PHỔ PHÁT XẠ HUỲNH QUANG VÀ ỨNG DỤNG

Mục tiêu học tập

- Hiểu và nêu đc KN về huỳnh quang và lân quang.
- Hiểu và nêu đc giản đồ Jablonski giải thích sự phát h.quang.
- Hiểu và nêu được nguyên tắc cấu tạo và các đặc tính cơ
bản của các bộ phận của máy quang phổ huỳnh quang.
- V.dụng
kiến thức
để biện giải
phổ huỳnh
quang và
c.thức để
tính 1 số ( A ) Phổ k.thích h.quang (EX) và phổ p.xạ (EM) của MNZ-F
đ.lượng trong dd metanol; (B) phổ p. xạ h.quang của MNZ-F trg các
d.môi . (λex = 366 nm, độ nhạy 2, độ rộng khe 10/10 nm).
v.lý .
 §1. Phổ phát xạ huỳnh quang và các khái niệm
1.1. Hiện tượng phát quang
Phát quang là sự phát ra AS từ bất kỳ chất nào và xảy ra do
t.thái k.thích đ.tử.
Sự phát quang đc chia thành 2 loại là huỳnh quang
(fluorescence) và lân quang (phosphorescence) - tùy thuộc
vào b.chất của t.thái k.thích
Tốc độ p.xạ của h.quang thường là 108 s–1 → t.gian tồn tại
của h.quang điển hình cỡ10 ns.
Hợp chất h.học có thể phát lại
AS khi bị k.thích bởi AS gọi là
Fluorophore.
T.gian tồn tại τ là t.gian t.bình từ khi bị
2
k.thích đến khi trở lại t.thái cơ bản. Fluorescence Spectroscopy
Lân quang là sự phát ra AS từ các t.thái k.thích bội ba, trong
đó đ.tử trong quỹ đạo bị k.thích có cùng hướng spin với đ.tử ở
t.thái cơ bản.

Việc c.đổi sang t.thái cơ bản bị cấm và tốc độ p.xạ chậm

(103 đến 100 s–1) → t.gian tồn tại của lân quang là ms đến s.
Thậm chí có thể có t.gian sống lâu hơn, như sự "phát sáng
trong bóng tối" ở đồ chơi trẻ em.

Sự phân biệt giữa huỳnh quang và lân quang k0 phải lúc nào
cũng rõ ràng. 3
1.2. Giản đồ Jablonski
Giản đồ Jablonski dùng để t.luận về sự h.thụ và p.xạ AS.
T.thái cơ bản, đ.tử
thứ 1 và thứ 2 mô tả
bằng S0, S1 và S2.
Tại mỗi mức n.lượng
đ.tử này, các chất
h.học h.quang có thể
tồn tại ở một số mức
n.lượng, đc mô tả
bằng 0, 1, 2,... Một dạng của giản đồ Jablonski

Q.trình ch.đổi xảy ra trong khoảng 10–15 s, một khoảng

t.gian quá ngắn để các h.nhân có sự d.chuyển đáng kể. Đây
là ng.tắc Franck-Condon. 4
1.3. Đặc điểm của phát quang huỳnh quang
1.3.1. Sự thay đổi Stokes
Là n.lượng của sự p.xạ
thường < n.lượng của sự
hấp thụ
H.quang xảy ra ở n.lượng
thấp hơn hoặc b.sóng dài hơn

VD: Quinine hấp thụ AS dưới 400 nm, quinine h.quang xảy
ra gần 450 nm và có thể nhìn thấy.
Ng.nhân của sự d.chuyển Stokes:
-mức thấp nhất của S1, mức d.động cao S0 → nhiệt.
- có thể do h.ứng d.môi, p.ứng ở t.thái k.thích, sự hình
thành phức chất và/hoặc truyền n.lượng. 5
1.3.2. Phổ phát xạ với bước sóng kích thích
Phổ p.xạ h.quang giống nhau đc q.sát thấy ở bất kỳ b.sóng
k.thích → quy tắc Kasha.

Khi bị k.thích ở mức d.động

và đ.tử cao hơn, n.lượng dư
thừa sẽ tiêu tan (~ 10–12 s),
h.quang ở mức độ d.động
thấp nhất của S1, và k.quả của
sự chồng lấp nhiều t.thái có
n.lượng gần như =.

Q.tắc h.ảnh phản chiếu và các yếu tố Franck-Condon.

