Ed
Ch
Machine Translated by Google
1
Trung tâm Giáo dục HYMS
Phát triển (CED), Hull York
Trường Y, Đại học Y
York, York, Vương quốc Anh
2
Đơn vị huyết học phân tử,
Viện thời tiết MRC
Y học phân tử, Đại học Oxford, John
Radcliffe
Bệnh viện, Oxford, Vương quốc Anh
3
Khoa Huyết học,
Đại học Oxford NHS
Quỹ ủy thác, Churchill
Bệnh viện, Oxford, Vương quốc Anh
4
Đơn vị học thuật về sức khỏe trẻ em,
Bệnh viện Nhi đồng Sheffield,
Sheffield, Vương quốc Anh
Thư từ gửi tới Tiến sĩ
David King, Đơn vị Học thuật về Sức
khỏe Trẻ em, Bệnh viện Nhi đồng
Sheffield, Ngân hàng Western,
Sheffield S10 2TH, Vương
quốc Anh; daking@sheffield.ac.uk
Nhận vào ngày 5 tháng 1 năm 2016
Sửa đổi ngày 18 tháng 2 năm 2016
Được chấp nhận ngày 19 tháng 2 năm 2016
Xuất bản trực tuyến đầu tiên
8 tháng 4 năm 2016
Trích dẫn: Redman M, King A, Watson
C, et al. Arch Dis Child
Education Practice Ed
2016;101:213–215.
Redman M, và cộng sự. Arch Dis Child Education Practice Ed 2016;101:213–215. doi:10.1136/archdischild-2016-310459
CRISPR/Cas9 là gì?
Giai điệu Redman, 1 Andrew King, 2 Caroline Watson, 3 David King4
GIỚI THIỆU Các lặp
lại palin-dromic xen kẽ thường xuyên (CRISPR)/
Cas9 là một công nghệ chỉnh sửa gen gây ra một
biến động lớn trong nghiên cứu y sinh. Nó có
thể sửa các lỗi trong bộ gen và bật hoặc tắt
gen trong tế bào và cơ quan một cách nhanh
chóng, rẻ và tương đối dễ dàng. Nó có một số
ứng dụng trong phòng thí nghiệm bao gồm tạo
nhanh các mô hình tế bào và động vật, sàng
lọc gen chức năng và chụp ảnh trực tiếp bộ gen
của tế bào.1 Nó đã được chứng minh rằng nó có
thể được sử dụng để sửa chữa DNA khiếm khuyết
ở chuột chữa khỏi bệnh di truyền. rối loạn,2
và đã có báo cáo rằng phôi người có thể được
sửa đổi tương tự.3 Các ứng dụng lâm sàng tiềm
năng khác bao gồm liệu pháp gen, điều trị các
bệnh truyền nhiễm như HIV và chế tạo vật liệu
tự thân của bệnh nhân để điều trị ung thư và
các bệnh khác.
Trong bài đánh giá này, chúng tôi sẽ cung cấp
cái nhìn tổng quan về CRISPR/Cas9, nhấn mạnh
vào cách nó có thể tác động đến chuyên khoa nhi.
Mặc dù nó có thể có tác động đáng kể đến nhi
khoa thông qua tác động của nó trong phòng thí
nghiệm, nhưng ở đây chúng ta sẽ tập trung vào
các ứng dụng lâm sàng tiềm năng của nó. Chúng
tôi cũng sẽ mô tả một số khó khăn và tranh cãi
về mặt đạo đức liên quan đến công nghệ mới này.
TỔNG QUAN VỀ CRISPR/CAS9 CRISPR/
Cas9 là một công nghệ chỉnh sửa gen bao gồm
hai thành phần thiết yếu: RNA hướng dẫn để phù
hợp với gen mục tiêu mong muốn và Cas9 (protein
liên quan đến CRISPR 9)—một enzyme nội bào gây
ra sự đứt gãy chuỗi DNA kép , cho phép sửa đổi
bộ gen (xem hình 1).
CÁC ỨNG DỤNG LÂM SÀNG TIỀM NĂNG
Điều chỉnh các rối loạn di
truyền Một trong những ứng dụng thú vị nhất
của CRISPR/Cas9 là khả năng sử dụng nó để điều
trị các rối loạn di truyền do đột biến gen đơn
lẻ gây ra. Ví dụ về các bệnh như vậy bao gồm
bệnh xơ nang (CF), bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
(DMD) và bệnh lý huyết sắc tố. Cách tiếp cận
cho đến nay đã
đ
Di
Ar
lt
d
Pb
x
E
NGHIÊN CỨU THỰC HÀNH
hiện chỉ được xác nhận trong các mô hình tiền
lâm sàng, nhưng có hy vọng nó có thể sớm được
áp dụng vào thực hành lâm sàng.
Schwank và cộng sự đã sử dụng CRISPR/Cas9 để
nghiên cứu cách điều trị CF. Sử dụng tế bào
gốc ruột trưởng thành thu được từ hai bệnh
nhân mắc CF, họ đã điều chỉnh thành công đột
biến phổ biến nhất gây ra CF ở các cơ quan
đường ruột. Họ đã chứng minh rằng một khi đột
biến đã được sửa chữa, chức năng của thụ thể
dẫn truyền xuyên màng CF (CFTR) đã được phục
hồi.4 Một căn bệnh khác mà CRISPR/Cas9 đã được
nghiên cứu là DMD.
Tabebordbar và cộng sự gần đây đã sử dụng
việc phân phối CRISPR/Cas9 endu-clease của
virus liên quan đến adeno (AAV) để phục hồi
biểu hiện dystrophin trong mô hình chuột mắc
bệnh DMD, bằng cách xóa exon chứa đột biến ban
đầu. Điều này tạo ra một protein bị cắt ngắn
nhưng vẫn có chức năng. Những con chuột được
điều trị đã được chứng minh là phục hồi một
phần những khiếm khuyết về chức năng của cơ.5
Điều đáng chú ý là người ta đã chứng minh rằng
gen dystrophin đã được chỉnh sửa trong các tế
bào gốc cơ để bổ sung cho mô cơ trưởng thành.
Điều này rất quan trọng để đảm bảo mọi tác
dụng điều trị của CRISPR/Cas9 không bị phai
nhạt theo thời gian. Hai nghiên cứu tương tự
đã mô tả việc sử dụng hệ thống CRISPR/Cas9
trong cơ thể sống để tăng biểu hiện gen dys-
trophin và cải thiện chức năng cơ trong mô
hình chuột mắc DMD.67 Các nghiên cứu khác đã
sử dụng CRISPR / Cas9 để nhắm mục tiêu sao
chép các exon trong gen dystrophin ở người
trong ống nghiệm và đã chỉ ra rằng phương pháp
này có thể dẫn đến việc sản xuất dys-trophin
có chiều dài đầy đủ trong ống cơ của người
mắc DMD.8 CRISPR/Cas9 cũng có thể được sử dụng
để điều trị
bệnh huyết sắc tố. Canver và cộng sự gần đây
cho thấy sự phá vỡ chất tăng cường BCL11A bởi
CRISPR/Cas9 có thể tạo ra huyết sắc tố bào
thai ở cả chuột và tế bào nguyên hồng cầu
nguyên phát ở người. Trong tương lai, cách
tiếp cận như vậy có thể cho phép biểu hiện
huyết sắc tố thai nhi ở những bệnh nhân có
huyết sắc tố trưởng thành bất thường. Điều này
sẽ đại diện cho một chiến lược điều trị mới ở
những bệnh nhân mắc các bệnh như bệnh hồng
cầu hình liềm hoặc bệnh thalassemia.
213

