QUY TẮC LÀM VIỆC TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM HÓA SINH

I. An toàn phòng thí nghiệm

1.1. An toàn khi làm việc với axit và kiềm
An toàn khi làm việc với axit:
1. Luôn phải đọc kỹ nhãn của chai đựng axit và tính chất của chúng
2. Phải làm việc trong tủ hút bất cứ khi nào đun nóng axit hoặc thực hiện phản ứng với
các axit có khả năng bay hơi như HCl, chú ý mang găng tay, kính bảo hộ
3. Khi pha loãng, luôn phải cho axit vào nước (hoặc dung dịch có nồng độ axit thấp
hơn)- đây là nguyên tắc hết sức quan trọng, nếu làm ngược lại sẽ gây bỏng axit rất
nguy hiểm!
4. Nếu làm văng axit lên da, lập tức rửa ngay dưới vòi nước chảy liên tục hoặc nhiều lần
với một lượng nước lớn.
An toàn khi làm việc với kiềm:
1. Kiềm đặc, tinh thể kiềm có thể làm cháy da, mắt, gây hại nghiêm trọng cho hệ hô hấp
2. Mang găng tay cao su, khẩu trang khi làm việc với dung dịch kiềm đậm đặc.
3. Thao tác trong tủ hút, mang khẩu trang để phòng ngừa bụi và hơi kiềm
4. Khi cân hạt kiềm tinh thể (NaOH) không sử dụng đồ đựng thủy tinh, chỉ nên dùng đồ
đựng bằng nhựa, hoặc cân trên giấy nến.
5. Khi hòa tan hạt kiềm tinh thể, luôn nhớ cho hạt kiềm vào nước- không làm ngược
lại!
1.2. Sử dụng và bảo quản hoá chất
1. Khi làm việc với hóa chất, cần hết sức cẩn thận, tránh gây những tai nạn đáng tiếc
cho mình và cho mọi người.
2. Tất cả các chai lọ đều phải có nhãn ghi, phải đọc kỹ nhãn hiệu hóa chất trước khi
dùng, dùng xong phải trả đúng vị trí ban đầu.
3. Chai lọ hóa chất phải luôn luôn có nắp.
4. Các loại hóa chất dễ bị thay đổi ngoài ánh sáng cần phải được giữ trong chai lọ
màu vàng hoặc nâu và bảo quản vào chỗ tối.
5. Khi làm việc với chất dễ nổ, dễ cháy không được để gần nơi dễ bắt lửa.
6. Các hóa chất dễ bốc hơi, có mùi,... đặc biệt dung môi bay hơi, các axit bay hơi,
phải trữ trong tủ hút, thao tác lấy hóa chất trong tủ hút, chú ý đậy thật kín nắp sau
 khi lấy hóa chất xong.
7. Không hút bằng pipette khi chỉ còn ít hóa chất trong lọ.
8. Bảo quản dung dịch trong tủ lạnh chú ý không được cho chai thủy tinh vào ngăn
đá!
1.3. Xử lý chất thải thí nghiệm
- Các dung dịch hóa chất, chất thải độc hại phải được xử lý đúng yêu cầu theo mỗi bài
học.
- - Một số dung dịch thải (dưa thừa hay từ súc rửa dụng cụ) chứa chất độc hại (ví dụ
DNS, follin..) phải được thu gom riêng, không được xả bỏ trong bồn rửa
II. Dung dịch trong thí nghiệm hoá sinh
2.1. Các đơn vị nồng độ dung dịch
➢ Nồng độ phần trăm, (%)
- Nồng độ phần trăm khối lượng - khối lượng, % (w/w): là số gam chất tan có trong 100g
dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch NH4Cl 5% (w/w) là trong 100g dung dịch có chứa 5g NH4Cl
- Nồng độ % khối lượng thể tích (w/v): là số g chất tan có trong 100ml dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch CuSO4 10% (w/v) là trong 100ml dung dịch chứa 10g CuSO4
- Nồng độ phần trăm thể tích - thể tích, % (v/v): là số ml dung chất có trong 100ml dung dịch
➢ Nồng độ gam-lit, (g/L): là số gam chất tan có trong 1 lít dung dịch.
➢ Nồng độ phân tử gam hay nồng độ mol, (Mol/L) hay M: là số phân tử gam (hay số
mol) chất tan trong 1 lít dung dịch.
Ví dụ: Dung dịch KH2PO4 M/15 là trong 1000 ml dung dịch chứa M/15 phân tử gam
KH2PO4.
➢ Nồng độ đương lượng (N): là số đương lượng gam (đlg) chất tan có trong 1 lit dung
dịch.
Số đương lượng chất tan = số mol (n) x hệ số đương lượng (z)
