ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

BÁO CÁO

THÍ NGHIỆM HÓA HỌC VÀ HÓA SINH THỰC PHẨM

BÀI 6: ENZYME (8,5d)

LỚP: HC21TP
GVHD: CÔ NGUYỄN THỊ NGUYÊN
NHÓM: 02
SVTH: NGUYỄN ĐỨC HUY 2111320
TRẦN THỊ THANH MAI 2114018
ĐOÀN NGUYỄN THÙY LINH 2113898

TP Hồ Chí Minh, 2023

1
1. Thí nghiệm 1 – Xác định hoạt tính enzyme Amylase theo phương pháp
Wohlgemuth

1.1. Nguyên tắc

- Amylase là enzyme thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose, glucose.

- Phương pháp Wohlgemuth xác định hoạt tính enzyme amylase dựa vào việc tìm nồng độ
enzyme nhỏ nhất để thủy phân một lượng tinh bột xác định với những điều kiện xác định
đến các sản phẩm không đổi màu dung dịch I2 0,3% / KI 3%.

- Đơn vị đo hoạt độ Wohlgemuth là lượng enzyme cần thiết để thủy phân 1mg tinh bột sau
30 phút ở 37 0 C có C l −¿ ¿ làm chất hoạt hóa.

E. α amylase (Termamyl)
Tinh bột α dextrin + Maltose + Glucose
(ⅇndo ; lk 1,4; bất kì)
3-5 glucose

1.2. Dụng cụ - thiết bị

- Ống nghiệm ϕ 18, kẹp ống nghiệm

- Chén cân, muỗng cân, bình định mức 100mL

- Phễu lọc, giấy lọc, erlen 100mL

- Pipette 1mL

- Ống bóp, bình tia, giấy thấm

1.3. Nguyên liệu, hóa chất

- Malt hạt 10g

- Dung dịch tinh bột 0,5% (đã hồ hóa hoàn toàn)

- Dung dịch NaCl 0,5%

- Dung dịch H2SO4 10%

2
- Thuốc thử Liugon

1.4. Các bước tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị dịch chiết enzyme amylase

- Cân chính xác 10g malt hạt bằng cân 2 số lẻ, nghiền nhỏ bằng cối sau đó đem chuyển
vào bình định mức 100mL, định mức đến 100mL bằng nước cất và lắc thật kỹ.

- Ngâm malt trong 60 phút, thỉnh thoảng lắc đều dịch trong bình định mức.

- Lọc dịch qua 2 lớp giấy lọc mịn thu được dung dịch trong suốt chứa enzyme amylase
(nên bỏ qua khoảng 20 giọt dịch lọc ban đầu đến khi thu được dịch trong).

Hình 1: Malt hạt sau khi được ngâm 60 phút và chiết

Bước 2: Tiến hành khảo sát hoạt tính enzyme amylase

- Lấy 10 ống nghiệm ϕ 18 đánh số thứ tự từ 1 đến 10.

3
- Hút vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch NaCl 0,5%.

- Cho vào ống [1] 1ml dịch chiết enzyme trong bước 1 và lắc kĩ. Sau đó lấy 1ml từ ống
[1] cho vào ống [2] và lắc kỹ. Tiếp tục lấy 1ml từ ống [2] cho vào ống [3] và lắc kỹ. lặp
lại tương tự cho ống [3] đến ống [9]. Ở ống [10], sau khi thêm 1ml từ ống [9] thì hút ra
1ml bỏ đi.

Lưu ý: Pipette 1mL sau mỗi lần hút phải đảm bảo khô và sạch để tránh dẫn đến kết quả có
sai số lớn và kết quả sai.

- Cho tiếp vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch tinh bột 0,5%, lắc đều, để vào tủ sấy ở 37 °
C, thỉnh thoảng lại lắc đều để lôi kéo các hạt tinh bột bám ở thành ống nghiệm xuống. Sau
30 phút lấy ra, thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL H2SO4 10% (để làm bất hoạt enzyme) và 2
giọt thuốc thử Liugon, rồi lắc đều và quan sát sự thay đổi màu ở các ống nghiệm.

