МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ЛЬВІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ІВАНА ФРАНКА

БІОЛОГІЧНИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра мікробіології

Звіт
про проходження навчальної практики з мікробіології

Студентки І курсу, групи БЛТ-11

спеціальності 162 Біотехнології та біоінженерія
Гаврилюк Ірини Василівни

Національна шкала ________________________

Кількість балів:_________Оцінка: ECTS_______

м. Львів − 2023 рік

 2

ВСТУП

З 22 червня по 19 липня 2023 року я проходила навчальну практику на

кафедрі мікробіології Львівського національного університету імені Івана Франка.
Метою практики було поглиблення, узагальнення і вдосконалення набутих
знань та умінь, формування основних навичок у процесі роботи з
мікроорганізмами з дотриманням правил біологічної безпеки, початок оволодіння
професійним досвідом виробничо-технологічних робіт, що пов’язані з
використанням біологічних агентів та продуктів їх життєдіяльності.
Завдання практики:
 навчитися застосовувати знання, критичне мислення та розуміння
біотехнологічного потенціалу мікроорганізмів у практичних ситуаціях;
 вміти правильно користуватися обладнанням, посудом, приладами
мікробіологічної лабораторії;
 сформувати навики роботи з хімічними речовинами, необхідними для
приготування поживних середовищ та реактивів;
 навчитися готувати, стерилізувати та розливати різні за призначенням та
складом поживні середовища;
 навчитися здійснювати посіви та вирощувати мікроорганізми у
лабораторних умовах;
 вміти виділяти з природних субстратів та ідентифікувати мікроорганізми
різних систематичних груп, досліджувати їхні властивості.
Предметом вивчення під час навчальної практики були правила роботи з
обладнанням, посудом, реактивами, приладами мікробіологічної лабораторії,
принципи приготування, стерилізації, розливу поживних середовищ, основні
методи посіву, культивування та дослідження властивостей мікроорганізмів.
 3

1. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

1.1. Кількісне визначення вмісту йонів сульфату

Вміст йонів сульфату у розчині визначали турбідиметричним методом (Гудзь
та ін., 2014). Суть методу полягає в осадженні йонів сульфату барій хлоридом і
турбідиметричному їх визначенні у вигляді барій сульфату. Як стабілізатор
суспензії використовували гліцерин.
Осаджуючий розчин. Барій хлорид, масою 20 г, поміщали у мірну колбу,
об’ємом 500 мл. Додавали 300 мл дистильованої води і 60 мл хлоридної кислоти у
концентрації 1 М. Після повного розчинення барій хлориду об’єм розчину
доводили до мітки і перемішували. Приготовлений розчин змішували з
гліцерином в співвідношенні 1:1.
Визначення вмісту йонів сульфату. До 1 мл розчину додавали 10 мл
робочого осаджуючого розчину, ретельно перемішували, витримували протягом
10 хв, струшували і фотометрували на КФК-3 (=520 нм, кювета з оптичним
шляхом 10 мм).
Для побудови калібрувальної кривої готували 100 мл 0,1 М водного розчину
Na2SO4. Вихідний розчин розводили у певну кількість разів для отримання
калібрувальних розчинів: 0 (контроль), 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 і 50 мМ. Вимірювали
екстинкцію розчинів на фотоелектроколориметрі за 520 нм (l = 1 см) за різних
концентрацій йонів сульфату у калібрувальних розчинах. Згідно отриманих
результатів будували калібрувальну криву.

1.2. Визначення біомаси бактерій фотоелектроколориметричним

методом
Після вирощування бактерій роду Desulfovibrio у рідкому середовищі
біомасу визначали за мутністю суспензії клітин фотометруванням на
 4

фотоелектроколориметрі КФК-3 за довжини хвилі 340 нм у кюветі з оптичним

шляхом 3 мм і розраховували за формулою (Гудзь та ін., 2014):

С, г/л = (Е340n)/0,19,

де Е340 – екстинкція за 340 нм;

n – фактор розведення;
0,19 – коефіцієнт перерахунку, отриманий за калібрувальною кривою
залежності екстинкції від сухої маси клітин.

