1.

Nguyên liệu và phương pháp

1.1 Hóa chất
Carbon dioxide có độ tinh khiết cao được cung cấp bởi Linde de Colombia.
Ethanol (96%) loại phân tích được lấy từ Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis-
MO, USA).
Cannabinoid tiêu chuẩn với độ tinh khiết cao hơn 99% được mua từ Lipomed AG.
Tetracosane và deuterated-dimethylsulfoxide (99,8%) được cung cấp bởi Sigma-
Aldrich Co (Milan, Ý).
Hộp mực SPE Supeclean ENVI được mua từ Supelco (Bellefonte-PA, USA)
1.2 Mẫu Cannabis sativa L. and cách chuẩn bị
Các mẫu cần sa có chùm hoa chín hoàn toàn (xác định bằng mắt thường khi hơn
75% số nhụy chuyển sang màu nâu và teo lại). Chúng được thu hoạch ở phía tây
nam của Colombia (Corinto, Cauca). Một lượng đại diện vật liệu thực vật đã được
lấy mẫu và khoảng 300 g được chọn để sử dụng tiếp. Vật liệu đã chọn được làm khô
ở nhiệt độ phòng (từ 15 đến 18 ° C) cho đến khi cuống trung tâm của cụm hoa bị
gãy [24], sau đó mẫu khô được nghiền và sàng đến kích thước nhỏ hơn 0,5 mm.
Cuối cùng, vật liệu thực vật được bảo quản ở 4 ° C trong điều kiện không có ánh
sáng cho đến SFE.
1.3 Chất lỏng siêu tới hạn
SFE được thực hiện bằng cách sử dụng thiết bị chiết chất lỏng siêu tới hạn quy mô
phòng thí nghiệm động lực học (Hình 1). Bộ phận chiết bao gồm một tế bào chiết 10
cm3 có nhiệt độ được kiểm soát bằng cách sử dụng áo khoác điện và bộ điều chỉnh.
Áp suất và lưu lượng chiết được duy trì không đổi bằng cách sử dụng bộ điều chỉnh
áp suất ngược. Tất cả các lần chiết đều giữ không đổi thời gian chiết, lượng mẫu cần
sa và lưu lượng dung môi siêu tới hạn (4 h, 8 g và 0,55 kg/h, tương ứng) theo nghiên
cứu trước đây [16]. Ethanol như một đồng dung môi được cung cấp bởi một máy
bơm chất lỏng và trộn với dòng CO2 chính trước khi ở ngăn chiết.
Các thông số chiết (áp suất, nhiệt độ và nồng độ đồng dung môi) thay đổi trong
khoảng từ 15 đến 33 MPa, 40 đến 80 ° C, và 0 đến 5% EtOH, theo thiết kế thí
nghiệm được trình bày trong Bảng 1. Tỷ lệ phần trăm etanol là thêm vào dòng CO2
với tốc độ không đổi trong toàn bộ thí nghiệm. Tỷ lệ CO2 trên dòng vào được sử
dụng trong tất cả các thí nghiệm là 275, trong khi tỷ lệ ethanol trên dòng vào là 5,5
đối với 2% EtOH và 13,7 đối với 5% EtOH. Sau khi chiết, etanol được loại bỏ trong
chân không và các chất chiết được cân bằng cân phân tích để ước tính sản lượng
chiết được biểu thị bằng phần trăm khối lượng trên cơ sở khô (% wt d.b.). Tất cả các
chiết xuất được phân tích bằng sắc ký khí với phát hiện ion hóa ngọn lửa (GC-FID)
để định lượng hàm lượng THC của chúng.
1.4 Thiết kế thí nghiệm và phân tích thống kê
Ảnh hưởng của các thông số SFE (áp suất, nhiệt độ và nồng độ đồng dung môi) đến
các biến phản ứng (năng suất chiết xuất và hàm lượng THC trong dịch chiết thô)
được xác định bằng cách sử dụng phương pháp luận bề mặt phản ứng (RSM) và

ACCEPTED
thiết kế hỗn hợp trung tâm (CCD, với α = 1 ). Mức độ của các biến độc lập được
thiết lập dựa trên các nghiên cứu trước đây về chiết xuất cannabinoids [20,22,25].
Thiết kế thử nghiệm bao gồm 19 lần chạy thử nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên.
Điểm trung tâm được lặp lại năm lần (trích từ số 15 đến số 19). Thiết kế thí nghiệm

MANUSCRIPT
đầy đủ được trình bày trong Bảng 1.
Dữ liệu thử nghiệm được đưa vào mô hình đa thức bậc hai biểu thị các biến phản hồi
dưới dạng hàm của các biến độc lập theo phương trình (1):

X X X X2 X X X X X 2 X X X 2
Y 0 1 1 2 2 3 3 11 1 12 1 2 13 1 3 22 2 23 2 3 33 3

(1)

