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(12)发明专利
(10)授权公告号 CN 112111002 B
(45)授权公告日 2021.07.13
(21)申请号 202011038808 .0 C07K 1/30 (2006 .01)
(22)申请日 2020 .09 .28 (56)对比文件
CN 107434820 A ,2017 .12 .05
(65)同一申请的已公布的文献号
WO 2019120639 A1 ,2019 .06 .27
申请公布号 CN 112111002 A
CN 103848910 A ,2014 .06 .11
(43)申请公布日 2020 .12 .22 CN 106928343 A ,2017 .07 .07
(73)专利权人 深圳深创生物药业有限公司 CN 109369798 A ,2019 .02 .22
地址 518000 广东省深圳市南山区粤海街 东圆珍, 等 .索玛鲁肽的制备《 . 中国医药工
道大冲社区大冲商务中心(三期)4栋 业杂志》.2018 ,第49卷(第6期) ,
25D大冲国际中心25楼DE座 Arne Staby ,等 .Influence of Production
Process and Scale on Quality of
(72)发明人 马亚平 王宇恩 张凌云 戴政清
Polypeptide Drugs: a Case Study on GLP-1
付信 周迎春 王庆磊
Analogs 《
. Pharmaceutical Research》.2020 ,第
(74)专利代理机构 北京市诚辉律师事务所 37卷(第7期) ,
11430
审查员 王康
代理人 范盈
(51)Int .Cl .
C07K 14/605 (2006 .01) 权利要求书1页 说明书9页 附图4页
(54)发明名称
一种司美格鲁肽制备方法
(57)摘要
本发明涉及一种司美格鲁肽的制备方法, 其
包括如下步骤: 1)以固相合成方法制备获得全保
护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物; 2)加
入裂解剂裂解固相合成树脂以及保护基团, 获得
裂解液; 3)在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的
混合溶液, 进行结晶 ;4)将结晶过滤获得司美格
鲁肽。本发明的方法采用了特殊的试剂组合进行
结晶, 晶体颗粒均匀, 夹杂杂质少, 能够通过过滤
的方式进行分离。
CN 112111002 B
CN 112111002 B 权 利 要 求 书 1/1 页
1 .一种司美格鲁肽的制备方法, 其包括如下步骤:
1)以固相合成方法制备获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物;
2)加入裂解剂裂解固相合成树脂以及保护基团, 获得裂解液;
3)在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液, 进行结晶;
4)将结晶过滤获得司美格鲁肽;
步骤3)中结晶时裂解液, 乙酸乙酯和环己烷的混合溶液的温度为10‑15℃;
步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中的乙酸乙酯和环己烷比例为1:1。
2 .根据权利要求1所述的制备方法, 步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液的加入体
积为裂解液体积的8‑12倍。
3 .根据权利要求2所述的制备方法, 步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液的加入体
积为裂解液体积的10倍。
4 .根据权利要求1所述的制备方法, 步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液加入裂解
液过程中搅拌速度为100rmp, 结晶过程中有晶体形成后搅拌速度提高到120rmp‑130rmp。
5 .根据权利要求1所述的制备方法, 步骤3)中结晶的时间为15‑60分钟。
6 .根据权利要求5所述的制备方法, 步骤3)中结晶的时间为25‑35分钟。
7 .根据权利要求1所述的制备方法, 步骤4)中过滤的方法为减压过滤。
8 .根据权利要求7所述的制备方法, 步骤4)中过滤的方法为采用减压漏斗进行过滤。
9 .根据权利要求1所述的制备方法, 步骤4)中过滤时采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶
液洗涤滤饼2‑5次。
10 .根据权利要求1所述的制备方法, 步骤2)所述的裂解剂为TFA、TIS、EDT、PhOH和H2O的
混合物。