Phổ hấp thụ và p.xạ của antraxen. 6
1.3.3. Vài ngoại lệ của quy tắc ảnh phản chiếu
Có nhiều t.hợp ngoại lệ đv
q.tắc hình ảnh phản chiếu

Phổ p. xạ của antraxen trong toluen

chứa 0,2 M dietylanilin. Nét đứt là
q.phổ p.xạ của antraxen hoặc
exciplex với dietylanilin. 7
 1.4. Thời gian sống và hiệu suất lượng tử của huỳnh quang

Tuổi thọ và h.suất l.tử là đ.điểm

q.trọng của h.quang.
H.suất l.tử là lượng photon phát ra
so với lượng photon bị hấp thụ.
Tốc độ p.xạ của chất h.quang (Γ)
và tốc độ phân rã k0 b.xạ của nó
thành S0 (knr) → h.suất l.tử Q Sơ đồ Jablonski minh họa ý
đc cho bởi nghĩa h.suất l.tử và t.gian sống.

Q<1, Q=1 nếu >> knr.

T.gian tồn tại của t.thái k.thích đc x.định

=t.gian t/bình mà p.tử tồn tại ở t.thái
k.thích trước khi trở về t.thái cơ bản. 8
 T.gian t.tại của h.quang khi k0 có các q.trình k0 bức xạ đc
gọi là t.gian t.tại nội tại hoặc tự nhiên là n
Tuổi thọ tự nhiên có thể đc tính
từ tuổi thọ đo đc (τ) và h.suất l.tử
H.suất lượng tử và t.gian tồn tại có thể b.đổi bởi các yếu
tố ả.hưởng đến một trong hai hằng số tốc độ (Γ hoặc knr)
Một p.tử có thể k0 phát h.quang do tốc độ c.đổi bên trong
lớn hoặc t.độ p.xạ chậm.
Bộ nhấp nháy đc chọn vì h.suất l.tử cao, do giá trị Γ lớn →
t.gian tồn tại ngắn cỡ 1 ns.
Sự phát h.quang của các chất thơm chứa nhóm –NO2 thường
yếu, chủ yếu là do giá trị knr lớn.
9
 H.suất l.tử của l.quang là << trong các dd c.lỏng ở n.độ phòng.
Vì c.đổi từ bội ba sang bội đơn bị cấm bởi tính đối xứng và
t.độ p.xạ tự phát là khoảng 103 s–1 hoặc nhỏ hơn.
Vì giá trị knr gần = 109 s–1 → h.suất l.tử của l.quang cỡ 10–6.
1.4.1. Dập tắt huỳnh quang
C.độ h.quang có thể bị giảm bởi nhiều q.trình . Sự giảm
c.độ đc gọi là sự dập tắt. Q.trình dập tắt theo các cơ chế .
Q.trình dập tắt v.chạm x.ra khi fluorophore ở t.thái k.thích bị
vô hiệu hóa khi t.xúc với 1 số p.tử  trong dd (chất dập tắt).
Để dập tắt va chạm, c.độ giảm đc mô tả = PT Stern-Volmer:
K là h.số dập tắt Stern-
Volmer, kq là h.số dập tắt
lưỡng p.tử,
τ0 là t.gian sống và [Q] là n.độ dập tắt. 10
 H.số dập tắt Stern-Volmer K b.thị độ nhạy của chất h.quang
đối với c.khử. Một fluorophore ở giữa 1 đại p.tử thì k0 thể
tiếp cận đc với các c.khử tan trog nc → K thấp.
K lớn if fluorophore tự do trg dd or trên b.mặt of p.tử s.học.
Q.trình dập tắt có do fluorophores h.thành các phức chất k0
h.quang với c.khử → gọi là q.trình dập tắt tĩnh vì nó xảy ra
ở t.thái cơ bản và k0  vào sự kh.tán hoặc va chạm p.tử.
Q.trình dập tắt có thể xảy ra bởi nhiều cơ chế  phi p.tử, như
sự giảm AS tới bởi chính chất h.quang hoặc các kiểu h.thụ .
1.4.2. Thang thời gian của các quá trình phân tử trong dung dịch
1.5. Huỳnh quang dẫn đường
1.6. Trạng thái ổn định và thời gian đáp ứng huỳnh quang
1.7. Thông tin phân tử từ huỳnh quang 11
 §2. Thiết bị đo quang phổ huỳnh quang
1. Máy quang phổ
1.1. Máy đo quang phổ cho nghiên cứu quang phổ
Các máy đo q.phổ, có thể ghi lại cả phổ k.thích và phổ p.xạ
Phổ p.xạ là sự p.bố theo b.sóng của p.xạ
đc đo ở 1 b.sóng k.thích k0 đổi duy nhất.
Ng.lại, phổ k.thích là sự  của c.độ p.xạ,
đc đo ở một b.sóng p.xạ duy nhất, khi
quét b.sóng k.thích.
Việc tr.bày q.phổ h.quang theo b.sóng
hoặc số sóng là một chủ đề tranh luận.
→ thị trường q.phổ theo b.sóng, quen và trực quan hơn.
Nên ư.tiên SD phổ k.thuật đc ghi tr.tiếp hoặc phổ chưa đc12
hiệu chỉnh trên thang b.sóng.
Sơ đồ ng.lý của máy đo
quang phổ h.quang
T.bị hiển thị đc
trang bị bộ đơn
sắc để chọn cả
b.sóng k.thích
và p.xạ.
Các t.phần của
mô-đun quang
bao quanh giá
đỡ mẫu. Các
t.phần q.học có
thể tháo rời và
cố định.
13
1.2. Máy đo quang phổ cho thông lượng cao
Các t.nghiệm h.quang đang thay đổi theo hướng tiếp cận
nhiều mẫu.
Những t.nghiệm như vậy có thể bao gồm các ng.cứu liên
kết, dập tắt và thử nghiệm dựa trên tế bào.