trong đó Y đại diện cho biến phản ứng, b0 là hằng số, b1, b2 và b3 là hệ số tuyến tính,
b11, b22 và b33 là hệ số bậc hai và b12, b13 và b23 là hệ số tương tác cho các biến
độc lập X1 (phần trăm EtOH ), X2 (áp suất) và X3 (nhiệt độ).
Sự phù hợp của mô hình được đánh giá bằng phân tích một chiều phương sai
(ANOVA) với α <0,05. Hệ số xác định (R2) và độ lệch trung bình tuyệt đối (AAD)
được sử dụng để thiết lập mối tương quan giữa dữ liệu dự đoán và dữ liệu quan sát.
Các giá trị của R2, R2 điều chỉnh và AAD được sử dụng để kiểm tra độ chính xác của
mô hình sao cho R2 và R2 điều chỉnh phải gần bằng 100% và AAD phải càng nhỏ
càng tốt. Các giá trị chấp nhận được của R2 và AAD có nghĩa là phương trình mô hình
xác định hành vi thực sự của hệ thống và nó có thể được sử dụng để nội suy trong
miền thực nghiệm [26]. Việc xử lý dữ liệu được thực hiện bằng phần mềm R-Project
phiên bản 3.4.2 (Dự án GNU của Tổ chức Phần mềm Tự do, Boston, Massachusetts,
Hoa Kỳ).
1.5 Phân tích và định lượng THC
Việc phân tích và định lượng THC được thực hiện bằng máy sắc ký Shimadzu GC-
2010 được trang bị bộ lấy mẫu tự động Shimadzu AOC-20i và cột mao quản phân
tích Rtx® GC (30 m x 0,25 mm x 0,25 μm, Restek, Bellefonte, Pennsylvania, US).
Nhiệt độ kim phun và đầu báo cháy được duy trì tương ứng ở 290 ° C và 300 ° C.
Một microlit chiết xuất cần sa hòa tan trong etanol (12,5 mg / mL) được tiêm ở chế
độ tách theo tỷ lệ 1:20. Điều kiện lò bắt đầu ở 200 ° C được giữ trong 2 phút, sau đó
tăng lên đến 260 ° C ở 10 ° C / phút và duy trì trong 10 phút [3]. Dữ liệu được phân
tích bằng phần mềm Lab Solutions lite phiên bản 5.52 của Shimadzu Corporation.
Việc định lượng THC được thực hiện bằng cách sử dụng đường cong chuẩn (10 đến
500 mg / L) mà tetracosan được thêm vào làm chất chuẩn nội (100 mg / L) [27]. Các
kết quả được biểu thị bằng phần trăm trọng lượng của THC đối với dịch chiết khô và
phần trăm trọng lượng của THC đối với mẫu cần sa khô (% wt d.b.).
1.6 Tổng hàm lượng THC trong nguyên liệu thô Cannabis sativa L.
THC có trong nguyên liệu thô được chiết xuất bằng phương pháp Soxhlet. Quá trình
chiết xuất được thực hiện dưới áp suất giảm để tránh sự phân hủy nhiệt của hợp chất
đích và sự hình thành đồ tạo tác. Quá trình chiết xuất được thực hiện trong khoảng thời
gian 6 giờ, sử dụng gradien phân cực dung môi - đầu tiên là hexan, sau đó là etyl
axetat, và cuối cùng là etanol. Tóm tắt:4,0 g nguyên liệu thô được chiết bằng hexan,
thu được phần không phân cực. Sau đó, phần bánh dư được chiết xuất bằng etyl axetat,
tạo ra phần nửa phân cực. Cuối cùng, phần bánh dư tiếp theo được chiết bằng etanol,
do đó thu được phần phân cực. Tất cả các phân đoạn được cô đặc trong chân không và
được phân tích bằng GC-FID. Tổng hàm lượng THC trong nguyên liệu thô được cho
bằng tổng của mỗi phần hàm lượng THC.
1.7 Quá trình phân lập và tinh chế THC
Kết quả SFE và GC-FID được sử dụng để xác định và chọn chiết xuất có năng suất
chiết xuất tốt, hàm lượng THC cao nhất và nhiễm bẩn thấp nhất (với số lượng hợp chất
được chiết xuất thấp nhất). Chiết xuất này được SPE đưa vào quy trình phân lập và
tinh chế để thu được THC có độ tinh khiết cao. Dịch chiết đã chọn được phân tích
bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC), ngoài phép phân tích GC-FID.
RP- HPLC cũng được sử dụng như một quy trình tiếp theo của quá trình SPE để xác
định các phân đoạn có độ tinh khiết THC cao nhất. Cuối cùng, một phần có hàm lượng
THC cao nhất đã được chọn và phân tích bằng cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác
nhận độ tinh khiết của THC.
1.7.1 Cách li và tinh chế THC bằng SPE
Việc phân lập và tinh chế THC được phát triển bằng cách sử dụng cột chiết pha rắn
được đóng gói bằng silica gel biến tính octadecyl (5 g, 40-60 m) [28]. Dịch chiết
(0,5 g) được hòa tan trong dung môi A (axit trifluoroacetic 0,05% trong nước) và
được bơm vào cột SPE, sau đó các hợp chất được rửa giải bằng cách sử dụng
gradient tuyến tính của dung môi B (axit trifluoroacetic 0,05% trong axetonitril) từ
0% đến 100% ở tốc độ dòng không đổi 1 mL / phút. Thu được 31 phần nhỏ của mỗi
phần 12 mL. Tất cả các phân đoạn được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng và RP-
HPLC để xác định sự hiện diện của THC và chọn các phân đoạn được làm giàu
THC. Các phần có hàm lượng THC cao được nối với nhau - do đó thu được phần
cuối cùng - và dung môi được loại bỏ trong chân không. Phần dung môi tự do thu
được được đông khô, và năng suất toàn cầu của quá trình SFE-SPE được xác định.
Phần cuối cùng được phân tích bằng RP-HPLC và NMR để đánh giá độ tinh khiết
của THC do đó thu được.
1.7.2 Phân tích bằng RP-HPLC
Phân tích RP-HPLC được thực hiện bằng máy sắc ký Agilent Series 1260, sử dụng
cột Chromolith C18 nguyên khối (50 x 4,6 mm, Merck, Darmstadt, Đức). Sự rửa
giải được phát triển bằng cách sử dụng một gradient tuyến tính của dung môi A
(acetonitril) trong dung môi B (nước) từ 5% đến 100% trong 17 phút. Các mẫu 5 L
ở 55,6 mg / L được phân tích. Dòng pha động là 2,0 mL / phút và các hợp chất được
phát hiện ở bước sóng 210 nm. THC được xác định bằng cách sử dụng một hợp chất
tiêu chuẩn dựa trên thời gian lưu của nó.
1.7.1 Phân tích NMR
Một thí nghiệm NMR một chiều cho phần cuối cùng đã được thực hiện: proton (1H
NMR) và carbon-13 (13C NMR). Một thiết bị Bruker AVANCE 400 MHz NMR
được trang bị đầu dò nghịch đảo với z-gradient đã được sử dụng. Một mẫu gồm 10
mg phân đoạn khô cuối cùng được hòa tan trong đimetylsulfoxit khử bền (DMSO-
d6) và phổ NMR thu được ở 23° C. Phần mềm Topspin 2.1 được sử dụng để thu
nhận và xử lý quang phổ (Bruker Corporation)
2. Kết quả và bàn luận
Kết quả chiết xuất được thể hiện trong Bảng 1. Các số chiết tương ứng với mỗi lần
chiết được thực hiện trong các điều kiện quy định. Các kết quả thu được về năng
suất chiết xuất được biểu thị bằng phần trăm trọng lượng của nguyên liệu thực vật
cần sa khô và hàm lượng THC được biểu thị bằng phần trăm trọng lượng của THC
trong dịch chiết khô và phần trăm trọng lượng của THC trong mẫu cần sa khô.
2.1 Năng suất chiết xuất
Bảng 1 cho thấy hiệu suất chiết cao nhất là 26,36%, tương ứng với chất chiết số 6
thu được ở 33 MPa, 80 ° C và 5% EtOH. Ở những điều kiện này, dung môi siêu tới
hạn có sức mạnh dung môi tốt vì áp suất chiết cao. Ngoài ra, sự hiện diện của đồng
dung môi cải thiện khả năng solvat hóa SC CO2 [22,29]. Mặc dù nhiệt độ cao hơn
có thể làm giảm mật độ CO2 SC, nhưng ở áp suất chiết cao hơn, hiệu ứng này thiếu
tầm quan trọng so với sự gia tăng áp suất hơi của chất tan; do đó nhiệt độ cao có thể
nâng cao năng suất chiết xuất [30,31]. Một chiết xuất khác có năng suất cao là số 4
(23,36%), thu được ở 15 MPa, 40 ° C và 5% EtOH, sử dụng mức áp suất và nhiệt độ
chiết thấp nhất. Số chiết 4 và 6 cho năng suất chiết cao nhất; tuy nhiên, những chất
chiết xuất này thu được bằng cách sử dụng các mức áp suất và nhiệt độ khác nhau
(mức thấp so với mức cao). Điều đáng nói là một kết quả tương tự đã được báo cáo
trước đó bởi Da Porto et al. [32] để chiết xuất dầu cần sa từ cây gai dầu. Những kết
quả này có thể là do sự thay đổi của độ chọn lọc dung môi với sự thay đổi áp suất và
nhiệt độ. Ví dụ, các hợp chất dễ bay hơi như tecpen có thể được chiết xuất hiệu quả
hơn ở nhiệt độ cao, trong khi chiết xuất cannabinoid được thực hiện ở nhiệt độ thấp.
Trước đây, Omar et al. [33] quan sát thấy rằng đối với SFE với CO2 / EtOH, việc
chiết xuất sesquiterpenes từ cây cần sa được ưa chuộng ở nhiệt độ cao, trong khi
chiết xuất cannabinoid tốt hơn ở nhiệt độ thấp. Các kết quả này đồng ý một phần với
nghiên cứu hiện tại, hàm lượng THC cao được quan sát thấy trong các dịch chiết thu
được bằng cách sử dụng các mức nhiệt độ thấp (ví dụ: dịch chiết số 1 và 4). Mặt
khác, SFE trước đây đã được sử dụng trên cần sa bằng cách sử dụng SC CO2 gọn
gàng để thu hồi các loại cannabinoid khác nhau, ví dụ: Rovetto và Aieta [22] báo
cáo năng suất chiết xuất tối đa là 18,5% thu được ở 34 MPa và 55 ° C, trong khi Da
Porto et al. [32] đạt được năng suất tối đa là 21,5% ở 30 MPa và 40 ° C. Các sản
lượng này thấp hơn so với chiết xuất số 4 và 6, cho thấy rằng việc thêm etanol làm
đồng dung môi sẽ cải thiện năng suất.
Dữ liệu thí nghiệm kết quả được phân tích bằng phương pháp luận bề mặt phản ứng
(RSM) theo các thông số được mô tả trong Phần 2.4. Bảng 2 cho thấy kết quả
ANOVA được sử dụng để đánh giá sự phù hợp của mô hình bậc hai trên dữ liệu
năng suất khai thác. ANOVA chỉ ra rằng chỉ một thông số chiết xuất có ảnh hưởng
đáng kể đến năng suất chiết, hệ số tuyến tính% EtOH (p-value = 0,027). Việc điều
chỉnh mô hình bậc hai được đưa ra bằng cách sử dụng tiêu chí thông tin Akaike để
có được một phương trình mô tả tốt nhất ảnh hưởng của các thông số chiết đến năng
suất chiết. Vì yếu tố duy nhất ảnh hưởng đáng kể đến năng suất chiết là đồng dung
môi, nên mô hình điều chỉnh có hệ số tuyến tính và bậc hai đối với hiệu ứng etanol.
Phương trình (2) cho thấy phương trình mô hình bậc hai thu được cho năng suất
chiết xuất từ cây Cần sa sativa L. của SFE (chỉ với các hệ số có ý nghĩa):
Yield (%) = 8.19 + 4.91EtOH - 0.42EtOH2 Eq. (2)