11 .根据权利要求10所述的制备方法, 步骤2)所述的裂解剂为TFA:TIS:EDT:PhOH:
H2O=
85‑95:2‑5:0‑3:0‑2:1‑5;
裂解时间为1 .5‑3 .5小时。
12 .根据权利要求1所述的制备方法, 步骤1)中, 在固相合成树脂上从C端向N端依次合
成主链, 然后脱除Lys的侧链保护基, 并偶联侧链获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂
的偶联物。
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一种司美格鲁肽制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及多肽合成领域,
具体涉及一种司美格鲁肽制备方法,
尤其涉及结晶方法。
背景技术
[0002] 司美格鲁肽(Semaglutide) , 商品名Ozempic, 由丹麦诺和诺德公司研发, Ozempic
被指定为饮食和运动的辅助手段, 以改善2型糖尿病患者的血糖控制, 注射剂于2017年12月
05日在美国上市, 2019年, FDA又批准口服司美格鲁肽上市, 作为首款口服的GLP‑1类似物糖
尿病药物, 该药的市场前景被广泛看好。
[0003] 司美格鲁肽也是一种GLP‑1类似物, 与人GLP‑1具有94%的序列同源性, 是诺和诺
德开发的第二代脂肪链修饰GLP‑1类似物, 与第一代脂肪链修饰GLP‑1类似物利拉鲁肽相
比, 其半衰期更长, 剂量更低。司美格鲁肽保持了利拉鲁肽良好的安全性和降糖有效性, 且
减轻体重效果优于前两者。
[0004] 司美格鲁肽化学表述为Aib8 ,Arg34Lys26‑[N‑ε‑ODA‑ODA‑(γ‑Glu(N‑α‑18‑十八烷
酸‑1‑酰基))]‑GLP‑1(7‑37)分子式为C 187 H 291 N 45 O 59 ,相对分子质量为4113 .58, CAS号为
910463‑68‑2, 序列信息如下:
[0005] H‑His7‑Aib8‑Glu9‑Gly10‑Thr11‑Phe12‑Thr13‑Ser14‑Asp15‑Val16‑Ser17‑Ser18‑Tyr19‑
Leu20‑Glu21‑Gly22‑Gln23‑Ala 24‑Ala 25‑Lys26 (AEEA‑AEEA‑γ‑Glu‑OctadecanedioicAcid)‑
Glu27‑Phe28‑Ile29‑Ala30‑Trp31‑Leu32‑Val33‑Arg34‑Gly35‑Arg36‑Gly37‑OH
34
[0006] 目前, 诺和诺德公司主要通过基因重组技术, 利用酵母生产司美格鲁肽主链Arg ‑
GLP‑19‑37 ,
然后连接上His‑Aib; 但由于采用基因重组技术只能生产主链Arg34‑GLP‑19‑37 , 还
8 34 7‑37
需要利用化学手段和His‑Aib反应, 生成司美格鲁肽主链Aib ,Arg ‑GLP‑1 ; 然后在Lys26
的侧链氨基上接上长效修饰基团。 由于Aib8 ,Arg34‑GLP‑17‑37的侧链及N端氨基均未保护, 存
在多个活性位点, 所以此过程会产生较多杂质, 损失较大。
[0007] 现有技术中, 提供了合成司美格鲁肽(Semaglutide)的Fmoc化学固相合成方法。
US8129343和US8536122中采用Mmt、 Mtt、 ivDde和Dde保护Lys26的侧链氨基, 在主链完成偶联
后, 再脱掉侧链保护基, 顺序偶联侧链长效修饰基团; CN106928344采用Alloc保护Lys26的侧链氨
基 ,在主链完成偶联后,再利用Pd (PPh3) 4 脱掉保护基 ,顺序偶联侧链长效修饰基团 ;而
CN106478806则采用Dde‑Lys(Fmoc)‑OH为合成单体, 先顺序偶联完成Lys26的侧链长效修饰基
团, 然后再脱掉Lys26的α氨基保护基Dde, 完成主链的偶联; 在上述合成方法中均存在侧链修饰
步骤繁多, 工艺复杂, 粗品的纯化难度较大等困难。 专利CN108059666则采用Alloc‑Lys(Fmoc)‑
OH为合成单体, 以CTC树脂为固相载体,用固相法合成得到单体Alloc‑Lys(AEEA‑AEEA‑γ‑
Glu(OtBu)‑Monobutyloctadecanate)‑OH ,然后再作为单体固相合成得到司美格鲁肽。
[0008] 在树脂切割, 粗品结晶工艺方基本都是采用裂解试剂对树脂进行切割、 乙醚沉淀
得到粗肽; RP‑HPLC制备得到粗肽。
[0009] 目前没有发现司美格鲁肽的结晶沉淀专利, 本发明人研究了司美格鲁肽制备过程
中的沉淀方法, 发现用乙醚作为溶剂存在一些问题, 乙醚沉淀的晶型不好, 只能通过离心得
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到粗品,离心过程会包裹杂质到粗品中,影响后一阶段的纯化以及产品质量,根据本领域常