Hệ số đương lượng (z): phụ thuộc vào bản chất của chất đó và phản ứng mà chất đó tham
gia.
- Nếu phản ứng là phản ứng acid, base: z là số ion H+ hay OH- mà 1 phân tử, ion của
chất đó tác dụng vừa đủ.
Ví dụ: Phản ứng giữa HCl và NaOH
H2SO4 + 2 NaOH → Na2SO4 + 2 H2O
 H2SO4 → 2 H+ →z=2
NaOH → 1OH- →z = 1
- Nếu phản ứng là phản ứng ôxy – hóa khử: z là số electron mà 1 phân tử, ion của chất
đó cho hay nhận.
Ví dụ: 2 Na2S2O3 + I2 → Na2S4O6 + 2 NaI
I + 1e → I- → z = 1
S2+ - 1e → S+ → z = 1
Nồng độ dung dịch bão hòa: là nồng độ dung dịch chứa lượng chất hòa tan tối đa
2.2. Hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
➢ Phương pháp hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
1. Đối với các chất dễ thay đổi thành phần khi ở dạng rắn, nếu muốn pha dung dịch có
nồng độ chính xác, pha dung dịch có nồng độ gần đúng, sau đó hiệu chỉnh nồng độ
của dung dịch dựa vào phản ứng với một dung dịch chuẩn thích hợp
Ví dụ: Pha dung dịch NaOH 0,1N từ NaOH rắn và dùng dung dịch chuẩn H2SO4 0,1N để
chuẩn độ lại.
2. Đối với các dung dịch dễ thay đổi nồng độ trong quá trình bảo quản, mỗi lần sử dụng
lại phải xác định lại hệ số hiệu chỉnh nồng độ dung dịch
Xét một phản ứng trung hòa acid - base, 1 ion gam H+ sẽ phản ứng với 1 ion gam OH-. Do
đó: C1.V1 = C2.V2
Nếu gọi Cp là nồng độ dung dịch định pha và Ct là nồng độ thực của dung dịch ta có hệ số
hiệu chỉnh K: K= Cp/Ct = Vp/Vt
Ví dụ: Dung dịch chuẩn là H2SO4 0,1N, dung dịch định pha là NaOH 0,1N.
Lấy 10ml H2SO4 0,1N cho vào erlen, thêm ba giọt phenolphtalien, dùng burette chuẩn độ
bằng NaOH được 11 ml NaOH
Vậy nồng độ thực tế NaOH đã pha là : Ct = (10*0,1)/11 = 0,091 N
- Hệ số điều chỉnh K: K= 0,091/0,1 = 10/11 = 0,91
➢ Dung dịch đệm:
Dung dịch đệm là dung dịch có pH không thay đổi đáng kể khi một lượng nhỏ acid (H+) hoặc
base (OH-) được thêm vào. Như vậy, dung dịch đệm bao gồm một cặp acid base liên hợp
(acid yếu và muối của acid yếu này hoặc base yếu và muối của base này) và tỉ lệ của chúng
sẽ quyết định pH của dung dịch.
Việc pha dung dịch đệm theo nguyên tắc chọn cặp acid – base có hằng số phân ly pKa gần
với pH đệm muốn pha (pH trong khoảng pKa ± 1) và phối trộn chúng với số mol bằng nhau.
Ví dụ: Dung dịch đệm phosphate (pH = 5,6 – 8,0)
- Pha dung dịch mononatri hydrophosphate (dung dịch a- bảng 1) có nồng độ 0,1M: cân
12 g NaH2PO4 (sodium phosphate monobasic anhydrous, wt = 119,98g), hòa tan vào nước,
định mức đến 1000 ml. Chú ý: nếu dùng tinh thể ngậm nước NaH2PO4.2H2O, cần thay đổi
số cân theo trọng lượng phân tử.
- Dung dịch dinatri hydrophosphate (dung dịch b- bảng 1) có nồng độ 0,1M: cân 26,8 g
Na2HPO4.7H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate, wt = 268,06g), hòa tan và định
mức đến 1000 ml.
Pha dung dịch đệm phosphate có pH mong muốn bằng cách trộn các cặp thể tích dung dịch
a và b theo bảng 1 với dung dịch đệm cuối cùng có thể tích 100 ml và nồng độ là 0,1 M.
Chú ý:
1. Để được nồng độ dung dịch đệm thấp hơn 0,1 M thì pha loãng từ dung dịch đệm
phối trộn đã thu được.
2. Để được nồng độ dung dịch đệm có nồng độ cao hơn 0,1 M, thì chuẩn bị dung dịch
a và b ban đầu có nồng độ bằng nhau và cao hơn 0,1 M, ví dụ dung dịch a 0,5M và
dung dịch b 0,5M. Vẫn sử dụng công thức phối trộn thể tích như bảng 1, sau khi
được 100 ml dung dịch đệm 0,5M, pha loãng đến nồng độ cần dùng.
Bảng 1: Pha 100 ml dung dịch đệm Na-phosphate có pH từ 5,6 đến 8,0

