3.

A szövettanban alkalmazott leggyakoribb mikrotechnikai eljárások

SEJTEK ÉS SZÖVETEK VIZSGÁLATA ÉLŐ ÁLLAPOTBAN

1. Túlélő sejtkészítmények
• egysejtű moszatok és gombák, növényi ivarsejtek, és spórék, állati egysejtűek, magasabb rendű állatok
testfolyadékaiban ás váladékaiban (vér, nyirok, liquor, sperma) keringő, áramló vagy mozgó magányos sejtek
tanulmányozása
• eredeti környezetükből izolált sejteket vájt tárgylemez vájulatába cseppentett izotóniás folyadékban (pl.
Ringer-oldatban, vérsavóban) szuszpendálják, melegíthető tárgyasztalon vizsgálják
• festetlenül (a szövettani festékek többsége cytotoxikus), fáziskontraszt mikroszkóppal
• vitális festék: olyan festék, ami az élő szervezetekre ártalmatlan, pl. neutrálvörös, Janus-zöld, tripánkék
• így vizsgálható pl. phagocytosis, papucsállatkák emésztése, spermiumok vitalitása

2. Sejttenyészet, szövettenyészet
• a sejtek hosszabb ideig való életben tartása, szaporítása
• prokaryoták, egysejtű eukaryóták tenyésztése
• gyógyszer- és élelmiszeriparban, orvosi diagnosztikában, biológiai kutatásokban
• biztosítani kell a megfelelő tápanyagellátást és fizikai körülményeket (hőmérséklet, oxigén- és szén-dioxid
koncentráció, páratartalom)
• enzimes kezeléssel kiszakítjuk a szövetet eredeti helyéről (embrióból/ újszülött állatból): disszociáltatás →
többféle sejtet tartalmazó szuszpenzió, az egyes sejttípusok szétválasztása → megkapjuk a tenyészteni kívánt
sejttípust
• a sejtet egy állandó hőmérsékleten tartott, tápoldatot tartalmazó (tenyészedénybe tesszük, figyeljük a
megfelelő ph-t, tápoldatot cseréljük
• így kialakul primer (elsőgleges) kultúra → átteszik egy sejteket nem tartalmazó edénybe, ahol a tápanyag
tovvábra is biztosított (passzálás), ahol osztódásnak indulnak
• számos sejttípus csak korlátozott osztódásra képes → a sejttenyészet elöregszik (szeneszcencia)
• sejtvonalak: korlátlan számú osztódásra képesek, élő szervezetből eltávolított daganatsejtekből vagy
egészséges sejtek transzformálásával (kémiai mutagenezissel, daganatkeltő vírusokkal), folyékony
nitrogénben, - 198°C-ra lefagyasztva tárolhatók sejtbankokban
• embrionális őssejtek tenyésztése, Evans&Kaufman

SEJTEK ÉS SZÖVETEK VIZSGÁLATA ELÖLT ÁLLAPOTBAN

1. Nyúzat
- növények epidermisének, állatok savós hártyájának tanulmányozása
- vékony réteget lehúzunk, azt megnedvesítjük (+ festjük metilénkékkel) majd tárgylemezen fedőlemezzel
fedve vizsgáljuk
- felszálló alkoholsorozattal víztelenítjük, kanadabalzsammal lecseppentve lefedjük, száraz-objektívvel
vizsgáljuk

2. Kaparék
- kültakaró/növényi raktározószövet vizsgálata
- lekaparunk egy kis réteget, rá vízcseppet (+festéket) és fedőlemezt rakunk és mikroszkóppal vizsgáljuk
- állatorvoslás: a mintavétel helyét 70%-os alkohollal megtisztítják, szikével megkaparják az első vércsepp
megjelenéséig, 10%-os KOH oldathoz (feloldja a szaruképleteket, nem támadja meg a kitint →
bőrön/bőrben élősködő ízeltlábúak kimutatása) adják egy kémcsőben → tárgylemez
- vizsgálat száraz objektívvel