规采用方法都是采用乙醚作为溶剂当选用乙醚等醚类溶剂时, 结晶基本比较粘稠,晶型不
均一,过滤比较慢,所以一般只能采用离心方法得到产品,由于晶型不均一、离心不易过滤
掉杂质,两者都会产生杂质包裹等因素,实例显示经过一次纯化后,其中一个主要杂质会明
显偏大,需要更多次纯化才能得到更纯的成品,影响生产效率,也影响产品质量。同时乙醚
属于易燃易爆危险化学品,生产操作过程中存在一定风险, 如果采用更环保的乙酸乙酯等
有机溶剂进行沉淀结晶,通过过滤方式,会更好的控制粗品中的杂质,同时该方式具有可控
性强、
重现性好、能量消耗低、绿色环保等特点,较传统工艺具有明显的优势。
发明内容
[0010] 针对现有司美格鲁肽合成技术的需求, 提供一种司美格鲁肽的结晶制备方法。
[0011] 有鉴于上述司美格鲁肽合成过程中结晶沉淀的一些缺点, 本发明旨在提供一种司
美格鲁肽的制备方法, 其包括如下步骤:
[0012] 1)以固相合成方法制备获得全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物;
[0013] 2)加入裂解剂裂解固相合成树脂以及保护基团, 获得裂解液;
[0014] 3)在裂解液中加入乙酸乙酯和环己烷的混合溶液, 进行结晶;
[0015] 4)将结晶过滤获得司美格鲁肽。
[0016] 在本发明的实施方案中, 步骤3)中结晶时裂解液, 乙酸乙酯和环己的混合溶液的
温度为2‑25℃, 优选为10‑15℃。
[0017] 在本发明的实施方案中, 步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液的加入体积为裂
解液体积的8‑12倍, 优选为10倍。
[0018] 在本发明的实施方案中, 步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液加入裂解液过程
中搅拌速度为100rmp, 结晶过程中有晶体形成后搅拌速度提高到120rmp‑130rmp。
[0019] 在本发明的实施方案中, 步骤3)中乙酸乙酯和环己烷的混合溶液中的乙酸乙酯和
环己烷比例为1:2‑2:1, 优选为1:1。
[0020] 在本发明的实施方案中, 步骤3)中结晶的时间为15‑60分钟, 优选为25‑35分钟。
[0021] 在本发明的实施方案中, 步骤4)中过滤的方法为减压过滤, 优选采用减压漏斗进
行过滤。
[0022] 在本发明的实施方案中, 步骤4)中过滤时采用乙酸乙酯和环己烷的混合溶液洗涤
滤饼2‑5次。
[0023] 在本发明的实施方案中, 步骤2)所述的裂解剂为TFA、TIS、EDT、PhOH和H2O的混合
物, 优选地TFA: TIS:EDT: PhOH:H 2 O=85‑95:2‑5:0‑3:0‑2:1‑5(体积比) ;
TFA:TIS:
EDT:
PhOH: H2O=85‑95:2‑5:0‑3:0‑2:1‑5(体积比); 裂解时间为1 .5‑3 .5小时。
[0024] 在本发明的实施方案中, 步骤1)中可以采用任意的方法制备全保护的司美格鲁肽
和固相合成树脂的偶联物,例如, 在固相合成树脂上从C端向N端依次合成主链, 然后脱除
Lys的侧链保护基, 并偶联侧链。合成主链和侧链的方法可以为依次偶联氨基酸或多个氨基
酸形成的多肽片段。也可以采用先合成主链的一部分, 然后延伸生成主链, 然后再完成主链
的方法。采用已知的任意方法制成的全保护的司美格鲁肽和固相合成树脂的偶联物均可。
[0025] 在本发明的一个而具体实施方案中, 步骤1)包括以下步骤:
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度高会导致溶剂对产品有部分溶解, 收率会降低。本发明采用10‑15℃结晶温度提高结晶效
率的同时保证了晶体的颗粒粒度以及产品的纯度。
[0039] 5)本发明采用的结晶溶剂优选了乙酸乙酯/环己烷体积比为1:1的混合溶剂, 相比
于乙醚、 异丙醚、甲基叔丁基醚,
乙酸乙酯和环己烷更为环保。
[0040] 6)本发明提供的司美格鲁肽的结晶沉淀方法, 采用最简单和经济的方法可以轻松
完成司美格鲁肽的合成并且取得很好的合成效果, 该制备方法具有操作简单、 生产成本低、
收率高、 绿色环保等优点。
附图说明
[0041] 图1: 实例6结晶后样品粗品色谱分析结果(纯度: 87 .72%、
关键杂质(RT=21 .100)
含量: 2 .77%)。
[0042] 图 2 : 实 例11结晶 后样品粗品色谱分析结果 (纯 度 :92 .72% 、关键 杂 质(RT=
21 .164)含量: 1 .54%)。
[0043] 图3: 实例6样品经过一次HPLC纯化后色谱分析结果(关键杂质(RT=20 .835)含量:
1 .13%)。
[0044] 图4: 实例11样品经过一次HPLC纯化后色谱分析结果(关键杂质(RT=20 .927)含
量: 0 .73%)。