Ghi chú: (a) là số ml dung dịch NaH2PO4; (b) là số ml dung dịch Na2HPO4
 BÀI 1. ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ BẰNG ACID DINITRO SALICYLIC (DNS)
1. Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử axit
dinitrosalicylic (DNS). 3,5 – dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng trong dung dịch kiềm
sẽ khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam.
Phương trình phản ứng tạo màu giữa đường khử và DNS

Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một
phạm vi nhất định. Dựa theo đường chuẩn của glucose với thuốc thử DNS sẽ tính được hàm
lượng đường khử của mẫu nghiên cứu
2. Hóa chất
a. Thuốc thử DNS:
- Hoà tan 10g DNS vào 400ml nước cất.
- Hoà tan 16g NaOH vào 150 ml nước cất.
- Thêm dung dịch NaOH vừa pha vào dung dịch DNS ở trên.
- Hoà tan bằng khuấy ở t0 không quá 500C.
- Tiếp tục khuấy và cho thêm từng ít một 300g potassium sodium tartrate cho đến khi
tan hoàn toàn, chú ý bao kín cốc pha hóa chất.
- Sau khi hòa tan hoàn toàn, định mức dung dịch đến 1 lít, trữ trong chai tối
b. Dung dịch glucose 10 mg/ml
3. Tiến hành
Dựng đồ thị đường chuẩn glucose (0-10 mg/ml) và phân tích đường khử
Bảng 2: Thứ tự thí nghiệm phân tích đường khử
Ống nghiệm M1 M2 M3
Đối
No.1 No.2 No.3 No.4 No.5
Hoá chất chứng
Nồng độ
glucose 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
(mg/ml)

Nước cất (ml) 10 9.8 9.6 9.4 9.2 9

Glucose
10mg/ml (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

Thực hiện phản ứng

Đường chuẩn
glucose Hút 1ml mỗi ống vào 6 ống nghiệm sạch mới

Mẫu nguyên
Hút 1ml mỗi ống vào 3
chất hoặc đã
ống nghiệm sạch mới
pha loãng (n)
Dung dịch
DNS 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

Đun sôi cách thủy 5 phút, làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng
Đo OD540nm

1. Chuẩn bị mẫu: M1, M2 và M3 là 3 mẫu lặp lại có thể dùng trực tiếp mẫu phân
tích. Nếu nồng độ đường khử trong mẫu phân tích dự đoán cao thì phải pha loãng.
Ghi lại cách pha loãng và độ pha loãng (n) để tính nồng độ đường khử trong mẫu
sau cùng.
2. Thực hiện phản ứng với các bước tuần tự như trong bảng 2.
3. Vẽ đổ thị đường chuẩn glucose- trị số OD 540nm.
4. Tính giá trị trung bình của OD 540nm của 3 mẫu M, nếu giá trị này nằm ngoài
đường chuẩn thì phải pha loãng mẫu
5. Sử dụng giá trịnh trung bình của OD 540nm mẫu tính được a mg/ml đường khử.
❖ Nhân với hệ số pha lõang (n) để được lượng đường trong dung dịch mẫu
gốc. Chọn hệ số pha lõang n sao cho OD của mẫu nằm trong giới hạn đường
chuẩn.
 BÀI 2. ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN THEO PHƯƠNG PHÁP BIURET
1. Nguyên tắc
Trong môi truờng kiềm, hợp chất chứa liên kết peptide sẽ phản ứng với thuốc thử chứa ion
đồng (Cu) tạo thành phức màu xanh dương có độ hấp thụ quang cực đại ở bước sóng 550nm.
Độ hấp thụ quang này tỉ lệ thuận với nồng độ liên kết peptide trong phản ứng vì thế dùng để
định lượng protein

2. Hóa chất
- Dung dịch albumin:10 mg/ml
- Dung dịch Biuret: 9g sodium potassium tartrate, 3g CuSO4. H2O, hoà tan 100ml
NaOH 0.2N định mức với nước cất thành 1 lít.
3. Tiến hành
a. Chuẩn bị mẫu: P1, P2 và P3 là 3 mẫu lặp lại có thể dùng trực tiếp mẫu phân
tích. Nếu nồng độ protein trong mẫu phân tích dự đoán cao thì phải pha loãng. Ghi
lại cách pha loãng và độ pha loãng (n) để tính nồng độ protein trong mẫu gốc.
b. Thực hiện phản ứng với các bước tuần tự như trong bảng 3.
c. Vẽ đồ thị đường chuẩn nồng độ albumin- trị số OD 550nm.
d. Tính giá trị trung bình của OD 550nm của 3 mẫu P, nếu giá trị này nằm ngoài
đường chuẩn thì phải pha loãng mẫu.
e. Sử dụng giá trị trung bình của OD 550nm mẫu P và đồ thị đường chuẩn
albumin, tính được a mg/ml protein trong mẫu pha loãng.
f. Nhân với hệ số pha lõang (n) để được nồng độ protein trong dung dịch mẫu
gốc. Chọn hệ số pha lõang (n) sao cho OD 550nm của mẫu phân tích nằm trong
giới hạn đường chuẩn
 Dựng đồ thị đường chuẩn albumin và phân tích nồng độ protein
Bảng 3: Thứ tự thí nghiệm phân tích nồng độ protein
Ống nghiệm P1 P2 P3
Đối
No.1 No.2 No.3 No.4 No.5
chứng
Hoá chất