Bảng 2 cho thấy hệ số xác định R2, R2 hiệu chỉnh và độ lệch trung bình tuyệt đối
(AAD). Các chỉ số thống kê (R2 = 83,6, R2 điều chỉnh = 81,5 y AAD = 9,1) chỉ ra
rằng mô hình bậc hai mới thể hiện đầy đủ dữ liệu thực nghiệm. Phân tích RSM cho
thấy rằng việc bổ sung ethanol làm đồng dung môi trong SFE là yếu tố chính ảnh
hưởng đáng kể đến năng suất chiết xuất. Hiệu ứng đồng dung môi này thể hiện rõ ở
24 MPa và 60ºC. Ở áp suất và nhiệt độ này, năng suất chiết xuất sử dụng SC CO2
tinh khiết là 13,06% (chiết suất số 14). Tuy nhiên, việc bổ sung ethanol ở mức 2 và
5% đã làm tăng sản lượng, lần lượt đạt 16,77% (giá trị trung bình của phần chiết từ
15 đến 19) và 18,27% (phần chiết số 13). Những kết quả này có thể được giải thích
là do sự gia tăng của các hợp chất phân cực cao hơn được chiết xuất từ chất nền thực
vật (ví dụ phenol và đường). Hiệu ứng này đã được báo cáo trước đây bởi Rovetto
và Aieta [22], họ quan sát thấy rằng etanol, được sử dụng làm đồng dung môi, đã cải
thiện năng suất chiết xuất nói chung
2.2 Hàm lượng THC
Hàm lượng THC trong chiết xuất thô được xác định bởi GC-FID. Bảng 1 cho thấy
kết quả thí nghiệm. Hàm lượng THC cao nhất, 37,85% (chiết xuất số 9) thu được ở
33 MPa, 60 ° C và 2% EtOH. Các chiết xuất khác có hàm lượng THC cao trên 30%
là số 1, 2, 4 và 11 (từ 31,08 đến 36,18%). Ngược lại, hàm lượng THC thấp hơn là
15,52% (chiết số 6) thu được ở 33 MPa, 80 ° C và 5% EtOH. Những kết quả này
cho thấy rằng mức đồng dung môi từ 2 đến 5% có lợi cho việc chiết xuất THC từ
cây cần sa. Tuy nhiên, sự gia tăng ethanol, đặc biệt là nồng độ cao hơn, có thể làm
giảm độ thu hồi THC. Hiệu ứng này thấy rõ khi so sánh chiết xuất số 9 và 6 (coi như
không có ảnh hưởng nhiệt độ). Trước đây, Omar et al. [33] và Rovetto và Aieta [22]
báo cáo rằng việc bổ sung ethanol làm đồng dung môi trong SFE đã nâng cao hiệu
quả chiết xuất cannabinoid, bao gồm cả THC. Tuy nhiên, nồng độ đồng dung môi
lớn hơn có thể làm giảm độ chọn lọc của dung môi [34].
Omar và cộng sự. [33] nghiên cứu khám phá chiết xuất cannabinoids (CBD, CBN và
THC) từ mười ba mẫu cần sa thuộc các loại, vùng trồng và mùa khác nhau, sử dụng
SFE với CO2 / EtOH. Họ đã nghiên cứu các điều kiện chiết xuất khác nhau (10-25
MPa, 35-55 ° C và 0-40% Ethanol) và quan sát hàm lượng THC từ 0,45 đến 32,4%
trong chiết xuất thô khô. Mặt khác, Rovetto và Aieta [22] đã nghiên cứu chiết xuất
THC và axit Δ-9-tetrahydrocannabinolic (THCA) từ bốn chủng Cannabis sativa L.
khác nhau bằng SFE với SC CO2 và CO2 / EtOH. Họ đã sử dụng một quy trình
chiết xuất mới dựa trên sự gia tăng áp suất nhiều tầng và xung của đồng dung môi.
Kết quả của họ cho thấy hàm lượng THC trong chiết xuất nằm trong khoảng từ 64,2
đến 76,2%. Liên quan đến công trình hiện tại, hàm lượng THC trong các chiết xuất
được quan sát bởi Omar và cộng sự. thấp hơn trong khi báo cáo của Rovetto và
Aieta cao hơn. Điều đáng chú ý là nguyên liệu thô cần sa được sử dụng trong công
việc hiện tại và nguyên liệu được sử dụng bởi Omar et al. và các nghiên cứu của
Rovetto và Aieta có hàm lượng THC khác nhau. Do đó hàm lượng THC trong dịch
chiết có thể rất khác nhau mặc dù sử dụng cùng phương pháp chiết, dung môi và các
điều kiện tương tự. Để đánh giá hiệu quả của phương pháp chiết xuất thu hồi THC
từ nguyên liệu thực vật, cần xem xét hàm lượng THC trong nguyên liệu thô. Tỷ lệ
giữa hàm lượng THC trong dịch chiết thô và tổng THC trong nguyên liệu thô (%
THCextract /% THCTotal) có thể được sử dụng để đánh giá hiệu quả thu hồi và
chiết xuất THC (xem Bảng 1). Trong nghiên cứu hiện tại, tổng hàm lượng THC
trong nguyên liệu thô là 7,04% (được ổn định theo quy trình được mô tả trong phần
2.6), và hàm lượng THC cao nhất trong chất chiết xuất là 37,85% và 36,18% (chất
chiết xuất số 9 và 11 tương ứng), thì mức thu hồi THC cao nhất là 5,38 và 5,14.
Những thu hồi THC này tốt hơn so với nghiên cứu Rovetto và Aieta (76,2%
THCextract / 16,6% THCTotal = 4,59), điều này cho thấy hiệu quả chiết xuất tốt
hơn.
Dữ liệu của nội dung THC được sử dụng để xác định các hệ số cho mô hình bậc hai
(Bảng 2). ANOVA cho thấy rằng các thông số chiết xuất có ảnh hưởng đáng kể là
hệ số tuyến tính và bậc hai của áp suất và hệ số tuyến tính của% EtOH. Do đó, mô
hình đơn hàng thứ hai được điều chỉnh bằng cách sử dụng tiêu chí thông tin Akaike.
Phương trình (3) đại diện cho phương trình mô hình bậc hai kết quả được điều chỉnh
cho hàm lượng THC trong chiết xuất thô từ cây Cần sa sativa L. R2, R2 điều chỉnh
và ADD (thể hiện trong Bảng 2) chỉ ra rằng mô hình đã điều chỉnh là chấp nhận
được.
THC content (%) = 72.2 + 3.46EtOH - 3.69P - 0.93EtOH2 + 0.070P2 Eq. (3)

