Praktični rad. Vidim (svoju) DNA!

Promjer dva polinukleotidna lanca, koja su međusobno povezana vodikovim

vezama i grade molekulu DNA, iznosi 2 nm. Možemo li golim okom vidjeti strukturu
DNA? Strukturu ne, ali nakupine molekula da! Kad bi spojili sve molekule DNA jedne
stanice u neprekinuti lanac, duljina DNA bi iznosila oko 2 m. Jednostavnim priborom
i postupkom izolirajte svoju DNA iz stanica epitela usne šupljine te iz banane i
crvenog luka!

Materijal i pribor:
∙ stakleni štapići
∙ otopina NaCl (8 %) ∙ automatska pipeta s nastavcima
∙ tekući deterdžent za posuđe ∙ menzura (50 mL, 100 mL)
∙ otopina pepsina (1 %) ∙ 1 termometar (°C, ± 1°C)
∙ rashlađeni etanol (95,6%) ∙ stalak za epruvete
∙ vodovodna voda ∙ skalpel
∙ staklene čaše ∙ cjedilo
(100 mL, 250 mL, 1000 mL) ∙ kuhalo za vodu
∙ plastična čaša (plastična epruveta) ∙ mikser
∙ 2 epruvete

Metoda ekstrakcije DNA iz stanica banane i crvenog luka

1. Narežite na komadiće i stavite tkivo banane ili luka u mikser.

2. Dodajte 200 mL vode.
3. Uključite mikser i miksajte 15 sekundi.
4. Procijedite 100 mL suspenzije u staklenu čašu od 250 mL. Operite posudu miksera.

5. U 100 mL suspenzije dodajte 20 mL tekućeg deterđenta. Lagano i kratko promiješajte staklenim

štapićem.

6. Dodajte 15 mL 1% otopine pepsina. Ponovno i veoma pažljivo promiješajte suspenziju staklenim

štapićem kako ne biste oštetili DNA. Uronite čašu u vodenu kupelj (čaša od 1000 mL) s vodom
zagrijanom na 50⁰ C.

7. Nakon 10 minuta suspenziju izvadite iz vode i dodajte 30 mL otopine natrijevog klorida.

8. Raspodijelite suspenziju u manje čaše namijenjene grupnom radu.

9. Suspenziju ulijte u epruvetu. Ispunite 1/3 volumena epruvete.

10. Kao na priloženoj slici, nagnite epruvetu i polako, po stijenci epruvete, ulijte ohlađeni etanol
približno jednak volumen etanola.

11. Epruvetu odložite na stalak, promatrajte 10 minuta, fotografirajte i zabilježite promjene.

 Praktični rad. Vidim (svoju) DNA!

I. Uvod (2 boda)

Deoksiribonukleinska kiselina (DNA), predstavlja nasljedni materijal kod većine

organizama. Svaka stanica u tijelu, osim crvenih krvnih stanica, sadrži istu DNA, no jedinka ne
dijeli istu DNA s drugom jedinkom. Potpuno istu DNA imaju samo identični blizanci.
Dok je veći dio DNA smješten u jezgri stanice, manja količina može se pronaći i u
mitohondrijima. Banana, luk i čovjek dijele sličnu molekularnu strukturu DNA, ali različite
informacije kodirane u njihovoj DNA određuju njihove specifične karakteristike i funkcije1.

organizam banana luk čovjek

broj molekula ● 33 kromosoma2 ● 16 kromosoma3 ● 46 kromosoma4

DNA

struktura DNA Sličnosti:

● DNA - struktura dvostruke uzvojnice
● dva polinukleotidna lanca koji su omotani jedan oko drugog
● sastoji se od nukleotida (povezani vodikovim vezama)
● dva lanca jedne molekule DNA antiparalelno orijentirana (moraju biti suprotno
orijentirana)
● svaki nukleotid sastoji se od šećera (deoksiriboza), fosfatne skupine i jedne od četiri
dušične baze (adenin, timin, citozin, gvanin)
● DNA se nalazi u jezgri stanica istraživanih organizama
Razlike:
●

svojstva DNA ● genetski materijal ● nosi informacije koje ● sadrži genetske

nalazi se u jezgri
svake svoje stanice
● nosi informacije koje ● regulira procese poput
su odgovorne za
boju, oblik i okus
su odgovorne za rast,
razvoj, boju, okus…
fotosinteze i diobe
stanica
● odgovorna za
informacije koje utječu
na sve aspekte ljudskog
razvoja (fizičke
karakteristika pa sve do
predispozicija za
određene bolesti)
nasljeđivanje genetskih
osobitosti s roditelja na
potomstvo

Tablica 1 -svojstva i građa DNA kod banane, luka i čovjeka5

1
https://shorturl.at/alz57
2
https://shorturl.at/hAFQ8 (luk)
3
https://rb.gy/2u4x3r (banana)
4
https://rb.gy/2944hk (čovjek)
5
https://sciencing.com/genetics/
 Proces u kojem se DNA kondenzira u vidljive kromosome, što slijedi razdvajanjem
kromosoma u dva identična skupa zove se mitoza (ili
mejoza, u slučaju stvaranja spolnih stanica).
Kondenzacija DNA ključan je korak u pripremi za
podjelu stanice, a proces uključuje značajne promjene
u organizaciji i pakiranju DNA. Prije same diobe, stanica
prolazi kroz razdoblje pripreme poznato kao interfaza.
U ovom razdoblju, DNA se replicira kako bi se stvorile
identične kopije kromosoma, čime se osigurava da
svaka kćerka stanica naslijedi potpuni genetski
materijal. Kada stanica započne proces mitoze, ulazi u Slika1.-Duplikacija i kondenzacija DNA
fazu profaze. U ovoj fazi, DNA počinje kondenzirati. To
znači da se dugačke niti DNA (koje su tijekom interfaze
rasvijetljene) skraćuju i zgušnjavaju. Kromosomi
postaju vidljiviji pod mikroskopom, a svaki od njih
sastoji se od dvije sestrinske kromatide, identičnih
kopija originalnog kromosoma. Kondenzacija DNA
Slika 2.-Kondenzacija DNA u kromosome
doseže vrhunac tijekom metafaze. Kromosomi se
poravnavaju duž središnje ravnoteže stanice poznate
kao metafazna ploča. Ovdje se pripremaju za
ravnomjernu podjelu između dviju kćerkih stanica. U
anafazi, sestrinske kromatide se razdvajaju i kreću
prema suprotnim polovima stanice. Ovaj proces
omogućuje ravnomjernu raspodjelu genetskog
materijala u dvije kćerke stanice. Na kraju, u telofazi,
DNA ponovno poprima svoju rastegnutu, manje
Slika 3.-Prikaz mitoze
kondenziranu strukturu. Ova faza označava završetak
diobe stanice. Citokineza se može smatrati posljednjom fazom mitoze kada se dvije stanice
kćeri razdvajaju, svaka s jezgrom i citoplazmatskim organelama. Cijeli proces kondenzacije DNA
tijekom stanične diobe ključan je za očuvanje i preciznu podjelu genetskog materijala,
osiguravajući da svaka kćerka stanica naslijedi kompletnu i identičnu genetsku informaciju od
majčinske stanice.6

6
https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/cell-cycle-m-phase
PRIMJENA

DNA se često koristi u forenzičkim znanostima za identifikaciju pojedinaca i rješavanje

kriminalističkih slučajeva. Analiza DNA omogućuje usporedbu bioloških tragova (npr. krvi) s
uzorcima DNA prikupljenim od osumnjičenih ili s mjesta zločina. Točnost i jedinstvenost
genetskog materijala čine DNA forenziku iznimno učinkovitom u identifikaciji ili isključivanju
pojedinaca iz istrage.7

