Machine Translated by Google

Thức ăn Chemi.~t I 9' 5 (1980) 57- 67

CHLOROPHYLL

AM HUMPHREY

Bush Boake Allen Lid, Blackhorse Lane, London ECI7 5QP, Vương quốc Anh

(Nhận: ngày 6 tháng 7 năm 1979)

TRỪU TƯỢNG

Sự phân bố của o/chlorophyll được xem xét, củng cố bởi một cuộc khảo sát lịch sử
dẫn đến việc thiết lập cấu trúc hóa học của o/chlorophyll a và b. Việc sử dụng
chúng làm màu thực phẩm được phép ở nhiều nước đã được thảo luận. Một phần trình
bày về quá trình sản xuất các sản phẩm diệp lục có màu đồng jbr/hod. Cuối cùng,
việc chuẩn bị trong phòng thí nghiệm, phân tích và kiểm tra sắc ký diệp lục được
mô tả một cách chi tiết.

GIỚI THIỆU

Chất diệp lục là sắc tố tự nhiên được phân bố rộng rãi nhất và xuất hiện ở lá và các
bộ phận khác của hầu hết các loại cây. Chức năng của nó trong r61e của quá trình quang
hợp đã được biết đến rộng rãi nhưng quá trình sinh tổng hợp, phương thức hoạt động
và số phận cuối cùng của nó ở một cây sắp chết vẫn chưa được hiểu rõ ràng. Sự xuất
hiện của nó trong mô thực vật sống chỉ giới hạn ở các tế bào 'lục lạp' chuyên biệt,
trong đó nó hiện diện ở dạng huyền phù keo, và các nghiên cứu đo quang phổ chỉ ra
rằng phần lớn ở dạng liên kết, có thể là với protein và carbohydrate.
Các nghiên cứu trên nhiều loại thực vật chỉ ra rằng các sắc tố diệp lục ở tất cả
chúng đều giống nhau và sự khác biệt rõ ràng về màu sắc là do sự hiện diện và phân
bố khác nhau của các sắc tố thực vật liên quan khác. Đặc biệt, đó là xanthophylls và
carotenes luôn đi kèm với diệp lục.
Mặc dù tỷ lệ giữa sắc tố màu vàng và diệp lục rất khác nhau nhưng lượng diệp lục
tuyệt đối trong một mô thực vật nhất định vẫn không đổi trong một môi trường nhất
định. Có rất ít sự khác biệt về hàm lượng chất diệp lục trong lá được kiểm tra 57

Hóa chất thực phẩm. 0308-8146/80/0005-0057/$02,25 © Nhà xuất bản Khoa học Ứng dụng Ltd, Anh, 1980 In tại Vương quốc
Anh
Machine Translated by Google

58 AM HUMPHREY

vào sáng sớm so với cùng một chiếc lá được kiểm tra vào giữa hoặc cuối ngày nắng. Tương
tự, hàm lượng chất diệp lục trong lá của cây trồng trong bóng râm cũng tương tự như hàm
lượng chất diệp lục trong lá của cây trồng dưới ánh nắng trực tiếp.

Tuy nhiên, lá của nó dưới ánh sáng mặt trời sẽ chứa nhiều sắc tố màu vàng hơn, điều này
dẫn đến suy đoán rằng r61e của sắc tố màu vàng hoạt động như một chất chống nắng cho chất
diệp lục nhạy cảm với ánh sáng. Nhưng lời giải thích đơn giản này cho sự hiện diện của
chúng không phải là toàn bộ sự thật và người ta cũng suy đoán rằng xanthophylls và carotenes
là một phần của hệ thống oxy hóa khử, một phần không thể thiếu của quá trình quang hợp.
Vật liệu lá thông thường sẽ chứa khoảng 0,25~o tổng số diệp lục, 0,03~o xanthophylls và
0,015~o carotenes. Các sắc tố thực vật được đề cập đến trong ngữ cảnh số nhiều vì từ lâu
người ta đã biết rằng mỗi nhóm sắc tố có thể được tách thành ít nhất hai phần khác nhau và
việc tách chất diệp lục thực vật thành hai thành phần chính của nó giữ một vị trí rất đặc
biệt. trong lịch sử hóa học phân tích.