Bước 3: Ghi nhận lại kết quả và tiến hành nhận xét, tính toán.

1.5. Kết quả thí nghiệm và giải thích hiện tượng

- Kết quả

Hình 2: Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase

4
 STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Độ pha loãng (F) 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
Nồng độ enzyme n/2 n/4 n/8 n/16 n/32 n/64 n/128 n/256 n/512 n/1024
Màu dung dịch v v v v v c n t x x
Bảng 1: Kết quả thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme amylase

- Như vậy, ống (5) (có màu vàng sáng nhạt nhất) là ống có nồng độ enzyme bé nhất và
vừa đủ để thủy phân hoàn toàn lượng tinh bột (F=32).

- Giải thích:
+ Dựa trên kết quả thí nghiệm ta thấy: 5 ống nghiệm đầu có tinh bột được thủy phân hoàn
toàn, ống (6) thủy phân 1 nửa và ống (7) thủy phân một ít nên ta thấy màu nâu đậm, 3 ống
còn lại hầu như không được thủy phân.

+ Khi dịch chiết enzyme được pha loãng theo cấp số nhân (qua 10 ống nghiệm) thì đến
ống số (6) và ống (7) có màu cam và nâu là vì nồng độ enzyme còn lại ít không đủ để
thủy phân hoàn toàn tinh bột nên hai màu khác với 5 ống đầu. Còn 3 ống cuối có màu
xanh đen vì lượng enzyme hầu như không còn nên không thể thủy phân tinh bột.

- Tính kết quả:

- Nhớ bổ sung giải thích cthuc ở đây (giải thích đại lượng)

+ Lượng enzyme cho vào ống (1) được tính theo công thức:

m. V 1
n=
V2

Trong đó: V1 – Thể tích dịch chiết enzyme amylase cho vào ống nghiệm (1), mL

V2 – Thể tích dịch chiết enzyme amylase, mL

m −¿ Khối lượng malt dùng để trích chiết enzyme amylase, mg

+ Một đơn vị Wohlgemuth:

5
 n
W=
5. F

Trong đó: F – Độ pha loãng chọn từ bảng trên

+ Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 mL dịch chiết enzyme:

n
Nw=
V 1 .W

Số 5 nghĩa là gì?

W là gì? Khái niệm?

- Thay số liệu vào các công thức trên ta được:

+ Lượng enzyme cho vào ống nghiệm (1):
4
10 ×1
n= =100(mg)
100

+ Một đơn vị Wohlgemuth:

100
W= =0,625
5 ×32

+ Số đơn vị Wohlgemuth có trong 1 mL dịch chiết enzyme:

100
Nw= =160
1 ×0,625

1.6 . Nhận xét và biện luận

- Khi so sánh kết quả với các nhóm thí nghiệm (thuộc lớp thí nghiệm buổi sáng) khác về
màu sắc và đáp án cho phần tính toán, nhóm em nhận thấy có một số sai khác và nguyên
nhân như sau:

+ Cường độ màu sắc của dải màu giữa các nhóm có phần khác nhau:

6
 Hình 3. So sánh màu các ống giữa 2 nhóm

+ Đặc biệt, độ đậm nhạt (hoặc màu sắc) ở hai ống (4) và (5) có sự khác biệt dẫn đến kết
luận về F và tính toán các kết quả phía dưới cũng khác nhau:

7
Ống (5) nhạt màu hơn (4)
Ống (5) đậm màu hơn (4)

Hình 4. So sánh hai ống (4) và (5) về trường hợp đậm nhạt khác nhau

Ống (5) khác màu (4)

Hình 5. So sánh hai ống (4) và (5) về trường hợp màu khác nhau
8
+ Sự khác nhau này có thể do: 1mL enzyme cho vào ống (1) được lấy không chính xác,
không lắc đều các ống sau khi cho enzyme vào, quá trình lấy 1mL và chuyền sang các
ống khác có sự sai lệch, pipette đã dùng không được làm sạch kỹ sau mỗi thao tác, thời
điểm cho H2SO4 vào để chấm dứt hoạt tính enzyme có sự sai lệch (khiến lượng tinh bột bị
thủy phân khác nhu giữa các nhóm, dẫn đến màu khi cho liugon vào khác nhau),… Ngoài
ra, việc pha loãng Liugon để dễ quan sát màu sắc cũng là một nguyên nhân khiến cho dải
màu của một số nhóm có phần nhạt màu hơn (hình 3).