1.3. Середовища для виділення з ґрунту мікроорганізмів різних еколого

трофічних груп та умови їх культивування
Для виділення з природного субстрату (ґрунту) та вивчення властивостей
мікроорганізмів різних еколого трофічних груп використовували наступні
середовища (Гудзь та ін., 2014):
1) крохмально-аміачний агар – для актинобактерій;
2) Сабуро – для грибів і дріжджів;
3) Ешбі – для олігонітрофілів і бактерій роду Azotobacter;
4) Виноградського І – для нітрифікувальних бактерій першої фази
нітрифікації;
5) Виноградського ІІ – для нітрифікувальних бактерій другої фази
нітрифікації;
6) картопляний агар з 2,3,5-трифенілтетразолій хлоридом (ТТХ) – для
фітопатогенних бактерій.
Крохмально-аміачне середовище (КАА) для актинобактерій. Склад, г:
розчинний крохмаль – 10,0; (NH4)2SO4 – 2,0; K2HPO4 – 1,0; MgSO4×7H2O – 1,0;
 5

NaCl –1,0; СаСО3 – 3,0; агар – 15,0; вода водопровідна – 1 л. Стерилізували 30 хв

за 1,0 атм.
Глюкозо-пептонне середовище для дріжджів (середовище Сабуро).
Склад, г: глюкоза – 40,0; агар – 20,0; пептон – 10,0; дріжджовий екстракт – 2,0 г/л;
вода водопровідна – 1 л. Середовище стерилізували 30 хв за 0,5 атм.
Середовище Ешбі для олігонітрофілів і бактерій роду Azotobacter. Склад,
г: маніт – 20,0; K2HPO4 – 0,2; MgSO4×7H2O – 0,2; NaCl – 0,2; K2SO4 – 0,1; СаСО3 –
5,0; агар – 20,0; вода дистильована – 1 л. У середовище додавали розчин
мікроелементів (за Федоровим) – 1 мл/л.
Розчин мікроелементів (за Федоровим), г: Н3BO3 – 5,0; (NH4)2MoO4×2H2O –
5,0; ZnSO4×7H2O – 0,2; KІ і NaВr – по 0,5; Al2(SO4)3×18H2O – 0,3; вода
дистильована – 1 л.
Середовище Виноградського І. Перша фаза нітрифікації. Склад, г:
(NH4)2SO4 – 2,0; K2HPO4 – 1,0; MgSO4×7H2O – 0,5; NaСl – 2,0; FeSO4×7H2O – 0,05;
СаСO3 – 5,0; агар – 20,0; вода водопровідна – 1 л. Стерилізували 30 хв за 1,0 атм.
Середовище Виноградського ІІ. Друга фаза нітрифікації. Склад, г: NaNO2
– 1,0; K2HPO4 – 0,5; MgSO4×7H2O – 0,5; NaСl – 0,5; FeSO4×7H2O – 0,4; Na2СO3 –
1,0; агар – 20,0; вода водопровідна 1 л. Стерилізували 30 хв за 1,0 атм.
До середовищ І і ІІ додавали розчин мікроелементів за Пфеннігом – 1 мл/л.
Розчин мікроелементів за Пфеннігом, мг: ЕДТА– 500,0; Na2MoO4×2H2O –
500,0; FeSO4×7H2O – 200,0; ZnSO4×7H2O – 10,0; MnCl2×4H2O – 3,0; Н3ВО3 – 30,0;
СоCl2×6H2O – 20,0; СuCl2×2H2O – 1,0; NiCl2×6H2O – 2,0; вода дистильована – 1 л;
рН 6,0.
Картопляний агар з 2,3,5-трифенілтетразолій хлоридом (ТТХ). До 500 г
очищених і нарізаних шматочками бульб картоплі додавали 1 л дистильованої
води, варили до готовності, фільтрували крізь ватний фільтр, доводили до
попереднього об’єму. До отриманого розчину додавали NaCl – 5,0 г; агар – 20,0 г.
 6

рН 7,0–7,2 за температури +25 °С. Середовище стерилізували 30 хв за 1,0 атм. До

стерильного картопляного агару додавали 0,005 % ТТХ (шприцом крізь
одноразовий фільтр).
Мікроорганізми культивували на чашках Петрі з агаризованими
середовищами у термостаті за 30 оС впродовж 1−2 діб. Кількість мікроорганізмів
різних груп у пробі ґрунту визначали за підрахунком чисельності КУО на чашках
та перерахунком на 1 г сухого ґрунту з урахуванням розведення ґрунтової
суспензії та відносної вологості ґрунту. З кожного середовища відбирали окремі
ізоляти висівом штрихами на чашки або пробірки з агаризованим середовищем.
Для перевірки на чистоту культури висівали на чашки виснажливим штрихом
(Гудзь та ін., 2014).