Nồng độ
albumin 0 2 4 6 8 10
(mg/ml)

Nước cất (ml) 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

Albumin
chuẩn 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
10mg/ml (ml)
Thực hiện phản ứng
Mẫu nguyên
Hút 1ml mỗi ống vào 3
chất hoặc đã
ống nghiệm sạch mới
pha loãng (n)
Dung dịch
5 ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml
Buiret

Ủ ở nhiệt độ phòng, 20 phút

Đo OD550nm
 BÀI 3. XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYME PROTEASE
1. Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thủy phân cơ chất protein (casein hoặc hemoglobin)
bằng protease. Sau đó làm vô hoạt enzym và kết tủa protein chưa bị thủy phân bằng dung
dịch acid trichloracetic. Định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng thủy phân bằng
phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn của tyrosine để tính lượng sản phẩm
do enzym xúc tác tạo nên.
2. Hóa chất

- Dung dịch phosphate buffer 50 mM, pH 7,5.

- Dung dịch casein 0.65%: hòa tan theo tỉ lệ 6.5 mg/mL casein trong 50 mM potassium
phosphate buffer pH 7,5. Tăng nhiệt độ tới ~80C ở điều kiện khuấy nhẹ trong khoảng
10 phút cho tới khi dung dịch đồng nhất. Không đun sôi dung dịch.
- Dung dịch trichloroacetic acid (TCA) 110 mM .
- Dung dịch thuốc thử Folin 0.5M.
- Dung dịch sodium carbonate 500 mM: 53 mg/mL sodium carbonate trong nước cất.
- Dung dịch pha loãng enzyme: 10 mM sodium acetate buffer pH7.5 và 5 mM
calcium, pH 7.5 trong 37C. Dung dịch được sử dụng để hòa tan mẫu protease rắn
hoặc pha loãng dung dịch enzyme.
- Dung dịch chuẩn L-tyrosine 1.1 mM: 0.2 mg/mL L-tyrosine trong nước cất và đun
nhẹ cho tới khi tyrosine được hòa tan. Giống như với casein, không đun sôi dung dịch
này.

3. Tiến hành
Dựng đường chuẩn L-tyrosine
Bảng 4: Dựng đường chuẩn L-tyrosine
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Blank No.1 No.2 No.3 No.4 No.5
Nổng độ L-Tyrosine
0 0.055 0.111 0.221 0.442 0.553
(µmole/ml)
H2O (ml) 2 1.95 1.9 1.8 1.6 1.5
Dung dịch chuẩn L-
tyrosine gốc 1,1 mM (1,1 0 0.05 0.1 0.2 0.4 0.5
µmole/ml), (ml)
Dung dịch Na2CO3 (ml) 5 5 5 5 5 5
Thuốc thử Folin (ml) 1 1 1 1 1 1
Lắc đều, ủ 37oC trong 30 phút
Đo OD 660nm

• Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ tyrosine (µmole/ml) và độ hấp thu
OD 660nm

Thiết lập phản ứng protease

Mỗi mẫu enzyme cần 4 ống nghiệm. 1 ống làm mẫu blank, và 3 ống tiếp theo dùng để đo
hoạt tính protease ở 3 nồng độ pha loãng khác nhau.
Bảng 5: Thứ tự phản ứng protease
Dung dịch Ống mẫu Ống
B1 B2 B3 Blank
Dung dịch Casein 0.65% (ml) 5 5 5 5
Giữ ở 37oC trong 5 phút
Dung dịch enzym (ml) 1 0.7 0.5 0
Lắc đều và giữ ở 37oC trong 10 phút
Dung dịch TCA 5% (ml) 5 5 5 5
Dung dịch enzym (ml) 0 0.3 0.5 1
Lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút
Sau 30 phút, lọc lấy dịch trong
Dịch lọc (ml) 2 2 2 2
Dung dịch Na2CO3 (ml) 5 5 5 5
Thuốc thử Folin (ml) 1 1 1 1
Lắc đều và giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút
Đo OD 660 nm