Bổ sung ý nghĩa của thí nghiệm (ứng dụng thực tiễn)

2. Thí nghiệm 2 – Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ và pH đến khả năng thủy phân
tinh bột của enzyme amylase

2.1. Nguyên tắc

- Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất protein, vì thế hoạt tính xúc tác của enzyme
bị giới hạn bởi những điều kiện phản ứng như nhiệt độ, pH nồng độ enzyme.

- Amylase là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột thành các loại dextrin, maltose
và glucose.

Trong hệ tiêu hóa, enzyme alpha amylase có trong nước bọt sẽ bắt đầu thủy phân tinh bột
đã hồ hóa trong thức ăn, và các amylase còn lại sẽ kết thúc quá trình thủy phân tạo thành
glucose thấm qua thành ruột.

- Mục đích của thí nghiệm là kiểm tra ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, nồng độ pH đến
khả năng thủy phân của enzyme amylase.

2.2. Dụng cụ - thiết bị

- Ống nghiệm ϕ 18, kẹp ống nghiệm

9
- Pipette 1mL, pipette 5mL

- Ống nhỏ giọt

- Tủ ấm

- Đĩa thủy tinh

2.3. Hóa chất

- Dung dịch tinh bột 1,0%

- Dung dịch glucose 0,5%

- Thuốc thử Liugon: 0,3% I2 / dd KI 3%

- Termamyl

- Dung dịch đệm pH 3.0 – 4.0 – 5.0 – 6.0 – 7.0

2.4. Cách tiến hành

1.Tạo ống màu mẫu

Đầu tiên cần tạo ống màu mẫu.

Lấy 2 ống nghiệm ghi số thứ tự.

Ở ống [1] cho 2mL dung dịch tinh bột 1,0% + 3 giọt thuốc thử Lugol

Ở ống [2] cho 2mL dung dịch glucose 0,5% +3 giọt thuốc thử Lugol

( Có thể pha loãng Liugon để dễ quan sát màu sắc hơn)

10
 Hình 6. Ống mẫu (1) bên trái, ống mẫu (2) bên phải

TN2.4.1. Kiểm tra ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme amylase

Bước 1: Lấy 2 ống nghiệm ϕ 18 và đánh dấu.

Bước 2: Hút vào mỗi ống nghiệm theo thứ tự: 5,5 mL dung dịch đệm pH=6,0 + 4 mL
dung dịch tinh bột 0,5% + 0,5 mL termamyl (tổng cộng 10 mL).

Bước 3: Cho 2 ống nghiệm vào môi trường nhiệt độ tương ứng (1)-50℃ và (2)-70℃ .

Bước 4: Kiểm tra kết quả: sau 15 phút phản ứng, lấy từ mỗi ống nghiệm 1 giọt mẫu, nhỏ
phân biệt trên đĩa thủy tinh, thêm một giọt thuốc thử Liugon và xem màu.

- Xác định thời gian thủy phân: Lấy mẫu định kỳ sau mỗi 3 phút, lấy từ mỗi ống nghiệm
một giọt mẫu, nhỏ phân biệt trên đĩa thủy tinh, thêm 1 giọt thuốc thử Liugon và xem màu.
Tiếp tục cho đến khi màu giọt mẫu giống ống màu mẫu số 2.

TN2.4.2. Kiểm tra ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme amylase

Bước 1: Lấy 4 ống nghiệm ϕ 18 và đánh dấu từ 3-6.

11
Bước 2: Hút vào mỗi ống nghiệm theo thứ tự: 5,5 mL dung dịch đệm + 4 mL dung dịch
tinh bột 0,5% + 0,5 mL termamyl (pH thí nghiệm: 3,0 – 4,0−¿5,0 – 6,0).