1.4. Виготовлення ґрунтової суспензії з десорбцією

Зразок ґрунту звільняли від каміння, щебеню, уламків скла, коренів рослин
тощо; поміщали у стерильну фарфорову ступку і відбирали наважки по 10 г для
приготування ґрунтової суспензії. Наважку ґрунту, попередньо розтерту
стерильним товкачиком у ступці з невеликою кількістю стерильного 0,9% розчину
NaCl, поміщали у стерильну колбу і заливали стерильним 0,9% розчином NaCl у
співвідношенні 1:10 (10 г ґрунту переносили у колбу, об’єм доводили (близько 90
мл 0,9% NaCl) до 100 мл). Суміш ретельно збовтували упродовж 10 хв для
відокремлення мікроорганізмів від ґрунтових часточок, потім відстоювали 2–3 хв
для осідання грубих фрагментів. Із отриманої суспензії готували серійні
десятикратні розведення від 10-2 до 10-5. З різних розведень суспензії здійснювали
посів на щільні поживні середовища по 0,1 мл/чашку для отримання розведень від
10-3 до 10-6 (Гудзь та ін., 2014).
 7

1.5. Визначення відносної вологості ґрунту

Для перерахунку ваги грунту на 1 г абсолютно сухого ґрунту необхідно знати
його вологість. Для цього наважки 1 г ґрунту поміщали в порожній попередньо
зважений бюкс і висушували за температури 105 °С до сталої маси. Бюкс із
висушеним ґрунтом важили й обчислювали вологість ґрунту за формулою:

В = (а–б)×100/а–с,

де В – вологість ґрунту, %; а – маса бюкса з вологим ґрунтом, г; б – маса бюкса з

сухим ґрунтом, г; с – маса порожнього бюкса, г (Гудзь та ін., 2014).

1.6. Дослідження деяких властивостей мікроорганізмів, виділених з

ґрунту
Для визначення форми чи угруповання клітин бактерій готували препарат
фіксованих клітин і застосовували зафарбовування фуксином. Для диференціації
грампозитивних і грамнегативних бактерій їх фарбували за Грамом або бактерії
диференціювали за допомогою тесту Куі–Грегерсена (Гудзь та ін., 2014).
Фарбування за Грамом.
1. На предметному склі готували фіксований препарат бактерій.
2. На фіксований препарат наносили 5–10 крапель розчину кристалічного
фіолетового (реагент 1, Crystal violet solution (1:3)). Витримували препарат під
барвником упродовж 1 хв. Не промиваючи препарат, заливали його розчином
Люголя (реагент 2) до повного почорніння (на 1 хв).
3. Змивали розчини дистильованою водою і ретельно наносили
деколоризуючий розчин (реагент 3) на препарат поки він не набував сіро-
блакитного забарвлення (10–15 сек).
 8

4. Розчин обережно змивали дистильованою водою. Ступінь знебарвлення

контролювали під мікроскопом (об’єктив ×8).
5. На знебарвлені зразки ретельно наносили розчин сафраніну (реагент 4).
Витримували препарат під барвником 1 хв і змивали обережно дистильованою
водою. Просушували. Розглядали препарат в імерсійній системі мікроскопа
(об’єктив ×90).
Метод диференціації грампозитивних та грамнегативних бактерій за
допомогою KОН (тест Кої-Грегерсена). На предметне скло наносили дві краплі 3
% KОН. У ці краплі поміщали клітини бактерій та перемішували 5–10 с. Опускали
петлю в краплі й піднімали вгору. Якщо за петлею тягнувся тяж завдовжки 0,5–2,0
см, то культуру вважали грамнегативною. Грампозитивні бактерії тяжів не
утворювали.
Для виявлення оксидази використовували тест Ковача або Gaby-Hadley
(Гудзь та ін., 2014). Результат уважали позитивним, якщо в разі використання
реактиву Ковача мазок з клітинами на смужках ставав від темно-фіолетового до
чорного, реактиву Gaby-Hadley – синього; негативним – колір не змінювався.
Для виявлення каталазної активності застосовували прямий метод
дослідження (Гудзь та ін., 2014). Краплю 10 % Н2О2 наносили на предметне скло і
в ній суспендували клітини досліджуваних бактерій. Виділення О2, яке було добре
помітно за утворенням пухирців газу, свідчило про наявність каталази в клітинах.