3. Lenyomati készítmény
- állati kötő/szaru/nyálkahártya vizsgálata
- tárgylemezt érintünk a hártyához, az odatapadó sejteket fixálás + festés után vizsgáljuk
- a megszáradt lenyomatot metanollal rögzítjük

4. Kenet
- bármiből készülhet, ami folyékony
I. Vérkenet – vér vizsgálata
1. vércsepp a tárgylemezre
2. kihúzólemezt értintünk hozzá: szétfut a kihúzó lemez széle mentén, elhúzzuk a tárgylemezen a
vért
3. Megszárítjuk szobahőmérsékleten
4. Fixálás: fehérjék gyors kicsapása révén a tárgylemezhez tapasztják, megakadályozzák a sejtek
változását (általában tömény metanolt használunk)
5. Megfestés
Giemsa-festés (metilénkék és metilénazúr-II-eozin metanolos oldata), ph 7 körüli, nem jó ha
túl savas vagy bázikus
Lassú Giemsa-festés: vérsejtekben élősködő paraziták
Gyorsfestési eljárások
6. Öblítés, szárítás
II. Testnedvből/váladékból - nyál, bélsár, sperma, vizelet, hüvelyváladék stb.
- folyékony minta: vérkenethez hasonlóan eloszlatjuk
- nyálkás minta: gumikesztyűvel szétoszlat
1. fixálás metanollal, etanollal, hővel
2. festés: Giemsa-oldat, Papanicolau festés
3. Öblítés, szárítás
III. Kenetvizsgálat
1. száraz objektívvel
A kenetet át kell itatni a sejtekhez hasonló fénytörésű folyadékkal, majd le kell fedni
2. immerziós objektívvel
szintetikus immerziós olaj cseppet rakunk a vizsgálandó részre, ebbe süllyesztjük

5. Biopsziás vizsgálat
- élő szervezet elváltozásainak vizsgálata
- mandrinos tűvel végezzük a tűbiopsziát
- vékony tűvel: több helyen, kevésbé invazívan vizsgálunk, kenetkészítéshez hasonlóan készítjük el
a preparátumot, hátránya hogy a sejtek egy része károsodhat, a sejt környezetéről nem ad
információt
- vastag tűvel: szövethengert kapunk, metszetkészítéshez hasonlóan készítjük el a preparátumot,
hátránya hogy nem mindig a kóros területről származik