Hình 2 cho thấy biểu đồ bề mặt phản hồi của mô hình bậc hai cho nội dung THC.
Biểu đồ này cho phép hình dung ảnh hưởng của các thông số chiết (áp suất và%
EtOH) về hàm lượng THC trong chiết xuất thô. Hiệu ứng tuyến tính tích cực của%
EtOH thể hiện rõ ở tất cả các áp suất trong khoảng từ 1 đến 2% EtOH. Ví dụ, ở 15
MPa, hàm lượng THC tăng khoảng từ 32 đến 35% khi đồng dung môi được tăng
cường từ 0 đến 2%. Ngược lại, ảnh hưởng bậc hai âm của đồng dung môi thể hiện rõ
ràng trong khoảng giữa 2 ở 5% EtOH (đối với tất cả các áp suất) - ảnh hưởng này rõ
ràng hơn ở 15 MPa. Ngoài ra, Hình 2 cho thấy hàm lượng THC cao nhất thu được ở
áp suất thấp (15 MPa). Tuy nhiên, sự gia tăng của thông số này từ 15 đến 24 MPa
làm giảm nồng độ cannabinoid trong dịch chiết. Ảnh hưởng của áp suất quan sát
được trong công việc hiện tại đồng ý với kết quả được Rovetto và Aieta báo cáo
[22]. Họ quan sát thấy rằng ở nhiệt độ không đổi, sự gia tăng áp suất từ 17 đến 24
MPa làm giảm hàm lượng THC trong dịch chiết từ 76,23 xuống 64,17%; tuy nhiên,
sự thay đổi từ 24 lên 34 MPa đã nâng cao hàm lượng THC.
Các kết quả thể hiện trong Hình 2 cho thấy SFE với CO2 / EtOH là một kỹ thuật
chiết xuất thích hợp để thu hồi THC từ cây Cần sa sativa L. Việc bổ sung etanol làm
đồng dung môi là một thông số chiết xuất quan trọng giúp cải thiện cả năng suất
chiết xuất và hàm lượng THC trong dịch chiết. Áp suất chiết xuất ảnh hưởng đến
hàm lượng THC, trong khi nhiệt độ không ảnh hưởng đến các biến phản ứng. Các
chất chiết được làm giàu hai THC thu được (số 9 và 11) bằng cách sử dụng giá trị
giữa của etanol và nhiệt độ (2% và 60 ° C), tuy nhiên, mức áp suất chiết của chúng
khác nhau (tương ứng là 33 MPa và 15 MPa). Cuối cùng, chiết xuất số 9 và 11 được
xem xét để phân lập và tinh chế THC bằng cách sử dụng SPE bước đơn.
3.3 Cô lập và làm tinh khiết THC
Kết quả hiển thị trong phần trước chỉ ra rằng chiết xuất số 9 và 11 là ứng cử viên để
tinh chế thêm, chúng được phân tích bằng GC-FID và RP-HPLC. Hình 3 cho thấy
các cấu trúc sắc ký tương ứng của chúng cho thấy rằng THC trong dịch chiết số 11
tinh khiết hơn trong dịch chiết số 9, do đó dịch chiết số 11 được gửi để tinh chế
thêm. Cần lưu ý rằng chất chiết số 11 thu được khi sử dụng áp suất thấp; một thông
số rất quan trọng có ý nghĩa kỹ thuật quan trọng nếu quy trình khai thác được mở
rộng.
50 mg dịch chiết số 11 được bơm vào cột chiết pha rắn (ODS, 5 g, 40-60 m) và

