1.

Nguyên lý của phương pháp

High performance liquid chromatography là một kỹ thuật tách các chất phân tích ra
khỏi nhau khi chúng di chuyển theo pha động qua các hạt pha tĩnh.

Kỹ thuật HPLC sử dụng pha tĩnh được giữ trong ống thủy tinh hoặc nhựa và pha động
bao gồm dung môi nước/hữu cơ chảy qua chất hấp phụ rắn. Khi mẫu cần phân tích
được xếp chồng lên trên cột, nó sẽ chảy qua và phân phối giữa cả pha động và pha
tĩnh. Điều này đạt được là do các thành phần trong mẫu cần tách có ái lực khác nhau
đối với hai pha và do đó di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau. Pha lỏng (động) nổi
lên từ cột tạo ra các phân đoạn riêng biệt chứa các thành phần riêng lẻ trong mẫu.

Mẫu cần phân tích thường được bơm vào pha tĩnh và các chất phân tích được đưa qua
pha tĩnh bằng pha động sử dụng áp suất cao do máy bơm cung cấp. Các chất phân tích
được phân phối khác nhau trong pha tĩnh thông qua các tương tác hóa học cũng như
vật lý với pha tĩnh và pha động. Thời gian rửa giải của một chất phân tích cụ thể được
máy dò ghi lại là thời gian lưu của nó. Thời gian lưu phụ thuộc vào bản chất của chất
phân tích và thành phần của cả pha tĩnh và pha động.

2.Trình tự phân tích

2.1. Nguyên liệu, hóa chất

- Chất chuẩn Aflatoxin, Zearalenone, Ochratoxin A có độ tinh khiết 98%

- Tween 20 (Polysorbate 20)

- PBS (Phosphate-buffered saline)

- Natri clorua

- Glacial acid acetic 100%

- Cột ái lực miễn dịch AOZ đặc trưng riêng cho AFs, OCA, ZEA

- Dung dịch gốc chuẩn được sử dụng cho AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, OTA và ZEA
lần lượt là 5, 5, 1, 1, 1 và 100 mg/kg

2.2. Lưu trữ mẫu

- Các mẫu ớt đỏ được thu mua từ các địa diểm khác nhau ở siêu thị, Internet và chợ
(58 mẫu Hàn Quốc, 10 mẫu Trung Quốc, 5 mẫu Việt Nam và 5 mẫu Ấn Độ), gồm các
mẫu đóng gói và không đóng gói.

- Tất cả các mẫu đều được nghiền mịn bằng máy nghiền thực phẩm cho đến khi mẫu
có thể lọt được qua lỗ 0,85 mm của sàng

- Mẫu được lưu trữ bằng túi zip nhôm, trong tủ lạnh (-20 ℃ ) trước khi tiến hành phân
tích

2.3. Xử lý mẫu (chiết và tinh sạch)

- Cho vào cốc thủy tinh 200 ml 25g mẫu cùng với 100 ml metanol-nước (80:20,
vol/vol) và 2,0 g natri clorua

- Sau đó, đồng nhất hỗn hợp bằng máy xay sinh tố trong 5 phút. Tiếp theo, ta lấy mẫu
vừa xay lọc qua giấy lọc (Whatman no.1), và 10 ml dịch lọc được pha loãng với 40 ml
PBS chứa 1% Tween 20.

- Sau khi lọc qua giấy lọc, 20 ml dung dịch dịch lọc được đưa qua cột ái lực miễn dịch
(AOZ) với tốc độ dòng chảy một giọt mỗi giây.

- Cột ái lực miễn dịch được rửa bằng 10 ml dung dịch PBS và 10 ml nước và làm khô
bằng cách cho không khí đi nhanh qua cột.
- Các chất độc được rửa giải bằng 5 ml metanol chứa 0,1% axit axetic. Dung dịch rửa
giải được làm bay hơi trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 50 ℃ . Cặn khô được hoàn
nguyên với 1 ml metanol-nước (50:50, vol/vol) và được lọc qua đầu lọc mẫu - Syringe
filter (0,2 μm).

2.4. Phân tích mẫu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

Điều kiện thiết bị và sắc ký:

- Hệ thống HPLC (dòng Agilent 1200) bao gồm: một hệ thống lấy mẫu tự động, bốn
máy bơm, lò cột và máy dò huỳnh quang (FLD).

- Cột phân tích là cột Symmetry C18 (3,5 μm, 4,6 x 150 mm).

- Để tăng cường hoạt động huỳnh quang của AFB1 và AFG1, hệ thống tạo dẫn xuất
sau cột PHRED đã được áp dụng trước máy dò huỳnh quang. Các bước sóng kích
thích và phát xạ là 360 và 455 nm (0 đến 17 phút) đối với AFs, 276 và 460 nm (17 đến
22 phút) đối với ZEA và 225 và 460 nm (22 đến 35 phút) đối với OTA.