Analiza DNA koristi se u genetskom testiranju kako bi se identificirale genetske

varijacije povezane s različitim bolestima i stanjima. Ove informacije mogu pomoći u
predviđanju rizika od određenih bolesti i prilagodbi medicinskih postupaka prema genetskim
predispozicijama pojedinca. Personalizirana medicina koristi te informacije kako bi prilagodila
terapeutske pristupe i poboljšala učinkovitost liječenja.8

Također DNA možemo koristiti i u području genetskog inženjeringa kako bi se

modificirali geni organizama, uključujući i ljudske. Tehnologije poput CRISPR-Cas9 omogućuju
precizno editiranje genoma. U medicini, ova tehnologija otvara vrata razvoju novih terapija i
liječenju genetski uvjetovanih bolesti. Genetsko inženjerstvo također ima potencijal za
liječenje bolesti stvaranjem genetski modificiranih stanica koje se mogu koristiti u terapiji
regenerativne medicine.9

II. Kratki opis metode (2 boda)

1. Odabrali smo uzorke luka, banane i tkiva čovjeka.

2. Luk i banana smo izrezali na male komade, a kao DNA čovjeka se pripremili smo
pljuvačku kako bi bili u skladu s etičkim smjernicama.
3. Dodali smo komade uzorka u čašu s otopinom NaCl (8%).
4. Dodali smo odgovarajuću količinu tekućeg deterdženta za posuđe kako bismo razbili
stanične membrane i pažljivo promiješali da ne oštetimo DNA..
5. Zatim smo dodali pepsin (1%) u smjesu kako bi razgradili proteine i histone.
6. Čašu s uzorkom stavili smo u vodenu kupelj na temperaturi od 50°C.
7. Održavali smo ovu temperaturu tijekom određenog vremena kako bismo potaknuli
aktivnost pepsina.
8. Stavili smo čašu s uzorkom u ohlađeni etanol kako bi izazvali precipitaciju DNA.
9. Pomiješali smo nježno i promatrali taloženje DNA.
10. Koristili smo stakleni štapić za pažljivo izdvajanje vidljive DNA iz otopine.

7
https://shorturl.at/itvy1
8
https://shorturl.at/cgwGM
9
https://shorturl.at/akmPZ
III. Rezultati (4 boda)

Slika 4.-Kondenzirana DNA banane Slika 5.- Kondenzirana DNA iz sline

(lijevo) i luka (desno), Florijan Lalić, 4.G čovjeka, Florijan Lalić, 4.G

Opažanja

● epruveta A (banana): Na temelju fotografija primjećujemo da je izolirana DNA iz