KHẢO SÁT LỊCH SỬ

Nghiên cứu về chất diệp lục đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học vĩ đại nhất trong quá
khứ. Nó được mô tả lần đầu tiên vào năm 1818 bởi Pelletier và Caventou, người đã nghĩ ra
cái tên này, và cuộc điều tra hóa học có hệ thống đầu tiên được thực hiện bởi Berzelius vào
năm 1838. Năm 1851 Verdeil đã công nhận mối quan hệ giữa cấu trúc của chất diệp lục và sắc
tố máu, haem, được biết đến với vai trò chứa sắt, và cho đến tận năm 1891, một số công nhân
vẫn tin rằng chất diệp lục có chứa sắt.
Lạc đề về chủ đề này là hiện nay người ta biết rằng thực vật chỉ có thể chuyển hóa magie
thành chất diệp lục khi có mặt sắt và cây trồng trong điều kiện đất vôi kiềm, thiếu sắt cần
có sự hiện diện của chelat sắt để phát triển. lá khỏe mạnh.

Quay trở lại lịch sử của diệp lục, nó được Stokes nghiên cứu bằng phương pháp quang phổ
vào năm 1864, người đã kết luận rằng nó là hỗn hợp của hai chất màu khác nhau và vào năm
1873 Sorby đã phân lập được hai chất diệp lục này ở dạng tương đối tinh khiết bằng cách
phân chia dung môi giữa metanol và carbon disulphide.
Bằng chứng sâu hơn về sự tồn tại của hai chất diệp lục đã được Borodin mô tả vào năm
1882 trên cơ sở bằng chứng hiển vi. Ông đã kiểm tra cấu trúc tinh thể của chất diệp lục
trên bề mặt của những chiếc lá đã được xử lý bằng cồn. Phương pháp xử lý này đã loại bỏ
chất diệp lục khỏi lục lạp và khi bay hơi rượu, thu được hai loại tinh thể có thể nhận
dạng được. Trên thực tế, các tinh thể được kiểm tra là chất tương đồng của diệp lục được
tạo ra bởi trao đổi este và là etyl diệp lục a và b.

Trong những năm đầu của thế kỷ 20, chủ đề này đã được Willstatter nghiên cứu rất kỹ
lưỡng, ông đã xuất bản một số lượng đáng kể các bài báo.
Machine Translated by Google

CHLOROPHYLL 59

đỉnh cao là một chuyên luận đầy đủ vào năm 1913. Trong chuyên luận này, ông đã mô tả rất
chi tiết các phương pháp mà nhờ đó các sắc tố diệp lục có thể được tách ra và phân chia
để tạo thành diệp lục a và b nguyên chất, mặc dù trước đó, quan điểm vẫn bị chia rẽ về
chủ đề tồn tại riêng biệt của chúng. . Điều này bất chấp công việc của Tswett vào năm
1903-1906 và một số công nhân cho rằng một chất diệp lục là sản phẩm thoái hóa của chất
diệp lục kia.

Quan điểm này được ủng hộ bởi thực tế đã được chứng minh là diệp lục a kém ổn định
hơn diệp lục b mặc dù không thể chuyển đổi cái này thành cái khác. Do đó, không có gì
đáng ngạc nhiên khi vào năm 1903, khi Tswett lần đầu tiên xuất bản công trình của mình và
giới thiệu một từ mới vào từ vựng khoa học trên thế giới, kết quả nên được xử lý với một
chút hoài nghi.
Một số công nhân có ảnh hưởng đã từ chối thừa nhận sự tồn tại của hai chất diệp lục
và không sẵn sàng chấp nhận kết quả cũng như tính hợp lệ của "phương pháp sắc ký" mới.
Ngay cả Willstatter viết vào năm 1906 cũng mô tả phương pháp này là 'kỳ quặc', mặc dù
vậy, ông đã hoàn toàn chấp nhận tính hợp lệ của nó. Thật thú vị khi suy đoán xem lịch sử
sắc ký và thời gian ngủ đông của nó bị ảnh hưởng như thế nào bởi sự lựa chọn chất màu
của Tswett để sử dụng cho quá trình phân tách của ông. bởi một lăng kính-=tức là
xanthophylls, tiếp theo là carotenes, sau đó là diệp lục a và diệp lục b-- Tswett đã đưa
ra giả thuyết không chính xác về mối liên hệ giữa hai chất này.

