Hranljive podloge

Hranljive podloge predstavljaju mešavinu raznih jedinjenja na kojim se bakterije

mogu razmnožavati u veštačkim uslovima. One mogu biti:
1) prirodne hranljive podloge sastavljene se od sastojaka nedefinisanog hemijskog
sastava životinjskog ili biljnog porekla (mleko, krvni serum, ekstrakt kvasca,
ekstrakt goveđeg mesa, peptoni itd),
2) veštačke (definisane) hranljive podloge pripremljene su od prečišćenih
jedinjenja poznatog hemijskog sastava i propisane koncentracije pojedinačnih
sastojaka (soli, amino kiseline, šećeri, vitamini, purini i pirimidini itd).

Po svojoj konstituciji hranljive podloge mogu biti tečne (tzv. bujon) i čvrste ili
polučvrste (sa dodatkom agara). Čvrste podloge se dobijaju kada se u tečne podloge doda
oko 1.5% agara, a polučvrste se dobijaju dodavanjem 0.6 – 0.7% agara.
Jednostavne podloge sadrže samo jednu suspstancu i obično se nazivaju osnovne
(bazne podloge) jer služe kao osnova za pripremu složenijih podloga. Podloge u čiji
sastav ulazi veći broj jedinjenja su tzv. kompleksne podloge.
Da bi se mogle uočiti biohemijske osobine mikroorganizama, mnogim podlogama
se dodaju indikatori i druga jedinjenja koja omogućavaju jasnije uočavanje datih
hemijskih promena (koje su rezultat karakterističnih osobina datih mikroorganizama).
Prema nameni hranljive podloge se dele na:

Neselektivne podloge

Neselektivne podloge su bogate hranljivim sastojcima (spadaju u kompleksne

podloge). Omogućavaju rast većini mikroorganizama (sa najrazličitijim potrebama u
ishrani). Najpoznatije neselektivne podloge su hranljivi bujon i hranljivi agar.

Hranljivi agar

Hranljivi agar (engl. Nutrient agar) je visokohranljiva podloga za kultivisanje velikog

broja mikroorganizama. Od ove podloge sa i bez dodataka drugih supstanci mogu se pripremati
druge mikrobiološke podloge (kosi agar, duboki agar, krvni agar, čokoladni agar, mlečni agar
itd.).
Sastav hranljivog agara (proizvođač „Torlak“ – Beograd) na 1 litar gotove
podloge:
- pepton 1--------------------------------- 15g
- mesni ekstrakt ------------------------- 3g
- NaCl ------------------------------------ 5 g
- K3PO4 ---------------------------------- 0.3 g
- agar ------------------------------------- 18 g

Nakon sterilizacije pH podloge je 7.3

 Hranljivi bujon

Hranljivi bujon (engl. Nutrient broth) ima široku primenu u kultivisanju velikog broja
mikroorganizama. Primena ove podloge se proširuje dodavanjem različitih supstanci kao što su
ugljeni hidrati, krv, selektivne supstance itd.
Sastav hranljivog bujona (proizvođač „Torlak“ – Beograd) na 1 litar gotove
podloge:
- pepton 1--------------------------------- 15g
- mesni ekstrakt ------------------------- 3g
- NaCl ------------------------------------ 5 g
- K3PO4 ---------------------------------- 0.3 g
- agar ------------------------------------- 0 g

