SLOBODNI

RADIKALI
mehanizam nastanka

antioksidativni sistem zatite

dejstvo slobodnih radikala na

makromolekule
Ass dr Ivanka Zelen
 SLOBODNI RADIKALI

slobodni radikal je svaki atom, grupa

atoma ili molekul sa jednim ili vie
nesparenih elektrona u spoljanjoj
orbitali

nespareni elektron u slobodnim

radikalima obeleava se takom na
sredini iza oznake radikala: OH
ELEKTRONSKA KONFIGURACIJA
KISEONIKA

na osmom mestu u
periodnom sistemu
elemenata
elektronska
konfiguracija 1s2 2s2
2p4
dva nesparena
elekrona u poslednjoj
orbitali
biradikal
SAMO ZA PODSEANJE

ELEKTRON
SPIN
ORBITALE
KOVALENTNA VEZA
OKSIDACIJA
REDUKCIJA
 KISEONIKI SLOBODNI
RADIKALI
intermedijerni produkti nepotpune
redukcije kiseonika u eliji

udahnemo 250 g kiseonika dnevno, od

toga se 2 do 5% prevede u toksini
superoksid anjon radikal

termodinamska barijera za inverziju

spina elektrona prilikom redukcije
kiseonika
 KISEONIKI SLOBODNI
RADIKALI
superoksid anjon radikal ( O2 -)
vodonik-peroksid ( H2O2 )
hidroksilni radikal ( OH )
"singletni" kiseonik
 SUPEROKSID ANJON
RADIKAL
nastaje jednoelektronskom redukcijom molekularnog
kiseonika u mitohondrijama, peroksizomima i EPR
(O2) ili
jednoelektronskom oksidacijom vodonik peroksida
(protonizovana forma: hidroperoksidni radikal HO2)
ponaa kao umereno redukujue sredstvo (redukuje
hinone (Co Q) i citohrom c)
ree se ponaa kao oksidujue sredstvo (oksiduje
vitamin E i C, kateholamine, tiole i hemoproteine ali
ne i nezasiene masne kiseline)
 SUPEROKSID ANJON
RADIKAL
u prisustvu slobodnih jona metala sa
promenljivom valencom pretvara se u
hidroksilni radikal u Haber Weiss - ovoj
reakciji
O2 + H2O2 O2 + OH + OH
u fiziolokim uslovima uklanja ga SOD
prevoenjem u vodonik peroksid
mogua je i spontana, neenzimska
dizmutacija
PRODUKCIJA SUPEROKSIDA NA
RESPIRATORNOM LANCU
PRODUKCIJA SUPEROKSIDA NA
RESPIRATORNOM LANCU
redukovani Co Q u
mitohondrijalnom lancu
za transport elektrona je
glavni izvor KSR

akcidentalna
nespecifina reakcija
izmeu Co QH i
molekulskog kiseonika
dovodi do nastanka
superoksida
 VODONIK PEROKSID
nije pravi radikal, nema nesparene elektrone
nastaje direktnom dvoelektronskom redukcijom
O2
2H+ + O2 + e + e H2O2
jednoelektronskom redukcijom superoksid anjon
radikala
O2 + e- + 2H+ H2O2
enzimskom dizmutacijom dejstvom SOD
O2 + O2 + 2H+ H2O2
nepolaran, lipososubilan, lako prolazi membrane
stabilan, relativno dug poluivot
nastaje na nivou peroksizoma, mitohondrija,
mikrozoma i elijske membrane
 VODONIK PEROKSID
pokazuje vrlo toksine efekte uz diskriminaciju prema ciljnim
biomolekulima

izaziva oteenje DNK, elijske membrane i mobilisanje Ca2+ iz

elijskih depoa, utie na proces oksidativne fosforilacije
Haber Weiss- ova reakcija
O2 + H2O2 O2 + OH + OH