ACCEPTED
các thành phần của nó được rửa giải bằng cách sử dụng gradient nước-axetonitril
tuyến tính. Ba mươi mốt phần được thu thập và mỗi phần được phân tích bằng TLC
và RP-HPLC để phát hiện sự hiện diện của THC và độ tinh khiết. Phân tích sắc ký

MANUSCRIPT
cho phép xác định các phân đoạn có hàm lượng THC cao nhất, tức là hai phân đoạn
(số 26 và 27) đã được chọn để mô tả thêm. Các cấu hình sắc ký thu được của phân
đoạn số 26 và 27 được thể hiện trong Hình 4. Các phân đoạn được chọn được kết
hợp, và dung môi hữu cơ được loại bỏ trong chân không, và loại bỏ nước bằng cách
đông khô. Do đó, phần cuối cùng đã làm khô (FF) thu được nặng 12,7 mg. và đã
được phân tích NMR để xác minh độ tinh khiết của nó đối với hàm lượng THC.
FF được phân tích bằng các thí nghiệm NMR: 1H-NMR và 13C-NMR. Phổ 1H-
NMR của dịch chiết số 11 và FF lần lượt được thể hiện trên Hình 5a và 5b. Bảng 3
trình bày các tín hiệu NMR quan sát được đối với FF và các tín hiệu THC được báo
cáo trong tài liệu. Các tín hiệu 1H- NMR quan sát được đối với FF rất giống với các
tín hiệu được báo cáo cho THC bởi Peschel và Politi [35]. Điều đáng chú ý là sự
khác biệt lớn nhất quan sát được đối với các giá trị δ là 0,02 ppm. Một số tín hiệu
1H-NMR đặc trưng cho THC được quan sát thấy trong phổ FF (xem Hình 6): proton
H-9 và H-10 của các nhóm metyl góc ở lần lượt là 0,98 ppm và 1,33 ppm; proton H-
6 ở 1,62 ppm; proton H-2 olefinic ở 6,37 ppm; proton H-5 ’thơm ở 6,15 ppm; các
proton H-5a và H-5b lần lượt ở 1,25 và 1,86 ppm; và proton trên nhóm hydroxyl
cung cấp tín hiệu có thể phân biệt được ở 9,21 ppm. ∆-8- THC và THCA là các
cannabinoid có cấu trúc tương tự như THC, việc phân tích tín hiệu 1H-NMR quan
sát được đối với FF cho phép loại bỏ các hợp chất này trong FF. Nhóm cacboxyl
trên C3 ’trong THCA thay đổi hóa học lập thể của proton H-1’ ’, do đó giá trị δ của
nó sẽ được tìm thấy dưới dạng các tín hiệu riêng biệt trong khoảng từ 2,7 đến 2,8
ppm. Trong ∆-8-THC, proton H-4 sẽ di chuyển vì nhóm OH không có tác dụng che
chắn đối với proton này. Mặt khác, các tín hiệu 13C-NMR quan sát được đối với FF
có thể so sánh với các tín hiệu được Young et al chỉ định trước đây cho THC. [36].
Việc so sánh phổ NMR có thể khẳng định rằng chiết xuất số 11 chủ yếu bao gồm
THC. Các cannabinoid khác như CBD hoặc CBN có thể có có mặt trong dịch chiết,
do đó có thể làm giảm độ phân giải tín hiệu phổ 1H-NMR (ví dụ, từ 0,25 đến 2,25
ppm), do sự chồng chéo của các tín hiệu NMR tương tự. Phân tích được hiển thị
trong Hình 5a và 5b chỉ ra rằng SFE với CO2 / EtOH đã cung cấp một chiết xuất
được làm giàu THC cao, sau quá trình tinh chế một bước SPE của các cannabinoid
khác. Kết quả RP-HPLC và NMR cho thấy FF tương ứng với THC có độ tinh khiết
cao. Cuối cùng, nồng độ THC được định lượng bằng GC-FID và 90,1% độ tinh
khiết được quan sát.
Nhìn chung, các kết quả cho thấy SFE kết hợp với SPE cho phép thu được THC có
độ tinh khiết cao từ cây Cần sa sativa L. Một sự cân bằng toàn cầu về quy trình chiết
xuất, phân lập và tinh chế cho thấy rằng từ 100 g nguyên liệu cần sa được sử dụng