Lời giải thích thông thường cho việc phương pháp này được chấp nhận chậm chạp xoay
quanh tính chất mơ hồ của ấn phẩm gốc (Arbeit Naturj~ Gesellschafi, Warsaw, 14 (1903))
nhưng vào năm 1906, một ấn phẩm bằng tiếng Đức đã được xuất bản ở Berichte Deutsche
Botanische Gesellschafi, 24, 384 . Đây là tài liệu tham khảo thường được trích dẫn là
bản gốc và được biết đến rộng rãi. Do đó, bản chất của ấn phẩm gốc nhiều nhất có thể chỉ
đóng một vai trò nhỏ trong việc kỹ thuật này được chấp nhận chậm. Ngay cả bản thân Tswett
cũng có thể có một số nghi ngờ vì ông đã mô tả rõ ràng hai phân số tách biệt là diệp lục
alpha và beta chứ không phải a và b thông thường. Hơn nữa, kỹ thuật theo mô tả của
Tswett rất khó sao chép và lượng vật liệu tách ra rất nhỏ.

Tất nhiên, ngày nay có nhiều dạng sắc ký khác nhau được công nhận và
hai chất diệp lục có thể dễ dàng được phân tách bằng nhiều phương pháp khác nhau.

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CHLOROPHYLL

Bây giờ phải chú ý đến câu hỏi về thành phần hóa học của chất diệp lục. Đến năm 1910
WiUstatter đã thiết lập được cấu trúc vòng cơ bản chứa bốn nhóm pyrrole. Đây là porphin
(Hình 1), từ đó tạo ra vòng cơ bản phức tạp hơn một chút của diệp lục, phorbin (Hình
2), là dihydro porphin với việc bổ sung một vòng đẳng vòng. Các hạt nhân pyrrole riêng lẻ
được đánh số từ I đến 1V và các vị trí bên ngoài được đánh số từ 1 đến 8 trong khi cacbon
cầu methine bên ngoài
Machine Translated by Google

60 AM HUMPHREY

Hình. I. Porphin.

2 3

H 5

H
H" HIOL-.../9

Hình 2. Phorbin.

CH2 *(~HO)
II

CH CH 3

CH3~ CH2~CH3

/CH 2 CO2 ~'

cho CH3 \
PHYTL

Hình 3. Chất diệp lục a. *Đối với diệp lục b thay thế metyl ở vị trí 3 bằng formyl.
Machine Translated by Google

CHLOROPHYLL 61

nguyên tử được chỉ định là ct-8. Đến năm 1940, cấu trúc của diệp lục, cả hai dạng
a và b, cuối cùng đã được Hans Fischer thiết lập (Hình 3).
Một số đặc tính hóa học quan trọng hơn của diệp lục là: dễ dàng bị mất magiê do
tác dụng của axit loãng hoặc được thay thế bằng các kim loại hóa trị hai khác và dễ
dàng mà este phytyl bị thủy phân bằng kiềm loãng hoặc bị chuyển hóa bởi các rượu bậc
thấp. . Chất kiềm mạnh hơn sẽ thủy phân metyl este và tách vòng đẳng vòng.

Loại bỏ phytol
chất diệp lục Chất diệp lục(ide)(trong)

Mất magiê

I Mất magiê

Loại bỏ phytol
phaeophytin phaeophorbide

sự phân chia sự phân chia Loại bỏ

metanol

clo Rhodin

Phaeo ~horbin

Hình 4. Chất diệp lục. Danh pháp hóa học.

Sơ đồ chung của các phản ứng này được thể hiện trong Hình 4. Danh pháp của một số
dẫn xuất gây ra một số nhầm lẫn vì bất kỳ dẫn xuất nào có chứa magie đều là phyllin
nhưng các sản phẩm thương mại, có chứa đồng, hòa tan trong nước được mô tả là
diệp lục đồng, trong khi chúng được mô tả chính xác hơn là các phaeophorbide đồng
trong đó magie đã được thay thế bằng
đồng.

SỬ DỤNG CHLOROPHYLL LÀM MÀU THỰC PHẨM

Các phức hợp đồng của cả phaeophytin và phaeophorbide có kim loại liên kết rất chắc
chắn và nó không bị giải phóng ngay cả khi tác dụng với axit clohydric đậm đặc. Khía
cạnh đặc biệt này làm cho các phức hợp đồng trở nên an toàn đối với màu thực phẩm và
người ta đã chứng minh rằng khi sử dụng như vậy, cơ thể không hấp thụ đồng mà được
bài tiết hoàn toàn dưới dạng phức hợp. Do đó, chúng được phép sử dụng làm màu thực
phẩm và luật hiện hành của Vương quốc Anh về việc sử dụng chúng được mô tả trong
Chất tạo màu trong Quy định thực phẩm (1973), trong đó cho phép sử dụng chất diệp lục
a và b, cũng như phức hợp đồng-diệp lục và đồng- phức hợp clorophyllin. Những màu sắc này
Machine Translated by Google

