xác lượng dược chất được giải phóng ra.
2.3.6 Một số ứng dụng trong dƣợc phẩm, mỹ phẩm
2.3.6.1 Dƣợc phẩm

Dạng phóng thích qua phổi
Liệu pháp điều trị qua đường hô hấp thường được sử dụng đối với bệnh
nhân hen. Tuy nhiên, liệu pháp này bị hạn chế bởi khả năng hấp thu kém đối
với một số dược chất do dược chất sẽ tiếp xúc với màng nhày ở niêm mạc
phổi. Để khắc phục tình trạng này, Terzano và cộng sự (2005)[86] đã phát triển
công thức bào chế niosome từ polysorbate 20 chứa beclomethasone
dipropionate dành cho bệnh nhân mắc bệnh phổi tắc ngẽn mãn tính. Nghiên
34
cứu trên đã cho thấy niosome có thể cải thiện khả năng thấm qua màng nhày,
giải phóng dược chất tại đích tác động, cũng như làm tăng hiệu quả điều trị.
Dạng thuốc dành cho protein và peptide
Ở các dạng thuốc thông thường có chứa các loại protein, khả năng
protein vào được hệ tuần hoàn là rất thấp do hoạt động của các enzyme phân
giải protein, sự chênh lệch pH, tính thấp qua biểu mô thấp. Do đó, việc phát
triển các dạng thuốc niosome chứa protein mang lại nhiều tiềm năng. Trong
đó, một nghiên cứu về insulin tái tổ hợp được bao bọc trong hệ thống niosome
hình thành từ polyoxyethylene alkyl ether cho những kết quả khả quan[87].
Insulin được bảo vệ trong lớp màng kép nên tránh khỏi các hoạt động phân
giải của -chymotrypsin, trypsin và pepsin. Thậm chí khi niosome được hình
thành từ Brij 92 còn cho kết quả tốt hơn, chỉ với 26% insulin được bao bọc
phóng thích sau 24 giờ. Những kết quả này cho thấy niosome có thể được phát
triển như một hệ mang thuốc dành cho protein và peptide.
Hóa trị liệu ung thư
Niosome là một phương tiện hiệu quả có khả năng đưa các dược chất
chống ung thư đến các khối u. Paolino và cộng sự (2008)[88] đã phát triển công
thức niosome chứa 5-fluorouracil để điều trị ung thư da. Nghiên cứu cho thấy
khả năng thấm dược chất của dạng bào chế cao hơn so với chỉ sử dụng dung
dịch thuốc đơn thuần. Ngoài ra, còn nhiều nghiên cứu về niosome với mục
tiêu mang các dược chất trị ung thư như: Niosomes doxorubicin (Uchegbu và
cộng sự, 1996)[89], niosome methotrexate (Chandraprakash và cộng sự,
1992)[90],…
Điều trị HIV/AIDS
Zidovudine thường được dùng cho các bệnh nhân AIDS nhưng lại bị hạn
chế bởi độc tính của nó và hiệu lực thấp. Một công thức niosome được phát
triển bởi Ruckmani và cộng sự (2010)[91] đã có thể khắc phục được những
nhược điểm của zidovudine. Nghiên cứu kết luận rằng niosome zidovudine sẽ
cung cấp khả năng giải phóng dược chất lâu dài và việc điều trị AIDS có hiệu
quả hơn.
35
Bảng 2.5 Một số ứng dụng của niosome đã được nghiên cứu
STT Dƣợc chất Ứng dụng Tác giả

Azmin et al -1985
Chandraprakash et al1992,1993
1 Methotrexate Trị vảy nến
Udupa et al- 1993
Lakshmi et al -2007
5,6- carboxy
2 Chất chuẩn đoán Baillie et al -1985
fluorescence
Sodium Baillie et al -1986
3 Bệnh Leishmaniasis
stibogluconate Carter et al -1989
4 Adriamycin Kháng ung thư Rogerson et al- 1987

Rogerson et al- 1988
5 Doxorubicin Kháng ung thư Cable et al -1989
Uchegbu et al -1995
6 Antimony Bệnh Leishmaniasis Hunter et al -1988
9-desglycinamide,
7 Peptides Yoshida et al -1992
8-arginine
8 Bovine serum albumin Protein Brewer and Alexander-1992
Flurbiprofen,
9 Chống viêm Reddy et al -1993
Piroxicam
10 Vincristine sulphate Kháng ung thư Parthasarthi et al -1994
11 Diclofenac Chống viêm Raja naresh et al -1994
Hofland et al -1994
12 Estradiol Hormone
Don et al-1997
Jain et al-1995,2006
13 Rifampicin Kháng lao
Mullaicharam et al- 2004
36
2.3.6.2 Mỹ phẩm
Kể từ khi được công ty mỹ phẩm L‘Oreal nghiên cứu và phát triển đầu
tiên vào năm 1975 cho đến nay, công nghệ sử dụng niosome vào mỹ phẩm
đang ngày càng phát triển cùng với số lượng sản phẩm ngày càng đa dạng.
Hình 2.17 Ứng dụng của niosome trong mỹ phẩm
37
Chương 3. Phương pháp nghiên cứu
CHƢƠNG 3
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm, thời gian, nguyên vật liệu và phƣơng tiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm và thời gian

- Địa điểm: các phòng thí nghiệm Hóa tại bộ môn Hóa, khoa Khoa học
Tự nhiên, đại học Cần Thơ.
- Thời gian thực hiện: Từ tháng 7/2015 đến tháng 11/2015.
3.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phƣơng tiện nghiên
cứu
3.1.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu

- Metformin hydrochloride
- Niosome
3.1.2.2 Nguyên vật liệu

Bảng 3.1 Nguyên vật liệu sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên nguyên vật liệu Nguồn gốc

1 Metformin hydrochloride Việt Nam
2 Tween 80 Trung Quốc
3 Span 80 Trung Quốc
4 Span 60 Trung Quốc
5 Diethyl ether Việt Nam
6 Potassium Kali dihydrophosphate Trung Quốc
7 Potassium chloride Trung Quốc
8 Sodium chloride Trung Quốc
9 Disodium hydrophosphate Trung Quốc
10 Ethanol Việt Nam
Túi thẩm tích MWCO (molecular
11 Mỹ
weight cut off) 8.000 và 14.000 D
12 Sulfuric acid Trung Quốc
13 Anhydride acetic Trung Quốc
38
3.1.2.3 Phƣơng tiện nghiên cứu
Hình 3.1 Máy quang phổ JENWAY Hình 3.2 Hệ thống xác định kích
6800UV/Vis thước hạt bằng laser Microtrac S3500
Hình 3.3 Máy quang phổ hồng ngoại Hình 3.4 Túi thẩm tích MWCO
Thermo NICOLET 6700 FT-IR 14.000 daltons
Hình 3.5 Kính hiển Hình 3.6 Máy li tâm Hình 3.7 Máy đo điểm
vi Olympus CH20 lạnh Mikro 220R nóng chảy Bibby
Stuart SMP3
- Máy khuấy từ IKA® RCT basic

- Máy đo pH Hana Hi 2221
- Hệ thống cô quay BIBBY RE 200
- Bể siêu âm Elma Transsonic T570
39
- Tủ sấy, tủ lạnh, bếp đun, kính hiển vi, cân phân tích và các dụng cụ
thủy tinh.
3.2 Quá trình nghiên cứu
3.2.1 Tách cholesterol từ mô não heo
3.2.1.1 Nguyên liệu

350 g mô não heo. Bảng 2.2 cho thấy hàm lượng cholesterol trong mô
não heo rất cao, thuận lợi cho quá trình tách chiết. Đồng thời, đây là một
nguyên liệu có giá thành rẻ, dễ tìm.
3.2.1.2 Tách chiết

Cholesterol được tách chiết từ mô não heo theo quy trình sau:
- Bƣớc 1: Chiết lipid toàn phần
Mô não heo được rửa sạch, loại bỏ màng nhày bên ngoài và nghiền nhỏ.
Cân khối lượng nguyên liệu ban đầu, cho vào cốc 250 mL. Cho tiếp vào cốc
hỗn hợp dung môi ethanol:diethyl ether (40:50), khuấy kỹ trong 5 phút. Sau đó
lọc lấy dung dịch vào một bình cầu 500 mL. Rửa phần rắn trên giấy lọc 2 lần
với dung môi diethyl ether, mỗi lần 25 mL.
- Bƣớc 2: Thủy phân
Cho vào bình cầu trên 25 mL dung dịch KOH 15% trong ethanol và đun
hoàn lưu trong 25 phút.
- Bƣớc 3: Chiết cholesterol
Sau khi đun, làm nguội bình cầu đến nhiệt độ phòng. Hỗn hợp trong bình
được chia làm 2 phần. Mỗi phần thêm 30 ml nước cất rồi chiết 3 lần, mỗi lần
với 25 ml diethyl ether. Gom các dịch chiết bên trên lại, chiết tiếp với 15 ml
dung dịch nước muối bão hòa. Phần dung dịch ether sau đó được làm khan với
Na2SO4 và cô quay áp suất thấp (diethyl ether có nhiệt độ sôi là 34-36ºC, do
đó cần chú ý nhiệt độ cô quay và áp suất trong suốt quá trình cô quay, tránh để
trào dung dịch qua bình dung môi và làm bẩn hệ thống máy cô quay).
- Bƣớc 4: Tinh chế sản phẩm
Sau khi bay hơi dung môi, phần rắn chứa cholesterol và một số tạp chất
khác, do đó cần kết tinh lại với methanol. Tiến hành hòa tan sản phẩm trong
methanol nóng, dùng than hoạt tính để khử màu, lọc nóng dưới áp suất kém.
Sau đó làm lạnh để cholesterol kết tinh. Lọc lấy tinh thể cholesterol, làm khô.
40
Cân, tính hiệu suất tách và cho một lượng tương ứng 1% nipazin vào để bảo
quản.
Quá trình tách cholesterol được tóm gọn trong sơ đồ ở Hình 3.8.
Nguyên liệu
Chiết với hỗn hợp

Nghiền nhỏ ethanol:diethyl
ether = 40:50
Dịch chiết chứa cholesterol,
chất béo và một số chất khác
Thủy phân với dung
Đun hoàn lưu dịch KOH 15%
trong ethanol
Dung dịch chứa cholesterol,
glycerol, xà phòng và một
số chất khác
Thêm nước, chiết
với diethyl ether
Dung dịch ether chứa Dung dịch ethanol-nước

cholesterol và một số chứa glycerol, xà phòng
tạp chất và một số chất khác
Làm khan Bay hơi

dung môi
Phần rắn chứa cholesterol
và một số tạp chất
Kết tinh lại với

methanol, khử màu
bằng than họa tính
Tinh thể cholesterol
Hình 3.8 Quy trình chiết tách cholesterol từ mô não heo
41
3.2.1.3 Định tính