Machine Translated by Google
Nghiên cứu thực tế
Hình 1 Hệ thống CRISPR/Cas9.1 Các đoạn lặp palindromic xen
kẽ xen kẽ đều đặn (CRISPR) đề cập đến các trình tự trong bộ gen
của vi khuẩn. Chúng có khả năng bảo vệ chống lại vi-rút xâm nhập
khi được kết hợp với một loạt protein liên quan đến CRISPR
(Cas). Cas9, một trong những protein liên quan, là một enzyme
nội bào có tác dụng cắt cả hai chuỗi DNA. Cas9 hướng tới
mục tiêu của nó bởi một đoạn RNA. Điều này có thể được tổng
hợp dưới dạng một chuỗi đơn gọi là RNA dẫn hướng đơn tổng hợp
(sgRNA); phần RNA liên kết với DNA bộ gen là 18–20 nucleotide.
Để cắt, một trình tự DNA cụ thể có từ 2 đến 5 nucleotide
(trình tự chính xác phụ thuộc vào vi khuẩn tạo ra Cas9) phải
nằm ở đầu 3' của RNA dẫn hướng: đây được gọi là mô típ liền kề
protospacer (PAM). ). Việc sửa chữa sau khi cắt DNA có thể xảy
ra thông qua hai con đường: nối đầu không tương đồng, thường
dẫn đến việc chèn/xóa DNA ngẫu nhiên hoặc sửa chữa theo hướng
tương đồng trong đó một đoạn DNA tương đồng được sử dụng làm mẫu
sửa chữa.
Đây là phương pháp thứ hai cho phép chỉnh sửa bộ gen chính
xác: phần DNA tương đồng với sự thay đổi trình tự cần thiết có thể
được phân phối cùng với Cas9 nuclease và sgRNA, về mặt
lý thuyết cho phép những thay đổi chính xác như một cặp bazơ đơn lẻ.
Việc tạo ra một gen β-globin đầy đủ chức năng khó khăn
hơn nhiều, đó là lý do cho cách tiếp cận có phần bất
thường này.
Điều trị HIV
Một ứng dụng lâm sàng tiềm năng khác của CRISPR/Cas9 là
điều trị các bệnh truyền nhiễm, chẳng hạn như HIV. Mặc dù
liệu pháp kháng vi-rút cung cấp phương pháp điều trị hiệu
quả cho HIV nhưng hiện tại chưa có phương pháp chữa trị
nào do vi-rút tích hợp vĩnh viễn vào bộ gen của vật chủ.
Hu và cộng sự cho thấy hệ thống CRISPR/Cas9 có thể được
sử dụng để nhắm mục tiêu hoạt động của bộ gen HIV-1. Sự
biểu hiện và sao chép gen HIV bất hoạt này trong nhiều
loại tế bào có thể bị nhiễm HIV tiềm ẩn mà không có bất
kỳ tác dụng độc hại nào. Hơn nữa, các tế bào cũng có thể
được miễn dịch chống lại sự lây nhiễm HIV-1. Đây là một
tiến bộ trị liệu tiềm năng trong việc khắc phục vấn đề
hiện tại là làm thế nào để loại bỏ HIV khỏi những người
nhiễm bệnh. Sau khi sàng lọc thêm, các tác giả cho rằng
phát hiện của họ có thể hỗ trợ các liệu pháp gen hoặc
cấy ghép các tế bào gốc tủy xương đã được biến đổi gen
hoặc các tế bào gốc đa năng cảm ứng để loại bỏ nhiễm HIV.10
Kỹ thuật tạo ra tế bào soma ex vivo để điều trị bệnh ác
tính hoặc các bệnh khác
Ngày càng có nhiều sự quan tâm đến khả năng sử dụng CRISPR/
Cas9 để sửa đổi các tế bào T có nguồn gốc từ bệnh nhân
214 Redman M, và cộng sự. Arch Dis Child Education Practice Ed 2016;101:213–215. doi:10.1136/archdischild-2016-310459
Ed
Ch
đ
Di
Ar
lt
d
Pb
x
E
và tế bào gốc/tế bào tiền thân sau đó có thể được đưa
lại vào cơ thể bệnh nhân để điều trị bệnh. Cách tiếp cận
này có thể khắc phục một số vấn đề liên quan đến cách đưa