Các xét nghiệm sàng lọc

thông lượng cao đc SD trong
khám phá thuốc, thường SD
nhiều đĩa vi bản. Đầu đọc vi bản huỳnh quang
Q.học đc SD trong đầu đọc vi bản khác với thiết bị thiết kế
SD cuvet. Các tấm vi bản phải nằm ngang và k0 thể SD
quan sát góc vuông như với cuvet.
14
1.3. Máy đo quang phổ lý tưởng
Trường hợp lý tưởng, phổ k.thích và p.xạ đc ghi lại sẽ biểu
thị c.độ photon tương đối trên mỗi khoảng b.sóng.
Để có đc phổ p.xạ "đã hiệu chỉnh” các t.phần có đ.điểm sau:
- ng.sáng phải tạo ra c.suất photon k0 đổi ở mọi b.sóng;
- Bộ đơn sắc phải cho các photon của tất cả các b.sóng đi
qua với h.suất =;
- Hiệu suất của bộ đơn sắc phải độc lập với sự phân cực;
- PMT p.hiện các photon các b.sóng là như nhau.
→ k0 có ng.sáng, bộ đơn sắc và PMT với đ.tính lý tưởng →
lựa chọn các t.phần và hiệu chỉnh cho sự k0 lý tưởng của t.bị.
Ng.lại với phép đo độ hấp thụ, phép đo c.độ h.quang là
tuyệt đối, k0 tương đối. 15
1.4. Biến dạng trong quang phổ kích thích và phát xạ
Để ghi lại phổ k.thích thì bộ đ.sắc p.xạ đc đặt ở b.sóng mong
muốn và c.độ phát ra cực đại. → độ đơn sắc k.thích đc quét
qua các dải h.thụ của chất h.quang
Phổ p.xạ đc ghi lại = chọn b.sóng k.thích th.hợp và b.sóng
quét với bộ đ.sắc p.xạ. T.hiệu q.sát đc bị b.dạng vì 1 số lý do:
- C.độ AS từ nguồn k.thích là 1 hàm của b.sóng. Khi c.độ
của AS k.thích đc giám sát và đc hiệu chỉnh thì p.ứng của
d.dịch tham chiếu hoặc máy dò có thể  vào b.sóng.
- H.suất truyền dẫn của bộ đ.sắc k.thích là 1 hàm của b.sóng
- Mật độ quang của mẫu có thể vượt quá phạm vi t.tính,
khoảng 0,1 đơn vị độ hấp thụ, tùy thuộc vào h.dạng của mẫu
Ngoài các y.tố đã th.luận, phổ p.xạ cũng có thể bị b.dạng
do sự h.thụ của mẫu. 16
2. Nguồn sáng
2.1. Đèn hồ quang và đèn xenon sợi đốt
Ng.sáng linh hoạt nhất
cho máy q.phổ
h.quang là đèn hồ
quang xenon (Xe) áp
suất cao. Đèn này cho
AS l.tục từ 250- 700
nm, với đỉnh nét ở gần
450 nm và trên 800
nm.
Q.phổ của đèn hồ quang xenon
liên tuc và đèn flash xenon.