Bước 3:

- Kiểm tra kết quả: sau 15 phút phản ứng, lấy từ mỗi ống nghiệm 1 giọt mẫu, nhỏ phân
biệt trên đĩa petri, thêm một giọt thuốc thử Liugon và xem màu.

- Xác định thời gian thủy phân: Lấy mẫu định kỳ sau mỗi 3 phút, lấy từ mỗi ống nghiệm
một giọt mẫu, nhỏ phân biệt trên đĩa thủy tinh, thêm 1 giọt thuốc thử Liugon và xem màu.
Tiếp tục cho đến khi màu giọt mẫu giống ống màu mẫu số 2.

2.5. Kết quả thí nghiệm

- Màu của hai ống màu mẫu lần lượt là:

+ Ống (1) có màu xanh tím đặc trưng

+ Ống (2) có màu vàng nhạt của Liugon (có pha loãng)

Hình 7. Hai ống màu mẫu

- Kết quả thí nghiệm 2.4.1:

12
+ Sau 15 phút, nhóm dùng liugol (có pha loãng) nhỏ vào 2 giọt mẫu thì nhận được kết
quả là cả hai giọt đều có màu vàng nhạt giống ống mẫu (2).

Hình 8. Kết quả TN2.4.1 lần lượt từ trên xuống là 50° C và 70° C

- Kết quả thí nghiệm 2.4.2 :

+ Ở thí nghiệm này cả 4 ống nghiệm với pH thí nghiệm lần lượt là 3,0 – 4,0 −¿5,0 – 6,0
sau 15 phút (tại thời điểm 0) khi nhỏ dung dịch Liugon vào đều không xuất hiện màu tím
mà chỉ có vàng nhạt hoặc gần như trong suốt không màu. . Trong đó, màu của ống (5) và
(6) là khá giống với màu trong ống màu mẫu (2) chứng tỏ chỉ sau 15 phút, tinh bột trong 2
ống có pH=5 và 6 đã bị thủy phân hết. Sau hai lần thí nghiệm, màu của ống (5) và (6) có
sắc độ gần như tương đồng. Như vậy, pH tối ưu cho enzyme trong thí nghiệm này có khả
năng rơi vào pH=5 hoặc 6.

13
 pH=3
pH=3

pH=5
pH=5 pH=4
pH=4

pH=6
pH=6

Hình 9. Kết quả TN2.4.2 sau hai lần thí nghiệm

Hình 10. Màu của hai giọt mẫu từ ống có pH =5 và 6

2.6. Nhận xét và biện luận

Hai ống màu mẫu:

- Khi tạo màu ống mẫu, ống mẫu (1) (chứa dung dịch tinh bột 1%) chuyển sang màu xanh
tím đặc trưng và ống (2) (chứa dung dịch glucose 0,5%) có màu vàng. Giải thích cho hiện
tượng này:

+ Ống (1) chứa amylose là mạch không phân nhánh, cuộn xoắn theo kiểu lò xo và
amylopectin có dạng mạch phân nhánh. Khi cho thuốc thử Lugol (trong thành phần thuốc
thử có chứa Iodine) vào ống nghiệm (1) thì các phân tử amylose có trong thành phần tinh
14
bột sẽ hấp thu và giữ Iodine lại trong lòng xoắn tạo phức hợp Amylose – Iodine, phức hợp
này hấp thụ ánh sáng có bước sóng khác với Iodine có trong thuốc thử Lugol ban đầu. Vì
thế màu dung dịch ống (1) chuyển sang màu xanh tím.

+ Ống (2) chứa dung dịch glucose 0,5% là monosaccharide, không có cấu trúc mạch vòng
nên không thể tạo được phức hợp với Iodine có trong thuốc thử Lugol. Chính vì thế, màu
ở ống nghiệm (2) có màu vàng nhạt và cũng chính là màu của thuốc thử Lugol (có pha
loãng).