chỉnh sửa gen đến đúng tế bào một cách hiệu quả.
Kỹ thuật gen tế bào T đã cho thấy thành công trong việc
điều trị các khối u ác tính về huyết học và có khả năng
điều trị các bệnh ung thư rắn, suy giảm miễn dịch nguyên
phát và các bệnh tự miễn dịch.
Thao tác di truyền của tế bào T trước đây không hiệu quả.
Tuy nhiên, Schumann và cộng sự gần đây đã báo cáo một
cách tiếp cận hiệu quả hơn trên tế bào T CD4+ của người
dựa trên hệ thống CRISPR/Cas9. Kỹ thuật của họ cho phép
chỉnh sửa trực tiếp và loại bỏ bộ gen trong các tế bào T
sơ cấp của con người bằng phương pháp điều trị và thử
nghiệm. Họ đã chứng minh rằng các tế bào T có thể được
điều khiển để ngăn chặn sự biểu hiện của protein PD-1,
nghiên cứu khác cho thấy có thể cho phép các tế bào T
nhắm mục tiêu vào các tế bào ung thư rắn.11
Ngoài ra còn có mối quan tâm đến việc sử dụng chỉnh sửa
bộ gen qua trung gian CRISPR/Cas9 trong tế bào gốc đa
năng hoặc tế bào gốc soma sơ cấp để điều trị bệnh. Ví dụ,
Xie và cộng sự12 cho thấy đột biến gây bệnh β-thalassemia
có thể được điều chỉnh trong tế bào gốc đa năng do con
người tạo ra ex vivo. Họ cho rằng trong tương lai phương
pháp này có thể cung cấp nguồn tế bào để cấy ghép tủy
xương nhằm điều trị bệnh β-thalassemia và các bệnh đơn
gen tương tự khác.
HẠN CHẾ Vẫn
còn một số thách thức trước khi tiềm năng của CRISPR/Cas9
có thể được chuyển thành các phương pháp điều trị hiệu
quả tại giường bệnh. Một vấn đề cụ thể là làm thế nào để
đưa việc chỉnh sửa gen đến đúng tế bào, đặc biệt nếu
việc điều trị được thực hiện in vivo. Để cung cấp các gen
mã hóa Cas9-nuclease và RNA hướng dẫn in vivo một cách an
toàn mà không có bất kỳ độc tính liên quan nào, cần có
một vectơ phù hợp. AAV trước đây là một lựa chọn được ưa
chuộng để chuyển gen.1 Tuy nhiên, hệ thống phân phối này
có thể quá nhỏ để cho phép tải nạp gen một cách hiệu quả.
Gen Cas9.1 Một gen Cas9 nhỏ hơn có thể được sử dụng,
nhưng điều này có ý nghĩa bổ sung về hiệu quả.1 Một số hệ
thống phân phối không chứa virus khác đang được nghiên
cứu và quá trình này đòi hỏi phải tối ưu hóa hơn nữa.
Một mối quan tâm đáng kể khác là khả năng tác động
ngoài mục tiêu lên các phần của bộ gen tách biệt khỏi khu
vực được nhắm mục tiêu. Việc vô ý chỉnh sửa bộ gen có thể
gây ra những biến chứng lâu dài nghiêm trọng cho bệnh
nhân, bao gồm cả bệnh ác tính. Nồng độ của enzyme nuclease
Cas9 và khoảng thời gian biểu hiện Cas9 đều quan trọng
khi hạn chế hoạt động ngoài mục tiêu.1 Mặc dù những sửa
đổi gần đây về nuclease đã tăng tính đặc hiệu, nhưng cần
phải nghiên cứu thêm để giảm thiểu các tác động ngoài mục
tiêu và để thiết lập sự an toàn lâu dài của bất kỳ phương
pháp điều trị nào.
Các ứng dụng điều trị của CRISPR/Cas9 được xem xét
trong bài viết này chủ yếu nhắm vào các tế bào soma. Một
vấn đề đặc biệt gây tranh cãi xung quanh CRISPR/Cas9 là
vấn đề chỉnh sửa gen trong
 Ed
Ch
đ
Di
Ar
lt
d
Machine Translated by Google