1.7. Використання виділеними мікроорганізмами різних джерел карбону

Для визначення здатності досліджуваних культур мікроорганізмів
використовувати різні джерела карбону їх висівали уколом у пробірки з різними
агаризованими середовищами Гісса (з глюкозою, лактозою, мальтозою,
сахарозою, сорбітом, інозитом). Середовища Гісса, окрім певного джерела
карбону, у своєму складі містять індикатор кислотності – бромтимоловий синій
 9

або бромкрезоловий пурпуровий. Реакцію оцінювали за зміною кольору

середовища. За позитивної реакції утворювалася кислота і колір змінювався з
рожевого на синій чи з фіолетового на жовтий. Також утворювались бульбашки
газу в глибині або на поверхні середовища. Якщо колір середовища не
змінювався, то реакцію вважали негативною.

1.8. Статистична обробка результатів

Статистичну обробку отриманих результатів проводили
загальноприйнятими методами. Обчислювали середні арифметичні величини М та
похибки середнього арифметичного m.
 10

2. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

2.1. Кількісне визначення вмісту йонів сульфату у розчині. Побудова

калібрувальної кривої
Для визначення вмісту йонів сульфату у розчині будували калібрувальну
криву (рис. 2.1). Вихідний 0,1 М розчин Na 2SO4 (1,42 г у 100 мл Н2О) розводили у
певну кількість разів для отримання калібрувальних розчинів: 0 (контроль), 1, 2, 4,
6, 8, 10, 12 і 50 мМ. Екстинкцію розчинів вимірювали на фотоелектроколориметрі
за 520 нм (l = 1 см) (табл. 2.1).
Таблиця 2.1
Концентрація SO42- у Е520 Розведення 100 мМ
розчині, мМ розчину, разів
0 0,000 0,00
0,000
1 0,089 100,00
0,069
2 0,147 50,00
0,113
4 0,277 25,00
0,276
6 0,412 16,67
0,369
8 0,594 12,50
0,437
10 0,705 10,00
0,623
12 0,841 8,33
0,652
50 1,546 2,00
1,364
 11

Рис. 1.2. Калібрувальна крива для визначення вмісту йонів сульфату у

розчині

2.2. Визначення біомаси сульфатвідновлювальних бактерій

Після вирощування бактерій роду Desulfovibrio у рідкому середовищі
біомасу визначали за мутністю суспензії клітин фотометруванням на
фотоелектроколориметрі КФК-3 за довжини хвилі 340 нм у кюветі з оптичним
шляхом 3 мм (табл. 2.2).
Таблиця 2.2

Біомаса,
Розведення, n
Штам Е340 Біомаса, г/л середнє
разів
значення г/л
Desulfovibrio 3 0,074 1,17
desulfuricans 7 0,046 1,69 1,84 ± 0,47
ІМВ К-6 21 0,024 2,65
3 0,050 0,79
Desulfovibrio
7 0,034 1,25 1,45 ± 0,45
sp. Yav-6
21 0,021 2,32
3 0,062 0,98
Desulfovibrio
7 0,041 1,51 1,60 ± 0,39
sp. Yav-8
21 0,021 2,32
 12

2.3. Визначення відносної вологості досліджуваного ґрунту

Для перерахунку ваги грунту на 1 г абсолютно сухого ґрунту визначили його
вологість, яка становила 27,2 % (табл. 2.3). Отже, встановили, що у 1 г вологого
ґрунту міститься 0,728 г сухого ґрунту.
Таблиця 2.3
Відносна вологість досліджуваного ґрунту