[0045] 图5 : 实例6成品色谱分析结果 (纯度 :98 .79%、关键杂质(RT=20 .837) 含量 :
0 .68%)。
[0046] 图6: 实例11成品色谱分析结果(纯度:99 .12%、
关键杂质未检测到)。
具体实施方式
[0047] 本发明公开了一种多肽的制备方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改
进工艺参数实现。特别需要指出的是, 所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显
而易见的, 它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了
描述, 相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行
改动或适当变更与组合, 来实现和应用本发明技术。
[0048] 说明书和权利要求书中所使用的缩写具体含义如下:
[0049]
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[0050]
[0051]
[0052]
本发明提供的多肽及其制备方法和用途中所用原料、
辅料和试剂均可由市场购得
或者本自行生产。
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次HPLC纯化条件件实施例17。经过一次HPLC纯化后关键杂质(关键杂质(RT=20 .927)含量
为0 .73%(见图4), 相比于实例11关键杂质含量少; 经两次HPLC纯化后成品纯度为99 .12%、
关键杂质没有检出(见图6), 对比实例6, 纯度高,关键杂质没有检出。
[0077] 实施例12司美格鲁肽的结晶
[0078] 取裂解液100mL加入圆底烧瓶, 控制圆底烧瓶溶液内温10‑15℃, 预先2:1体积比混
合乙酸乙酯和环己烷, 通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液, 边加边搅拌, 搅拌
速度为100rmp, 加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120‑130rmp, 共搅拌
30分钟。然后用砂芯漏斗过滤, 再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤三次, 抽干,干燥得
到司美格鲁肽粗品3 .9克, 收率为92 .8%,裂解收率低于实施例11, 过滤时间45分钟, 过滤速
度略慢于实例11, 结晶后粗品纯度为90 .38%、 关键杂质含量为1 .88%,对比与实例11, 粗品
纯度略有偏低、 关键杂质含量略有偏高。
[0079] 实施例13司美格鲁肽的结晶
[0080] 取裂解液100mL加入圆底烧瓶, 控制圆底烧瓶溶液内温10‑15℃, 预先1:2体积比混
合乙酸乙酯和环己烷, 通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液, 边加边搅拌, 搅拌
速度为100rmp, 加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120‑130rmp, 共搅拌
30分钟。然后用砂芯漏斗过滤, 再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤三次, 抽干,干燥得
到司美格鲁肽粗品4 .0克, 收率为95 .2%,裂解收率略低于实施例11, 结晶后, 呈粘稠状, 过
滤时间60分钟,过滤速度远慢于实例11 ,结晶 后粗品纯度为87 .38%、关键杂质含量为
2 .07%,对比与实例11, 粗品纯度偏低、 关键杂质含量偏高。
[0081] 实施例14司美格鲁肽的结晶
[0082] 取裂解液100mL加入圆底烧瓶, 控制圆底烧瓶溶液内温5‑10℃, 预先1:1体积比混
合乙酸乙酯和环己烷, 通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液, 边加边搅拌, 搅拌
速度为100rmp, 加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120‑130rmp, 共搅拌
30分钟。然后用砂芯漏斗过滤, 再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤滤饼三次, 抽干,干
燥得到司美格鲁肽粗品4 .0g, 收率为95 .2%,裂解收率略低于实施例11, 结晶后,呈粘稠状,
过滤时间90分钟, 过滤速度远慢于实例11, 结晶后粗品纯度为90 .38%、关键杂质含量为
1 .85%,对比与实例11, 粗品纯度偏低、 关键杂质含量偏高。