Nakon sterilizacije pH podloge je 7.3

Diferencijalne podloge

Kao što im ime i govori diferencijalne podloge se koriste za razlikovanje jedne

vrste ili grupe mikroorganizama od druge. One sadrže posebne sastojke koji se menjaju u
toku rasta samo određenih tipova mikroorganizama, dajući kolonijama, ili podlozi oko
njih, karakterističan izgled. Najčešće su to indikatori koji menjaju boju podloge oko
izraslih bakterijskih kolonija.
Klasičan primer diferencijalne podloge je Endo agar. Na ovoj podlozi se vrši
diferencijacija bakterija prema sposobnosti da fermetišu ili ne mlečni šećer laktozu (uz
stvaranje kiselih produkata fermentacije). Zahvaljujući prisustvu peptona na ovoj podlozi
rastu i bakterije koje ne mogu koristiti laktozu. Bakterije koje imaju sposobnost
fermentacije laktoze (npr. Escherichia coli) produkuju različite organske kiseline koje
snižavaju pH podloge oko svojih kolonija menjajući tako svetloružičastu boju indikatora
fuksina u tamnu „metalik crvenu“ boju. Indikator fuksin (pararozanilin) inhibira rast
Gram-pozitivnih bakterija.
Endo agar se koristi za identifikaciju i diferencijaciju laktoza pozitivnih od laktoza
negativnih Gram negativnih štapićastih bakterija, kao i za dokazivanje koliformnih
bakterija u životnim namirnicama, vodi, itd.
Sastav Endo agara (proizvođač „Torlak“ – Beograd) na 1 litar gotove podloge:
- pepton 4 --------------------------------- 10g
- laktoza ---------------------------------- 10g
- K3PO4 ------------------------------------ 3.5g
- Na3PO4 ----------------------------------- 2.5g
- agar -------------------------------------- 15 g
- dijamant fuksin (pararozanil)-------- 0.4g

Nakon sterilizacije pH podloge je 7.5.

 Selektivne podloge

Selektivne podloge sadrže jedan ili više sastojaka koji inhibiraju rast brojnijih
neželjenih mikroorganizama a ne inhibiraju rast željenih manje brojnih mikroorganizama.
Najčešći selektivni agensi koji se koriste su antibiotici, konzervasi, boje itd.
Postoji veliki broj selektivnih podloga. Kao školski primeri najčešće se navodi
Simonsov citratni agar i SS agar.

Simmons citratni agar

Simmons citratni agar je podloga koja se koristi za diferenciranje enterobakterija na

osnovu njihove sposobnosti iskorišćavanja citrata kao jedinog izvora ugljenika u podlozi.
Koristi se i za diferenciranje između pojedinih članova grupe Salmonella.
Sastav Simmons citratnog agara (proizvođač „Torlak“ – Beograd) na 1 litar gotove
podloge:
- MgSO4 --------------------------------- 0.2 g
- (NH4)2HPO4 --------------------------- 1 g
- K3PO4 ------------------------------------ 1 g
- natrijum citrat --------------------------- 2 g
- NaCl -------------------------------------- 5 g
- agar --------------------------------------- 15g
- brom timol plavo ----------------------- 0.08 g
Nakon sterilizacije pH podloge je 6.8.
5.2.3b. SS agar

SS agar (Salmonella Shigella agar) je visokoselektivna podloga za izolovanje

rodova Salmonella i Shigella. Ova visokoselektivna podloga maksimalno inhibira rast
Gram-pozitivnih i koliformnih bakterija prisutnih u ispitivanom uzorku a ne ograničava
rast patogenih Gram-negativnih bakterija. Ova podloga istovremeno daje jasnu sliku
između laktoza negativnih i laktoza pozitivnih enterobakterija. SS agar sprečava i rojenje
bakterija iz roda Pseudomonas.
Sastav SS agara (proizvođač „Torlak“ – Beograd) na 1 litar gotove podloge:
- pepton 4--------------------------------- 5g
- mesni ekstrakt ------------------------- 5g
- laktoza -------------------------------- 10g
- žučne soli br. 3 ----------------------- 8.5g
- natrijum citrat ------------------------ 8.5g
- natrijum tiosulfat -------------------- 8.5g
- feri citrat ------------------------------ 1 g
- agar ------------------------------------ 13.5g
- neutralno crveno --------------------- 0.025 g
- brilijant zeleno ----------------------- 0.00033 g

Nakon rastvaranja pH podloge je 7.0

 VEŽBA Datum: ___________________

STERILIZACIJA I HRANLJIVE PODLOGE

Nastavni cilj – upoznavanje studenata sa:

- sterilizacijom
- razumevanje prednosti i mana različitih metoda sterilizacije
- rad sa sterilnim priborom
- uvežbavanje tehnike sterilnog rada
- vrste hranljivih podloga i čemu služe
- priprema tečnih i čvrstih hranljivih podloga

I Sterilizacija u autoklavu

Upotreba autoklava zahteva detaljno poznavanje uputstva za rukovanje i veoma

pažljivo rukovanje (u početku nikako bez prisustva instruktora).