1. Cho 5 mL dung dịch casein 0.65% vào 4 ống nghiệm và ủ 37C trong 5 phút.
2. Sau đó, thêm các dung dịch enzyme khác nhau vào 3 ống chuẩn bị lúc ban đầu, không
cho vào mẫu blank.
3. Lắc đều và ủ ở 37°C trong 10 phút. Hoạt động protease và sự phóng thích amino acid
trong thời gian ủ này sẽ được xác định và so sánh giữa các mẫu thử.
4. Sau chính xác 10 phút ủ, thêm 5 ml dung dịch TCA vào mỗi ống để dừng phản ứng.
5. Sau đó, một thể tích dung dịch enzyme thích hợp được thêm vào mỗi ống, bao gồm
cả mẫu blank, sao cho thể tích cuối cùng của dung dịch enzyme trong mỗi ống là 1
mL (đảm bảo rằng thể tích cuối cùng trong mỗi ống bằng nhau).
6. Trộn đều dung dịch, để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để đảm bảo bất hoạt toàn
bộ enzyme và kết tủa hoàn toàn casein.
7. Lọc thu dịch trong của mỗi ống bằng giấy lọc, chuyển sang 4 ống sạch mới.
8. Lấy 4 ống nghiệm sạch mới khác. Hút 2 mL dịch lọc từ mẫu thử và mẫu blank cho
vào 4 ống nghiệm này.
9. Thêm lần lượt 5 ml Na2CO3 mỗi ống.
 10. Sau đó, thêm lần lượt 1ml thuốc thử Folin cho mỗi ống, thuốc thử sẽ phản ứng tạo
màu với tyrosine tự do.
11. Lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút.
12. Tiến hành đo OD 660nm.

4. Tính hoạt tính của protease

Sử dụng giá trị OD 660nm mẫu, dựa vào đồ thị đường chuẩn suy ra được µmole tyrosine
tương ứng được giải phóng trong thể tích 2 ml dịch lọc. Dùng lượng Tyrosine này đế tính
hoạt tính protease theo công thức sau:

Hoạt độ Protease được tính theo đơn vị trên mỗi ml:

(µmole lượng tyrosine phóng thích trong

Units/mL enzyme = 2 ml dịch lọc ) x (11)

(1) x (10) x (2)

Với:

µmole tương đương tyrosine được giải phóng trong 2ml dịch lọc thu được từ phương trình
đường chuẩn.

11 = Tổng thể tích dịch lọc (mL)

10 = Thời gian phản ứng (phút)
1 = Thể tích enzyme (mL) của enzyme được sử dụng
2 = Thể tích dịch lọc dùng trong phản ứng tạo màu (ml)

Hoạt tính trong mẫu protease rắn (Unit/mg) được pha loãng tính bằng Unit/mL enzyme
chia cho lượng chất rắn được sử dụng trong phản ứng này ban đầu (mg/mL)

Units/mL enzyme
Units/mg chất rắn =
mg chất rắn/mL enzyme

Units/mg protein = Units/mL enzyme

mg protein/ml enzyme
 BÀI 4A. ĐỊNH LƯỢNG LIPID THÔ BẰNG MÁY SOXHLET

1. Nguyên tắc

Trong tế bào, lipid ở dạng tự do và liên kết. Lipid tự do tập trung chủ yếu ở các cơ quan
dự trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở động vật). Để xác định hàm lượng lipid, chiết
rút lipid ra khỏi nguyên liệu bằng dung môi hữu cơ.
Có 2 phương pháp để xác định
Phương pháp xác định trực tiếp: chiết xuất lipid ra khỏi nguyên liệu và
cân trực tiếp
Phương pháp gián tiếp: chiết xuất lipid ra khỏi nguyên liệu và cân lại
nguyên liệu
Dùng dung môi kị nước trích li hoàn toàn lipid từ nguyên liệu đã
được nghiền nhỏ. Các dung môi chiết xuất lipid thông dụng là etylic (ether
petrol, benzen, cloroform, tetraclorua cacbon ...). Trong phòng thí nghiệm
thường sử dụng ete etylic, vì ete có độ bay hơi cao, nhiệt độ sôi thấp. tốc độ
của quá trình chiết xuất phụ thuộc vào mức độ nghiền nhỏ của nguyên liệu.
Ngoài lipid ra còn có một số hợp chất khác như: vitamin hoà tan trong lipid
phosphatit, steroid, ... cũng được chiết ra. Tuy nhiên, hàm lượng các chất
này rất ít, nên phương pháp này vẫn chấp nhận trong các thí nghiệm thông
thường. Vì vậy, lipid chiết xuất trong hai phương pháp trên gọi là lipid thô.
Quá trình chiết xuất lipid được thực hiện trên máy Soxhlet, gồm có: bình cầu (a), trụ
chiết (b), ống sinh hàn (c).