6. Metszetkészítés fénymikroszkóphoz
 5-15 mikrométer vastag metszet kell
I. Anyaggyűjtés
- mikor? halál után hamar, megelőzve a változásokat
- mekkorát? olyan kb. 1 köbcentiméteres minta: rögzítőszer biztosan át tudja járni
- honnan? érdeklődésünk területéről, kórszöveti mintavétel esetén ép és kóros
- mivel? éles eszközzel (pl szike)
II. Rögzítés: célja legkisebb elváltozás mellett konzerválás
- sok anyag kioldódik (pl. szacharid, lipidek, aminosavak, nukleotidok)
- fixálószerek: a sejtek fehérjéit denaturálják, leállítják az enzimatikus bomlási folyamatokat,
baktériumok, gombák szaporodásának megakadályozása, szervek rothadásának felfüggesztése
- univerzális rögzítőszer nincs, minden sejtre másfajta kell
- legegyszerűbb mód: immerziós rögzítéshez: a fixáló oldatba tesszük
- perfúziós eljárás: a fixálószert az artáriás rendszeren keresztül juttatjuk el a fixálandó szervbe
vagy szövetbe
- Egyszerű rögzítők:
▪ vízelvonó szerek (96%-os vagy abszolút etil-alkohol, metil-alkohol, aceton): dehidratáció,
hátrány, hogy zsugorítják az anyagot
▪ savak (ecetsav, triklór-ecetsav, pikrinsav, krómsav, foszfor- wolfrámsav): denaturáció, hátrány,
hogy roncsolják az anyagot
▪ nehézfémsók (króm sók, higanysók) denaturáció, hátrány, hogy pigmentek keletkeznek
 ▪ aldehidek (formaldehid, paraformaldehid): új kovalens kötéseket hoznak létre, dehidratáció
• formaldehid: tömény oldata nem használható, 10%-os vizes oldata igen,
előnyei: olcsó, fertőtlenítő, jó behatolási képesség, nem zavarja a festési eljárásokat, nem oldja
a lipideket, nem zavarja az enzimek aktivitását, de zsugorító, pigmentképző és carcinogen
- Rögzítő keverékek hogy a pozitív hatások felerősödjenek
III. Kivágás
- akkora darabka legyen, ami passzol a tárgylemezre, a roncsolódott részeket eltávolítjuk, éles
eszközzel
IV. Kimosás
- felesleges rögzítőszert leöntjük, madj kimossuk
- áramló csapvíz
- alkoholt etanollal
V. Mésztelenítés: a vízben oldhatatlan kalcium sókat, kórosan elmeszesedett szöveteket
mészteleníteni kell
- erős savvakkal (sósav, salétromsav), EDTA-Na-val
- kellően mésztelenített képletek is rugalmasak lesznek
- napjainkban elektromos dekalcinálst végeznek
VI. Metszési módok – Metszetet kell készíteni
- vibrációs mikrotóm: nagy sebességgel rezgő penge, nem roncsolja a szövetet 30 – 60 μm
- anyag kellő szilárdságát kell biztosítani
a.) beágyazással: szervdarabkát olyan anyagba helyezzük, amely magasabb hőmérsékleten
folyékony, szobahőmérsékleten megszilárdul (legelterjedtebb a paraffin) lépései:
1. víztelenítés felszálló alkoholsorral, majd a végén acetonnal/izopropil alkohollal
2. intermedierrel átitatás: aceton/izopropil alkohol eltávolítása, erre apoláris szerves anyagokat
használunk, hátrányuk hogy mérgezőek
3. átitatás: a beágyazószer intermedier anyagok útján történő bejuttatása a szervbe, napjainkban
automatizált
4. kiöntés, ezzel fejeződik be a beágyazás, formába, paraffint vagy celloidon-paraffint
engedünk, majd , gyors hidegvizes lehűlés
5. metszés mikrotómmal: statívből és metszőszerkezetből áll, szánkamikrotóm (vékony
metszetek), kerekesmikrotóm (sorozatmetszés)
b.) fagyasztással: a szervdarabot fagyasztják, ezzel tesszük metszhetővé.
akkor használjuk, ha gyorsan akarunk mintát, vagy ha a beágyazásos módszer nem működik
mert kioldódna (pl: lipid), roncsolódna (pl:enzim)
régen: fagyasztó mikrotómmal, ma kriosztáttal vagy automatizált kriomikrotómmal
VII. Felhúzás
- késről vízbe húzzuk a metszetet,vízből tárgylemezre egyengetjük
- zsírtalanított tárgylemezre, amelyet előtte tojásfehérje és glicerin egyenlő arányú keverékével
vagy krómzselatinnal kentek be
- szárítás 56 °C-os termosztátban
VIII. Festések
- a festékek lehetnek: természetes eredetűek (növényi eredetű hematoxilin, bíbortetű nőstényeinek
őrleményéből kivont kármin) vagy mesterséges/ szintetikus festékek (aromás alapvegyületből,
hozzájuk kromoformok kapcsolódnak)
- savanyú festékek: színes festéksavak alkáli fémekkel (K, Na), alkáli földfémekkel (Ca) vagy
földfémekkel (Al) képzett sói, színes anionokat tartalmaz (eozin, anilinkék, savanyú fukszin) → a
kimutatható komponensek: acidophil
- bázikus festékek: színes szerves bázisoknak szervetlen vagy szerves savakkal alkotott vegyületei
(kloridjai, szulfátjai, acetátjai), színes kationokat tartalmaz (hematoxilin, metilénkék, metilibolya,
kristályibolya, bázikus fukszin) → a kimutatható komponensek: basophil
- semleges festékek: nem disszociálnak, töltésük nincsen, vízben nem oldódnak, csak szerves
oldószerekben (zsírfestők, pl. Sudan-III, Sudan-vörös, Sudan-fekete
- általános festés: sejtmag, cytoplasma, intercelluláris állomány festődik (pl. hematoxilin-eozin)
- elektív/ speciális festés: egy bizonyos sejtalkotórészt vagy szövetelemet tüntet fel (pl. elasticus
rostot rezorcin-fukszinnal, (ezüst)impregnációk)
- egyszerű festés: egyetlen festékanyaggal
 - összetett festés: kettő vagy több festékkel
o oldatban: szimultán festés (pl. collagén rostok kimutatása Mallory eljárással → oldat
anilinkékből és Orange G-ből)
o egymás után: szukcedán festés (hematoxilin-eozin: a sejt savanyú komponinsei (sejtmag,
ribosomák) hematoxilinnal, bázikus összetevők eozinnal)
- progresszív festés: ha a folyamatot akkor szakítjuk meg, amikor a kérdéses szöveti alkotórész
kellő intenzitással már megfestődött
- regresszív festés: ha a metszetet erősen túlfestjük és a festék feleslegét kivonjuk belőle
(differenciálás sósavas alkohollal)
- ortokromáziás festődés: egy festék a szövetelemet a saját oldatának színében tüntet fel
- metakromáziás festődés: bizonyos struktúrákat nem a saját oldatuk színében jelenítenek meg
(toluidinkék, tionin, azúr-A),
- speciális festési eljárás az impregnáció
- a) beágyazott metszetek festése: hematoxilin-eozin festés (általános, összetett, szukcedán,
progresszív, ortokromáziás) festőküvettában történik. Lépései (festősor)
- 1. deparaffinálás (xilollal) – paraffin eltávolítása
- 2. nedvesítés: xilol eltávolítása, hozzászoktatjuk a vízhez (leszálló alkoholsorozattal: abszolút,
96%-os, 70%-os, 50%-os etil-alkohol, majd desztillált víz)
- 3. hematoxilin (hematoxilin érése: oxidáció; 5 perc) megfesti: sejtmag: DNS, cytoplasma: RNS
- 4. kékítés: a preparátumot többször váltott csapvízzel öblítjük
- 5. eozin (1-2 perc), bázikus komponenseket piros színre
- 6. víztelenítés (felszálló alkoholsorozattal)
- 7. derítés: alkohol kiűzése xilollal
- 8. lefedés kanadabalzsammal: észak-amerikai balzsamfenyők többszörösen átdesztillált gyantája
- b) fagyasztott metszetek festése
- közvetlenül vihetőek a festőoldatba