62 AM HUMPHREY

được cấp mã hóa EEC lần lượt là E 140 và E 141. Chúng phải phù hợp với các tiêu
chí về độ tinh khiết chung của phụ gia thực phẩm đối với hàm lượng kim loại vi
lượng nhưng có một hạn chế đặc biệt đối với đồng là chất tạo màu không được chứa
quá 200 ppm đồng có thể ion hóa tự do. Phương pháp xác định không được đưa ra.
Cho đến nay được chấp nhận trên toàn thế giới, sản phẩm El40 (chất diệp lục magie)
được phép sử dụng ở tất cả các quốc gia lớn trên thế giới ngoại trừ Na Uy. Ở Hoa
Kỳ, việc sử dụng nó chỉ bị hạn chế đối với một số loại thực phẩm nhất định. Các
sản phẩm El41, chất diệp lục đồng (đồng phaeophytin) hoặc chất diệp lục đồng (đồng
phaeophorbide) đều được phép sử dụng ở tất cả các nước Châu Âu ngoại trừ Thụy Sĩ.
Chúng cũng được phép ở Chile, Hy Lạp, Israel, Nhật Bản, Malta, New Zealand, Nam
Phi và Tây Ban Nha. Chúng thường không được phép ở Hoa Kỳ.

SẢN XUẤT THƯƠNG MẠI CHLOROPHYLL ĐỒNG

Việc sản xuất thương mại các sản phẩm diệp lục đồng để tạo màu thực phẩm đã diễn
ra từ lâu và từ năm 1926, lượng tiêu thụ diệp lục đã qua chế biến hàng năm ở Mỹ là
20 tấn. Các quy trình ngày nay có thể khác nhau về chi tiết nhưng Hình 5 đưa ra
một sơ đồ chung. Nguyên liệu ban đầu là bột cỏ hoặc

Bột cỏ khô

I Chiết bằng dung môi, làm bay hơi

phaeophytin thô

Phân vùng dung môi

Thủy phân, axit hóa,
TÔI
Phân vùng dung môi
Dung dịch hữu
phaeophorbide cơ phaeophytin

Trung hòa
Đồng
Phá hủy

Dung dịch Đồng phaeophytin

phaeophorbide kiềm (tan trong dầu)

Đồng

Chất diệp lục đồng(in)(ide)

(tan trong nước)

Hình 5. Các sản phẩm diệp lục thương mại.

Machine Translated by Google

CHLOROPHYLL 63

cỏ linh lăng có thể ở dạng tươi hoặc thông thường hơn là được nghiền nhỏ và sấy
khô. Quá trình sấy khô diễn ra nhanh chóng để tránh mất magie quá mức và giảm thiểu
hoạt động của enzyme tự nhiên, diệp lục, thủy phân liên kết phytol ester, do đó làm
cho diệp lục được giải phóng hòa tan trong dung dịch kiềm loãng.
Cỏ hoặc linh lăng được chiết xuất bằng dung môi hữu cơ và khi cô đặc dung môi
chiết xuất, magie sẽ bị mất do sự hiện diện của các axit hữu cơ yếu có nguồn gốc từ
cỏ. Sự mất magie để tạo ra phaeophytin xảy ra rất đột ngột trong quá trình này và
điểm mất magie được xác định bởi nồng độ axit và lượng nước có mặt. Dung dịch khan
ổn định hơn nhiều nhưng tất nhiên không thể đạt được ở quy mô thương mại. Việc
lựa chọn dung môi bị hạn chế do có thể xảy ra những tác dụng phụ không mong muốn.
Các rượu bậc thấp dễ dàng thay thế phaeophytin tạo thành chất diệp lục tương ứng.