Pb
x
E
Nghiên cứu thực tế

phôi. Người ta đã chứng minh rằng công nghệ CRISPR/ NGƯỜI GIỚI THIỆU

Cas9 có thể thay đổi bộ gen của phôi người3 mà về mặt 1 Hsu PD, Lander ES, Zhang F. Phát triển và ứng dụng CRISPR-Cas9 cho Kỹ thuật

lý thuyết có thể chứng minh là hữu ích trong việc điều bộ gen. Tế bào 2014;157:1262–78.

trị các bệnh di truyền trước khi làm tổ.

2 Yin H, Xue W, Chen S, và cộng sự. Chỉnh sửa bộ gen bằng Cas9 ở chuột
Tuy nhiên, bất kỳ biến đổi di truyền nào của dòng mầm
trưởng thành giúp điều chỉnh đột biến bệnh và kiểu hình. Công nghệ sinh
sẽ là vĩnh viễn và hậu quả lâu dài là không rõ ràng.
học Nat 2014;32:551–3.
Nhiều người phản đối việc sửa đổi dòng mầm trong bất
3 Liang P, Xu Y, Zhang X, và cộng sự. Chỉnh sửa gen qua trung gian CRISPR/
kỳ trường hợp nào, với lý do rằng hậu quả cuối cùng Cas9 trong hợp tử ba nhân của con người. Tế bào Protein
có thể là sự tăng cường di truyền không mang tính trị 2015;6:363–72.