banane niske kvalitete, ali to je zato što je trebalo više vremena da se u epruveti A
dogodi reakcija. Nakon vizualne inspekcije zaključili smo da je izolirana DNA iz banane
visoke kvalitete. Niti DNA su iznimno duge i jasno vidljive, sugerirajući da je ekstrakcija
genetskog materijala iz biljnog tkiva bila učinkovita. DNA se čini čistom i dobro
definiranom, bez znakova kontaminacije drugim tvarima. Kvaliteta izolacije DNA iz
banane čini ovu metodu pogodnom za daljnja istraživanja i analize.
● epruveta B (luk): Izolirana DNA iz luka također pokazuje solidnu kvalitetu. Niti DNA su
nešto kraće u usporedbi s onima iz banane, ali i dalje su vidljive i dobro definirane.
Opažamo da su niti malo manje izražene, što može ukazivati na manju koncentraciju
DNA u uzorku. Unatoč tome, rezultati su zadovoljavajući, a DNA iz luka pruža dobar
materijal za daljnje analize.
● epruveta C (uzorak čovjeka): Izolirana DNA iz uzorka čovjeka može pokazivati manju
kvalitetu u usporedbi s biljnim uzorcima. Niti DNA su kraće i manje izražene, što može
sugerirati teže izdvajanje genetskog materijala iz ljudskih stanica u ovom postupku.
Moguće je da su prisutni neki inhibitori ili da je potrebno prilagoditi uvjete ekstrakcije
kako bi se poboljšala kvaliteta DNA iz uzorka čovjeka.
IV. Zaključak (12 bodova)
● Zašto ste koristili mikser?
○ Upotreba miksera ima ključnu ulogu u procesu razbijanja staničnih stijenki
biljnog tkiva. Miješanje pomaže u homogenizaciji uzorka, čime se oslobađa
DNA iz stanica. Ovaj korak olakšava daljnju ekstrakciju genetskog materijala.
● Zašto ste dodali deterdžent i NaCl (aq)? 10
○ Deterdžent razgrađuje i otapa masti sa suđa i posuđa, pa isto tako razgrađuje
masti od kojih su izgrađene stanične membrane (fosfolipidi) što ubrzava
oslobađanje sadržaja stanice u otopinu pa tako i molekula DNA. Kuhinjska sol
ima ulogu neutralizacije naboja, tj. natrijevi ioni iz soli neutraliziraju negativne
naboje fosfata na molekulama DNA zbog kojih se one odbijaju pa će se uz
dodatak NaCl lakše taložiti.
● Što je pepsin i koja je njegova uloga u ovom praktičnom radu?
○ Pepsin, kao proteolitički enzim, koristi se za razgradnju proteina histona u
jezgri stanica, tj. pomoću pepsina odvajamo molekule DNA od histona što
rezultira jasnijim rezultatima. Njegova prisutnost omogućava oslobađanje DNA
iz proteinskih kompleksa, što je ključno za uspješnu ekstrakciju genetskog
materijala.
● Zašto ste suspenziju izložili temperaturi od 50°C? 11
○ Temperatura od 50oC odabrana je zato što je odabrani enzim (pepsin)
najaktivniji pri temp. od 3oC do 50oC iako ovi podatci variraju ovisno o izvoru.
Enzimi su najaktivniji pri povišenim temperaturama, no kada bismo suspenziju
izložili temperaturama višima od 50oC aktivnost pepsina bi se zaustavila te bi
se sam enzim imobilizirao
● Zašto ste koristili ohlađeni etanol?
○ Ohlađeni etanol koristi se za precipitaciju DNA iz otopine. Etanol je odabran
zato što je etanol manje polarna molekula od molekule DNA, zbog čega se
DNA bolje taloži u etanolu nego npr. u vodi u kojoj bi se DNA otopila.
Nataložene molekule DNA sakupljaju se na granici između vode i etanola, ovo
se događa zato što su nastale molekule lakše, tj. manje gustoće od vode pa se
dižu u sloj etanola koji je također manje gustoće od vode.

10-https://shorturl.at/cijnY

11-https://rb.gy/mwgmr1
V. Popis literature (2 boda)

● Genetika, evolucija, ekologija : udžbenik iz biologije za IV. razred

gimnazije / Boris Vrtar, Josip Balabanić, Milan Meštrov.
● Priručnik za vježbe iz biologije 1. Šver, Lidija; Bielen, Ana; Babić,
Ivana; Vladušić, Tomislav; Hrašćan, Reno; Durgo, Ksenija;
Franekić, Jasna
https://repozitorij.pbf.unizg.hr/islandora/object/pbf%3A4148/d
atastream/FILE0/view , pristupljeno 2.12.2023.
● DO ONIONS, STRAWBERRIES AND BANANAS HAVE DNA?
https://www.edvotek.com/site/pdf/S-75.pdf , pristupljeno 2.12.2023.
● 3.9.1. Izolacija DNA iz voća. https://edutorij-admin-
api.carnet.hr/storage/extracted/fd4e4aca-de35-49a7-9436-
638df9b1c154/izolacija-dna-iz-voca.html , pristupljeno 2.12.2023.
● Sciencing. https://sciencing.com/five-types-gene-splicing-mechanism-
23880.html , pristupljeno 2.12.2023.
● Science direct, Cell cycle
https://www.sciencedirect.com/topics/neuroscience/cell-cycle , pristupljeno
2.12.2023.