Hơn nữa, chúng không ức chế hoạt động của chlorophyllase tự nhiên xúc tác quá trình
thủy phân nhóm este, do đó cuối cùng tạo ra phaeophorbide.
Hydrocacbon béo và thơm sẽ không chiết xuất được diệp lục, nhưng các dung môi
thành công nhất là hydrocacbon clo hóa và axeton. Nhưng ngay cả ở đây việc khai thác
cũng không hề đơn giản. Axeton khan với cỏ khô hoặc cỏ linh lăng là dung môi kém và
cần thêm nước trước khi phát huy tác dụng. Nếu thêm quá nhiều nước, nó sẽ không ức
chế hoạt động của chlorophyllaza và việc kiểm soát nồng độ axeton là rất quan trọng.
Việc kiểm soát này rất phức tạp do hàm lượng nước thay đổi trong nguồn cung cấp cỏ
hoặc bột linh lăng.
Tác động của nước trong việc cải thiện hiệu quả chiết xuất được cho là do ảnh
hưởng của nó đến sự phân tán keo của diệp lục trong lục lạp. Sự hiện diện của nước
bổ sung làm đảo lộn sự cân bằng điện giải, do đó làm cho sự phân tán chất diệp lục
kết tụ lại. Sự có mặt của muối hòa tan trong dung môi chiết cũng có tác dụng tương
tự. Do đó, rượu etylic khan là dung môi kém nhưng việc bổ sung canxi clorua hoặc
nước sẽ cải thiện đáng kể tác dụng. Ngược lại, metanol chỉ có tác dụng khi ở trạng
thái gần khan. Vì hầu hết diệp lục trong lục lạp liên kết với protein và carbohydrate
nên cần phải chọn dung môi giải phóng diệp lục khỏi các phức hợp này.

Sự phân tán keo của chất diệp lục cũng được thực hiện bằng cách ngâm nguyên liệu
thực vật vào nước sôi và điều này phá hủy chlorophyllase nhưng gây ra sự phân hủy
axit của chất diệp lục thành phaeophytin và do đó, quá trình này không được sử dụng
thương mại mặc dù lá được chần nhiều. dễ chiết xuất hơn lá tươi.

Việc chiết thương mại được thực hiện nhanh chóng để giảm thiểu sự hình thành các
sản phẩm phân hủy và việc bố trí chiết được thiết kế để mang lại nồng độ hoạt chất
cao nhất trong dịch chiết. Đối với những người không quen thuộc với nghệ thuật - và
chính là nghệ thuật - của các kỹ thuật trích xuất, cần phải giải thích thêm. Tỷ lệ
dung môi với cỏ xay hoặc linh lăng được giữ ở mức tối ưu. Nếu sử dụng quá nhiều dung
môi thì hiệu suất không gian của sản phẩm sẽ quá thấp và cần thêm
Machine Translated by Google

64 AM HUMPHREY

nhà máy thu hồi dung môi là cần thiết với tất cả các yêu cầu về năng lượng và chi phí được ngụ
ý. Mặt khác, nếu sử dụng quá ít dung môi thì việc chiết tổng sẽ khó xử lý hơn ở các giai đoạn

tiếp theo. Bột cỏ khô mang lại trọng lượng lên tới 5% so với dung môi được sử dụng và vật liệu

nhựa hòa tan này làm thay đổi đáng kể khả năng dung môi và tính chất chiết của dung môi. Không

có gì hòa tan một loại nhựa nhất định tốt hơn dung dịch mạnh của chính nó trong một dung môi

khác, và vì lượng diệp lục hoặc phaeophytin trong cỏ khô thay đổi từ 0,15 ~o đến 0,35 ~o, nên

có thể thấy điều quan trọng là phải giữ các loại nhựa ngoại lai ở mức bình thường. một mức tối
thiểu. Sự khác biệt đáng kể được tìm thấy trong các sản phẩm được tạo ra từ khối lượng bột và

thể tích dung môi nhất định tùy theo bột được chiết từ lớp rộng, mỏng, lớp dày, hẹp hay từ huyền

phù, và ảnh hưởng này là do các yếu tố hòa tan lẫn nhau. .

Các loại nhựa ngoại lai đi kèm với diệp lục và phaeophytin là chất béo và sáp, phospholipid,

axit thực vật hữu cơ, xanthophylls, caroten và một số lượng lớn các sản phẩm thoái hóa và các

vật liệu vô tính không xác định được. Cả canxi và magiê đều được tìm thấy có mặt.

Sau đó, chiết xuất phaeophytin thô được xử lý tiếp để tạo ra diệp lục đồng hòa tan trong

nước hoặc hòa tan trong dầu thương mại được bán và sử dụng theo mã màu E.141.

Các sản phẩm hòa tan trong dầu được tạo ra từ phaeophytin mà không thủy phân phytol và sau

khi tinh chế bằng một loạt các phân chia dung môi, phaeophytin được chuyển thành phức hợp đồng

của nó và được bán dưới dạng bột nhão sáp hoặc dầu. Mặt khác, các sản phẩm hòa tan trong nước

được điều chế sau khi thủy phân và loại bỏ phaeophytin. Trong trường hợp này quá trình tinh chế

đạt được bằng cả phản ứng kết tủa và phân chia dung môi. Cuối cùng, phaeophorbide kiềm trong

nước được kết thành đồng và các muối khô - natri, kali hoặc hỗn hợp natri/kali - được tạo ra

bằng cách bay hơi.