17
 2.7. Nguồn sáng LED
Đèn LED có nhiều dải b.sóng.
Để thu được dải b.sóng rộng,
có thể SD dãy đèn LED.
Đèn LED có thể đc đặt gần
mẫu và b.sóng k.thích có thể
đc x.định = SD bộ lọc. Q.phổ đầu ra của điốt phát
Đèn LED k0 tạo ra tia IR quang. Đường màu đen hiển
đ.kể, do đó k0 cần thêm bộ thị đầu ra của đèn LED trắng
lọc nhiệt.
Có nhiều nỗ lực p.triển đèn LED trắng để cung cấp dải
b.sóng rộng hơn. Đèn LED có ƯĐ là tuổi thọ cao và tiêu thụ
đ.năng thấp. Việc SD đèn LED làm nguồn k.thích có thể sẽ
đc mở rộng trong tương lai gần. 18
3. Bộ đơn sắc
Bộ đ.sắc đc SD để phân tán AS đa sắc thành các màu or
b.sóng .
Sự phân tán này đc t.hiện = SD l.kính hoặc cách tử n.xạ.
Các bộ đ.sắc trong hầu hết các máy đo q.phổ SD c.tử n.xạ.
Các t.số k.thuật của bộ đ.sắc là độ ph.tán, hiệu quả và mức
độ AS đi lạc.
Bộ đ.sắc dùng cho q.phổ h.quang nên có AS lạc thấp để
tránh các sự cố do AS tán xạ or lạc.
Bộ đ.sắc đc chọn để đạt h.quả cao, có độ phân giải để có
các c.đại với độ rộng vạch nhỏ hơn 5 nm. Độ rộng của khe
nhìn chung có thể t.đổi, và một bộ đ.sắc điển hình sẽ có cả
khe vào và khe ra.
19
4. Bộ lọc quang học
4.1. Bộ lọc màu
Bộ lọc q.học đc SD để bù đắp cho máy đơn sắc.
Ngoài ra, khi biết các đ.tính q.phổ của chất h.quang, độ nhạy
tối đa thường thu đc = SD các bộ lọc thay vì SD các bộ đ.sắc
Tiến bộ trong công nghệ phim ảnh,
các bộ lọc đều là kính lọc màu
Một số bộ lọc màu đc gọi là bộ lọc
thông dài, cho truyền qua các b.sóng
từ một số b.sóng xác định.

Bộ lọc thông dài loại bỏ AS laser

He-Cd ở b.sóng 325 nm hoặc
laser ion Ar ở b.sóng 488 nm. 20
5. Bộ lọc và chuẩn tín hiệu
Ng.nhân chính gây ra sai số trong phép đo huỳnh quang là
nhiễu do AS tán xạ, AS lạc hoặc tạp chất. Giảm = lựa chọn
bộ lọc p.xạ, SD bộ lọc quang ngoài bộ đ.sắc k.thích và p.xạ.
Trong k.hiển vi và trong các xét nghiệm, h.quang có thể đc
q.sát mà k0 cần bộ đ.sắc.
Q.sát qua bộ lọc thay vì bộ đ.sắc làm tăng độ nhạy vì thông
dải của q.sát đc tăng lên và sự suy giảm do bộ đ.sắc gây ra bị
loại bỏ. Mức tín hiệu thường có thể cao hơn 50 lần khi đc
q.sát qua các bộ lọc thay vì bộ đ.sắc.
Kiểm tra mẫu trắng và d.môi để phát hiện h.quang hay
ko, sau đó xét đến h.quang mẫu.