a) Xác định nhiệt độ nóng chảy
- Chuẩn bị cholesterol: cholesterol sau khi làm khô hoàn toàn được
nghiền thành bột mịn bằng cối sứ.
- Dụng cụ đo: Thí nghiệm được tiến hành với máy đo điểm chảy Bibby
Stuart SMP3. Sử dụng ống mao quản thủy tinh, hở hai đầu, có chiều dài 40
mm, đường kính trong từ 1 đến 1,2 mm.
- Tiến hành thí nghiệm: Dùng đèn cồn hơ kín một đầu ống mao quản,
cho một lượng mẫu vừa đủ vào ống sao cho đạt được độ cao khoảng 2 mm.
Đặt ống vào khe đo và bắt đầu cho máy tăng nhiệt độ. Quan sát chặt chẽ sự
thay đổi trạng thái của chất rắn trong ống. Khi nhìn thấy mẫu bắt đầu chảy thì
nhấn nút ―Stop" trên dụng cụ và ghi nhận nhiệt độ, tiến hành tương tự để xác
định nhiệt độ nóng chảy hoàn toàn. Nhiệt độ nóng chảy của một chất là trung
bình của hai nhiệt độ trên. Thông thường với một chất tinh khiết, nhiệt độ bắt
đầu nóng chảy và nóng chảy hoàn toàn thường rất gần nhau (chênh lệnh trong
khoảng 0,5-1ºC), vì vậy cần phải quan sát cẩn thận trong quá trình tiến hành
thí nghiệm. Để đảm bảo độ chính xác cao thí nghiệm cần lập lại 3 lần và lấy
kết quả trung bình.
b) Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Thí nghiệm được tiến hành dựa vào phương pháp tách cholesterol và
acylglycerol, acid, amide béo bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) được thiết kế bởi
Alexander Bilyk và cộng sự (1991)[92].
- Chuẩn bị mẫu: Hòa tan 1 mg mẫu trong 0,1 mL dung môi chloroform.
- Chuẩn bị dung môi giải ly: Dung môi giải ly gồm 2 hệ. Hệ A gồm các
dung môi toluene:diethyl ether:ethyl acetate:acetic acid tỷ lệ về thể tích tương
ứng là 75:10:13:1.2. Hệ B gồm hexane:diethyl ether:formic acid có tỷ lệ thể
tích 80:20:2. Cho mỗi hệ vào một bình giải ly kín và được bão hòa dung môi
bằng cách cho vào bình một tờ giấy lọc, lắc bình để trộn đều dung môi và để
yên trong 5 phút. Chỉ nên giải ly khi dung môi đã thấm ướt hết giấy lọc.
- Tiến hành giải ly: Sử dụng bản mỏng silica gel GF254 dài 14 cm và rộng
2 cm, hoạt hóa ở nhiệt độ 120ºC trong 30 phút. Dùng ống mao quản thủy tinh
(đường kính trong 1 mm), hơ nóng chảy và kéo dài một đầu để hút dung dịch
mẫu. Chấm cẩn thận từng lượng nhỏ mẫu lên bản mỏng tại vạch xuất phát, vết
chấm cần nhỏ, tròn với lượng mẫu thích hợp. Đặt bản mỏng vào bình giải ly
với hỗn hợp dung môi A, cho dung môi A giải ly lên đến độ cao 8 cm (tính từ
vạch xuất phát) lấy bản mỏng ra khỏi bình, để khô tự nhiên trong không khí.
42
Khi bản mỏng đã khô, tiếp tục cho vào bình và giải ly với hỗn hợp dung môi B
đến vạch giới hạn (tương đương đường đi của dung môi B là 14 cm). Sau khi
được làm khô ngoài không khí, nhúng bản mỏng vào dung dịch vanilin trong
sulfuric acid 20% và nước trên bếp điện để hiện hình.
c) Phản ứng màu Leibermann-Burchard
Chuẩn bị thuốc thử: dùng ống hút thủy tinh lấy 5 giọt anhydride acetic và
1 giọt acid sulfuric vào hũ bi nhỏ, lắc đều.
Tiến hành: lấy một ít tinh thể mẫu thử hòa tan vào 1 mL chloroform. Sau
đó cho dung dịch thuốc thử đã chuẩn bị bên trên vào và lắc đều. Quan sát và
ghi nhận sự thay đổi màu sắc của hỗn hợp.
d) Quang phổ hồng ngoại FT-IR
Cho một lượng nhỏ tinh thể khoảng 0,01 g cholesterol vào cối mã não,
thêm một lượng vừa đủ bột KBr (dùng cho IR) vào cối. Dùng chày trộn nghiền
đến khi hỗn hợp đồng nhất. Cho hỗn hợp vào khuôn và tiến hành ép viên với
máy ép mẫu.
Hình 3.9 Khuôn và thiết bị ép mẫu chuyên dùng cho FT-IR

Mẫu đã chuẩn bị được quét phổ bằng máy quang phổ hồng ngoại Thermo
NICOLET 6700 FT-IR, dữ liệu được xử lý bằng phần mềm OMNIC để cho ra
phổ FT-IR hoàn chỉnh. Dựa vào các peak đặc trưng trên phổ đồ, so sánh với
phổ chuẩn (Phụ lục A) của cholesterol để xác định cấu trúc phân tử của sản
phẩm tách chiết được.
43
3.2.2 Đánh giá metformin sử dụng trong nghiên cứu
3.2.2.1 Thử độ hòa tan

Chuẩn bị 4 lọ thủy tinh nhỏ, cân 0,01 g metformin cho lần lượt vào các
lọ. Cho 1 mL các loại dung môi ethanol, nước cất, acetone, methylene chloride
lần lượt vào các lọ, lắc đều và để yên. Quan sát mức độ hòa tan trong từng loại
dung môi.
3.2.2.2 Quét phổ hồng ngoại (FT–IR)

Mẫu metformin được chuẩn bị và tiến hành quét phổ tương tự như quét
phổ cholesterol (phần d mục 3.2.1.3). Dựa vào các peak đặc trưng trên phổ đồ,
so sánh với phổ chuẩn IP[93] (Indian Pharmacopoeia 2010) để xác định cấu trúc
của metformin sử dụng so với chất chuẩn.
3.2.2.3 Quét phổ tử ngoại – khả kiến

Cân lượng chính xác 0,005 g metformin, hòa tan trong dung dịch đệm
PBS pH 7,4 và định mức đến thể tích 50 mL. Nồng độ sau định mức đạt 10
µg/mL.
Tiến hành quét phổ tử ngoại-khả kiến bằng máy quang phổ JENWAY
6800UV/Vis. Cài đặt bước sóng quét trong khoảng 200-400 nm. Đầu tiên quét
trừ nền mẫu trắng là dung dịch đệm PBS pH 7,4, rồi quét mẫu đã được chuẩn
bị trước đó. Sau khi quét, thu được phổ hấp thụ, dựa vào phổ đồ xác định được
bước sóng hấp thu cực đại của metformin.
3.2.2.4 Xác định nhiệt độ nóng chảy

Ống mao quản được hàn kín một đầu bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn
cồn, sau đó cho một lượng nhỏ metformin vào đáy ống. Tiến hành đo nhiệt độ
nóng chảy bằng máy đo điểm nóng chảy Bibby Stuart SMP3. Ghi nhận lại
nhiệt độ bắt đầu nóng chảy và nóng chảy hoàn toàn của metformin. Lập lại thí
nghiệm 3 lần và xác định nhiệt độ nóng chảy trung bình.
3.2.3 Bào chế niosome bằng kỹ thuật hydrat hóa film mỏng
Bào chế niosome bằng phương pháp hydrat hóa film mỏng dựa theo mô
tả ở mục 2.3.4.1 phần a. Tuy nhiên phương pháp có sửa đổi, bổ sung cho phù
hợp với điều điện phòng thí nghiệm và mục đích thí nghiệm.
Phương pháp đưa metformin vào các tiểu phân niosome, được chia thành
hai phương pháp nhỏ trong quá trình bào chế là:
44
- Phương pháp thụ động (phương pháp A): metformin được đưa vào hệ
trong quá trình bào chế và không sử dụng thêm bất kỳ phương pháp nào giúp
đưa metformin vào bên trong các tiểu phân niosome.
- Phương pháp chủ động (phương pháp B): metformin được đưa vào
niosome trong quá trình hydrat hóa (sử dụng môi trường có tính acid), sau đó
hệ được bổ sung thêm dung dịch đệm có tính base, tiếp tục ủ khuấy, lợi dụng
sự chênh lệch pH để đưa metformin vào niosome.
Thiết kế công thức bào chế: với mục đích khảo sát ảnh hưởng của các
loại chất HĐBM khác nhau, ảnh hưởng của chỉ số HLB của chất/hỗn hợp chất
HĐBM đến hiệu suất niosome hóa (khả năng mang thuốc của hệ) và độ bền
của hệ. Nên các công thức được thiết kế với 3 loại chất HĐBM chính là T80,
Sp80 và Sp60. Ba công thức được thiết kế chỉ có sự tham gia của một chất
HĐBM, hai công thức là hỗn hợp của T80+Sp80 và T80+Sp60, tỷ lệ khối
lượng được phối hợp sao cho chỉ số HLB của hỗn hợp là 8,6. Lượng
cholesterol thêm cho vào công thức được tính toán sao cho có tỷ lệ mol 1:1
với chất HĐBM.
Thành phần các công thức được thể hiện ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2 Thành phần các công thức niosome
Công thức 1 2 3 4 5
Pha hữu cơ
Cholesterol (mmol) 0,475 0,475 0,475 0,475 0,475
T80 (mmol) 0,475 − 0,085 − 0,396
Sp80 (mmol) − 0,475 0,389 − −
Sp60 (mmol) − − − 0,475 0,079
Diethyl ether (mL) 10 10 10 10 10
Pha nước (mL) 10 10 10 10 10
45
Bào chế niosome metformin theo phương pháp thụ động
Cholesterol, chất HĐBM

không ion
Lắc kỹ để tạo dung Hòa tan bằng 10 mL

dịch đồng nhất Diethyl ether vào
bình cầu
Metformin hydrochloride Hỗn hợp Lipid
Hòa tan vào 10 mL Cô quay ở nhiệt

dung dịch đệm độ 50±2ºC, tốc độ
phosphate pH 7,4 50 vòng/phút đến
khi hết dung môi
Dung dịch chứa metformin Lớp film mỏng
Đun cách thủy từng phần đến 70±2ºC
Phối hợp từ từ phần dung Khuấy trên máy khuấy từ với tốc
dịch chứa metformin vào độ 1.500 vòng /phút và giữ nhiệt
bình cầu độ ổn định ở 70±2ºC trong 1 giờ
Hệ niosome metformin
thô
Siêu âm trong 15 hoặc

30 phút ứng với từng
công thức khảo sát
Niosome metformin
Hình 3.10 Sơ đồ bào chế niosome metformin theo

phương pháp thụ động
46
Mô tả phương pháp thụ động (phương pháp A):

- Cân và hòa tan các CHĐBM không ion, cholesterol (Bảng 3.2) trong 10
mL dung môi diethyl ether. Cần hòa tan hoàn toàn, lắc kỹ để đảm bảo các chất
được trộn lẫn trong dung dịch.
- Cho hỗn hợp trên vào bình cầu 50 mL, cô quay chân không với tốc độ
50±5 vòng/phút ở nhiệt độ 50±2ºC. Chỉ cho hệ thống quay không bật máy tạo
áp suất thấp, cho bình cầu vào quay khi nước trong nồi nung còn nguội đến
khi đạt 50±2ºC và tiếp tục quay ở nhiệt độ này. Điều này giúp dung môi bay
một cách từ từ, không quá nhanh, sẽ cho tác dụng tạo lớp màng kép tốt. Quá
trình cô quay thực hiện trong khoảng 30 phút.
Hình 3.11 Cô quay chân không loại dung môi
- Sau khi cô cạn dung môi, tiếp tục thổi khí nitrogen trong 2 giờ hoặc để
trong tủ hút qua đêm để loại tối đa lượng dung môi còn lại. Khi diethyl ether
được loại hoàn toàn, các chất tạo màng niosome sẽ tạo lớp film mỏng bám trên
thành bình cầu.
Hình 3.12 Lớp màng mỏng được hình thành sau khi loại hết dung môi
của công thức 4 và 5
47
- Cân 0,05 g metformin, hòa tan vào 10 mL dung dịch đệm PBS pH 7,4
và đun cách thủy đến 70±2ºC, cần đậy kín nắp, tránh bay hơi nước làm thay
đổi thể tích hydrat hóa.
- Bình cầu chứa màng niosome đã khô dung môi, cũng được đun cách
thủy đến 70±2ºC. Nhiệt độ được lựa chọn là do quan sát bằng thực nghiệm, tại
nhiệt độ này, hỗn hợp chất HĐBM và cholesterol từ dạng rắn như sáp bắt đầu
chảy lỏng (Riêng công thức 1, thành phần màng gồm T80 và cholesterol khi
loại hết dung môi thì không đóng rắn lại như các công thức khác, nên hỗn hợp
này chỉ được nung cách thủy đến 40±2ºC).
Hình 3.13 Điều chỉnh nhiệt độ ổn định ở 70±2oC
- Tiến hành hydrat hóa: cho dung dịch thuốc vào bình cầu giữ nhiệt độ ổn
định 70±2ºC, tốc độ khuấy 1.500 vòng/phút trong 1 giờ. Sau khi khuấy xong,
tiến hành siêu âm ở 15 và 30 phút. Sản phẩm tạo ra được cho vào lọ thủy tinh,
đậy kín nắp, bảo quản ở 2-8ºC.
Hình 3.14 Hydrat hóa ở 70±2ºC.
48
3.2.3.1 Bào chế niosome metformin theo phƣơng pháp chủ động
Cholesterol, Chất HĐBM

không ion
Lắc kỹ để tạo Hòa tan bằng 10

dung dịch đồng mL Diethyl ether
nhất vào bình cầu
Metformin hydrochloride Hỗn hợp Lipid
Cô quay ở nhiệt độ
Hòa tan vào 5 mL
phòng, tốc độ 50±5
dung dịch NaCl, chỉnh
vòng/phút đến khi
về pH 4,5
hết dung môi
Dung dịch metformin pH 4,5 Lớp film mỏng
Đun cách thủy từng phần đến 70±2oC

