Biyomoleküler Teknikler:

Gaz Kromatografisi - Kütle Spektrometresi (GC/MS)

GC-MS sistemi, çok bileşenli karışımlardaki küçük asitler, alkoller, hidroksil asitler,
amino asitler, şekerler, yağ asitleri, steroller, katekolaminler, ilaçlar ve toksinler gibi
küçük metabolitleri (<650 dalton) tanımlamak ve miktarlarını ölçmek için, gaz fazında
bulunan ya da uçucu hale getirilen numunelerin gaz kromatografisi kütle
spektrofotometresi yöntemi ile ayrımını sağlayan analitik yöntemdir.

Martin ve Synge tarafından 1941’de gaz kromatografisi (GC) icat edildikten sonra, ilk
olarak 1951'de bir takım yağ asitlerinin ayrılması için kullanılmıştır. İlerleyen yıllarda,
GC tekniği hızla gelişmiş ve bir bilgisayar tarafından kontrol edilen ilk analitik cihaz
olmuştur.

Genel olarak sistem prensibi, gaz kromatografisinde karışımdaki maddelerin

birbirinden ayrılmasına, daha sonra iyonlaştırılarak kütle spektrometresinde
maddelerin kütlelerine göre moleküler tayin yapılmasına dayanmaktadır (Şekil 1).

Şekil 1. Biyoakışkanların ve Ekstrelerin Gaz Kromatografisi - Kütle Spektrometresi (Emwas

HM, et al., 2015)
GC-MS sistemini oluşturan temel bileşenler olarak; gaz kromatografisi içerisinde
hareketli faz olarak He/Ar tüpü, kolon, kolon fırını ve numune enjektörü bulunmaktadır.
Kütle spektrometresi ise iyon kaynağı, kütle analizörü ve dedektörü içermektedir.
Sistemin en sonunda ise bir veri toplayıcı (bilgisayar) aracılığı ile verilerin analizi
sağlanmaktadır.

GC-MS yaygın olarak biyolojik sıvıların metabonomik analizlerinde kullanılır. Biyolojik

sıvılar da tüm vücudun metabolizması hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. GC numune girişi,
karışımı analitik kolona aktarmak için kullanılan GC sisteminin bir parçasıdır. Giriş,
numuneyi buharlaştırmak ve kolona vermek için içine ısının uygulandığı bölümdür. Bu
tür girişler, programlanmış sıcaklıklarda buharlaştırıcılar (PTV) içerir. Alternatif olarak,
soğuk sütunlu (COC) girişi gibi buharlaştırılmayan bir giriş de kullanılabilir, böylece sıvı
bir örnek buharlaşma olmadan doğrudan sütuna aktarılır. PTV girişi, karışık modlarda
çalışacak şekilde tasarlanmıştır. Bu modda, numune soğuk girişe enjekte edilir ve
analitleri buharlaştırmak ve bunları kolona aktarmak için sıcaklık hızla yükseltilmeden
önce analitleri odaklamak için çözücü dışarı atılır. COC girişi, numuneyi doğrudan
kolona bırakma prensibine dayanır. Diğer tekniklerin aksine, numune yüksek bir
sıcaklığa maruz bırakılmaz. COC girişleri genellikle iz analizi veya termal olarak
kararsız ve hassas numunelerin analizi için tercih edilir.

GC-MS analizinin zorluklarından biri, incelenecek çoğu metabolitin uçucu olmadığı