TN2.4.1

*) So sánh với kết quả nhóm khác:

- Bên cạnh các nhóm cho ra hai giọt mẫu đều có màu vàng nhạt (sau 15 phút), có nhóm
thí nghiệm thu được kết quả khả quan hơn, cụ thể như sau:

- Theo kết quả nhóm này nhận được, sau 24 phút màu mẫu thử ống nghiệm (1)- 50oC và
sau 27 phút màu mẫu thử ống nghiệm (2)-70oC có màu vàng giống ống mẫu [2]. Từ đó,
nhóm này đưa ra kết luận rằng nhiệt độ tối ưu của enzyme amylase là 50oC.

*) So sánh với các tài liệu tham khảo khác

15
- Theo thông tin nhóm tìm hiểu được, nhiệt độ tối ưu cho enzyme α −amylase là 85 –
97oC1. Có thể hoạt động ngay ở 95 – 97oC và duy trì hoạt lực cao ở 100oC.2 Một nguồn
tham khảo khác cho rằng: nhiệt tối ưu của α −amylase phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme,
thường nằm trong khoảng 40 – 500C.3

- Như vậy, dù so sánh với nguồn thông tin nào thì kết quả mà nhóm chúng em nhận được
đều không chính xác vì thí nghiệm không thành công và không thể đưa ra đáp án cuối
cùng được. Các lí do cho kết quả thí nghiệm bất lợi có thể là :

+ Khoảng nhiệt độ tối ưu của amylase là khá rộng (10 đến 70 0C)4, tùy vào nguồn enzyme,
có thể khoảng nhiệt độ trong thí nghiệm ( 500C và 700C) là chưa đủ để thể hiện rõ ràng sự
khác biệt.

+ Sự sai sót trong các thao tác trung gian như: thời gian để mẫu trong tủ sấy quá lâu (hoặc
thời gian khi thực hiện quá lâu) khiến tinh bột bị thủy phân hết và khó quan sát kết quả
cho các lần nhỏ định kỳ 3 phút, khi lấy các giọt mẫu bằng pipette nhựa lên đĩa thủy tinh
đã không làm sạch pipette,…

TN2.4.2

*) So sánh với các nhóm thí nghiệm khác

- Khi so sánh với nhóm lấy mẫu termamyl được chuẩn bị sẵn trong phòng thí nghiệm có
thể thấy, màu của 4 giọt mẫu mà các nhóm khác nhận được ngay sau 15 phút là tương
đồng nhau – khác với kết quả mà nhóm em nhận được ( màu của ống có pH=5 và 6 có
phần nổi bật hơn).

1
“Enzyme amylase”, https://aquavet.vn/enzyme-amylase.html, truy cập ngày 28/3/2023.
2
“Amylase: Thủy phân tinh bột ngành đường”, https://www.mdi.vn/chi-tiet-san-pham/enzyme/amylase:-thuy-phan-
tinh-bot-nganh-duong-p761.html, truy cập ngày 28/3/2023.
3
“Tính chất của enzyme amylase”, https://123docz.net/trich-doan/542098-tinh-chat-cua-enzyme-amylase.htm, truy
cập ngày 28/3/2023.
4
“Characterization of an a-Amylase with Broad Temperature Activity from an Acid-Neutralizing Bacillus cereus
Strain” (2010), http://www.ijbiotech.com/article_7096.html, truy cập ngày 28/3/2023.
16
- So sánh với nhóm khác làm thí nghiệm với dịch chiết của malt đại mạch:

1 2

4
3

Theo các thông tin có được từ nhóm thí nghiệm khác, khi sử dụng nguồn enzyme chiết từ
malt đại mạch thì ngay 3 phút đầu tiên đã có sự chênh lệch rõ rệch về màu sắc: ống (1) có
màu tím than (2) màu vàng đậm, ống (3) có màu vàng nhạt hơn (tương tự như ống chuẩn
số 2) và ống (4) có màu cam đậm và sau 15 phút thí nghiệm thì màu sắc các ống dần
giống với màu ống chuẩn. Từ kết quả như vậy ta có thể kết luận pH tối ưu của enzyme
theo nhóm này là ống (3) (có pH=5). Kết quả này tương đồng với kết quả mà nhóm em
17
nhận được, tuy vậy, các giọt mẫu từ 4 ống nghiệm lại không có hiện tượng đổi màu rõ rệt
như trong hình của nhóm bạn.