Phối hợp từ từ phần dung Khuấy trên máy khuấy từ
dịch chưa metformin vào với tốc độ 1.500 vòng /phút
bình cầu và giữ nhiệt độ ổn định ở
70±2oC trong 1 giờ
Hệ niosome metformin
thô
Siêu âm trong 30 phút
Niosome metformin mịn
Thêm 5 mL dung Khuấy trên máy khuấy

dịch đệm phosphate từ với tốc độ 500
pH 7,4 vòng/phút trong 1 giờ
Niosome metformin
Hình 3.15 Sơ đồ bào chế niosome metformin theo

phương pháp chủ động
49
Mô tả phương pháp chủ động (phương pháp B):

- Quá trình tạo film mỏng được tiến hành tương tự như phương pháp bắt
giữ thuốc thụ động.
- Cân 0,05 g metformin, hòa tan vào 5 mL dung dịch đẳng trương NaCl
0,9%, chỉnh về pH 4,5 bằng dung dịch acid citric 10% và đun cách thủy đến
70±2ºC.
- Bình cầu chứa màng niosome cũng được điều nhiệt đến 70±2ºC.
- Phối hợp 2 phần trên lại với nhau và khuấy ở tốc độ 1.500 vòng/phút
trong 1 giờ. Duy trì nhiệt độ 70±2ºC trong suốt quá trình khuấy.
- Siêu âm hỗn hợp trong 30 phút.
- Thêm tiếp 5 mL dung dịch PBS pH 7,4 và ủ khuấy hỗn hợp với tốc độ
500 vòng/phút trong 1 giờ.
- Sản phẩm tạo ra được cho vào lọ thủy tinh đậy kín nắp và bảo quản ở 2-
8ºC.
3.2.4 Đánh giá niosome metformin sau bào chế
3.2.4.1 Xác định hình dạng tiểu phân niosome bằng kính hiển vi
quang học
Cho một giọt hỗn dịch sản phẩm lên miếng lam bằng thủy tinh và đặt lên
trên giọt lỏng bằng một miếng lamen thủy tinh. Miếng lamen giúp hỗn dịch
trải đều và phẳng trên bề mặt lam, giảm sự tập trung cao, khó quan sát. Cần
đặt lamen lên giọt lỏng nhẹ nhàn từ một cạnh nhất định, tránh bọt khí xuất
hiện trong trong mẫu quan sát. Xem hình dạng và kích thước của tiểu phân
bằng vật kính thích hợp.
3.2.4.2 Xác định kích thƣớc và phân bố kích thƣớc của các tiểu phân
niosome
Các tiểu phân niosome được xác định kích thước và phân bố kích thước
bằng máy laser Microtrac S3500. Hỗn dịch sản phẩm được cho từng lượng
nhỏ vào máy đến khi đạt nồng độ tiêu chuẩn. Sau khi đo, kết quả là đồ thị và
bảng số liệu chỉ ra sự phân bố kích thước của hệ niosome.
Đánh giá kết quả dựa vào đồ thị phân bố kích thước theo thể tích và kích
thước hạt trung bình.
50
3.2.4.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng metformin bằng đo

quang phổ hấp thụ UV-Vis
Quét phổ hấp thu UV-Vis của dung dịch metformin trong hệ đệm PBS
pH 7,4 có nồng độ 10 µg/mL để xác định các cực đại hấp thu.
Chọn bước sóng hấp thu cực đại để đo đường chuẩn.
Xây dựng đường chuẩn metformin ở bước sóng đã chọn với các nồng độ
tương ứng 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 µg/mL như sau: cân chính xác 0,002 g
metformin trong cốc thủy tinh 50 mL. Hòa tan bằng lượng nhỏ dung dịch đệm
PBS rồi cho vào bình định mức 100 mL. Tráng cốc thủy tinh 3 lần bằng dung
dịch đệm trên và cho hết vào bình định mức. Định mức đến vạch. Rút tương
ứng 1, 2, 3, 4, 5, 6 mL cho vào các bình định mức 10 mL và định mức đến
vạch bằng dung dịch đệm PBS sẽ được các dung dịch chuẩn có nồng độ 2, 4,
6, 8, 10, 12 µg/mL. Tiến hành đo mật độ quang ở bước sóng đã chọn và xác
định phương trình hồi quy tuyến tính.
Việc xây dựng đường chuẩn giúp xác định khoảng tuyến tính của nồng
độ dung dịch metformin và mật độ quang. Các lần đo sau để xác định tỷ lệ
niosome hóa metformin chỉ cần pha một nồng độ dung dịch chuẩn xác định và
đo lặp lại lấy giá trị trung bình. Căn cứ vào kết quả mật độ quang của mẫu đo
và dung dịch chuẩn mà quy đổi ra nồng độ tương ứng.
3.2.4.4 Xác định hiệu suất niosome hóa metformin

Hiệu suất niosome hóa metformin thể hiện khả năng niosome đưa
metformin bên trong cấu trúc của nó, giúp bảo vệ và phóng thích kéo dài
metformin ra môi trường bên ngoài. Lượng metformin không vào được bên
trong cấu trúc niosome được gọi là metformin tự do. Để xác định hiệu suất
niosome hóa, cần xác định lượng thuốc được niosome bắt giữ hay lượng
metformin tự do. Do điều kiện hạn chế của phòng thí nghiệm, không có hệ
thống sắc ký lọc gel và hệ thống lọc tiếp tuyến để tách riêng niosome với
lượng metformin tự do, nên nghiên cứu sử dụng phương pháp lọc tách bằng
túi thẩm tích.
Thí nghiệm được mô tả như sau: Rút 1 mL hỗn dịch cho vào túi thẩm
tích, buộc kín 2 đầu và cho vào dung dịch đệm. Môi trường đệm bên ngoài là
50 mL dung dịch PBS chứa trong bình tam giác 100 mL. Treo túi thẩm tích lơ
lửng trong bình sao cho phần hỗn dịch bên trong túi ngập trong dung dịch môi
trường. Giữ hệ trong khoảng thời gian khảo sát ở nhiệt độ phòng.
51
Hình 3.16 Quy trình thử nghiệm hiệu suất niosome hóa
Để xác định kích thước lỗ trên túi thẩm tích có cho phân tử meformin tự
do đi qua hay không, thì tiến hành thí nghiệm với dung dịch metformin có
nồng độ biết trước và các túi thẩm tích có kích thước lỗ khác nhau. Cho 1 mL
dung dịch metformin có nồng độ 10 µg/mL vào 2 túi thẩm tích MWCO 8.000
và 14.000 D. Treo túi ngập trong 50 mL dung dịch đệm PBS pH 7,4 ở nhiệt độ
phòng và sau các khoảng thời gian 2, 4, 5, 6, 12 giờ rút 5 mL dung dịch bên
ngoài túi thẩm tích để đo mật độ quang. Nếu có sự chênh lệch mật độ quang
với mẫu trắng (dung dịch đệm PBS pH 7,4) thì xác định metformin đi qua
được túi thẩm tích đó và ngược lại, metformin không qua được túi thẩm tích.
Đối với túi thẩm tích cho phân tử metformin đi qua thì định lượng nồng
độ ở các khoảng thời gian rút ra cho đến khi kết quả định lượng không có sự
thay đổi thì xem như lượng metformin tự do đã được tách hết. Từ đó, xác định
thời gian cần thiết để tiến hành thử niosome hóa.
Thiết kế thí nghiệm xác định tỷ lệ niosome hóa tương tự như xác định
khả năng thẩm tích của túi thẩm tích và thực hiện ở thời gian đã xác định từ thí
nghiệm trên. Lượng sản phẩm được dùng để thử nghiệm là 1 mL.
Tỷ lệ niosome hóa được xác định theo công thức sau:
Trong đó:
H: Hiệu suất niosome hóa (hay hiệu suất mang metformin của niosome.
m0, m: Khối lượng metformin tổng và lượng metformin tự do.
3.2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu

Mỗi thí nghiệm được lập lại tối thiểu 3 lần và lấy kết quả theo giá trị
trung bình. Các số liệu được xử lý thống kê để xác định giá trị trung bình ̅ và
sai số tuyệt đối.
Xử lý thống kê bằng phần mềm Microsoft Office Excell để tính toán các
đại lượng thống kê.
52
Chương 4. Kết quả và thảo luận
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tách chiết cholesterol từ mô não heo
4.1.1 Hiệu suất tách chiết cholesterol

Tiến hành chiết cholesterol 3 lần, tính toán hiệu suất chiết và hiệu suất
trung bình của ba lần chiết. Kết quả được hiển thị ở Bảng 4.1.
Bảng 4.1 Hiệu suất chiết tách cholesterol
Khối lƣợng Khối lƣợng Hiệu Hiệu suất

Khối lƣợng
Lần nguyên liệu cholesterol cholesterol suất chiết trung
chiết theo lý thuyết thu đƣợc chiết bình
(g)
(g) (g) (%) (%)
1 100 2,195 1,751 79,72
2 105 2,305 1,924 83,48 83,06 ± 0,24
3 107 2,349 2,018 85,92
Hình 4.1 Tinh thể cholesterol được hình thành trong dung dịch methanol
53
Hình 4.3 Cholesterol trước khi kết tinh lại Hình 4.2 Cholesterol sau khi kết tinh lại
4.1.2 Định tính
4.1.2.1 Phản ứng với thuốc thử Liebermann-Burchard

Sản phẩm sau khi tách từ mô não
heo cho kết quả dương tính với phản ứng
màu Leibermann-Burchard. Như vậy,
trong sản phẩm tách có cholesterol.
Hình 4.4 Kết quả thử nghiệm theo

phương pháp Leibermann-Burchard
54
4.1.2.2 Sắc ký lớp mỏng
a b
Hình 4.5 Kết quả TLC (a) theo phương pháp Alexander Bilyk và cộng sự (1991); (b)
TLC so sánh với cholesterol trên thị trường (vết bên trái là sản phẩm tách được, vết
bên phải là cholesterol được cung cấp bởi công ty Sigma-Aldrich của Mỹ).
Dựa vào hình (a) ta thấy trên bản mỏng chỉ xuất hiện một vết tròn màu
tím và không xuất hiện vết tạp. Hình (b), khi so với cholesterol thương mại
trên thị trường cho thấy chúng có giá trị Rf tương đương và chỉ xuất hiện một
vết tròn. Như vậy có thể kết luận, sản phẩm sau tinh chế có hàm lượng
cholesterol cao và tương đương với sản phẩm thương mại.
4.1.2.3 Đo nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy của cholesterol được tiến hành đo 3 lần. Kết quả
được thể hiện trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2 Nhiệt độ nóng chảy của cholesterol
Lần đo To bắt đầu nóng chảy To nóng chảy hoàn toàn TTB
1 147,8 148,9 148,35
2 147,5 148,7 148,10
3 148,0 149,3 148,65
4.1.2.4 Quang phổ hồng ngoại FT-IR