№ Маса Маса Маса бюкса з Маса бюкса Вологість

бюкса порожнього вологого вологим з сухим ґрунту, %
бюкса, г ґрунту, г ґрунтом, г ґрунтом, г
1. 24,665 1,005 25,661 25,391 27,1
2. 22,018 1,048 23,062 22,777 27,3
Середнє значення 27,2 ± 0,1

2.4. Кількість мікроорганізмів різних груп у пробі ґрунту

Кількість мікроорганізмів нітрифікувальних бактерій II фази нітрифікації та
фітопатогенних бактерій у пробі ґрунту визначали за підрахунком чисельності
КУО на чашках та перерахунком на 1 г сухого ґрунту з урахуванням розведення
ґрунтової суспензії та відносної вологості ґрунту (табл. 2.4). Чисельність
нітрифікувальних бактерій II нітрифікації та фітопатогенних бактерій у пробі
ґрунту становила 4,50×106 та 1,75×107 КУО/г сухого грунту, відповідно.

2.5. Дослідження деяких властивостей мікроорганізмів, виділених з

ґрунту
Відібрали 7 ізолятів нітрифікувальних бактерій II фази нітрифікації та 3
ізоляти фітопатогенних бактерій. Дослідили їхні деякі морфологічні та біохімічні
властивості (табл. 2.5).
 13

Таблиця 2.4
Кількість мікроорганізмів різних груп у пробі ґрунту
№ Група мікроорганізмів Середовище Спосіб посіву Розве- Кількість Кількість Кількість Середнє
з/п дення, КУО мікроорганізмів, мікроорганізмів, значення,
разів на чашці, КУО/г КУО/г сухого КУО/г
шт вологого грунту грунту сухого
ґрунту
1. Нітрифікувальні бактерії Виноградського Поверхневий 10-3 169 1,69×105 2,30×105
ІІ фаза нітрифікації посів 10-3 122 1,22×105 1,70×105
10-4 93 9,30×105 1,30×106
10-4 72 7,20×105 1,00×106 4,50×106
10-5 48 4,80×106 6,60×106
10-5 73 7,30×106 1,00×107
10-6 7 7,00×106 9,60×106
10-6 5 5,00×106 7,00×106
2. Фітопатогенні бактерії Картопляний Поверхневий 10-3 980 9,80×105 1,35×106
агар з ТТХ посів 10-3 719 7,19×105 9,88×105
10-4 206 2,06×106 2,83×106
10-4 293 2,93×106 4,02×106
10-5 125 1,25×107 1,72×107 1,75×107
10-5 86 8,60×106 1,18×107
10-6 55 5,50×107 7,55×107
10-6 19 1,90×107 2,61×107
 14

Таблиця 2.5
Дослідження деяких властивостей мікроорганізмів, виділених з ґрунту

№ Група Середовище № Форма та Фарбування Оксидазна Каталазна Примітки

з/п мікроорганізмів ізоля- угруповання за Грамом активність активність (аналіз посіву
тів клітин ізолята
виснажливим
штрихом)
1. Нітрифікувальні Виноградського 1. поодинокі коки − + чиста
бактерії II фази культура
нітрифікації
2. коки − +
3. коки − +
5. коки − − +
6. стрептококи та + + чиста
поодинокі коки культура
7. коки − + чиста
культура
8. коки + − +
2. Фітопатогенні Картопляний 3. палички − +++ +
бактерії агар з ТТХ 4. коки − +++ +
7. коки + +
 15

2.6. Використання відібраними ізолятами різних джерел карбону

Для визначення здатності ізолятів № 1 і 7 нітрифікувальних бактерій II фази
нітрифікації та № 3 і 4 фітопатогенних бактерій використовувати різні джерела
карбону їх висівали уколом у пробірки з різними агаризованими середовищами
Гісса (з глюкозою, лактозою, мальтозою, сахарозою, сорбітом, інозитом).
Відмітили їх ріст, здатність до кислотоутворення та виділення бульбашок газу
(табл. 2.6).
Таблиця 2.6