Giá trị màu sắc của sản phẩm được điều chỉnh bằng cách kết hợp các chất pha loãng thích hợp.

Tỷ lệ liều dùng để tạo màu thực phẩm dao động trong khoảng từ 0,005 ~ đến 0,01 ~ đối với các sản
phẩm hòa tan trong dầu và 0,002 ~o và 0,01 ~o đối với các sản phẩm hòa tan trong nước.

CHUẨN BỊ, PHÂN TÍCH VÀ KIỂM TRA SẮC KÝ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Sau khi đề cập đến việc sản xuất chất diệp lục thương mại, việc chuẩn bị chất diệp lục trong

phòng thí nghiệm cũng như việc phân tích và kiểm tra nó bằng sắc ký sẽ được mô tả.

Việc lựa chọn nguyên liệu ban đầu là quan trọng và bột cỏ, lá già và lá tầm ma đặc biệt thích

hợp vì chúng có hàm lượng chlorophyllaza và sắc tố màu vàng thấp. Ngược lại, lá của cây

Heracleum (cỏ heo) có hàm lượng chlorophyllaza cao nên tránh dùng cho
Machine Translated by Google

CHLOROPHYLL 65

chuẩn bị chất diệp lục, nhưng lại lý tưởng cho việc điều chế các enzyme đậm đặc.

Bột cỏ hoặc bột cây tầm ma có thể được chiết xuất tươi, nhưng thường thay đổi quá
trình sấy khô. Việc này phải được thực hiện nhanh chóng trong điều kiện chân không ở
nhiệt độ thấp càng sớm càng tốt sau khi thu hoạch và tránh tiếp xúc quá mức với ánh
sáng. Bột khô sau đó được chiết nhanh thành từng lớp mỏng bằng cách sử dụng axeton
80-90 ~o và dịch chiết này sau đó được thêm vào ete dầu mỏ để hòa tan phần lớn. Một
phần nhỏ nước được thêm vào và sau khi khuấy để chiết, sẽ được loại bỏ. Khi hầu hết,
nhưng không phải tất cả, axeton đã được chiết theo cách này thì dung dịch ete dầu mỏ
được phân chia bằng metanol 80% để loại bỏ xanthophylls. Dung dịch metanol có thể
được tạo ra để tạo xanthophyll. Sau đó, dung dịch ete dầu mỏ được rửa nhiều lần bằng
nước để loại bỏ các vết cuối cùng của axeton và metanol, và trong quá trình này, dung
dịch ete dầu hỏa sẽ mất huỳnh quang và chất diệp lục tách ra thành huyền phù mịn. Sau
đó, chất này có thể được lọc bằng chất trợ lọc thích hợp và kết tủa được hòa tan
trong dietyl ete. Việc kết tủa lại bằng cách bổ sung ete dầu mỏ có thể cần thiết trước
khi kết tinh lại lần cuối từ ete. Bằng cách này, có thể sản xuất khoảng 6,5 g chất
diệp lục với hiệu suất 80 từ 1 kg lá cây tầm ma khô chất lượng tốt. (Cây tầm ma ~,
thích hợp hơn cỏ vì hàm lượng chất diệp lục cao hơn.)

Các bước chính trong quá trình tách phụ thuộc vào việc loại bỏ phospholipid trong
quá trình chiết axeton khỏi dung dịch ete dầu mỏ và tránh hình thành nhũ tương. Không
được rửa sạch hoàn toàn axeton nếu không chất diệp lục và các chất màu khác có thể bị
kết tủa. Tương tự, việc rửa ete dầu mỏ bằng metanol sẽ đạt được độ tinh khiết cao
hơn và sự có mặt của vết metanol trong ete dầu mỏ giữ cho diệp lục ở dạng dung dịch.
Đặc điểm của diệp lục là chúng không hòa tan trong ete dầu mỏ nguyên chất, nhưng một
lượng nhỏ rượu bậc thấp khiến chúng hòa tan tự do. Sự kết tủa của diệp lục bằng cách
rửa kỹ dung dịch ete dầu mỏ chỉ xảy ra với điều kiện các giai đoạn tinh chế trước đó
có hiệu quả và tất cả metanol và axeton đã được loại bỏ. Caroten và bất kỳ phaeophytin
nào vẫn còn trong ete dầu mỏ.