Kết quả quét phổ FT-IR được thể hiện trong Hình 4.6.
55
Hình 4.6 Phổ FT-IR của cholesterol

Kết quả so sánh với phổ chuẩn của cholesterol (Phụ lục A) được hiển
thị trong Bảng 4.3.
Bảng 4.3 Kết quả giải phổ FT-IR của cholesterol tách được
Dao động
Dao động Stretching cm-1
Liên kết Bending cm-1
đặc trƣng C-H C-H C-H
O-H C=C C-O C-H
(Olefinic) (béo) (béo)
Cholesterol 3437 2933 2902 1631 1056 1467 1381
chuẩn
Choleterol 3432 2927 2853 1649 1052 1465 1375
tách
Như vậy, cholesterol tách được có các tín hiệu peak đặc trưng tương
ứng với phổ chuẩn.
56
4.2 Đánh giá metformin sử dụng trong nghiên cứu
4.2.1 Độ tan
Metformin tan tốt trong nước, tan ít trong ethanol, không tan trong
acetone và methylene chloride.
4.2.2 Nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy của metformin hydrochloride được tiến hành đo 3
lần. Kết quả được thể hiện trong Bảng 4.4.
Bảng 4.4 Nhiệt độ nóng chảy của metformin hydrochloride
Lần đo To bắt đầu nóng chảy To nóng chảy hoàn toàn TTB
1 231,2 233,6 232,40
2 231,8 232,9 232,35
3 231,6 233,0 232,30
Từ kết quả đo nhiệt độ nóng chảy so với tài liệu (232˚C), kết quả cho
thấy không có sự chênh lệch có ý nghĩa thống kê. Vì vậy, metformin sử dụng
là khá tinh khiết.
4.2.3 Phổ hồng ngoại FT-IR

Kết quả quét phổ FT-IR được thể hiện trong Hình 4.7.
57
Hình 4.7 Phổ FT-IR của metformin hydrochloride
Sau khi so sánh với phổ chuẩn của metformin hydrochloride (Phụ lục
B) cho thấy đều có các tín hiệu peak đặc trưng tương ứng với phổ chuẩn.
Bảng 4.5 Kết quả giải phổ FT-IR của metformin hydrochloride
Liên kết Dao động Stretching cm-1 Dao động Bending cm-1
đặc trƣng N-H C=N C-N C-N N-H C-H C-H
Metformin 3394 1672 1063 1169 1584 1448 1419
chuẩn
Metformin 3371 1627 1060 1167 1567 1448 1415
sử dụng
4.3 Đánh giá niosome metformin sau bào chế
4.3.1 Xác định hình dạng tiểu phân niosome bằng kính hiển vi
Hình ảnh tiểu phân chụp dưới kính hiển vi được trình bày ở Phụ lục C.
Các tiểu phân niosome từ các công thức đa số có kích thước lớn, khoảng
thay đổi kích thước khá rộng, công thức có kích thước trung bình nhỏ nhất là
0,597 µm và lớn nhất lên đến 9,81 µm. Do đó có thể quan sát một số mẫu
bằng kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần. Dưới kính hiển vi hình ảnh các
58
tiểu phân là dạng hình tròn, rời nhau và chuyển động. Riêng công thức 1 các
tiểu phân có xu hướng kết tụ lại, không có sự hình thành cấu trúc khối cầu
giống như các công thức khác.
4.3.2 Xác định kích thƣớc và phân bố kích thƣớc của các tiểu phân
niosome
Kết quả xác định kích thước và phân bố kích thước của tiểu phân
niosome được trình bày ở Phụ lục D.
Bảng 4.6. Kích thước tiểu phân niosome của các công thức
Chất Thời gian siêu âm Kích thƣớc hạt trung bình

Công thức
HĐBM (phút) (m)
A1.15 T80 15 3,7
A1.30 T80 30 6,03
A2.15 Sp80 15 1,426
A2.30 Sp80 30 0,597
A3.15 T80 + Sp80 15 2,657
A3.30 T80 + Sp80 30 2,633
A4.15 Sp60 15 2,359
A4.30 Sp60 30 0,762
A5.15 T80 + Sp60 15 3,04
A5.30 T80 + Sp60 30 2,653
B1 T80 30 4,89
B2 Sp80 30 2,202
B3 T80 + Sp80 30 2,457
B4 Sp60 30 9,81
B5 T80 + Sp60 30 5,9
Đa số các công thức tạo ra tiểu phân niosome có kích thước tương đối
lớn và thay đổi từ 0,597 µm đến 9,81 µm. Kích thước trung bình bị ảnh hưởng
bởi thành phần tạo màng niosome, thời gian siêu âm và phương pháp đưa
dược chất vào niosome.
a) Ảnh hƣởng của thành phần màng đến kích thƣớc hạt niosome
Các chất HĐBM khác nhau trong các công thức tạo ra các tiểu phân
niosome có kích thước không giống nhau, trong đó, công thức với sự tham gia
của Sp80 ở cả 2 phương pháp và thời gian siêu âm đều có kích thước hạt nhỏ
hơn các công thức khác.
59
b) Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến kích thƣớc hạt niosome
Sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm lên kích thước hạt niosome được thể
hiện ở Bảng 4.7 và đồ thị ở Hình 4.8.
Bảng 4.7 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến kích thước hạt niosome
Kích thƣớc hạt (m)

Chất
Công thức Chỉ số HLB Siêu âm 15 Siêu âm 30
HĐBM
phút phút
1 T80 15 3,7 6,03
2 Sp80 4,3 1,426 0,597
3 T80 + Sp80 8,6 2,657 2,633
4 Sp60 4,7 2,359 0,762
5 T80 + Sp60 8,6 3,04 2,653
6.03
6
Kích thƣớc hạt niosome (m)
3.70
4
2.66 2.633 3.04 2.653

3
2.36
2
1.43
0.762
1 0.597
0
Công thức 1 Công thức 2 Công thức 3 Công thức 4 Công thức 5
Siêu âm 15 phút Siêu âm 30 phút
Hình 4.8 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian siêu âm
đến kích thước hạt niosome
Nhận xét: Với phương pháp đưa metformin vào niosome bị động, thực
hiện siêu âm ở 2 khoảng thời gian là 15 phút và 30 phút sau bào chế để làm
60
giảm kích thước tiểu phân. Kết quả cho thấy khi siêu âm trong 30 phút đa số
các công thức có sự giảm đáng kể kích thước so với chỉ siêu âm trong 15 phút,
nhiều nhất là công thức 4 từ 2,36 µm xuống 0,762 µm. Ngược lại, công thức 1
khi được siêu âm trong 30 phút có sự tăng kích thước các tiểu phân từ 3,7 µm
lên 6,03 µm. Như vậy, siêu âm làm một phương pháp hữu hiệu và đơn giản để
làm giàm kích thước tiểu phân niosome sau bào chế. Tuy nhiên, không phù
hợp với hệ niosome với thành phần chất HĐBM không ion chỉ có tween 80.
c) Ảnh hƣởng của phƣơng pháp đƣa metformin vào niosome đến
kích thƣớc hạt niosome
Phương pháp đưa metformin vào các tiểu phân niosome có ảnh hưởng
đến kích thước hạt niosome tạo thành, kết quả được thể hiện ở Bảng 4.8 và đồ
thị Hình 4.9.
Bảng 4.8 Ảnh hưởng của phương pháp đưa metformin vào niosome
đến kích thước hạt niosome
Công Chất Kích thƣớc hạt (m)

thức HĐBM Phƣơng pháp A Phƣơng pháp B
1 T80 6,03 4,89
2 Sp80 0,597 2,202
3 T80 + Sp80 2,633 2,457
4 Sp60 0,762 9,81
5 T80 + Sp60 2,653 5,9
61
9.81
10
9
Kích thƣớc hạt niosome (m) 8
7
6.03 5.9
6
4.89
5
3 2.633 2.457 2.653

2.202
2
0.597 0.762
1
0
Phương pháp thụ động Phương pháp chủ động
Hình 4.9 Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của phương pháp đưa
metformin vào niosome đến kích thước hạt
Nhận xét: Các công thức 2, 4, 5 cho thấy phương pháp chủ động đưa
metfomrin vào niosome có sự tăng kích thước đáng kể so với phương pháp thụ
động. Trái lại, công thức 1 và 3 lại có sự giảm kích thước. Như vậy, phương
pháp đưa dược chất vào niosome có ảnh hưởng đáng kể đến kích thước hạt
niosome.
4.3.3 Xây dựng phƣơng pháp định lƣợng metformin bằng đo quang
phổ hấp thụ UV-Vis
4.3.3.1 Lựa chọn bƣớc sóng dùng cho các phép đo quang
Phổ hấp thụ UV-Vis của dung dịch metformin 10 µg/mL, ở bước sóng từ
200-400 nm.
62
ABS
1.8
1.6
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0 nm
200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
Hình 4.10 Phổ hấp thu UV/Vis của metformin ở bước sóng 200-400 nm
Từ phổ đồ ta thấy đỉnh hấp thu cực đại của metformin trong dung dịch
đệm PBS là 232-233 nm. Chọn bước sóng 232 nm để định lượng metformin.
4.3.3.2 Xây dựng đƣờng chuẩn đo quang

Kết quả đo độ hấp thụ, thiết lập đường chuẩn cho metformin ở bước sóng
232 nm được trình bày ở Bảng 4.9.
Bảng 4.9 Kết quả đo mật độ quang của các dung dịch metformin chuẩn ở
bước sóng 232 nm
Nồng độ Metformin
2 4 6 8 10 12
(µg/mL)
Độ hấp thụ 0,1645 0,3115 0,4614 0,6118 0,7713 0,9315
14
µg/mL
12 y = 13.044x - 0.0697
R² = 0.9997
10
8
6
4
2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 A
Hình 4.11 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ dung dịch metformin chuẩn và
độ hấp thụ ở bước sóng 232 nm
63
Phương trình hồi quy tuyến tính y = 13,044 – 0,0697 biểu thị mối quan
hệ giữa nồng độ dung dịch metformin và độ hấp thụ ở bước sóng 232 nm có
hệ số tương quan R2 (0,997) 1. Kết quả cho thấy có sự tương quan tuyến tính
giữa độ hấp thụ và nồng độ metformin trong khoảng khảo sát 2-12 µg/mL.
Như vậy có thể áp dụng phương pháp đo quang để định lượng metformin
trong khoảng khảo sát.
4.3.4 Xác định hiệu suất niosome hóa metformin

Dựa vào thí nghiệm xác định khả năng thẩm tích của túi thẩm tích với
dung dịch metformin trong đệm PBS xác định thời gian tiến hành thử nghiệm
hiệu suất niosome hóa là 12 giờ. Mặc dù trong thí nghiệm sau 2 giờ, lượng
metformin trong túi và môi trường ngoài gần như cân bằng (Phụ lục E.1),
nhưng hệ phân tán tạo ra có độ nhớt và nồng độ hạt cao hơn. Vì vậy thí
nghiệm chọn 12 giờ để khảo sát.
Bảng 4.10 Hiệu suất niosome hóa metformin
Chất Thời gian siêu âm Hiệu suất niosome hóa

Công thức
HĐBM (phút) (%)
A1.15 T80 15 19,88
A1.30 T80 30 19,93
A2.15 Sp80 15 5,40
A2.30 Sp80 30 4,45
A3.15 T80 + Sp80 15 19,73
A3.30 T80 + Sp80 30 18,35
A4.15 Sp60 15 13,98
A4.30 Sp60 30 16,84
A5.15 T80 + Sp60 15 11,40
A5.30 T80 + Sp60 30 18,22
B1 T80 30 35,14
B2 Sp80 30 30,23
B3 T80 + Sp80 30 36,32
B4 Sp60 30 33,77
B5 T80 + Sp60 30 33,37
64
Hiệu suất niosome hóa (hay khả năng mang metformin của niosome)
được thể hiện ở Bảng 4.10 cho thấy nó bị ảnh hưởng bởi phương pháp đưa
metformin vào niosome, thành phần tạo màng niosome, kích thước tiểu phân
và thời gian siêu âm.
a) Ảnh hƣởng của thành phần màng đến hiệu suất niosome hóa
Niosome được cấu tạo bởi những chất HĐBM khác nhau tạo ra hiệu suất
niosome hóa khác nhau. Điều này là do các chất HĐBM sẽ ảnh hưởng trực
tiếp đến cấu trúc và độ ổn định của màng. Nhìn chung, các công thức có thành
phần chất HĐBM gồm T80+Sp80 đều cho hiệu suất niosome hóa cao hơn
những công thức khác.
b) Ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất niosome hóa
Sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất niosome hóa được thể
hiện ở Bảng 4.11 và đồ thị Hình 4.12.
Bảng 4.11 Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hiệu suất niosome hóa
Hiệu suất niosome hóa (%)