ACCEPTED
trong công việc này, có thể thu hồi khoảng 5,1 và 1,2 g THC trong chiết xuất thô và
FF, tương ứng. Bằng quy trình SFE-SPE, có thể thu được THC có độ tinh khiết cao
với sản lượng toàn cầu trên 1%. Sử dụng nguyên liệu cần sa ban đầu có hàm lượng
THC cao có thể làm tăng sản lượng THC
Kết luận
MANUSCRIPT
Một quy trình SFE-SPE tuần tự đã được khám phá để thu được THC với độ tinh
khiết cao từ nguyên liệu thực vật Cannabis Sativa L. Ảnh hưởng của các thông số
SFE đến năng suất chiết xuất và hàm lượng THC trong dịch chiết thô đã được phân
tích; ethanol làm đồng dung môi cho thấy tác động chính lên cả hai biến phản ứng,
trong khi áp suất ảnh hưởng đến hàm lượng THC. Năng suất chiết xuất tốt hơn thu
được ở các mức áp suất, nhiệt độ và tỷ lệ phần trăm etanol cao hơn; tuy nhiên, các
điều kiện chiết xuất này cung cấp hàm lượng THC thấp hơn. Thu hồi THC cao nhất
đạt được khi sử dụng tỷ lệ phần trăm etanol thấp (2%), và việc tăng thêm áp suất từ
15 lên 33 MPa đã cải thiện quá trình chiết THC, nhưng điều này làm giảm độ chọn
lọc chiết xuất. SFE cung cấp hai chiết xuất có hàm lượng THC cao nhất, số 9 và 11
với lần lượt là 37,85 và 36,18% THC. Chiết xuất số 11 được chọn cho bước tinh
chế-phân lập do ít phức tạp hơn. Một bước SPE duy nhất trên dịch chiết số 11 cho
phép chiết THC ở độ tinh khiết 90,1%, đã được kiểm tra bằng phân tích sắc ký và
quang phổ. Trên cơ sở kết quả của chúng tôi, chúng tôi kết luận rằng từ 100 g
nguyên liệu bào chế Cannabis Sativa L trải qua quy trình SFE-SPE tuần tự, có thể
thu được 13,97 g chiết xuất làm giàu THC và 3,55 g THC tinh khiết cao. Đây là một
ứng cử viên đầy hứa hẹn cho "tiêu chuẩn nội bộ", hoặc tiếp tục tinh chế cho đến khi
thu được tiêu chuẩn đối chứng. Chúng ta có cho thấy sự hữu ích của việc kết hợp
SFE với SPE để thu được dịch chiết thô sạch. Những điều đã nói ở trên cho phép
chúng tôi có thể có một loại vật liệu tiêu chuẩn trong nhà THC, có được với chi phí
thấp và với đầy đủ các nguồn lực có thể chi trả được.
Sự nhìn nhận
Các tác giả công nhận Đại học Nacional de Colombia (División de Investigación,
Sede Bogotá) đã hỗ trợ tài chính và Fiscalía General de la Nación vì sự hỗ trợ quý
báu của họ trong việc thực hiện công việc này.
References
[1] R. Upton, L. Craker, M. ElSohly, A. Romm, E. Russo, M. Sexton, Cannabis
Inflorescence Cannabis spp. Standards of Identity, Analysis, and Quality
Control, first ed., American Herbal Pharmacopoeia, Scott’s Valley, 2013.
[2] United Nations office on Drugs and Crime, Terminology and Information On
Drugs, Second ed., United Nations, New York, 2003.
[3] United Nations office on Drugs and Crime, Resumen, Conclusiones y
Consecuencias en Materia de Políticas - Informe Mundial Sobre las Drogas
2017. United Nations, Viena, 2017.
[4] United Nations office on Drugs and Crime, Market Analysis of Plant- Based
drugs. Opiates, cocaine, cannabis, United Nations, Viena, 2017.
[5] M. ElSohly, M. Radwan, W. Gul, S. Chandra, A. Galal, Phytochemistry of
Cannabis sativa L., Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 103 (2017) 1-36,
https://doi.org/10.1007/978-3- 319-45541-9_1.
[6] N. Darmani, J. Johnson, Central and peripheral mechanisms contribute to the
antiemetic actions of delta-9-tetrahydrocannabinol against 5-hydroxytryptophan-
induced emesis, Eur. J. Pharmacol. 488 (2004) 201-12,
https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2004.02.018.
[7] A. Hardisson, C. Expósito, C. Rubio, M.R. Pozuelo, Nuevas perspectivas
terapéuticas de los compuestos cannabinólicos. Rev. Toxicol. 19 (2002) 89-92.
[8] F. Borrelli, I. Fasolino, B. Romano, R. Capasso, F. Maiello, D. Coppola, P.
Orlando. G. Battista, E. Pagano, V. Di Marzo, A. A. Izzo, Beneficial effect of
the non-psychotropic plant cannabinoid cannabigerol on experimental
inflammatory bowel disease, Biochem.
 Pharmacol. 85 (2013) 1306-1316, https://doi.org/10.1016/j.bcp.2013.01.017.
[9] G. Bar-Sela, A. Avisar, R. Batash, M. Schaffer, Is the clinical use of cannabis by
oncology patients advisable? Curr. Med. Chem. 21 (2014) 1923-1930.
[10] Z. Zdrojewicz, D. Pypno, K. Cabala, M. Waracki, Potential applications of
marijuana and cannabinoids in medicine, Pol. Merkur Lekarski 37 (2014) 248-

ACCEPTED
252.
[11] J. Parmar, B. Forrest, R. Freeman, Research in Social and Administrative
Pharmacy: Medical marijuana patient counseling points for health care
professionals based on trends in the medical uses, efficacy, and adverse effects

MANUSCRIPT
of cannabis-based pharmaceutical drugs, Res. Social Adm. Pharm. 12 (2016)
638-654, https://doi.org/10.1016/j.sapharm.2015.09.002.
[12] The National Academies of Sciences-Engineering-Medicine, The Health Effects
of Cannabis and Cannabinoids: The Current State of Evidence and
Recommendations for Research, The National Academies Press, Washington
(DC), 2017.
[13] M. Radwant, M. ElSohly, A. El-Alfy, S. Ahmed, D. Slade, A. Husni, S.P.
Manly, L. Wilson, S. Seale, S.J. Cutler, S.A. Ross, Isolation and
Pharmacological Evaluation of Minor Cannabinoids from High-Potency
Cannabis sativa. J. Nat. Prod. 78 (2015) 1271- 1276,
https://doi.org/10.1021/acs.jnatprod.5b00065.
[14] Y. Gaoni, R. Mechoulam, Isolation, Structure, and Partial Synthesis of an Active
Constituent of Hashish. J. Am. Chem. Soc. 86 (1964) 1646-1647,
https://doi.org/10.1021/ja01062a046.
[15] M. Lamers, Colombia’s medical cannabis industry poised for ‘bellwether year’
on world stage, Marijuana Business Daily, https://mjbizdaily.com/colombias-
medical-cannabis- industry-poised-bellwether-year/, 2018, (accessed 14
September 2018).
[16] H. Perrotin-Brunel. Sustainable Production of Cannabinoids with Supercritical
Carbon Dioxide Tecnologies,
TUDelft, https://repository.tudelft.nl/islandora/object/uuid%3Ac1b4471f-ea42-
47cb-a230- 5555d268fb4c, 2018, (accessed 14 September 2018).
[17] J.D. Roberts, C. Gennings, M. Shih, Synergistic affective analgesic interaction
between delta-9-tetrahydrocannabinol and morphine, Eur. J. Pharmacol. 530
(2006) 54-58, https://doi.org/10.1016/j.ejphar.2005.11.036.
[18] N.J. Goodwin, N.J. Archer, C. Murray, A.K. Greenwood, D. McHattie,
Production of
 Delta-9-Tetrahydrocannabinol, United States Patent (US 2005/0171361), 2005.
[19] P. Bhatarah, D. McHattie, A.K. Greenwood, Production of delta-
9tetrahidrocannabinol, Patent (WO 2009/133376), 2009.
[20] H. Perrotin-Brunel, M. Roosmalen, M. Kroon, J. van Spronsen, G. witkamp, C.
Peters, Solubility of Cannabinol in Supercritical Carbon Dioxide, J. Chem. Eng.