Bất kỳ quá trình xử lý nghiêm ngặt nào đối với chất chiết bằng dung môi, đặc biệt
nếu không tinh khiết, sẽ dẫn đến mất magie và nếu dự tính nồng độ ở bất kỳ giai đoạn
trung gian nào thì dung dịch phải được khử nước và giữ ở mức kiềm nhẹ bằng cách thêm
dimethyl anilin, trietanolamine, canxi cacbonat hoặc magie oxit. Chất kiềm không được
đủ mạnh để thủy phân este phytyl.
Một khi magiê đã bị mất khỏi phyllin thì thực sự rất khó để thay thế nó và quy trình
thực sự thành công duy nhất liên quan đến việc sử dụng một lượng lớn thuốc thử Grignard
như methyl magiê iodide.
Các sản phẩm diệp lục được sản xuất từ cây tầm ma hoặc bột cỏ bằng phương pháp
phân chia dung môi chứa hỗn hợp diệp lục a và b với tỷ lệ gần đúng là ba phần a và một
phần b. Tỷ lệ này không bị ảnh hưởng nhiều bởi các tác động bên ngoài đến đời sống
Machine Translated by Google

66 AM HUMPHREY

cây trồng như mùa, thời gian trong ngày thu hoạch hoặc mức độ chiếu sáng. Tuy nhiên,
diệp lục a nhạy cảm hơn với sự phân hủy so với diệp lục b, với hệ số từ 3 đến 5 và
tỷ lệ tìm thấy trong sản phẩm sẽ bị ảnh hưởng bởi bất kỳ sự phân hủy nào xảy ra trong
quá trình thu hoạch và sấy khô bữa ăn hoặc trong quá trình chế biến thực phẩm. chiết
xuất dung môi.
Chất diệp lục a trong dung dịch có màu xanh lam trong khi chất diệp lục b có màu
vàng lục. Sự khác biệt này có thể được định lượng bằng quang phổ. Nhóm formyl trong
diệp lục b chuyển cực đại hấp thụ màu đỏ từ 660 nm xuống 643 nm và làm giảm hệ số hấp
thụ. Một thước đo về độ tinh khiết của diệp lục là tỷ lệ độ hấp thụ của cực đại
'xanh' và 'đỏ', trong trường hợp diệp lục a, là 1,31 đến 1,32.

Việc tách hai chất diệp lục có thể đạt được bằng cách phân chia dung môi giữa ete
dầu mỏ và metanol 90~. Dạng a có khả năng phân tách trong ete dầu mỏ cao hơn dạng b
và quá trình chiết ngược dòng cuối cùng sẽ đạt được sự phân tách tốt, nhưng phương
pháp này phức tạp và khả năng phân hủy cao. Phương pháp này phần lớn được thay thế
bằng phương pháp tách sắc ký.

Kiểm tra sắc ký của diệp lục

Vị trí đặc biệt của chất diệp lục trong lịch sử sắc ký đã được đề cập và một số kỹ
thuật ban đầu vẫn được áp dụng.
Chất diệp lục có thể được tách ra trên các cột đường, cellulose, tinh bột và inulin,
nhưng quá trình phân tách diễn ra chậm và lượng tải thấp. Các cuộc điều tra ban đầu
của Tswett đã kiểm tra hơn một trăm chất hấp thụ khác nhau và canxi cacbonat được sử
dụng cuối cùng phải mất một thời gian dài để rửa giải. Phương pháp của Tswett là chỉ
tiếp tục rửa giải cho đến khi xảy ra sự phân tách vừa đủ và sau đó đẩy lớp đệm ra
cùng với các dải hấp thụ trong đó. Sau đó, các dải được tách ra một cách cơ học và
các sắc tố được chiết bằng dung môi phân cực.
Ngày nay, cột alumina, silica gel và bột polythene cũng như sắc ký giấy và lớp
mỏng được sử dụng. Tuy nhiên, một ví dụ nữa về đặc tính độc đáo của chất diệp lục
được thể hiện qua hoạt động của nó trên một số chất thấm gel nhất định. Mặc dù sự
khác biệt về trọng lượng phân tử giữa diệp lục a và b chỉ là 14 Dalton, nhưng hai
chất này có thể dễ dàng tách ra nếu chọn đúng hệ thống gel và dung môi. Hệ thống cũng
sẽ tách phaeophytin và các dẫn xuất đồng.