*) So sánh với các tài liệu tham khảo khác

- Theo thông tin có được, pH tối ưu của α −amylase phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và
thường nằm trong khoảng axit yếu 4,8-6,9. Cụ thể hơn là khoảng pH: 5,8 – 6,5.5

- Như vậy, sau khi so sánh với các nhóm khác và với tài liệu tham khảo từ internet, kết
quả mà nhóm em nhận được (pH tối ưu là 5 hoặc 6) là khá trùng khớp. Tuy vậy, khi pH<
4.5 thì amylase có thể bị bất hoạt do môi trường axit, tức là ống (3) và (4) sẽ không thủy
phân tinh bột và cho ra màu xanh tím với Lugon, trong khi đó nhóm em lại cho ra ống (3)
và (4) là không màu. Sự sai khác này có thể là do thao tác trung gian của các nhóm bị sai
sót: khi lấy pH (hoặc tinh bột, enzyme) cho vào ống nghiệm đã lấy lượng không chính
xác, khi lấy các giọt mẫu ra đĩa bằng pipette nhựa đã không làm sạch kỹ pipette,…

- Ý nghĩa:

+ Enzyme là chất xúc tác sinh học có khả năng thúc đẩy nhanh các phản ứng hóa học và
là những công cụ sinh học để nâng cao chất lượng thực phẩm, hoạt động chế biến thực
phẩm và nhiều lĩnh vực khác. Việc khảo sát và tìm ra khoảng nhiệt độ và pH tối ưu cũng
như các yếu tố môi trường khác đến ezyme sẽ giúp cho việc ứng dụng enzyme được hiệu
quả hơn.

+ Trong đó, enzyme amylase được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực đời sống đặc biệt là
trong công nghệ thực phẩm. Việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng hoạt
động của amylase là vô cùng quan trọng để ứng dụng chúng vào công nghệ quy trình sản
xuất chế biến các sản phẩm thực phẩm (như bánh kẹo, bia, đồ hộp, v.v..).

3. Thí nghiệm 3 – Tính đặc hiệu của enzyme

3.1. Nguyên tắc

- Tính đặc hiệu của enzyme thể hiện khả năng lựaxcz chọn xúc tác chuyển hóa một hay
một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định tùy vào cấu tạo của TTHĐ, chẳng
5
“Enzyme amylase”, https://aquavet.vn/enzyme-amylase.html, truy cập ngày 28/3/2023.
18
hạn ở thí nghiệm này enzyme amylase chỉ thủy phân tinh bột, enzyme invertase chỉ thủy
phân saccharose.

Chỗ này bị thiếu cái điều kiện mtr acid (thủy phần saccarose, trừ 0,5d)

3.2. Dụng cụ - thiết bị

- Ống nghiệm

- Pipette 10mL

- Tủ ấm

- Nồi cách thủy

- Bếp điện

3.3. Hóa chất

- Dung dịch enzyme amylase, enzyme invertase

- Thuốc thử Liugon, hồ tinh bột 1%, saccharose 5%

- Thuốc thử Fehling

3.4. Cách tiến hành

Bước 1: Chuẩn bị 4 ống nghiệm, ống (1) và (2) cho 5 mL dung dịch saccharose 5%, ống
(3) và (4) cho 5 mL dung dịch hồ tinh bột 1%.

19
Bước 2: Thêm tiếp vào ống (1) và (3) mỗi ống 1 mL dung dịch enzyme invertase, ống (2)
và (4) mỗi ống 1mL dung dịch enzyme amylase, lắc đều và để vào tủ ấm ở 37 ℃ trong 15
phút.

Bước 3: Lấy ống nghiệm ra khỏi tủ, cho vào ống (1) và ống (2) mỗi ống 5 mL dung dịch
Fehling và đặt vào bể điều nhiệt đang sôi trong 2 phút thì lấy ống nghiệm ra, làm nguội
tới nhiệt độ phòng. Cho vào ống (3) và (4) mỗi ống 2 giọt thuốc thử Liugon.