[0083] 实施例15司美格鲁肽的结晶
[0084] 取裂解液100mL加入圆底烧瓶, 控制圆底烧瓶溶液内温15‑20℃, 预先1:1体积比混
合乙酸乙酯和环己烷, 通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液, 边加边搅拌, 搅拌
速度为100rmp, 加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120‑130rmp, 共搅拌
30分钟。然后用砂芯漏斗过滤, 再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤滤饼三次, 抽干,干
燥得到司美格鲁肽粗品3 .4g, 收率为80 .9%,收率远低于实施例11。结晶后, 过滤时间35分
钟, 过滤速度远略慢于实例11, 结晶后粗品纯度为90 .88%、关键杂质含量为1 .74%, 对比与
实例11, 粗品纯度略偏低、 关键杂质含量略偏高。
[0085] 实施例16司美格鲁肽的结晶
[0086] 取1000mL预先1:1体积比混合乙酸乙酯和环己烷加入圆底烧瓶, 控制圆底烧瓶溶
液内温15‑20℃, 将100mL裂解液通过分液漏斗缓慢加入乙酸乙酯和环己烷混合液中, 边加
边搅拌, 搅拌速度为100rmp,加完后继续搅拌当晶体开始产生时将搅拌速度增加到120‑
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130rmp,共搅拌30分钟。然后用砂芯漏斗过滤, 再用适量乙酸乙酯和环己烷混合液洗涤滤饼
三次, 抽干, 干燥得到司美格鲁肽粗品3 .5克, 收率为83 .3%, 收率远低于实施例11, 结晶呈
块状 ,不易搅拌散开 ,过滤时间80分钟 ,过滤速度远略慢于实例11 ,结晶 后粗品纯度为
86 .88%、 关键杂质含量为2 .16%, 对比与实例11, 粗品纯度偏低、 关键杂质含量偏高。
[0087] 实施例17司美格鲁肽的二次HPLC纯化
[0088] 取粗品, 用反相高效液相色潽法对粗肽进行两步纯化: 第一步纯化和第二步纯化,
第一步纯化: 流动相A相为体积分数0 .1%TFA‑H 2O溶液, 流动相B相为体积分数0 .1%TFA‑
ACN溶液; 第二步纯化对纯品转盐: 流动相A相为体积分数0 .1%乙酸‑H2O溶液, 流动相B相为
体积分数0 .1%乙酸‑ACN溶液; 两步纯化均为梯度洗脱: 洗脱梯度为B相10%~60%, C18制
备柱(50×250mm, 10μm),洗脱时间为60min, 流速为80mL/min, 紫外检测波长220nm。经浓缩、
冻干得到司美格鲁肽成品。
[0089] 实施例18司美格鲁肽结晶产物的检测条件
[0090] 过滤后样品检测方法如下: 1 .仪器: DIONEX170,2 .色谱柱:Welch‑C18‑120A‑5μm
4 .6×250mm ,3 .流动相: A相: 2%三乙胺水溶液用磷酸调pH至3 .0, B相:色谱纯乙腈, 4 .流速:
1mL/min ,5 .波长: 220nm,6 .梯度(B%):22%——42%(40min)。
[0091] 由以上实施例可知, 采用不同的试剂进行结晶, 所得到得到产物状态非常不同。即
使是相同种类的有机试剂也可能产生不同的产品状态。而不同的产品状态对于产品最终的
分离、纯度以及后处理都存在较大影响。例如结晶颗粒小或者不成型的产品会导致无法过
滤或者过滤速度太慢, 无法在商业上使用, 严重影响了该方案的实施, 而只能采用离心的方
法进行分离, 进而导致杂质的带入。本发明的方法简单, 能够获得很好的结晶状态, 所以可
以通过减压过滤迅速获得产品, 且纯度很高。本发明的方法过滤速度是其他方法过滤速度
的至少2倍, 更重要的是, 在RT=20‑21min附近的关键杂质, 如果采用本发明的结晶条件, 可
以显著减低该杂质的含量, 进而通过HPLC能够完全去除。 虽然HPLC是纯化的重要手段, 通过
HPLC多次纯化能够去除大部分杂质, 但是HPLC纯化时间长、 耗费有机溶剂, 同时也降低了产
率。本发明采用调整结晶条件的方法, 意外地发现本发明的结晶条件能够在结晶步骤进行
初步纯化, 纯化方法简单、 采用的设备简单、 效率更高。
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图1
图2
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图3
图4
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图5
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图6
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