Ріст мікроорганізмів у середовищі Гісса з різними джерелами карбону

Середовище Ізоляти Джерело карбону

Глюкоза Лактоза Сахароза Сорбіт Мальтоза Інозит
Виноград- 1 + + + + +, К +
ського ІІ фаза 7 + + +, К + +, К +, К
Картопляний 3 + + +, К + +, К +
агар з ТТХ 4 +, К + +, К + +, К +
Примітки. + − ріст; К – кислотоутворення; Г – виділення бульбашок газу
 16

ВИСНОВКИ

1. Побудовано калібрувальну криву для визначення вмісту йонів сульфату у

розчині.
2. Біомаса бактерій роду Desulfovibrio становила 1,45−1,84 г/л.
3. Відносна вологість досліджуваного ґрунту становила 27,2 %.
4. Кількість мікроорганізмів нітрифікувальних бактерій II фази нітрифікації та
фітопатогенних бактерій у пробі ґрунту становила 4,50×106 та 1,75×107 КУО/г
сухого грунту, відповідно.
5. Виділеним з ґрунту нітрифікувальним бактеріям II фази нітрифікації здебільшого
властива форма коків та стрептококів. За будовою клітинної стінки ізоляти № 1, 2,
3, 5, 7 є Грам-негативними, а № 6 та 8 – Грам-позитивними. Оксидазна активність
ізолятів № 5 і 8 є відсутньою. Позитивна каталазна активність притаманна всім
ізолятам. Під час аналізу росту ізолятів № 1, 6, 7, попередньо засіяних
виснажливим штрихом на чашки Петрі, зробили висновок про чистоту виділених
культур. Властивості фітопатогенних бактерій: ізолят № 3 має форму паличок, а №
4 та 7 – коків. Виражена оксидазна активність спостерігається у ізолятів № 3 та 4.
Позитивна каталазна активність притаманна всім ізолятам.
6. Відібрані ізоляти № 1 та 7 нітрифікувальних бактерій II фази нітрифікації
виявили ріст на усіх середовищах Гісса з різними джерелами карбону (глюкозою,
лактозою, сахарозою, сорбітом, мальтозою, інозитом). Жодний з ізолятів не
здатний до газоутворення за росту на цих середовищах. Середовище з мальтозою
після культивування ізолятів № 1 та 7 змінили колір, що свідчить про
кислотоутворення. Ізолят № 7 також виявив здатність до кислотоутворення в
середовищах з сахарозою та інозитом. Відібрані ізоляти № 3 та 4 фітопатогенних
бактерій також не виявили здатності до газоутворення. Всі ізоляти виявили ріст на
середовищах Гісса з глюкозою, лактозою, сахарозою, сорбітом, мальтозою,
 17

інозитом. Ізолят № 3 здатний до кислотоутворення на середовищах з сахарозою і

мальтозою, а № 4 – з глюкозою, сахарозою та мальтозою.
 18

ЛІТЕРАТУРА

1. Гудзь С. П., Гнатуш С. О., Білінська І. С. Мікробіологія: підручник. Львів: Вид.

центр ЛНУ імені Івана Франка, 2009. 359 с.
2. Гудзь С. П., Гнатуш С. О., Білінська І. С. Мікробіологія: практикум, тести:
навч. посіб. Львів: ЛНУ імені Івана Франка, 2012. С. 228 с.
3. Гудзь С. П., Гнатуш С. О., Яворська Г. В., Білінська І. С., Борсукевич Б. М.
Практикум з мікробіології: підручник. Львів: ЛНУ імені Івана Франка, 2014.
436 с.
4. Климнюк С., Ситник В., Широбоков В. Практична мікробіологія: навчальний
посібник. Вінниця: Нова Книга, 2018. 576 с.
5. Люта В. А., Кононов О. В. Мікробіологія з технікою мікробіологічних
досліджень, вірусологія та імунологія: підручник. К.: ВСВ “Медицина”, 2018.
576 с.
6. Манько В., Гальків М., Клевець М. Основи техніки лабораторних робіт у
фізіологічних дослідженнях: навчальний посібник. Львів: ЛНУ імені Івана
Франка, 2005. 135 с.
7. Сергійчук М. Г. Будова бактеріальної клітини та методи її дослідження. К.:
Фітосоціоцентр, 2001. 232 с.