Công thức Chất HĐBM
1 T80 13,51 21,80
2 Sp80 5,63 4,45
3 T80 + Sp80 20,84 20,74
4 Sp60 12,15 17,86
5 T80 + Sp60 12,91 18,07
65
25
21.80
20.84 20.74
20
17.86 18.07
15
13.51 12.91
12.15
10
5.63
5 4.45
0
Công thức A1 Công thức A2 Công thức A3 Công thức A4 Công thức A5
Hình 4.12 Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của thời gian siêu âm
đến hiệu suất niosome hóa
Nhận xét: Thời gian siêu âm tăng làm tăng đáng kể hiệu suất niosome
hóa các công thức 1, 4, 5 và làm giảm hiệu suất niosome hóa công thức 2 và 4
(tuy nhiên sự giảm là không đáng kể). Hiệu suất tăng có thể lý giải là do sau
khi siêu âm niosome tạo ra có thể có cấu trúc nhiều lớp, khiến dược chất khó
vào được bên trong. Thời gian siêu âm càng lâu, thì các lớp vỏ bền ngoài càng
dễ bị phá vỡ và hình thành niosome mới, tạo điều kiện thuận lợi cho dược chất
gắn vào bên trong niosome.
66
c) Ảnh hƣởng của phƣơng pháp đƣa metformin vào niosome đến
hiệu suất niosome hóa
Bảng 4.12 Ảnh hưởng của phương pháp đưa metformin vào niosome
đến hiệu suất niosome hóa
Công Chất Hiệu suất niosome hóa (%)

thức HĐBM Phƣơng pháp thụ động Phƣơng pháp chủ động
1 T80 21,80 35,14
2 Sp80 4,45 30,23
3 T80 + Sp80 20,74 36,32
4 Sp60 17,86 33,77
5 T80 + Sp60 18,07 33,37
40
36.32
35.14
35 33.77 33.37
30.23
30
25
21.80 20.74
20 17.86 18.07
15
10
4.45
5
0
Phương pháp thụ động Phương pháp chủ động
Hình 4.13 Đồ thị thể hiện sự ảnh hưởng của phương pháp đưa thuốc
vào hệ đến hiệu suất niosome hóa
67
Nhận xét:
- Hiệu suất niosome hóa bị ảnh hưởng bởi phương pháp đưa metformin
vào niosome.
- Phương pháp đưa metformin vào niosome bằng cách thụ động đều có
hiệu suất thấp, cao nhất chỉ đạt 21,8% (công thức 1).
- Phương pháp chủ động đều đạt hiệu suất niosome hóa cao thay đổi từ
30,23% đến 36,23%.
- Tất cả các công thức đều có sự tăng đáng kể hiệu suất niosome hóa khi
thay đổi phương thụ động sang chủ động. Trong đó, sự tăng nhiều nhất được
thể hiện rõ ở công thức 2 từ 4,45% lên 30,23%.
4.3.5 Đánh giá sơ bộ độ bền của niosome metformin

Các hệ phân tán niosome metformin sau bào chế được đánh giá sơ bộ về
độ bền ở điều kiện bảo quản với nhiệt độ từ 2-8oC. Kết quả cho thấy, đa số các
công thức đều giữ được trạng thái ổn định về độ đồng đều, không bị tách lớp
sau hơn 30 ngày. Riêng đối với công thức B1 đã xuất hiện hiện tượng tách lớp
sau 20 ngày. Điều này cho thấy công thức B1 có độ bền thấp.
Hình 4.14 Các công thức A sau 15 ngày bảo quản
Hình 4.15 Các công thức B sau 15 ngày Hình 4.16 Công thức B1
bảo quản sau 20 ngày bảo quản
68
Hình 4.17 Các công thức sau 30 ngày bảo quản
4.4 Thảo luận
4.4.1 Về tách chiết cholesterol

Quy trình tách chiết cholesterol từ mô não heo tương đối đơn giản và có
thể thực hiện dễ dàng ở điều kiện phòng thí nghiệm thông thường. Hiệu suất
tách tương đối cao và nguyên liệu dễ tìm. Vì vậy, có thể áp dụng quy trình để
tách chiết cholesterol nhằm phục vụ nhu cầu cholesterol tinh sạch cho nghiên
cứu niosome và các nghiên cứu khác.
Các thí nghiệm định tính được thực hiện nhằm mục đích định tính
cholesterol và mức độ tinh sạch của sản phẩm. Mặc dù phổ đồ FT-IR có sự
tương quan với phổ chuẩn, phản ứng màu phù hợp với kết quả do Liebermann-
Burchard đưa ra, kết quả TLC là một vết đơn, tròn và kết quả TLC so sánh
cholesterol thương mại là tương đương thì chỉ có thể khẳng định trong sản
phẩm tách ra có cholesterol với hàm lượng cao. Sự hiện diện của các tạp khác
với lượng rất bé, khi phân tích bằng TLC khó có thể phát hiện, do đó dựa vào
kết quả TLC chưa thể khẳng định sản phẩm là tinh khiết. Để xác định sự hiện
diện của các tạp khác ở hàm lượng rất nhỏ, có thể phân tích bằng phương pháp
sắc ký lỏng cao áp với điều kiện thích hợp. Độ tinh khiết của cholesterol cũng
có thể được xác định bằng phương pháp sắc ký khí theo nghiên cứu của
Vedaraman N. và cộng sự năm 2005[94].
69
4.4.2 Về quy trình bào chế

Nghiên cứu lựa chọn quy trình bào chế hệ phân tán niosome metformin
theo phương pháp hydrat hóa film mỏng. Đây là phương pháp thông dụng và
có thể thực hiện được ở các phòng thí nghiệm bình thường.
4.4.2.1 Về thời gian siêu âm

Ảnh hưởng khác nhau của thời gian siêu âm lên kích thước hạt và hiệu
suất niosome hóa được thể hiện cụ thể ở Bảng 4.13. Kết quả cho thấy, sự biến
đổi kích thước hạt và hiệu suất niosome hóa là tương đồng với nhau ở công
thức A1, điều này phù hợp với lập luận theo lý thuyết về sự tương đồng của
kích thước hạt và khả năng mang dược chất của nó. Sự siêu âm có ảnh hưởng
không đáng kể lên hai công thức A2 và A3. Trái lại, công thức A4 và A5 cho
thấy tác động tích cực của siêu âm là giảm kích thước tiểu phân và tăng hiệu
suất niosome hóa. Sự khác biệt này, chủ yếu là do sự khác biệt về thành phần
tạo màng niosome. Các chất HĐBM khác nhau, khi dùng để bào chế niosome
theo phương pháp hydrat hóa film mỏng có thể cho ra các cấu trúc niosome là
khác nhau, thông thường tạo niosome nhiều lớp[95]. Siêu âm chỉ phù hợp để
làm phá vỡ cấu trúc của các niosome đa lớp và hình thành lại các niosome đơn
lớp. Như vậy, áp dụng siêu âm để làm nhỏ kích thước sẽ phù hợp cho niosome
có thành phần màng là Sp60 hoặc Sp60 kết hợp với T80.
Bảng 4.13 Tác động của việc tăng thời gian siêu âm lên kích thước niosome và hiệu
suất niosome hóa
Công thức Kích thƣớc hạt Hiệu suất niosome hóa

A1 Tăng 2,330 µm Tăng 11,29%
A2 Giảm 0,829 µm Giảm 1,18%
A3 Giảm 0,024 µm Giảm 0,10%
A4 Giảm 1,597 µm Tăng 5,71%
A5 Giảm 0,387 µm Tăng 5,16%
4.4.2.2 Về phƣơng pháp đƣa metformin vào niosome

Qua kết quả nghiên cứu có thể khẳng định phương pháp đưa dược chất
bằng cách chủ động vào niosome cho hiệu suất niosome hóa và kích thước tiểu
phân lớn hơn so với phương pháp thụ động (Bảng 4.14). Công thức 3 có sự
giảm kích thước nhưng không đáng kể. Điều này có thể lý giải dựa trên đặt
tính thân nước-kỵ nước của dược chất. Metformin là một dược chất thân nước
do đó nó sẽ nằm bên trong nhân nước của niosome. Khi metfomrin vào bên
70
trong càng nhiều sẽ làm cho nhân nước càng lớn lên và làm tăng đáng kể kích
nước của niosome. Mặc dù, trong nghiên cứu có sử dụng siêu âm để làm nhỏ
kích thước. Nhưng bản chất của siêu âm là để phá vỡ các cấu trúc nhiều lớp
của niosome và khó có thể làm nhỏ kích thước của các niosome một lớp.
Ngoài phương pháp siêu âm thì nén qua màng lọc và đồng nhất hóa ở áp suất
cao cũng có thể áp dụng để làm nhỏ kích thước trong trường hợp này.
Bảng 4.14 Tác động của phương pháp chủ động so với bị đông lên kích thước
niosome và hiệu suất niosome hóa
Công thức Kích thƣớc hạt Hiệu suất niosome hóa

1 Giảm 1,140 µm Tăng 13,14%
2 Tăng 1,605 µm Tăng 25,78%
3 Giảm 0,176 µm Tăng 15,58%
4 Tăng 9,048 µm Tăng 15,91%
5 Tăng 3,247 µm Tăng 15,30%
4.4.3 Về chất HĐBM không ion đƣợc sử dụng

Chất HĐBM không ion là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng quyết định đến
cấu trúc, đặc tính lý hóa, độ bền, kích thước, khả năng mang và giải phóng
hoạt chất của niosome.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy nếu chỉ sử dụng T80 và cholesterol
(1:1, mol/mol) thì không phù hợp để tạo niosome. Các công thức sử dụng T80
tạo ra hạt có kích thước lớn, độ bền không cao do dễ có sự kết tụ xảy ra làm
tăng thể tích nhanh và tách lớp. Điều này có thể là do đầu thân nước của T80
lớn, trong dây alkyl có nối đôi dó đó làm tăng tính thấm và kém bền. Kết quả
này cũng phù hợp với nghiên cứu của Anchal Sankyan và Pravin K Pawar
(2013)[8].
Ảnh hưởng của chất HĐBM được thể hiện rõ ràng nhất ở kích thước hạt
và hiệu suất niosome hóa (Bảng 4.15). Khi so sánh giữa các công thức 2
(Sp80) và các công thức 3 (Sp60) thì kích thước hạt và hiệu suất niosome hóa
của Sp60 luôn lớn hơn Sp80. Điều này có thể lý giải dựa vào công thức phân
tử của Sp60 và Sp80, chúng có đầu thân nước là giống nhau và đuôi kỵ nước
có chiều dài như nhau. Tuy nhiên, Sp80 có một dây alkyl không no dẫn đến
làm tăng tính thấm và giảm khả năng mang thuốc của cấu trúc niosome. Sự
khác biệt này cũng có thể là do ảnh hưởng của chỉ số HLB gây ra. Theo nhiều
71
nghiên cứu, chỉ số HLB thấp thì cho hiệu suất niosome hóa không tốt[67,96]. Cả
Sp60 và Sp80 đều có chỉ số HLB thấp, nhưng HLB của Sp80 thấp hơn Sp60.
Trong sự kết hợp của hai chất HĐBM để có chỉ số HLB là 8,6 (chỉ số
HLB được cho là mang lại hiệu suất niosome hóa cao nhất[67]) cho thấy hiệu
suất niosome hóa là cao hơn hẳn so với các công thức có chỉ số HLB thấp.
Tuy nhiên, trong các công thức kết hợp đều có dây alkyl không no trong công
thức T80 nên kích thước hạt tạo ra đa số lớn.
Bảng 4.15 Ảnh hưởng của chất HĐBM lên kích thước hạt
Chất HĐMB Chỉ số Kích thƣớc Hiệu suất