liệu.13 Rõ ràng là các ranh giới đạo đức, trong đó 4 Schwank G, Koo BK, Sasselli V, và cộng sự. Sửa chữa chức năng CFTR bằng

CRISPR/Cas9 có thể được sử dụng, vẫn chưa được xác CRISPR/Cas9 trong các cơ quan tế bào gốc ruột của bệnh nhân xơ nang. Tế

định đầy đủ. bào gốc tế bào 2013;13:653–8.

5 Tabebordbar M, Zhu K, Cheng JK, và cộng sự. Chỉnh sửa gen in vivo ở cơ chuột

loạn dưỡng và tế bào gốc cơ. Khoa học 2016;351:407–11.

Điểm mấu chốt lâm sàng

6 Nelson CE, Hakim CH, Ousterout DG, và những người khác. Chỉnh sửa bộ gen in

vivo cải thiện chức năng cơ trong mô hình chuột mắc chứng loạn

dưỡng cơ Duchenne. Khoa học 2016;351:403–7.

Công nghệ CRISPR/Cas9 có tiềm năng cách mạng
hóa việc điều trị nhiều bệnh nhi.
thách thức thực tế và đạo đức phải được vượt qua
trước khi tiềm năng này có thể được hiện thực
hóa ở đầu giường.
7 Long C, McAnally JR, Shelton JM, và cộng sự. Phòng ngừa
Một số
chứng loạn dưỡng cơ ở chuột bằng cách chỉnh sửa DNA dòng mầm qua trung gian
CRISPR/Cas9. Khoa học 2014;345:1184–8.
8 Wojtal D, Kemaladewi Dwi U, Malam Z, và cộng sự. Bản chất kiểm tra chính tả:
tính linh hoạt của CRISPR/Cas9 để phát triển các phương pháp điều trị rối

loạn di truyền. Am J Hum Genet 2016;98:90–101.

9 Canver MC, Smith EC, Sher F, và cộng sự. Chất tăng cường BCL11A

mổ xẻ bằng phương pháp gây đột biến bão hòa tại chỗ qua trung gian Cas9.
Cộng tác viên DK đã hình thành ý tưởng cho bài viết này. Tất cả các tác giả đều
Thiên nhiên 2015;527:192–7.
tham gia viết và xem xét bản thảo cuối cùng.
10 Hu W, Kaminski R, Yang F, và cộng sự. Chỉnh sửa gen hướng RNA
AK tài trợ được hỗ trợ bởi Học bổng Wellcome Trust (108785/Z/15/Z).
đặc biệt loại bỏ tiềm ẩn và ngăn ngừa nhiễm HIV-1 mới.

Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ 2014;111:11461–6.

Cạnh tranh lợi ích Không có tuyên bố nào.
11 Schumann K, Lin S, Boyer E, và cộng sự. Tạo ra các tế bào T sơ cấp ở người

Xuất xứ và đánh giá ngang hàng Không được đưa vào vận hành; được đánh giá bằng cách sử dụng ribonucleoprotein Cas9. Proc Natl Acad Sci Hoa Kỳ
ngang hàng bên ngoài.
2015;112:10437–42.

Truy cập Mở Đây là một bài viết Truy cập Mở được phân phối theo các điều 12 Xie F, Ye L, Chang JC, và cộng sự. Chỉnh sửa gen liền mạch các đột biến
khoản của giấy phép Creative Commons Ghi công (CC BY 4.0), cho phép
β-thalassemia ở iPSC dành riêng cho bệnh nhân bằng CRISPR/Cas9 và
người khác phân phối, phối lại, phỏng theo và xây dựng dựa trên tác phẩm
piggyBac. Độ phân giải bộ gen 2014;24:1526–33.
này, cho mục đích sử dụng thương mại, miễn là tác phẩm gốc là được
trích dẫn đúng cách. 13 Lanphier E, Urnov F, Haecker SE, và cộng sự. Đừng chỉnh sửa con người

Xem: http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ dòng mầm. Thiên nhiên 2015;519:410–1.

Redman M, và cộng sự. Arch Dis Child Education Practice Ed 2016;101:213–215. doi:10.1136/archdischild-2016-310459 215