Hình 11. Quá trình phản ứng với thuốc thử Fehling

3.5. Kết quả thí nghiệm

20
 1 2 3 4

Hình 12: Kết quả thí nghiệm tính đặc hiệu của enzyme

- Ống (1) có xuất hiện kết tủa màu nâu đỏ, ống (2) là dung dịch màu xanh làm và có một
ít kết tủa đỏ lắng ở dưới. Ống (3) chỉ có màu vàng rất nhạt. Ống (4) lại có màu tím nhạt.

3.6. Giải thích hiện tượng và biện luận:

- Để nhận biết xem ống nghiệm chứa mẫu nào được thủy phân, ta dùng hai thuốc thử là
Fehling và Liugon theo cơ chế:

+ Thuốc thử Fehling phản ứng với đường khử hình thành kết tủa Cu2O có màu đỏ gạch:

RCHO + 2Cu2+ → RCOO- + Cu2O↓ + 3H2O

+ Thuốc thử Liugon khi có mặt tinh bột sẽ cho ra dung dịch có màu xanh đặc trưng vì
Amilose trong tinh bột có khả năng tương tác tạo phức với tinh bột, hình thành cấu trúc
xoắn giữ các phân tử iod ở giữa (trong hồ tinh bột ở nhiệt độ thường, phân tử tinh bột tồn
tại dưới dạng các chuỗi xoắn, cứ 6 phân tử glucose lập thành 1 bước xoắn có thể hấp phụ
1 phân tử Lugol làm cho dung dịch có màu).

- Ở ống (1), kết tủa nâu đỏ xuất hiện chính là Cu 2O. Điều này chứng tỏ enzyme invertase
đã xúc tác cho phản ứng thủy phân saccharose thành glucose và fructose :

21
 E. invertase , 37° C
Saccharose Glucose + Fructose

RCHO + 2Cu2+ → RCOO- + Cu2O↓ + 3H2O

(RCHO ở đây là glucose và fructose)
+ Ở ống nghiệm (2), dung dịch có màu xanh lam của ion Cu 2+ có trong thuốc thử Fehling.
Như vậy ở ống nghiệm này, termamyl đã không xúc tác cho phản ứng thủy phân
saccharose và dẫn đến việc Fehling không tạo kết tủa màu nâu đỏ với đường khử như ống
(1).

Ngoài ra, khi quan sát ống nghiệm (2) của các nhóm lại thấy có một ít kết tủa nâu đỏ hình
thành ở đáy ống nghiệm (với lượng ít nhiều tùy nhóm). Điều này có thể là do hóa chất
không tinh khiết hoặc nhiệt độ quá cao dẫn đến việc thủy phân một phần saccharose tạo
thành glucose và fructose, hoặc trong quá trình lấy enzyme bị lẫn vào các ống. (SAI)

- Giải thích: lẫn hóa chất

Kết tủa nâu đỏ

Kết tủa nâu đỏ

Hình 13. Kết tủa xuất hiện trong ống (2)

22
+ Dung dịch trong ống (3) chuyển sang vàng nhạt chứng tỏ không có sự hiện diện của
tinh bột trong ống này. Còn ống (4) có dung dịch màu tím nhạt, đây có thể là màu sắc khi
tinh bột phản ứng với thuốc thử Liugon (với lượng không lớn vì phần lớn tinh bột đã bị
thủy phân).

- Khi so sánh với các tài liệu tham khảo trên internet có thể thấy, hiện tượng xảy ra trong
2 ống (1) và (2) là chính xác (về ống (2) có chút sai khác và đã được giải thích ở trên):

Hình 14. So sánh màu sắc của nhóm (phải) với kết quả từ tài liệu tham khảo (trái)
(Hình ảnh từ trang web: www.quora.com)
- Thí nghiệm trên với mục đích chứng minh cho tính đặc hiệu của các loại enzyme. Hiện
tượng sinh ra ở hai ống (1) và (2) nhằm kiểm chứng cho tính chất của enzyme invertase
và tương tự, ống (3) (4) sẽ thực nghiệm cho enzyme amylase.