2. Hóa chất
Ether etylic hoặc ether petrol
3. Tiến hành
- Bước 1: Chuẩn bị mẫu
Đem mẫu cho vào cối sứ nghiền mịn. Sau đó đem sấy khô ở nhiệt độ 100 – 1050C đến
khi khối lượng không đổi.
Chuẩn bị túi giấy lọc, sấy khô đến khối lượng không đổi.
Mẫu sau khi được sấy khô cân chính xác 2 – 5g rồi cho mẫu vào túi giấy. Gấp kín mép
túi, cân túi mẫu, ghi nhận kết quả và cho vào trụ chiết.
 - Bước 2: Chiết rút lipid
1. Rửa sạch và làm khô bộ Soxhlet
2. Cho ether vào ½ thể tích bình cầu (a)
3. Cho túi nguyên liệu vào trụ chiết (b).
4. Lắp trụ chiết vào bình cầu (a).
5. Cho dung môi vào bình chiết ngập túi nguyên liệu
6. Lắp ống làm lạnh (c), ngâm nguyên liệu trong dung môi
7. Mở hệ thống Soxhlet
Sau khi kết thúc thí nghiệm, lấy túi nguyên liệu ra khỏi trụ chiết, cho dung môi bay
hơi và sấy túi nguyên liệu đến khối lượng không đổi, cân túi nguyên liệu.

4. Tính kết quả

Hàm lượng lipid có trong 100g mẫu nguyên liệu

(a-b) x 100
X=
c

Với: X: hàm lượng lipid (%)

a: khối lượng túi mẫu nguyên liệu trước khi chiết (g)
b: khối lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi chiết (g)
c: khối lượng nguyên liệu đem xác định (g)
 BÀI 4B. XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ ACID CỦA CHẤT BÉO

1. Nguyên tắc
Chỉ số acide của chất béo là số milligram KOH cần thiết để trung hoà hết những acid
béo tự do chứa trong 1g chất béo.
Dùng KOH 0,1N để trung hoà các acid béo tự do trong nguyên liệu với phenolphtlein
làm chất chỉ thị màu .

2. Hóa chất

− Ehanol 980 .
− Dung dịch KOH 0,1N chuẩn .
− Chỉ thị phenolphthalein 1%

3. Tiến hành

− Sử dụng erlen 250ml, cân khoảng 5g dầu ăn và thêm vào đó 50ml ethanol 980 để hoà tan
dầu ăn. Sau đó đun nhẹ ở 600C
− Chuẩn độ với KOH 0,1N, thêm 3 giọt chỉ thị phenolphthalein,
− Chuẩn độ đến khi dung dịch trong erlen có màu hồng nhạt bền trong 30 giây
− Làm lặp lại thí nghiệm 3 lần lấy thể tích trung bình

4. Tính kết quả

5, 61.V
Chỉ số Acid =
m
Với :
5,61 : số mg KOH ứng với 1ml KOH 0,1N
V : số ml KOH 0,1N dùng để chuẩn độ .
m : trọng lượng chất béo đã cân
 BÀI 4C. XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ IOD CỦA CHẤT BÉO

1. Nguyên tắc:
Chỉ số iod của chất béo là số gram iod kết hợp với 100 gram chất béo
Xác định chỉ số iod là dựa trên khả năng của iod kết hợp được với acid béo ở những liên
kết đôi, vì mỗi nối đôi của lipit sẽ cho phản ứng cộng với 2 nguyên tử của nhóm halogen.
Do đó, nếu cho chất béo tác dụng với một lượng thừa iod và xác định lượng thừa đó suy
ra chỉ số iod
Như vậy chỉ số iod xác định các acid béo không no trong chất béo

2. Nguyên liệu và hóa chất:

− Dầu ăn
− Cồn 96o
− Dung dịch I2 0,1N
− Dung dịch Na2S2O3 0,1N
− Dung dịch tinh bột 1%

3. Tiến hành
Lấy 4 erlen:
▪ Erlen 1 (mẫu trắng): 1ml nước cất
▪ Erlen 2, 3, 4 (mẫu nguyên liệu): 1→2g dầu ăn
− Thêm vào mỗi bình 10ml cồn 96o lắc đều, thêm 10ml I2 0,1N. Sau đó bịt kín erlen để
tránh bay hơi I2
− Để yên trong tối từ 10 – 15 phút, rồi sau đó chuẩn độ bằng Na2S2O3 0,1N đến khi dung
dịch có màu vàng nhạt
− Thêm vào mỗi bình 1ml dung dịch tinh bột 1% và tiếp tục chuẩn độ đến khi mất màu
xanh

4. Tính kết quả

Chỉ số iod:
( a − b).0,0127.100
Chỉ số I ot =
m
a: số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ mẫu trắng
b: số ml Na2S2O3 0,1N dùng chuẩn độ mẫu nguyên liệu
m: trọng lượng mẫu tính bằng gram
0,0127: số gram iod ứng với 1ml Na2S2O3 0,1N
 BÀI 5A. XÁC ĐỊNH SỰ HIỆN DIỆN CỦA AMINO ACID
BẰNG SẮC KÝ BẢN MỎNG