ACCEPTED
Data 55 (2010) 3704-3707, https://doi.org/10.1021/je100245n.
[21] H. Perrotin-Brunel, M. Kroon, M. Roosmalen, J. van Spronsen, C. Peters, G.
Witkamp, Solubility of non-psychoactive cannabinoids in supercritical carbon
dioxide and comparison with psychoactive cannabinoids, J. Supercrit. Fluids 55

MANUSCRIPT
(2010) 603-608, https://doi.org/10.1016/j.supflu.2010.09.011.
[22] L. Rovetto, N. Aieta, Supercritical carbon dioxide extraction of cannabinoids
from Cannabis sativa L. plant material. J. Supercrit. Fluids 129 (2017) 16-27,
http://dx.doi.org/10.1016/j.supflu.2017.03.014.
[23] S. Wood, A. Botha, The new ISO Guide 80: Guidance for the in-house
preparation of quality control materials (QCMs), Accred. Qual. Assur. 19 (2014)
477-480, https://doi.org/10.1007/s00769-014-1084-1.
[24] S. Chandra, IA. Khan, MA. El-Sohly, The role of biotechnology in Cannabis
sativa propagation for the production of phytocannabinoids, Biotechnology for
Medicinal Plants 123 (2013) 123-48, https://doi.org/10.1007/978-3-642-29974-
2_5.
[25] K. Aladic, K. Jarni, T. Barbir, S. Vidovic, J. Vladic, Supercritical CO 2
extraction of hemp (Cannabis sativa L.) seed oil. Ind. Crops Prod. 76 (20159
472-478, https://doi.org/10.1016/j.indcrop.2015.07.016.
[26] D. Bas, I. Boyaci, Modeling and optimization I: Usability of response surface
methodology, J Food Eng. 78 (2007) 836-
845, https://doi.org/10.1016/j.jfoodeng.2005.11.024.
[27] United Nations office on Drugs and Crime, Terminology and information on
Drugs, Third ed., United Nations, New York, 2016.
[28] W. Kamysz, M. Okroj, E. Lempicka, T. Ossowski, J. Lukasiak, Fast and
efficient purification of synthetic peptides by solid-phase extraction, Acta
Chromatographica 14 (2004) 180-186.
[29] M. Rahoma, S. Marleny, M. Paulo, Extraction of Caffeine, Theobromine, and
Cocoa
 Butter from Brazilian Cocoa Beans Using Supercritical CO2 and Ethane, Ind
Eng. Chem. Res. 14 (2002) 6751-6758, https://doi.org/10.1021/ie0203936.
[30] X. Cao, B. Peng, S. Ma, H. Ni, L. Zhang, W. Zhang, M. Li, C.S. Hsu, Q. Shi,
Molecular Selectivity in Supercritical CO2 Extraction of a Crude Oil, Energy
Fuels 31 (2017) 4996- 5002, https://doi.org/10.1021/acs.energyfuels.7b00415.

ACCEPTED
[31] F. Gaspar, Extraction of Essential Oils and Cuticular Waxes with Compressed
CO2: Effect of Extraction Pressure and Temperature, Ind. Eng. Chem. Res. 41
(2002) 2497- 2503, https://doi.org/10.1021/ie010883i.
[32] C. Da Porto, D. Voinovich, D. Decorti, Response surface optimization of hemp

(2012)
MANUSCRIPT
seed (Cannabis sativa L.) oil yield and oxidation stability by supercritical carbon
dioxide extraction, J. Supercrit. Fluids 68
45-51, https://doi.org/10.1016/j.supflu.2012.04.008.
[33] J. Omar, M. Olivares, M. Alzaga, N. Etxebarria, Optimisation and
characterisation of marihuana extracts obtained by supercritical fluid extraction
and focused ultrasound extraction and retention time locking GC-MS, J. Sep.
Sci. 36 (2013) 36 1397-1401, https://doi.org/10.1002/jssc.201201103.
[34] E. Reverchon, L. De Marco, Supercritical fluid extraction and fractionation of
natural matter. J Supercrit Fluids 28 (2006)
146-166, https://doi.org/10.1016/j.supflu.2006.03.020.
[35] W. Peschel, M. Politi. 1H NMR and HPLC/DAD for Cannabis sativa L.
chemotype distinction, extract profiling and specification, Talanta, 140 (2015)
150-165, https://doi.org/10.1016/j.talanta.2015.02.040.
[36] Y. Choi, A. Hazekamp, A.M. Peltenburg-Looman, M. Frederich, C. Erkelens
A.W. Lefeber, R. Verpoorte, NMR Assigments of the Major Cannabinoids and
Cannabiflavonids Isolated from Flowers of Cannabis sativa, 15 (2004) 345-354,
https://doi.org/10.1002/pca.787.
Figures Captions

Fig 1. Schematic diagram of SFE apparatus. (1) CO 2 cylinder; (2) CO2 pump; (3)
and (6) micrometering valve; (4) co-solvent reservoir; (5) co-solvent pump; (7)
preheating spiral tube; (8) 10 cm3 extraction cell; (9) electronic temperature control;

ACCEPTED
(10) collection vial; (11) Flowmeter; (12) backpressure regulator valve; (13)
manometer.

MANUSCRIPT

Fig. 1.

Fig. 2. Surface response plot for the effect of pressure and co-solvent percentage on
THC content in Cannabis Sativa L. extracts (%THC in dry extract).
 ACCEPTED
MANUSCRIPT

Fig. 2.

Fig. 3. RP-HPLC and CG-FID profiles for extracts number 9 and 11. The signals at
12.7 and
12.2 minutes corresponds to THC in RP-HPLC and CG-FID profiles, respectively.
 ACCEPTED
MANUSCRIPT

Fig. 4. RP-HPLC profiles for fractions 26 (a) and 27 (b). The signal at 12.7
corresponds to THC.