Công thức
không ion HLB hạt niosome hóa (%)
A2.15 + 5,4
Sp80 A2.30 4,3 - 3,37
B2 ++ 30,23
A4.15 ++ 13,98
Sp60 A4.30 4,7 - 16,84
B4 +++ 33,77
A3.15 ++ 19,73
T80+Sp80 A3.30 8,6 ++ 18,35
B3 ++ 36,32
A5.15 ++ 11,40
T80+Sp60 A5.30 8,6 ++ 18,22
B5 +++ 33,37
(-:nhỏ; +: vừa; ++: lớn; +++: rất lớn)
72
CHƢƠNG 5
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận

Sau thời gian nghiên cứu luận văn đã đạt được các kết quả sau:
- Bào chế thành công hệ phân tán niosome metformin theo phương pháp
hydrat hóa film mỏng. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: thành phần tạo
màng niosome (tween 80, span 80, span 60, span 80+tween80, span
60+tween80), thời gian siêu âm (15 phút và 30 phút), phương pháp đưa
metformin vào niosome (thụ động và chủ động) tới kích thước và hiệu suất
niosome hóa.
- Đánh giá được một số thông số về hệ phân tán sau bào chế: kích thước
trung bình (0,597-9,81 µm) và sự phân bố kích thước của các tiểu phân, hiệu
suất mang metformin của niosome (4,45-36.32%) đánh giá sơ bộ độ ổn định
của sản phẩm tạo thành.
- Kết quả nghiên cứu cho thấy nếu chỉ sử dụng tween 80 làm thành phần
chính để tạo màng niosom sẽ không đạt được cấu trúc kép như mong muốn.
Hệ tạo ra có kích thước lớn và không bền. Siêu âm trong 30 phút là phương
pháp hữu hiệu để giảm kích thước và dùng phương pháp chủ động giúp tăng
đáng kể hiệu suất niosome hóa so với phương pháp thụ động.
5.2 Kiến nghị

Nghiên cứu bào chế hệ mang thuốc niosome là một quá trình cần nhiều
thời gian và công sức. Việc thử nghiệm, bào chế và đánh giá sản phẩm gặp rất
nhiều khó khăn do sự thiếu thốn các trang thiết bị thực hiện. Qua thời gian
nghiên cứu với kết quả đạt được, chúng tôi có một số đề xuất sau:
- Xác định cấu trúc bên trong niosome của các công thức tạo ra bằng
phương pháp đo TEM.
- Khảo sát thêm các yếu tố như thể tích, tốc độ và thời gian hydrat hóa,
dung môi sử dụng và các phương pháp bào chế khác nhằm tối ưu hóa các công
thức.
- Tiến hành thử nghiệm phóng thích dược chất in vitro và in vivo của các
hệ phân tán niosome metformin.
- Tiếp tục nghiên cứu các biện pháp làm tăng khả năng đưa dược chất
vào bên trong niosome, giảm kích thước tiểu phân và các biện pháp bảo quản
thích hợp.
73
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] UKPDS (1998). Effect of intensive blood-glucose control with