21
6. Ống nhân quang (PMT)
Các máy đo h.quang đều sử dụng các PMT làm máy dò.
Một PMT được coi là tốt nhất hiện tại là c.độ d.điện tỉ lệ
thuận với c.độ AS.
Một ống chân không PMT bao gồm 1 photocathode và
một loạt các dynode là tầng kh.đại
PMT rất hữu ích cho việc phát hiện AS ở mức thấp vì chúng
là bộ kh.đại nhiễu thấp
Sự kh.đại bên ngoài PMT thường dẫn đến nhiều nhiễu
hơn đc thêm vào tín hiệu.
Các PMT có nhiều loại . Chúng có thể đc phân loại theo
nhiều cách , chẳng hạn như theo th.kế của chuỗi dynode,
k.thước và h.dạng, p.ứng q.phổ hoặc p.ứng thời gian. 22
7. Máy phân cực (tự đọc)
8. Hiệu chỉnh phổ kích thích
Sự p.triển của các PP để thu đc phổ k.thích và p.xạ, đc
h.chỉnh đối với các hiệu ứng phụ thuộc vào b.sóng.
Phổ k.thích bị biến dạng chủ yếu bởi sự phụ thuộc b.sóng
của c.độ AS k.thích.
Trc khi h.chỉnh q.phổ, nhà ng.cứu nên x/định xem những
h.chỉnh đó có cần thiết hay k0.
Thông thường, chỉ cần SS phổ p.xạ với các phổ khác đc thu
thập trên cùng 1 thiết bị.
Những SS như vậy thường đc t.hiện giữa các q.phổ kỹ thuật
(hoặc chưa hiệu chỉnh).
P.ứng của nhiều máy đo q.phổ h.quang tương tự nhau → SS
với phổ trong tư liệu máy. 23
9. Hiệu chỉnh phổ phát xạ
9.1. So sánh với phổ phát xạ đã biết
Phổ kỹ thuật q.sát đc thường để nguyên → cần h.chỉnh thì SS
với phổ đã hiệu chỉnh của một chất chuẩn.
→ có nhiều phổ c.bố cho nhiều loại chất phát h.quang sẵn.
B.sóng p.xạ của các h.chất này đc t.bày ở dạng đồ thị và số.
9.2. Hiệu chỉnh bằng cách sử dụng đèn tiêu chuẩn
H.số h.chỉnh có thể dựa vào b.sóng từ ng.sáng đã h.chỉnh.
SD đèn tiêu chuẩn có n.độ màu đã biết từ Cục Tiêu chuẩn
Quốc gia và các nguồn khác.
H.động của đèn tiêu chuẩn c.xác khi k.soát n.độ màu.
Ng.ra, q.phổ ra của đèn có thể t.đổi theo tuổi và cách SD.
24
9.3. Các yếu tố hiệu chỉnh = SD bộ đếm l.tử và bộ phân
tán
Tự đọc

9.4. Chuyển đổi giữa bước sóng và số sóng

Tự đọc

25
10. Ảnh hưởng của hình dạng mẫu
C.độ h.quang b.kiến và sự p.bố q.phổ có thể  vào mật độ
q.học và dạng h.học c.xác mẫu, của sự chiếu sáng mẫu.
Dạng h.học phổ biến nhất đc SD cho h.quang là q.sát góc
vuông ở tâm cuvet, chiếu sáng tập trung.

T.thuờng, chiếu sáng

mặt trước đc t.hiện =
SD cuvet c hoặc
cuvet vuông đ.hướng
ở 30 đến 600 so với
chùm tia tới.

Góc 450 k0 nên đc

Các sắp xếp hình học 
khuyến khích SD. 26
để quan sát huỳnh quang
11. Các lỗi thường gặp trong chuẩn bị mẫu
Mẫu quá co cụm→ AS đc hấp thụ ở bề
mặt đối diện với ng.sáng→mức tín hiệu
có thể rất thấp.
Mẫu chứa t.chất h.quang, hoặc mẫu
không tinh khiết.
Bất cứ khi nào phổ p.xạ t.đổi theo
b.sóng k.thích→ nghi ngờ có tạp
chất.

27
12. Sự hấp thụ AS và sai lệch theo đ.luật Beer-Lambert
(tự đọc)
13. Kết luận
K0 dễ t.hiện thí n0 h.quang→ cần hiểu, làm và học hỏi.
Có nhiều yếu tố có thể ả.hưởng đến dữ liệu và làm mất hiệu
lực kết quả..
Lưu ý nhiễm bẩn mẫu, or t.hiệu do AS tán xạ or đi lạc.
Việc thu thập phổ p.xạ và k.tra các mẫu trắng là cần thiết đối
với mọi thí n0.
Ta k0 thể g.thích
g.trị c.độ, tính dị
hướng or t.gian
sống nếu k0 k.tra
kỹ q.phổ p.xạ. 28