- Thể tích tiêm là 50 μl. Pha động được bơm ở tốc độ dòng chảy là 1,0 ml/phút trong
quá trình rửa giải gradient ở 35℃ .

- Các điều kiện HPLC tối ưu đối với pha động (metanol, acetonitril và axit axetic
0,1%) được thiết lập như sau: rửa giải đẳng cấp từ 0 đến 10 phút với 27% metanol,
14% acetonitril và 59% axit axetic (0,1%), sau đó rửa giải gradient (10 đến 12 phút)
thành 10% metanol, 44% acetonitril và 46% axit axetic (0,1%), sau đó rửa giải đẳng
cấp với cùng thành phần (12 đến 28 phút), kết thúc bằng 27% metanol, 14 %
axetonitril và axit axetic 59% để cân bằng lại cột (28 đến 33 phút).

- Để cân bằng lại cột, giữa các lần tiêm thì mẫu được tiêm vào cách nhau 2 phút

3. Kết quả phân tích

 Sắc ký đồ trong mẫu không nhiễm AFs, OTA và ZEA

Sắc ký đồ trong mẫu chuẩn AFs, OTA và ZEA

Sắc ký đồ trong mẫu tự nhiên nhiễm AFs, OTA và ZEA

Tính chọn lọc, độ đặc hiệu, độ tuyến tính và độ nhạy. Sắc ký đồ HPLC của tất cả sáu
loại độc tố nấm mốc đều cho thấy đường cơ sở và độ phân giải chấp nhận được đối
với từng hợp chất.
Quan sát thấy các đỉnh nhiễu tại thời gian lưu của từng loại độc tố nấm mốc lần lượt là
7,5, 8,65, 9,54, 11,4, 20,9 và 23,7 phút đối với AFG2, AFG1, AFB2, AFB1, ZEA và
OTA tương ứng. Ngoài ra, việc không có kết quả dương tính giả đối với OTA đã được
xác nhận bằng lần chạy khối lượng song song HPLC lần thứ hai bằng phép đo phổ
(HPLC-MS/MS)

Do đó, tính chọn lọc và độ đặc hiệu của quy trình được coi là đạt yêu cầu. Đường
cong hiệu chuẩn là tuyến tính (hệ số tương quan xác định, R 2 > 0,997) trên phạm vi
nồng độ AFB1, AFB2, AFG1, AFG2, OTA và ZEA. So với phương pháp sử dụng
phát hiện huỳnh quang sau khi tạo dẫn xuất trifluoroacetic acid (LOD từ 0,3 đến 0,6
đối với AFs và 0,4 đối với OTA), phương pháp sử dụng máy dò huỳnh quang tạo dẫn
xuất PHRED phù hợp để xác định đồng thời AF và OTA. Ngoài ra, LOQ (giới hạn
định lượng) của ZEA tương tự với kết quả (10 μg/kg) thu được từ việc phân tích ZEA
duy nhất.

Độ chụm và độ chính xác

Quy trình được lặp lại ba lần vào ba ngày khác nhau trên cùng một dãy chuẩn. Tỷ lệ
thu hồi dao động từ 80,4 - 94,9 μg/kg đối với tất cả các chất độc và độ lệch chuẩn
tương đối đều nhỏ hơn 15%.

Độ không đảm bảo đo

Kết quả cuối cùng, độ không đảm bảo đo mở rộng sử dụng hệ số bao phủ là 2, cho
mức độ tin cậy xấp xỉ 95%, là 0,64 - 1,62 μg/kg đối với AFB1, 0,24 - 0,45 μg/kg đối
với AFB2, 0,79 - 2,19 μg/kg đối với AFG1, 0,32 - 0,61 μg/kg đối với AFG2, 0,81 -
2,31 μg/kg đối với OTA và 8,48 - 26,25 μg/kg đối với ZEA khi tăng nồng độ.

Độ không đảm bảo chuẩn tối đa của các nồng độ khác nhau đối với từng độc tố là 0,6
- 6 μg/kg đối với AFs, 1,4 - 4,2 μg/kg đối với OTA và 36,2 - 108,1 μg/kg đối với
ZEA, theo độ không đảm bảo tiêu chuẩn tối đa được thiết lập ở Liên minh Châu Âu.
Do đó, trong nghiên cứu này, độ không đảm bảo của phương pháp phân tích thỏa mãn
yêu cầu đưa ra.

Mức độ nhiễm độc tố nấm mốc trong các mẫu

AFs được phát hiện trong 43% mẫu đóng gói, trong đó nồng độ dao động từ 0,04 -
38,03 μg/kg. Đồng thời, AFs được phát hiện trong 2% mẫu không được đóng gói. Tỷ
lệ mắc và mức độ ô nhiễm của OTA lần lượt là 48% và 0,23 - 56,30 μg/kg đối với
mẫu được đóng gói và 4% và 0,15 - 0,20 μg/kg đối với mẫu không được đóng gói.
ZEA không được phát hiện trong bất kỳ mẫu ớt đỏ nào.