- Trong khi các hiện tượng xảy ra ở 2 ống nghiệm đầu tiên là chính xác với những lý
thuyết về enzyme thì ống (3) và (4) theo kết quả mà nhóm nhận được (cũng như khi so

23
sánh với các nhóm khác) lại không đúng về mặt lý thuyết. Cụ thể, màu sắc trong ống (3)
và (4) của phần lớn nhóm (bao gồm nhóm em) lần lượt là vàng nhạt và tím nhạt ( hoặc
tím đen nhạt):

Hình 14. Hai ống (3) và (4)( từ trái sang) của một số nhóm

+ Về ống (3), enzyme invertase chỉ xúc tác chuyển hóa Saccharose chứ không thủy phân
tinh bột. Nếu cho thuốc thử Liugon vào, dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh đặc trưng.
Ống (3) có màu vàng nhạt như hình có thể là do: trong quá trình thực hiện nhóm đã dùng
sai hóa chất hoặc các quy trình trung gian có sai sót.

+ Trong khi đó, ống (4) có chứa tinh bột và enzyme α −¿ amylase, theo lý thuyết thì
enzyme này sẽ xúc tác thủy phân tinh bột trong ống và kết quả cho ra sau khi nhỏ Liugon
vào là ống nghiệm có màu vàng nhạt. Màu trong ống (4) bị chuyển sang tím/tím đen nhạt
như hình có thể do: còn lượng tinh bột bị dính lên thành ống, lượng tinh bột chưa bị thủy
phân hoàn toàn bởi enzyme (với nhiệt độ từ 30 - 50 oC, tinh bột có bị thủy phân nhưng
không phải là hoàn toàn),…

+ Còn có một cách khác để lí giải cho hiện tượng của ống (3). Màu sắc khi nhỏ Lugol vào
dung dịch có tinh bột còn phụ thuộc vào cấu trúc chiều dài phân tử của các thành phần

24
trong tinh bột6 (ví dụ như: amilose hoặc amilopectin có M>500 000 khi kết hợp với Iod
cho ra màu xanh dương, maltodextrin (M=1000) cho màu vàng, …). Tuy nhiên, cách giải
thích này lại không hợp lí cho trường hợp của ống (4). Tóm lại, nhóm em vẫn chưa tìm ra
lập luận thật sự thỏa đáng nào để lí giải cho cả hai hiện tượng của hai ống (3) và (4) ngoài
các ý kiến như trên.

Ví dụ t ghi ở trên không tìm thấy trên mạng, t ghi theo cô giảng

3.7. Ý nghĩa

- Thí nghiệm đã dùng hai thuốc thử là Fehling và Liugon để nhận biết khi enzyme
invertase và termamyl xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột và saccharose. Từ đó kết
luận rằng enzyme có khả năng lựa chọn xúc tác chuyển hóa một hay một số chất nhất
định theo một kiểu phản ứng nhất định.

- Việc tìm ra tính đặc hiệu của enzyme là rất quan trọng trong việc ứng dụng enzyme để
xúc tác thủy phân các chất sao cho hiệu quả và thích hợp ( ví dụ khi biết được đặc tính
này, người ta dùng enzyme amylase trong sản xuất bia và rượu để giúp phân hủy tinh bột
thành glucose và maltose, tạo ra độ ngọt và hương vị đặc trưng cho sản phẩm; hoặc
Invertase được dùng để xúc tác phản ứng thủy phân liên kết glycoside có trong saccharose
để tạo thành D-glucose và D-fructose - một quy trình rất quan trọng trong công nghệ thực
phẩm để tạo ra một hỗn hợp gọi là sirup đường nghịch đảo7).

6
“Iodine Test- Definition, Principle, Procedure, Result, Uses” (2022), https://microbenotes.com/iodine-test/, truy cập
ngày 28/3/2023.
7
“Đề tài enzyme invertase” , https://timtailieu.vn/tai-lieu/de-tai-enzyme-invertase-46263/, truy cập ngày 28/3/2023.
25