metformin on complications in overweight patients with type 2 diabetes
(UKPDS 34). Lancet 352: 854-865.
[2] Balan, G., Timmins, P., Greene, D.S. and Marathe, P.H. (2001). In
vitro-in vivo correlation (IVIVC) models for metformin after administration of
modified-release (MR) oral dosage forms to healthy human volunteers.
Journal of Pharmaceutical Sciences, 90/ 8: 1176-1185.
[3] Defang, O. et al (2005). In Vitro and In Vivo Evaluation of Two
Extended Release Preparations of Combination Metformin and Glipizide.
Drug Development and Industrial Pharmacy, 31/7: 677-685.
[4] Karim, K.M., Mandal, A.S., Biswas, N. et al (2010). Niosome: a
future of tageted drug delivery systems. Journal of Advanced Pharmaceutical
Technology and Research, 1: 374-80.
[5] Kamboj, S., Saini, V. and Bala, S. (2014), Formulation and
Characterization of Drug Loaded Nonionic Surfactant Vesicles (Niosomes) for
Oral Bioavailability Enhancement. The Scientific World Journal, 2014: 1-8.
[6] Sahin N. O. (2007) Niosomes as a nanocarrier systems. In: M.R.
Mozafari (editor). Nanomaterials and Nanosystems for Biomedical
Applications. Springer. The Netherlands. Pp. 67-81.
[7] Gupta, N.B., Loona, S. and Khan, M.U. (2012). Preparation and
Characterization of Metfomrin Proniosome Gel for Treatment of Diabetes
Mellitus. International Journal of Pharmaceutical Science Review and
Reseach, 15/2: 108-114.
[8] Sankhyan, A. and Pawar, P.K. (2013). Metformin loaded non-ionic
surfactant vesicles: optimization of formulation, effect of process variables
and characterization. Journal of Pharmaceutical Science, 21/7: 1-8.
[9] Hasan, A.A., Madkor, H. and Wageh (2013). Formulation and
evaluation of metformin hydrochloride-loaded niosomes as controlled release
drug delivery system. Drug delivery, 20/3-4: 120-126.
[10] WHO (March 2010). Model List of Essential Medicines.16th
edition, World Health Organization, p. 24.
[11] IDF (2005). Glucose control: oral therapy. In: Global Guideline for
Type 2 Diabetes. Brussels: International Diabetes Federation. pp. 35–8.
[12] National Collaborating Centre for Chronic Conditions (2008). Type
2 diabetes: national clinical guideline for management in primary and
secondary care. London: Royal College of Physicians, pp. 86.
[13] American Diabetes Association. Standards of medical care in
diabetes—2009.Diabetes Care. 2009, 32: 13–61.
[14] Andreja Marić (2010). Metformin – more than ‗gold standard‘ in the
treatment of type 2 diabetes mellitus. Diabetologia Croatica, 39-3: 95-104.
[15] Messaoudi, E.S, Rongen, G.A., de Boer, R.A. and Riksen, N.P.
(December 2011). The cardioprotective effects of metformin.. Current
Opinion in Lipidology 22/6: 445–53.
74
[16] Malek, M., Aghili, R., Emami, Z. and Khamseh, M.E. (2013). Risk
of Cancer in Diabetes: The Effect of Metformin. International Scholarly
Research Notices Endocrinology 2013: 636927.
[17] British National Formulary (BNF). In: Joint Formulary Committee.
"Chapter 6: Endocrine system". 2003, (65 ed.). London, UK: Pharmaceutical
Press. pp. 447–448.
[18] O'Neil, M.J. (ed.) (2001). The Merck Index - An Encyclopedia of
Chemicals, Drugs, and Biologicals. 13th Edition, Whitehouse Station, NJ:
Merck and Co., Inc., p. 1061
[19] Werner, A. and Bell, J. CCX1V (1922). The preparation of
methylguanidine and of ββ-dimethylguanidine by the interaction of
dicyanodiamide and methylammonium and dimethylammonium chlorides
respectively. Journal of the Chemical Society Transaction, 121: 1790-1794.
[20] Sterne, J. (1959). Treatment of diabetes mellitus with N,N-
dimethylguanylguanidine (LA. 6023, glucophage). Thérapie, 14: 625-630.
[21] Pharmaceutical Manufacturing Encyclopedia (Sittig's
Pharmaceutical Manufacturing Encyclopedia), 2007. 3rd ed. Norwich, NY:
William Andrew, 3: 2208.
[22] Lord, J.M., Flight, I.H.K. and Norman, R.J. (2003). Metformin in
polycystic ovary syndrome: systematic review and meta-analysis. British
Medical Journal, 327/7421: 951–953.
[23] Marchesini, G., Brizi, M., Bianchi, G., Tomassetti, S., Zoli, M. and
Melchionda, N. (2001). Metformin in non-alcoholic steatohepatitis. The
Lancet, 358/9285: 893–894.
[24] Ibáñez, L., Ong, K., Valls, C., Marcos, M.V., Dunger, D.B. and de
Zegher, F. (2006). Metformin treatment to prevent early puberty in girls with
precocious pubarche. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism,
91/8: 2888–2891
[25] Nair, S., Diehl, A.M., Wiseman, M., Farr, G.H.J. and Perrillo, R.P.
(2004). Metformin in the treatment of non-alcoholic steatohepatitis: a pilot
open label trial. Alimentary Pharmacology & Therapeutics, 20/1: 23–28.
[26] Angelico, F., Burattin, M., Alessandri, C., Del Ben, M. and Lirussi,
F. (2007). Drugs improving insulin resistance for non-alcoholic fatty liver
disease and/or non-alcoholic steatohepatitis. Cochrane Database of Systematic
Reviews, 24/1: CD005166.
[27] Socha, P., Horvath, A., Vajro, P., Dziechciarz, P., Dhawan, A. and
Szajewska, H. (2009). Pharmacological interventions for nonalcoholic fatty
liver disease in adults and in children: a systematic review. Journal of
Pediatric Gastroenterology and Nutrition, 48/5: 587–596.
[28] Kirpichnikov, D., McFarlane, S.I., Sowers, J.R. (2002). Metformin:
an update. Annals of Internal Medicine, 137/1: 25–33.
[29] Rena, G., Pearson, E.R. and Sakamoto, K. (2013). Molecular
mechanism of action of metformin: old or new insights? Diabetologia, 56/9:
1898–1906.
75
[30] Burcelin, R. (2013). The antidiabetic gutsy role of metformin
uncovered? Gut, 63/5: 706–707.
[31] Madiraju, A.K., Erion, D.M., Rahimi, Y.; Zhang, X.M., Braddock,
D.T., Albright, R.A., Prigaro, B.J., Wood, J.L., Bhanot, S., MacDonald, M.J.,
Jurczak, M.J., Camporez, J.P., Lee, H.Y., Cline, G.W., Samuel, V.T., Kibbey,
R.G. and Shulman, G.I. (21 May 2014). Metformin suppresses
gluconeogenesis by inhibiting mitochondrial glycerophosphate
dehydrogenase. Nature, 510/7506: 542–546.
[32] Hardman, J.G., Limbird, L.E., and Gilman, A.G. Goodman and
Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics. 10th ed. New York,
NY: McGraw-Hill, 2001, p. 1705.
[33] Ellenhorn, M.J., Schonwald, S., Ordog, G. and Wasserberger, J.
Ellenhorn's Medical Toxicology: Diagnosis and Treatment of Human
Poisoning. 2nd ed. Baltimore, MD: Williams and Wilkins, 1997, p. 730.
[34] Scheen, A.J. (1996). Clinical pharmacokinetics of metformin.
Clinical Pharmacokinetics, 30/5: 359-371.
[35] Melchior, W.R., Jaber, L.A. (1996). Metformin: an
antihyperglycemic agent for treatment of type II diabetes. Annals of
Pharmacotherapy, 30/2: 158-164.
[36] Rumack BH POISINDEX(R) Information System Micromedex,
Inc., Englewood, CO, 2016; CCIS Volume 167, edition expires Feb, 2016.
Hall AH & Rumack BH (Eds): TOMES(R) Information System Micromedex,
Inc., Englewood, CO, 2016; CCIS Volume 167, edition expires Feb, 2016.
[37] Ford, M.D., Delaney, K.A., Ling, L.J. and Erickson, T. Clinical
Toxicology. W.B. Saunders Company., Philadelphia, PA. 2001, p. 426.
[38] McEvoy, G.K. (ed.). American Hospital Formulary Service- Drug
Information 2002. Bethesda, MD: American Society of Health-System
Pharmacists, Inc. 2002 (Plus Supplements), p. 3058.
[39] Stang, M., Wysowski, D.K. and Butler-Jones D (1999). Incidence of
lactic acidosis in metformin users. Diabetes Care 22/6: 925–927.
[40] Salpeter, S., Greyber, E., Pasternak, G., Salpeter, E. (2003). Risk of
fatal and nonfatal lactic acidosis with metformin use in type 2 diabetes
mellitus: systematic review and meta-analysis. Archives of Internal Medicine,
163/21: 2594–2602.
[41] McEvoy, G.K. (ed.). American Hospital Formulary Service- Drug
Information 2002. Bethesda, MD: American Society of Health-System
Pharmacists, Inc. 2002 (Plus Supplements), p. 3056.
[42] MICROMEDEX Thomson Health Care. USPDI - Drug Information
for the Health Care Professional. 22nd ed. Volume 1. MICROMEDEX
Thomson Health Care, Greenwood Village, CO. 2002. Content Reviewed and
Approved by the U.S. Pharmacopeial Convention, Inc., p. 2005
[43] Thomsen, H.S. and Morcos, S.K. (2003). Contrast media and the
kidney: European Society of Urogenital Radiology (ESUR) guidelines. The
British Journal of Radiology, 76/908: 513–518.
76
[44] Weir, J. (March 19, 1999). Guidelines with Regard to Metformin-
Induced Lactic Acidosis and X-ray Contrast Medium Agents. Royal College
of Radiologists. Retrieved October 26, 2007 through the Internet Archive.
[45] Jayasagar, G., Krishna Kumar, M., Chandrasekhar, K., Madhusudan
Rao, C., Madhusudan Rao, Y. (2002). Effect of cephalexin on the
pharmacokinetics of metformin in healthy human volunteers. Drug
Metabolism and Drug Interactions, 19/1: 41-48.
[46] Westover, E.J., Covey, D.F., Brockman, H.L., Brown, R.E. and
Pike, L.J. (2003). Cholesterol depletion results in site-specific increases in
epidermal growth factor receptor phosphorylation due to membrane level
effects. Studies with cholesterol enantiomers. Journal of Biological
Chemistry, 278/51: 51125–33.
[47] Kristiana, I., Luu. W., Stevenson, J., Cartland, S., Jessup, W.,
Belani, J.D., Rychnovsky, S.D. and Brown, A.J., (September
2012). Cholesterol through the looking glass: ability of its enantiomer also to
elicit homeostatic responses. Journal of Biological Chemistry, 287/40: 33897–
33904.
[48] Christian, M. (ed); Journal American College of Toxicology, 1986,
5/5: p 491‐516.
[49] Lecerf, J.M. and Lorgeril, M., (2011). Dietary cholesterol: from
physiology to cardiovascular risk. British Journal of Nutrition, 106 (1): 6-14.
[50] O'Neil, M.J. (ed). The Merck Index ‐ An Encyclopedia of
Chemicals, Drugs, and Biologicals. 13th Edition, Whitehouse Station, NJ:
Merck and Co., Inc., 2001., p. 381
[51] Klaassen, C.D. (ed). Casarett and Doull's Toxicology. The Basic
Science of Poisons. 6th ed. New York, NY: McGraw‐Hill, 2001., p. 718.
[52] Harris and Robin, J. (ed), (2010). Cholesterol binding and
cholesterol transport proteins: structure and function in health and disease.
Subcellular Biochemistry. pp.109-135.
[53] Sadava, D., Hillis, D.M., Heller, H.C. and Berenbaum, M.R.,
(2011). Life: The Science of Biology 9th Edition. San Francisco: Freeman.
pp. 105–114.
[54] Yeagle, P.L. (October 1991). Modulation of membrane function by
cholesterol. Biochimie, 73 (10): 1303–1310.
[55] Haines, T.H. (July 2001). Do sterols reduce proton and sodium leaks
through lipid bilayers? Progress in Lipid Research, 40/4: 299–324.
[56] Hanukoglu, I. (1992). Steroidogenic enzymes: structure, function,
and role in regulation of steroid hormone biosynthesis. The Journal of Steroid
Biochemistry and Molecular Biology, 43/8: 779–804.
[57] Lewis, R.J. (1997), Sr (Ed.). Hawley's Condensed Chemical
Dictionary. 13th ed. New York, NY: John Wiley & Sons. Pp. 265
[58] Liebermann, N. C., (1885). Uber das Oxychinoterpen. Biological
and Environmental Research, 18: 1803.
77
[59] Burchard, H., (1890). Beitraegezur Kenntnis des Cholesterins.
Chemisches Zentralblatt, 61: 25.
[60] Lange, W., Folzenlogen, R. G., and Koip, D. G., (1949). Colorless
crystalline perchloric and hexafluorophosphoric acid salts of sterols. Journal of
the American Chemical Society, 71: 1733.
[61] Dulou, R., Chopin, J., and Raoul, Y., (1951). Structures of the two
bicholestadienes formed in the Salkowski test for cholesterol. Bulletin de la
Société Chimique de France,18: 616.
[62] Brieskorn, C. H., and Capuano, L., (1953). Color reaction with
triterpenes and sterols. Chemische Berichte, 86: 866.
[63] Watanabe, T., (1959). Coloured products and intermediates of
Liebermann-Burchard reaction with cholesterol and its mechanism. Eisei
Shikenjo Hokoku, 77: 87.
[64] Brieskorn, C. H., and Hofmann, H., (1964). Beitrag zum
Chemismus der Farbreaktion nach Liebermann-Burchard. Archiv der
Pharmazie, 297: 37.
[65] Jessy Shaji and Akshay Shah (2015). Niosome: a novel drug
delivery systerm. World journal of pharmaceutical research, 4/6: 853-876.
[66] Vadlamudi, H.C. and Sevukarajan M. (2012). Niosomal drug
delivery system-a review. Indo American Journal of Pharmaceutical Reseach,
2/9: 1193-1213.
[67] Yoshioka, T. et al (1994). Preparation and properties of vesicles
(niosomes) of sorbitan monoesters (Span 20, 40, 60 and 80) and a sorbitan
triester (Span 85). International Journal of Pharmaceutics, 105: 1-6.
[68] Guinedi A. S., Mortada N. D., Mansour S. and Hathout R. M.
(2005). Preparation and evaluation of reverse-phase evaporation and
mutilamellar niosome as opthalmic carriers of acetazolamide. International
Journal of Pharmaceutics, 306: 71-82.
[69] Gannu P. Kumar and Pogaku Rajeshwarrao (2011). Nonionic
surfactant vesicular systems for effective drug delivery-an overview. Acta
Pharmaceutica Sinica B, 1/4: 208–219.
[70] Lê Thanh Phước (2010). Phương pháp tổng hợp các hệ nhũ tương
cơ bản với các chất hoạt động bề mặt có độ phân cực khác nhau. NXB Đại học
Cần Thơ. Cần Thơ. Tr. 6-17.
[71] Malinda Salim, Hiroyuki Minanikawa, Akhihiko Sugimura and
Rauzah Hashim, (2014). Amphiphilic designer nano-carriers for controlled
release, from drug delivery to diagnostics. Medicinal Chemistry
Communications, 1-29.
[72] Baillie, A. J., Florence A. T., Hume L. R. Muirhead G. T. and
Rogerson (1985). The preparation and properties of niosomes non-ionic
surfactant vesicles. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 37: 863-868.
[73] Varshosaz, A. J., Pardakhty A., Hajhashemi V. and Najafabadi A. R
(2003). Development and physical characterization of sorbitan monoester
niosomes for insulin oral delivery. Drug delivery, 10: 251-262.
78
[74] Bayindir, Z. S. and Yuksel, N. (2009). Characterization of niosomes
prepared with various nonionic surfactants for paclitaxel oral delivery.
Pharmaceutical technology, 99/4: 2049-2058.
[75] Vyas, S. P. and Khar, R. K. (2002). Targeted and controlled drug
delivery: Novel carrier systems. CBS publish. New Delhi, Inia.
[76] Handiani, V.ila, M.R. (1990). Non-ionic vesicles as drug delivery
systems. Fifth International Pharmaceutical Technology Symposium. Ankara.
[77] Kiwada, H., Niimura, H., Fujisaki, Y., Yamada, S. and Kato Y.
(1985). Application of synthetic alkyl glycoside vesicles as drug carriers. I
preparation and physical properties. Chemical and Pharmaceutical Bulletin,
33: 753-759.
[78] Mozafari, M. (2005). Method and apparatus for producing carrier
complexes. UK patent No. GB0404993.8, Int. Appl. No. PCT/GB05/000825
(03/03/2005).
[79] Blazek-Walsh, A.I. and Rhodes, D.G. (2001). SEM imaging
predicts quality of niosomes from maltodextrin-based proniosomes.
Pharmaceutical Reseach, 18: 656-661.
[80] Uchegbu, F.I. and Vyas, P.S. (1998). Non-ionic surfactant based
vesicles (niosomes) in drug delivery. International Journal of Pharmaceutics,
172: 33-70.
[81] Hunter, C.A. et al (1988). Vesicular system (niosomes and
liposomes) for delivery of sodium stibogluconate in experimental murine
visceral leishmaniasis. Jounal of pharmacy and Pharmacology, 40: 161.
[82] Ozer, A.Y et al (1991). A novel drug delivery system nonionic
surfactatnt vesicles. European Journal of Pharmaceuticals and
Biopharmceutics. 37: 75.
[83] Arunothayanun, P., Bernard, M.S., Craig, D.Q.M., Uchegbu, I.F.,
and Florencea, A.T. (2000). The effect of processing variables on the physical
characteristics of non-ionic surfactant vesicles (niosomes) formed from a
hexadecyl diglycerol ether. International Journal of Pharmaceutics, 201/1: 7-
11.
[84] Stafford, S., Ballie, A.J. and Florence, A.T. (1988). Drug effect on
the size of chemically defined nonionic surfactant vesicles. Journal of
Pharmacy and Pharmacology, 40: 26.
[85] Manconi, M., Valenti, D., Sinico, C., Lai, F., Loy, G. and Fadda,
A.M. (2003). Niosomes as carriers for tretinoin II. Influence of vesicular
incorporation on tretinoin photostability. International Journal of
Pharmaceutics, 260: 261–272.
[86] Terzano, C., Allegra, L., Alhaique, F., Marianecci, C. and Carafa,
M. (2005). Non-phospholipid vesicles for pulmonary glucocorticoid delivery.
European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 59: 57-62.
[87] Pardakhty, A., Varshosaz, J. and Rouholamini, A. (2007). In vitro
study of polyoxyethylene alkyl ether niosomes for delivery of insulin.
International Journal of Pharmaceutics, 328: 130-41.
79
[88] Paolino, D., Cosco, D., Muzzalupo, R., Trapasso, E., Picci, N. and
Fresta, M. (2008). Innovative bola-surfactant niosomes as topical delivery
systems of 5-fluorouracil for the treatment of skin cancer. International
Journal of Pharmaceutics, 353: 233-242.
[89] Uchegbu, I.F., Double, J.A., Kelland, L.R., Turton, J.A. and
Florence, A.T. (1996). The activity of doxorubicin niosomes against an
ovarian cancer cell line and three in vivo mouse tumour models. Journal of
Drug Targeting, 3: 399–409.
[90] Chandraprakash, K.S., Udupa, N., Umadevi, P. and Pillai, G.K.
(1992). Formulation and evaluation of methotrexate niosomes. Indian Journal
of Pharmaceutical Sciences, 54: 197-199.
[91] Ruckmani, K. and Sankar, V. (2010). Formulation and optimization
of Zidovudine niosomes. American Association of Pharmaceutical Scientists,
11: 1119-1127.
[92] Bilyk, A. et al (1991). Separation of cholesterol and fatty
acylglycerols, acids and amides by thin-layer Chromatography. Lipids, 26/5:
405-406.
[93] Metformin hydrochloride tablet (2010). In: Indian Pharmacopoeia.
The Indian Pharmacopoeia Commission. Ghaziabad. Vol.1. Pp. 368.
[94] Vedaraman, N., Srinivasakannan, C., Brunner, G., Ramabrahmam,
B.V. and Rao, P.G.(2005). Experimental and modeling studies on extraction of
cholesterol from cow brain using supercritical carbon dioxide. Elsevier, 34:
27-34.
[95] Madhav, N.V.S. and Saini, A. (2011). Niosomes: A novel drug
delivery system. International Journal of Reseach in Pharmacy and Chemistry,
1/3: 498-511.
[96] Dharashivkar, S., Sahasrabuddhe, S. and Saoji, A. (2013). Silver
sulfadiazine niosomes: a novel sustained release once a day formulation for
burn treatment. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences, 6/1: 611-616.
80
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC A
PHỔ CHUẨN CỦA CHOLESTEROL
81
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC B
PHỔ CHUẨN CỦA METFORMIN HYDROCHLORIDE
82
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC C
ẢNH CHỤP KÍNH HIỂN VI CÁC HỆ PHÂN TÁN TẠO THÀNH
C.1 Công thức A1
- Siêu âm 15 phút (ảnh chụp dưới vật kính x40)
83
PHỤ LỤC
C.2 Công thức A2