Sắc ký lớp mỏng trên silica gel cũng là một phương pháp tách thuận tiện và vị trí
của các sắc tố thực vật được xác định rõ ràng qua màu sắc của chúng. Tuy nhiên, việc
xử lý các đĩa bằng anisaidehyde/axit sulfuric cho thấy sự có mặt của một lượng đáng
kể chất không màu xuất hiện thành dải ở hầu hết các vị trí trên sắc ký đồ.

Việc phân tách TLC và cột có thể được thực hiện định lượng bằng nhiều kỹ thuật bổ
sung. Trong trường hợp cột, các dải được rửa giải và thu thập
Machine Translated by Google

CHLOROPHYLL 67

riêng biệt và trong trường hợp TLC, các điểm được loại bỏ một cách cơ học. Sau đó, chất diệp lục có

thể được ước tính bằng phương pháp đo quang phổ, nếu các chất màu là phyllin thì chúng có thể được

ước tính bằng cách xác định hàm lượng magie và nếu chúng là đồng thì bằng xác định đồng. Trong cả hai

trường hợp, hấp thụ nguyên tử là một kỹ thuật rất phù hợp, nếu dải chứa hợp chất giữ lại phytol thì

chất này có thể được tách ra bằng kali hydroxit trong cồn và được xác định bằng sắc ký lỏng g'as.

Việc kiểm tra quang phổ của diệp lục

Việc xác định trực tiếp chất diệp lục trong các sản phẩm thương mại và chiết xuất thực vật đã

được Smith & Benitez xem xét rộng rãi vào năm 1955 trong Phương pháp hiện đại về phân tích thực vật

nhưng hầu hết các phương pháp thông thường đều dựa vào phép đo màu của loại này hay loại khác. Về

mặt thương mại, điều này có thể bằng cách sử dụng Máy đo màu và biểu thị kết quả theo các giá trị

màu tùy ý hoặc bằng cách sử dụng phương pháp được đề xuất AOAC (1960) bằng máy đo màu.

Kỹ thuật đo quang phổ dựa trên các phép đo độ hấp thụ ở các bước sóng khác nhau, thường là trong

dung dịch axeton hoặc dietyl ete, và các phương pháp khác nhau được thảo luận bởi Smith & Benitez.

Gần đây hơn, một bài báo của White et al. (J. Agric. Food Chem., 25, 143, 1977) đã mô tả một

phương pháp xác định phaeophytin đồng, diệp lục và phaeophytin trong hỗn hợp phức tạp. Phương pháp

này dễ áp dụng và bao gồm các phép đo quang phổ trước và sau khi xử lý bằng axit oxalic để chuyển

phyllin thành phaeophytin. Tuy nhiên, việc xử lý toán học các số liệu hấp thụ đo được rất khó khăn,

nhưng kết quả đáng tin cậy, ngoại trừ trường hợp một hoặc nhiều thành phần có mặt với lượng nhỏ thì

có thể thu được số âm.

THƯ MỤC

AOAC (1960). Các phương pháp phân tích chính thức của A OAC, A OAC, Washington DC, 92.
BERZEUS, J. (1838). Ann. d. Hóa học, 27, 296.
BORODIt~, J. (1882). Người máy. Ztg, 40, 608.
FISCHER, H. & STERN, A. (1940). Die Chemic des Pyrolls, Tập !1(2), 478. Akademische Verlagsgesellschaft,
Leipzig.
PELLETIER, PJ & CAVENTOU, JB (1818). Ann. Chim. và Vật lý, 9, 194.
Suirri, JHC & BENITEZ, A. (1955). Các phương pháp hiện đại phân tích thực vật, Tập IV, 142. Springer-Verlag,
Berlin.
SORBY, HC (1873). Proc. Roy. Xã hội, 21.442.
CỔ, GG (1864). Proc. Roy. Sóc, 13, 144.
TswE't-r, M. (1903). Arbeit Naturj~ Ges., Warsaw, 14.
TSWETT, M. (1906). Ber. D. Bot. Ges., 24, 384.
TRẮNG, RC, JONES, 1. D., GIBaS, E. & BUTLER, LS (1977). Ước tính phaeophytin đồng, diệp lục và
phaeophytin trong hỗn hợp trong dietyl ete. J. Agric. Hóa chất thực phẩm, 25, 143.
WILt.STARTER, R. & STOLL, A. (1913). Nghiên cứu về chất diệp lục. Dịch. bởi Schertz, FM và Mertz,
AR (1927). Công ty In Báo chí Khoa học, Lancaster, PA.
VERDEIL, F. (1851). Compt. Rend., 33, 689.