Vertikalni autoklav proizvođača „Sutjeska“ – Beograd

• u autoklav se kroz levak sipa destilovana voda,

• u komoru autoklava se stavi materijal za sterilizaciju,
• spusti se poklopac i unakrsnim zavrtanjem zavrtnja zatvori komora,
• proveri se sigurnosni ventil,
• zatvori se ventil za ispuštanje pare i uključe se električni grejači,
• kada se autoklav dovoljno zagreje, otvori se slavina za ispuštanje pare do
pojave pare, uz kontolisanje putem manometra da li je sav vazduh izašao iz
komore (ovo je neophodno iz razloga što vazduh smeta u toku sterilizacije jer
je temperatura mešavine vodene pare i vazduha pri datom pritisku niža od
temperature čiste vodene pare, što može rezultirati neuspehom sterilizacije),
• slavina za ispuštanje vodene pare se zatvori a zatim se kontroliše željeni
pritisak uz pomoć manometra i termometra,
• po isteku vremena sterilizacije (od npr. 15 min) grejači se isključe,
• sačeka se da pritisak padne na nulu (odnosno da se izjednači sa atmosferskim
pritiskom),
• otvori se ventil za ispuštanje vodene pare sve dok pritisak na manometru ne
„opadne“ na nulu a zatim se otvara poklopac (u protivnom može doći do
teških opekotina, prskanja staklarije i izletanja npr. poklopaca epruvete),
• sterilisan materijal se vadi iz autoklava tek kada se ohladi na oko 500C.

II Sterilizacija filtriranjem

Sterilizaciju filtriranjem primenićemo na bunarskoj vodi.

• pre početka sterilizacije sterilišu se delovi koji će biti u kontaktu sa vodom i

sterilnom filter disk membranom,
• na porozni filterski deo sterilnom pincetom se postavlja sterilna filter disk
membrana (proizvođača PALL-Gelman, dijametra pora 0.2 µm),
• iznad disk membrane postavi se sredinji cilindrični deo i gornji levkasti
prošireni deo
• nakon toga se postavi uzorak vode,
• vakum pumpom se stvara negativan pritisak koji je pogonska sila filtracije,
• bakterije zaostaju na filter disk membrani tako da se u prethodno sterilisanoj
vakum boci nalazi voda bez prisustva bakterija.

III Pripremanje hranljivih podloga

• na tehničkoj vagi odmerimo određenu količinu hranljive podloge u prahu

(uputstvo za pripremanje 1 litra podloge se nalazi na ambalaži podloge),
• izmerena količina praha potrebnog za 1 litar podloge se stavi u erlenmajer
zapremine dva litra,
• menzurom se izmeri 1000 ml destilovane vode i sipa se u erlenmajer,
• mešanjem se dobija suspenzija,
• suspenzija se zagreva u vodenom kupatilu ili na magnetnoj mešalici sve do
rastvaranja,
• nakon toga erlenmajer se zatvara specijalnim zatvaračem, zapušačem od vate
ili „kapom“ od aluminijumske folije ili papira,
• zatvoren erlenmajer se stavlja u autoklav i steriliše se 15 minuta na 1200C,
• nakon sterilizacije podloga se ohladi na 50-600C i razliva u Petrijeve kutije ili
epruvete,
• nakon hlađenja razlivene podloge se preko noći inkubiraju u termostatu na
temperaturi od 370C (čime se proverava njiova sterilnost),
• nakon provere sterilnosti podloge se koriste ili čuvaju u frižideru do upotrebe
(u frižideru se čuva i erlenmajer sa preostalom nerazlivenom količinom
podloge).

Pitanja i zadaci:

1. Organsko jedinjenje koje se najčešće koristi za očvršćavanje podloga je

___________________.

2. Kod sterilizacije u autoklavu pri pritisku od 1 bara postiže se temperatura

vodene pare od _______0C, dok na 2 bara temperatura iznosi _______0C.

3. Primer selektivne podloge je ____________________, primer diferencijalne

podloge je ___________________, primer neselektivne podloge je
____________________.

4. Sterilizacija u suvom sterilizatoru se postiže kada se vazduh zagreje na

temperaturi ____________0C i predmeti ostave da stoje u njemu na zadatoj
temperaturi u trajanju ___________ minuta.

5. Kiselina koja se u prehrambenoj industriji često koristi za potrebe dezinfekcije

i sterilizacije čija je hemijska formula CH3COOOH naziva se
__________________________.

6. Za potrebe sterilizacije membranskom filtracijom koriste se filter disk

membrane dijametra pora ________ µm.