7. Metszés elektronmikroszkóphoz
 Nagy vonalakban megegyezik a fénymikroszkóp lépéseivel, de vékonyabbra kell vágni, hogy ne
nyelődjenek el mindenhol az elektronok, és a fixálásnak tökéletesebbnek kell lennie
 Fixálás: paraformaldehid és/vagy glutáraldehid pufferolt (pH = 7,4) oldataival, immerziós
 Ha lehetőség van perfúziósra
 Dehidrálás: felszálló alkoholsorozatban, kontrasztozás: az alkoholsorozat 70%-os tagját uranil-
acetáttal telítjük
 Beágyazás: szintetikus műgyantákba (Durcupan ACM: négy komponensű, gyanta, keményítő,
lágyító, akcelerátor)
 Metszés: ultravékony (60-90 nm vastag) metszetek mehetnek az elektronmikroszkópba
ultramikrotomban: sztereomikroszkóppal ellátott mikrotom, üveg/gyémántkéssel, a mikroszkópra
azért van szükség hogy lássuk a metszetet
 Félvékony metszeteket toulidinkékkel megfestjük, rézgidre visszük fel, ólom-citrát cseppekre
helyezzük

HISZTOKÉMIA ÉS CITOKÉMIA
Hisztokémia: meghatározandó anyag szöveti szintű kimutatása a célunk
Citokémia: meghatározandó anyag sejtszintű kimutatása a célunk
Klasszikus hisztokémia: célja a szövetek egyes alkotórészeinek azonosítása kémiai tulajdonságaik alapján
Enzimhisztokémia: alapja az enzimek biokémiája
enzimreakció  csapadékképzés  színreakció
Immunhisztokémia: antigén, antitest felismerésén alapulnak