84
PHỤ LỤC
C.3 Công thức A3

85
PHỤ LỤC
C.4 Công thức A4

86
PHỤ LỤC
C.5 Công thức A5

87
PHỤ LỤC
C.6 Công thức B1 (ảnh chụp dưới vật kính x40)
88
PHỤ LỤC
C.9 Công thức B4

(ảnh chụp dưới vật kính x40)
89
PHỤ LỤC
C.10 Công thức B5

90
PHỤ LỤC
91
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC D
DỮ LIỆU XÁC ĐỊNH KÍCH THƯỚC HẠT BẰNG DLS
D.1. Công thức A1
- Siêu âm 15 phút
Công thức A1.15

100 20
90 18
80 16
70 14
60 12
% Channel
% Passting
50 10
40 8
30 6
20 4
10 2
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)
Tỷ lệ (%) Kích thước (m)

10.00 2.451
20.00 2.799
30.00 3.09
40.00 3.39
50.00 3.70
60.00 4.08
70.00 4.58
80.00 5.32
90.00 6.48
95.00 7.45
92
PHỤ LỤC
Công thức A1.30

100 20
90 18
80 16
70 14
60 12
% Channel
% Passting
50 10
40 8
30 6
20 4
10 2
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 3.83
20.00 4.39
30.00 4.94
40.00 5.49
50.00 6.03
60.00 6.62
70.00 7.29
80.00 8.17
90.00 9.67
95.00 11.29
93
PHỤ LỤC

Công thức A2.15

100
14
90
80 12
70
10
% Channel
60
% Passting
8
50
40 6
30
4
20
2
10
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 0.762
20.00 0.916
30.00 1.061
40.00 1.234
50.00 1.426
60.00 1.640
70.00 1.895
80.00 2.226
90.00 2.751
95.00 3.26
94
PHỤ LỤC
Công thức A2.30

100 20
90 18
80 16
70 14
60 12
% Channel
% Passting
50 10
40 8
30 6
20 4
10 2
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 0.381
20.00 0.416
30.00 0.463
40.00 0.522
50.00 0.597
60.00 0.697
70.00 0.840
80.00 1.058
90.00 1.440
95.00 1.808
95
PHỤ LỤC

Công thức A3.15

100 20
90 18
80 16
70 14
60 12
% Channel
% Passting
50 10
40 8
30 6
20 4
10 2
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 1.607
20.00 1.847
30.00 2.113
40.00 2.384
50.00 2.657
60.00 2.929
70.00 3.22
80.00 3.60
90.00 4.34
95.00 7.76
96
PHỤ LỤC
Công thức A3.30

100 20
90 18
80 16
70 14
60 12
% Channel
% Passting
50 10
40 8
30 6
20 4
10 2
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 1.620
20.00 1.822
30.00 2.046
40.00 2.315
50.00 2.633
60.00 3.01
70.00 3.50
80.00 4.21
90.00 5.70
95.00 7.41
97
PHỤ LỤC

Công thức A4.15

100 25
90
80 20
70
60 15
% Channel
% Passting
50
40 10
30
20 5
10
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 1.490
20.00 1.728
30.00 1.949
40.00 2.158
50.00 2.359
60.00 2.560
70.00 2.779
80.00 3.04
90.00 3.46
95.00 4.05
98
PHỤ LỤC
Công thức A4.30

100 25
90
80 20
70
60 15
% Channel
% Passting
50
40 10
30
20 5
10
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 0.529
20.00 0.566
30.00 0.612
40.00 0.676
50.00 0.762
60.00 0.880
70.00 1.052
80.00 1.315
90.00 1.781
95.00 2.271
99
PHỤ LỤC

Công thức A5.15

100 20
90 18
80 16
70 14
60 12
% Channel
% Passting
50 10
40 8
30 6
20 4
10 2
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 1.933
20.00 2.169
30.00 2.416
40.00 2.702
50.00 3.04
60.00 3.48
70.00 4.05
80.00 4.86
90.00 6.15
95.00 7.42
100
PHỤ LỤC
Công thức A5.30

100 20
90 18
80 16
70 14
60 12
% Channel
% Passting
50 10
40 8
30 6
20 4
10 2
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 1.849
20.00 2.032
30.00 2.228
40.00 2.433
50.00 2.653
60.00 2.912
70.00 3.24
80.00 3.78
90.00 5.37
95.00 7.62
101
PHỤ LỤC
D.6. Công thức B1
Công thức B1
100 25
90
80 20
70
60 15
% Channel
% Passting
50
40 10
30
20 5
10
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 3.07
20.00 3.60
30.00 4.10
40.00 4.52
50.00 4.89
60.00 5.25
70.00 5.63
80.00 6.09
90.00 6.78
95.00 7.56
102
PHỤ LỤC
Công thức B2
100 20
90 18
80 16
70 14
60 12
% Channel
% Passting
50 10
40 8
30 6
20 4
10 2
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 1.332
20.00 1.565
30.00 1.781
40.00 1.991
50.00 2.202
60.00 2.422
70.00 2.663
80.00 2.950
90.00 3.37
95.00 3.80
103
PHỤ LỤC
Công thức B3
100 20
90 18
80 16
70 14
60 12
% Channel
% Passting
50 10
40 8
30 6
20 4
10 2
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 1.575
20.00 1.760
30.00 1.969
40.00 2.195
50.00 2.457
60.00 2.771
70.00 3.17
80.00 3.71
90.00 4.78
95.00 6.79
104
PHỤ LỤC
Công thức B4
100 60
90
50
80
70
40
60
% Channel
% Passting
50 30
40
20
30
20
10
10
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 8.35
20.00 8.85
30.00 9.23
40.00 9.53
50.00 9.81
60.00 10.09
70.00 10.40
80.00 10.75
90.00 11.29
95.00 11.84
105
PHỤ LỤC
Công thức B4
100 60
90
50
80
70
40
60
% Channel
% Passting
50 30
40
20
30
20
10
10
0 0
0,03 0,07 0,20 0,58 1,64 4,62 13,08 37,00 104,70 296,00 837,20
Size (microns)

10.00 4.23
20.00 4.81
30.00 5.23
40.00 5.58
50.00 5.90
60.00 6.22
70.00 6.60
80.00 7.07
90.00 7.78
95.00 8.60
106
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC E
DỮ LIỆU THỬ NGHIỆM TỶ LỆ NIOSOME HÓA
CỦA CÁC HỆ PHÂN TÁN TẠO THÀNH
E.1 Thử nghiệm xác định thời gian cần thiết để xác định tỷ lệ niosome hóa
Độ hấp thụ
Thời gian
2 giờ 4 giờ 5 giờ 6 giờ 12 giờ
Túi 8.000 D 0,0907 0,0905 0,1104 0,0923 0,0917
Túi 14.000 D 0,0928 0,0919 0,0926 0,0913 0,0915
E.2 Dữ liệu xác định tỷ lệ niosome hóa các công thức
Thử nghiệm tỷ lệ niosome hóa

Thời gian
Thành siêu âm Khối lượng Tỷ lệ
Tên mẫu Độ hấp
phần uncapsule niosome hóa
(phút) thu*
(µg) (%)
Tween 80/ 15 phút 1,2322 40035,901 19,93
A1
Cholesterol 30 phút 1,2329 40058,747 19,88
Span 80/ 15 phút 1,4548 47300,914 5,40
A2
Span 80 + 15 phút 1,2352 40133,812 19.73
A3 Tween 80/
Span 60/ 15 phút 1,3233 43009,138 13.98

A4
Span 60 + 15 phút 1,3629 44301,567 11,40
A5 Tween 80/
Tween 80/
B1 30 phút 0,5023 32430,37 35,14
Cholesterol
Span 80/
B2 30 phút 0,5399 34884,68 30,23
Cholesterol
Span 80 +
B3 Tween 80/ 30 phút 0,4933 31840,73 36,32
Cholesterol
B4 Span 60/ 30 phút 0,5128 33115,75 33,77
107
PHỤ LỤC
Cholesterol
Span 60 +
B5 Tween 80/ 30 phút 0,5159 33313,75 33,37
Cholesterol
Giá trị trung bình sau 3 lần đo
*
108

(Nano) Th. Dung+Tr - Nghĩa

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

(Nano) Th. Dung+Tr - Nghĩa

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Cần Thơ, 2015

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

Cần Thơ, 2015

Lê Thùy Dung, Lê Trọng Nghĩa

Lê Thùy Dung Lê Trọng Nghĩa

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƢỚNG DẪN

1. Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Thanh Phƣớc

2. Đề tài: NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NIOSOME METFORMIN

4. Nội dung nhận xét:

TS. Lê Thanh Phƣớc

NHẬN XÉT ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

1. Cán bộ phản biện: ……………………………………………………………

2. Đề tài: NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ NIOSOME METFORMIN

3. Sinh viên thực hiện: Lê Thùy Dung MSSV: B1203429

4. Nội dung nhận xét:

CHƢƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1.3 Nội dung nghiên cứu

1.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nƣớc

1.4.1 Các nghiên cứu ngoài nƣớc

1.4.2 Các nghiên cứu trong nƣớc:

2.1 Metformin hydrochloride

2.1.1 Đại cƣơng về metformin hydrochloride

2.1.1.1 Tính chất hóa lý[18]

2.1.1.2 Tổng hợp

Hình 2.2 Phương trình tổng hợp metformin hydrochloride

2.1.1.3 Chỉ định

2.1.1.4 Cơ chế tác động

2.1.1.5 Thông tin dƣợc động học của metformin

2.1.1.6 Liều lƣợng sử dụng[36]

2.1.1.7 Tác dụng phụ

2.1.1.8 Chống chỉ định[37]

2.1.1.9 Thận trọng

2.1.1.10 Tƣơng tác thuốc[43, 45]

2.1.2 Một số chế phẩm trên thị trƣờng

STT Chế phẩm Dạng bào chế Hàm lƣợng Xuất xứ

2.2.1 Đại cƣơng về cholesterol

Cholesterol (tiếng Hi Lạp:

2.2.1.1 Thông tin dƣợc động học của cholesterol

Acid mật Pregnenolon Vitamin D

Glucocorticoid Mineralocorticoids Androgens

Hình 2.4 Sơ đồ chuyển hóa của cholesterol

2.2.1.2 Sinh tổng hợp

2.2.1.3 Vai trò của cholesterol với cơ thể

2.2.1.4 Cholesterol trong một số thực phẩm

Thực phẩm Hàm lƣợng Thực phẩm Hàm lƣợng

2.2.2 Định tính cholesterol

2.2.2.1 Phƣơng pháp đo nhiệt độ nóng chảy

2.2.2.2 Phƣơng pháp sắc ký lớp mỏng

2.2.2.3 Phƣơng pháp Liebermann-Burchard

Hình 2.7 Cơ chế đề nghị cho phản ứng Leibermann-Burchard

2.2.2.4 Phƣơng pháp quang phổ FT-IR

2.3 Đại cƣơng về niosome

2.3.1 Khái niệm và phân loại

2.3.1.1 Khái niệm

2.3.1.2 Phân loại