1. Nguyên tắc
Sắc ký lớp mỏng (thin layer chromatography - TLC) là một kĩ thuật sắc ký được dùng để
tách các chất trong hỗn hợp. Phương pháp sắc ký lớp mỏng bao gồm pha tĩnh là một lớp
mỏng các chất hấp phụ, thường là silica gel, aluminium oxit, hoặc cellulose được phủ trên
một mặt phẳng chất trơ. Pha động bao gồm dung dịch cần phân tích được hòa tan trong một
dung môi thích hợp và được hút lên bản sắc ký bởi mao dẫn, tách dung dịch thí nghiệm dựa
trên tính phân cực của các thành phần trong dung dịch.
Các amino acid có độ phân cực phân cực khác nhau sẽ tan trong các dung môi có độ
phân cực tương ứng trong pha động.
Vì các amino acid là những hợp chất không màu, nên ninhydrin thường được dùng để
làm chất chỉ thị phát hiện ra các amino acid đó, nhờ vào sự hình thành phức chất Ruhemann
màu tím xanh khi ninhydrin tác dụng với gốc amin.
Mỗi amino acid có một hệ số phân bố riêng giữa pha di động và pha tĩnh. Kết quả là
hỗn hợp amino acid được phân tích ra thành từng amino acid riêng biệt.
Trong những điều kiện nhất định (dung môi, nhiệt độ, loại bản mỏng sắc ký...) tốc độ
dịch chuyển của dung môi và các amino acid của hỗn hợp được đặc trưng bởi hệ số Rf
khoảng dịch chuyển của cấu tử
Rf =
khoảng dịch chuyển của dung môi

Khoảng dịch chuyển của

dung môi Khoảng dịch chuyển của
cấu tử
Ninhyrin phản ứng với amino acid:

2. Hóa chất

1. Hỗn hợp dung môi n-butanol : acid acetic : nước = 5:1:5

2. Dung dịch ninhydrin
3. Hỗn hợp amino acid
3. Tiến hành
Chuẩn bị bản mỏng sắc ký
- Dùng bút chì kẻ một đường nhạt cách đáy bản mỏng sắc ký 1,5cm (theo chiều
ngang)
- Dùng bút chì chia đường kẻ thành những đoạn bằng nhau, mỗi đoạn cách nhau
bằng một dấu chấm nhạt
Chấm sắc ký
 - Dùng ống mao quản lấy dung dịch amino acid và chấm vào các dấu chấm tương
ứng trên bản mỏng sắc ký. Để khô
- Rót dung môi sắc ký vào bình sắc ký
- Đặt bản mỏng sắc ký vào dung môi sao cho dung môi ở dưới đường kẻ viết chì
- Đậy kín bình sắc ký
- Khi dung môi di chuyển lên trên bản mỏng sắc ký đến cách bờ trên của bản mỏng
khoảng 1cm, lấy ra, đánh dấu mực dung môi bằng viết chì. Để khô
Xác định amino acid bằng thuốc thử
- Phun thuốc thử ninhydrin vào bản mỏng sắc ký. Sấy khô
- Dùng viết chì đánh dấu mỗi vệt xuất hiện
4. Kết quả
- Tính toán các giá trị Rf theo công thức ở trên.
- So sánh các thành phần trong mẫu với các amino acid có giá trị Rf chuẩn và xác
định các axit amin đã có mặt trong mẫu
 BÀI 5B. ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C

1. Nguyên tắc:
Để xác định hàm lượng vitamin C (acid ascorbic) trong nguyên liệu khi không có
chất màu sử dụng phương pháp chuẩn độ iod. Tất cả acid ascorbic bị oxy hoá bởi iod
, phần iod còn thừa sẽ cho màu xanh với dung dịch tinh bột
I2 + I-  I3 –
C6H8O6 + I 3 – + H2 O → C6H6O6 + 3I - + 2H +

2. Hóa chất:

− Dung dịch HCl 5%.

− Dung dịch I2 0,1N.
− Dung dịch tinh bột 1% .

3. Tiến hành

− Lấy m gram mẫu vào cối sứ giã, nghiền nhỏ. Cho 10ml HCl 5% vào bình định mức
loại 100ml, chuyển toàn bộ mẫu đã nghiền mịn vào bình định mức, thêm nước cất
đến 100ml.
− Lắc đều cho lượng axit ascorbic có trong nguyên liệu được hoà tan hoàn toàn, loại
bỏ cặn bằng cách lọc thu dung dịch mẫu nếu cần thiết.
− Hút lấy 20ml dung dịch mẫu cho vào erlen, thêm 1ml tinh bột 1%.
− Chuẩn độ bằng I2 0,1N cho đến khi dung dịch bắt đầu xuất hiện màu xanh. Ghi nhận
số ml dung dịch iode tiêu tốn.
− Lặp lại chuẩn độ 3 lần
4. Tính kết quả

Số mg Vitamin C trong 100g mẫu

8,8.a.V.100 8.8.a.V.100
mg% = %
v.m v.m.1000
Với: a : thể tích (ml) dung dịch iode 0,1N đã tiêu tốn (giá trị trung bình của 3 lần
chuẩn độ)
V : thể tích chung của dịch chiết (100ml).
v : thể tích dịch mẫu lấy để chuẩn độ (20ml).
m: khối lượng mẫu gốc (g)
8.8: hệ số, một ml dung dịch iot 0,1 N tương ứng với 8,8 mg acid ascorbic
 BÀI 6. ĐỊNH LƯỢNG POLYPHENOL BẰNG FOLIN-CIOCALTEU (F-C)