halde analitlerin uçucu ve termal olarak kararlı olması gerekliliğidir. Uçucu olmayan
metabolitlerin analizi, uçuculuğu ve termal stabiliteyi arttırmak ve polariteyi azaltmak
için fonksiyonel gruba bir türevlendirme ajanı eklenerek sağlanır. Moleküldeki polar
fonksiyonel grup, alkilasyon, açilasyon veya sililasyon ile türevlendirilebilir: Sililasyon;
fonksiyonel gruptaki aktif hidrojene, TMS (Trimethylsilyl), MSTFA (N-methyl-N-
(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) veya BSTFA ((N,O-bis (trimethylsilyl)
trifluoroacetamide) bağlanması ile numunenin uçucu hale getirilmesi olarak
tanımlanabilir. Türevlendirme reaktifleri olarak genellikle BSA, BSTFA, MTBSTFA,
MSTFA, TMSIM, TMCS, TBDMCS kullanılır. İyonizasyon bölümü, incelenen
örneklerden çok sayıda iyon üretmekle görevlidir. Burada iyon üretildikten sonra kütle
analizörü iyonları kütle/yük (m/z) oranlarına göre ayırır ve detektör m/z değerlerini
belirler. Bu orana göre her bir iyon tipinin miktarı tayin edilir.
Numune türevlendirme prosedüründen önce dikkat edilmesi gereken noktalardan biri
de numunenin azot gazı vb. yöntemlerle iyice kurutulmuş olmasıdır. Sonrasında da
türevlendirilmiş numunelerin nem ile temasından kaçınmak için özel dikkat
gösterilmeli, çünkü bu da türevin bozulmasına yol açacaktır. Diğer bir taraftan,
türevlendirme reaktiflerinin de bir takım dezavantajları vardır. Türevlendirme sırasında
oluşan trifluoroacetamide gibi uçucu yan ürünlerin yüksek uçuculuk ve üretimi, GC-
MS kromatogramında aynı bileşik veya beklenmeyen bileşenler (yapaylıklar) için
birden fazla pike yol açabilir ve veri yorumlaması açısından yanılmalara neden olabilir
(Şekil 2).

Yanlış sonuçlardan kaçınmak için, herhangi bir GC-MS tabanlı metabonomi analizi,
standart işletim prosedürleri kullanılarak iyi kontrol edilen koşullar altında,
karşılaştırmalı olarak gerçekleştirilmelidir. Bunlar, numunelerin toplanması, taşınması
ve saklama koşullarının yanı sıra numune hazırlamanın da tüm adımlarını içermelidir.
Sonuç olarak, metabolit ekstraksiyonunun optimizasyonu ve numune
deproteinizasyonu, herhangi bir metabonomi analizinde çok önemli adımlardır.

Şekil 2. Örnek bir GC-MS kromatogramı (Bengü ÇETİNKAYA).

Günümüzde GC-MS; Kimya endüstrisi, gıda endüstrisi, polimer endüstrisi, ilaç

endüstrisi, petrokimya endüstrisi, yağ endüstrisi, çevre laboratuvarları vb. alanlarda
üretilen malzemelerin iyileştirilmesi ve geliştirilmesinin yanında, piyasada kullanılan ya
da üretilen malzemelerin standartlara uygun olup olmadığı hakkında bilgi sahibi
olmamıza yardımcı olur.
KAYNAKLAR

1- Fiehn O. Metabolomics by Gas Chromatography-Mass Spectrometry: the combination of targeted

and untargeted profiling. Curr Protoc Mol Biol. 2017;114: 30.4.1–30.4.32.

2- Zuo HL, et al. Preparative Gas Chromatography and Its Applications. Journal of Chromatographic
Science. 2013;51:704–715.

3- James AT, et al. Gas-liquid partition chromatography; the separation and micro-estimation of volatile
fatty acids from formic acid to dodecanoic acid; Biochemical Journal. 1952. 50: 679–690.

4- Hu X, et al. GC-MSbased metabolomics study of the responses to arachidonic acid in Blakeslea

trispora. Fungal Genet Biol. 2013. 57:33–41.

5- Dettmer K, et al. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass Spectrom Rev. 2007. 26:51–78.

6- Halket JM, et al. Chemical derivatization and mass spectral libraries in metabolic profiling by GC/MS
and LC/MS/MS. J Exp Bot. 2005. 56:219–243.

7- Emwas HM, et al. Gas Chromatography–Mass Spectrometry of Biofluids and Extracts.

Metabonomics: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology, vol. 1277. 2015.