2400 VWD: Signal A, 210 nm

Extracto THC run 1
F15
Retention Time (a)
2200
2000
12.756

1800
1600
1400
1200
1000
800
600
400
12.376

200
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
20
Minutes
 24
00 VWD: Signal A, 210 nm

22
Extracto THC run 1
F16
Retention Time (b)
00

ACCEPTED
20
00
18
00
16

MANUSCRIPT
12.716
Fig. 00
4.
14
00
12
00
10
00
80
0
60
0
40
0
20
0
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
19 20
Minutes

Fig. 5. 1H NMR (400 MHz in DMSO-d6) spectra for (a) the extract number 11 and (b)
the final fraction.
 (a)

(b)

Fig. 5.
Fig. 6. Tetrahydrocannabinol (THC) structure. The numbering presented is
based monoterpenenoid nomenclature.

ACCEPTED
Fig. 6. MANUSCRIPT
 ACCEPTED
Table
MANUSCRIP
Table 1. Extraction yields and THC contents of SFE extracts from Cannabis sativa L. plant

Extraction parameters THC contents

Pressu Temperatu Co- Extraction %THC in %THC in THC b
Extrac re re (ºC) solven yields (% dry dry cannabis Recovery
t (MPa t (% wt d.b.a) extract sample
) wt)
1 15 40 0 4.83 32.2 1.5 4.5
5 6 8
2 15 80 0 6.32 31.0 1.9 4.4
8 6 1
3 15 80 5 21.17 24.8 5.2 3.5
8 7 3
4 15 40 5 23.36 30.1 7.0 4.2
4 4 8
5 33 80 0 10.41 24.7 2.5 3.5
3 7 1
6 33 80 5 26.36 15.5 4.0 2.2
2 9 0
7 33 40 5 21.49 20.3 4.3 2.8
4 7 9
8 33 40 0 6.32 25.8 1.6 3.6
1 3 7
9 33 60 2 16.01 37.8 6.0 5.3
 5 6 8
1 24 80 2 17.43 29.5 5.1 4.2
0 4 5 0
1 15 60 2 13.97 36.1 5.0 5.1
1 8 5 4
1 24 40 2 15.57 25.1 3.9 3.5
2 0 1 7
1 24 60 5 18.27 22.0 4.0 3.1
3 4 3 3
1 24 60 0 13.06 28.3 3.7 4.0
4 8 1 3
1 24 60 2 16.39 24.0 3.9 3.4
5 9 5 2
1 24 60 2 17.18 26.1 4.4 3.7
6 5 9 1
1 24 60 2 16.13 23.8 3.8 3.3
7 4 5 9
1 24 60 2 18.61 24.5 4.5 3.4
8 3 7 8
1 24 60 2 15.48 28.2 4.3 4.0
9 8 8 2
a
d.b. = dry basis
b
THC Recovery values were calculated as the ratio between the THC content in the raw extracts and the total THC in raw
material (%THCextract / %THCTotal). The total THC observed in cannabis sample used was 7.04%, this was extracted
followed the procedure described in section 2.6
 ACCEPTED
MANUSCRIP
Table 2. Analysis of variance and statistical indicators of second order model for extraction yield and THC content

Extraction THC percent in raw extract

Factor yield
Estimat p Adjuste p Estima p Adjuste p
e value d value te value d value
Intercept (b0) 4.3923 0.780 8.19 0.0001 ** 51.985 0.059 * 72.23 0.001 **
* 5 *
b1 EtOH 5.1500 0.027 ** 4.91 0.0002 ** 4.9502 0.142 3.46 0.081 **
*
b2 MPa 0.4915 0.620 -4.2478 0.020 * -3.69 0.010 **
*
b3 T -0.1716 0.726 0.8921 0.263
b12 -0.0123 0.762 -0.0436 0.498
EtOH*MPa
b13 EtOH*T -0.0071 0.697 -0.0224 0.442
b23 MPa*T 0.0067 0.207 0.0004 0.963
b11 EtOH2 -0.3280 0.230 -0.42 0.0405 ** -0.7464 0.095 * -0.93 0.018 **
b22 MPa2 -0.0155 0.431 0.0832 0.020 * 0.07 0.016 **
*
b33 T2 0.0007 0.867 -0.0074 0.248
p value 0.01 <0.0001 0.085 0.005
R2 90.4 83.6 72.3 62.8
R2 adjusted 80.7 81.5 44.5 52.1
ADD 9.5 9.1 8.5 7.9
* = significant
** = highly significant
*** = Very highly significant
Table 3. 1H-NMR and 13C-NMR spectroscopy data for final fraction and THC

n
1

ACCEPTED
H-NMR (δ ppm, J Hz)

Positio Final fraction

(400 MHz)
THC
(400
13
C-NMR (δ ppm)
Final
fraction
THC
(100

1
2
MANUSCRIPT
3.07 (1H, dm)
6.37(1H, m)
MHz)a
3.08
6.37
(100 MHz) MHz)b
33.81
125.34
33.6
123.7
3 132.45 134.3
4 2.08 (2H, m) 2.08 30.70 31.2
5a 1.25 (1H, m) 1.30 27.86 25.0
5b 1.86 (1H, m) 1.85
6 1.62 (1H, sw) 1.60 45.90 45.8
7 1.62 (3H, sw) 1.60 23.63 23.4
8 76.92 76.7
9 0.98 (3H, s) 0.98 24.95 19.3
10 1.33 (3H, s) 1.31 24.95 27.6
1´ 108.39 110.8
2´ 154.61 154.7
3´ 6.01 (1H, m, J 6.01 109.00 107.5
=1.40)
4´ 141.83 142.8
5´ 6.15 (1H, m, J 6.15 107.41 110.1
=1.40)
6´ 154.81 154.4
1´´ 2.35 (2H, m) 2.34 35.54 35.5
2´´ 1.49 (2H, m) 1.48 31.20 30.6
3´´ 1.25-1.30 (2H, 1.25 31.36 31.5
m)
4´´ 1.25-1.30 (2H, 1.25 22.44 22.5
m)
5´´ 0.86 (3H, t) 0.85 14.38 14.0
 OH 9.24 (1H, s) 9.20

δ (ppm): Chemical shift

J (Hz): Nuclear spin-spin coupling constant
a
Reported data obtained using 400 MHz NMR equipment [35]
b
Reported data obtained using 100 MHz NMR equipment [36]