1. Nguyên tắc
Phương pháp định lượng tổng polyphenols bằng Folin-Ciocalteu (F-C) dựa vào
phản ứng của các hợp chất phenolic với thuốc thử Folin-Ciocalteu. Thuốc thử Folin-
Ciocalteu là một hỗn hợp của natri volframat và natri molybđat khi có mặt phenol sẽ
xảy ra phản ứng oxi hóa-khử, các nhóm –OH trong phenolic sẽ được chuyển thành
nhóm quinol tạo thành phức hợp có màu xanh được định lượng bằng mật độ quang ở
bước sóng 760 nm.
2. Hoá chất
Dung dịch chuẩn gallic acid chuẩn 0,2mg/ml.
Dung dịch Folin – Ciocalteu (1:10, v/v)
3. Tiến hành
Dựng đường chuẩn gallic acid (0 – 0.1 mg/ml)
Bảng 6. Đường chuẩn gallic acid
Ống nghiệm
Blank No.1 No.2 No.3 No.4 No.5
Hoá chất
Nồng độ gallic
0 20 40 60 80 100
acid (µg/ml)
H2O (µl) 500 450 400 350 300 250
Dung dịch gallic
acid 0.2 mg/ml 0 50 100 150 200 250
(µl)
Folin – Ciocalteu
2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
(1:10) (ml)
Lắc đều, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
Na2CO3 7.5%
2 2 2 2 2 2
(ml)
Để ở nhiệt độ phòng, trong tối 2 giờ
Đo OD 760nm
 - Vẽ đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ gallic acid và độ hấp thu OD
760nm.
Thực hiện phản ứng như trên đối với mẫu cần phân tích, cách làm như sau:

- Cho 0.5 ml mẫu (lặp lại 3 ống) và 2.5 ml thuốc thử Folin – Ciocalteu (pha loãng
1:10, v/v) vào ống nghiệm.
- Sau 5 phút, thêm 2 ml Na2CO3 (7.5% w/v)
- Để trong tối 2h để phản ứng
- Đo mật độ quang ở bước sóng 760 nm
4. Tính kết quả:
- Từ phương trình đồ thị đường chuẩn tính được a GA (µg/ml)
 BÀI 7. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA
BẰNG 1,1-DIPHENYL-2-PICRYLHYDRAZYL (DPPH)

1. Nguyên tắc

Phương pháp đánh giá khả năng bắt gốc tự do 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (,-
diphenyl--picrylhydrazyl; DPPH)

DPPH là một gốc tự do bền vững, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thu
tại bước sóng 517 nm. Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH
bằng cách cho hydrogen và làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung
dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Hoạt động kháng oxy hóa sẽ
được thể hiện qua việc đo độ giảm hấp thu ở bước sóng 517 nm.

Phản ứng trung hòa gốc tự do của DPPH

2. Hoá chất

- Dung dịch DPPH 0.2 mM trong methanol (Pha stock DPPH 1mM: 19.7 mg DPPH
trong 50 ml methanol).
- Vitamin C
3. Tiến hành
- Pha loãng mẫu dịch chiết thành các nồng độ khác nhau trong methanol (µg/ml)
- Đối chứng dương là ascorbic acid (vitamin C). Pha ascorbic acid (vitamin C) thành
các nồng độ khác nhau trong Methanol: 0, 2, 4, 6,8, 10 µg/ml
- Hút 1 mL dung dịch mẫu ở các nồng độ khác nhau cho vào từng ống nghiệm.
- Thêm 1 mL dung dịch DPPH 0.2mM vào mỗi ống.
- Ủ 30 phút trong tối ở nhiệt độ phòng.
- Đo mật độ quang ở bước sóng 517 nm.
- Mẫu trắng: 1 ml dung dịch mẫu và 1 ml methanol.
- Mẫu không: 1 ml methanol và 1 ml dung dịch DPPH 0.2mM
4.Tính kết quả

Khả năng trung hòa gốc tự do DPPH được xác định theo công thức:

Ac − (As − Ab)
S% = ( ) × 100%
Ac
Với:

+ As – mật độ quang của mẫu cần phân tích

+ Ab – mật độ quang của mẫu trắng
+ Ac – mật độ quang mẫu không, không có chất phân tích

Xác định IC50:

- Từ các kết quả tính được, vẽ đồ thị biểu thị độ tương quan giữa nồng độ dung dịch
mẫu và phần trăm ức chế.
- Phương trình y = ax + b, với y là phần trăm ức chế, x là log nồng độ.
- Thay y = 50% vào phương trình, tính ra được nồng độ có khả năng ức chế 50% gốc
tự do.