Fenton-ova reakcija
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + OH + OH
uklanja se aktivnou katalaze i peroksidaza koje razlau H2O2,
ali i aktivnou SOD koja onemoguava Haber Weiss-ovu
reakciju
 HIDROKSILNI RADIKAL
produkt nepotpune redukcije
molekularnog kiseonika sa tri elektrona
nastaje i iz superoksid anjon radikala
(Haber-Weiss-ova reakcija) i iz vodonik
peroksida (Fenton-ova reakcija)
Fenton ova reakcija: znaajno je
prisustvo slobodnih jona metala sa
promenljivom valencom Fe3+ i Cu2+
gvoe koje je vezano u vidu
transferina, laktoferina, feritina, feri
enzima i drugih HEM proteina ne moe
da uestvuje u Fenton-ovoj reakciji
 HIDROKSILNI RADIKAL
bez ikakve diskriminacije reaguje sa
svim biolokim makromolekulima

mogua su tri tipa reakcija:

- transfer elektrona

- oduzimanje vodonika

- adicija
 POLUIVOT REAKTIVNIH
METABOLITA
vreme
simbol ime
poluivota
O2 superoksid anjon 10 20 sec
HO2 radikal 7 sec
radikali OH hidroperoksidni 10-9 sec
RO radikal 10-6 sec
ROO hidroksilni radikal 7 sec
NO alkoksil radikal 5 sec
peroksil radikal
NO radikal
H2O2 vodonik peroksid stabilan
neradika ROOH hidroperoksid stabilan
 SUDBINA KSR U ELIJI

reakcija sa neradikalima; reakcija po tipu

radikali raaju radikale reakcija lipidne
peroksidacije nezasienih masnih kiselina

reakcija sa radikalima; funkcija vitamina E u

procesu terminacije lipidne peroksidacije

reakcija sa radikalima; nastanak jo

toksinijeg produkta (peroksinitrit radikala)
 MESTA PRODUKCIJE KSR U
FIZIOLOKIM USLOVIMA
oksidativna fosforilacija u mitohondrijama
oksidativna hidroksilacija u mikrozomima
autooksidacija malih molekula
fagocitoza
sinteza eikosanoida
kao produkti katalitikih reakcija enzima
lipidna peroksidacija nezasienih masnih
kiselina
u toku reakcije oksido-redukcije u prisustvu
metala sa promenljivom valencom
 IZVORI RADIKALA -
FIZIOLOKI
2
IZVORI -O H2O2 ROOH
Fizioloki izvori
autooksidacije mitohondrijalnih nosilaca elektrona V
superoksid dizmutaza ( Cu/Zn_, Mn-zavisna ) V
monoamino oksidaza (Cu-zavisna) N
monoamino oksidaza (flavin-zavisna) N
ostale flavin-zavisne monooksigenaze N
citohrom P450-monooksigenaze N S
lipooksigenaze (ne-hem Fe-zavisne) S
ciklooksigenaze S
NADPH-oksidaze VV
mijeloperoksidaze (hem-Fe) (ClO-)
peroksizomi VV V
Oznake : N nisko, S srednje, V visoko, V V vrlo visoko, I V izuzetno visoko
 IZVORI RADIKALA -
NEFIZIOLOKI
IZVORI -O
2 H2O2 ROOH
Nefizioloki izvori
ishemija, anoksija S N N
hiperoksija S S S
indukcija ksantin oksidaze V V

postishemina reperfuzija VV VV V
preoptereenje gvoem S V V
aktivirani leukociti VV V

redoks ciklusi (ksenobiotici) VV V V

radijacija IV

Oznake : N nisko, S srednje, V visoko, V V vrlo visoko, I V izuzetno visoko

RESPIRATORNI LANAC

do oticanja radikala sa
respiratornog lanca
moe da doe samo na
nivou kompleksa I tj,
NADH-CoQ-reduktaze i
koenzima Q
u uslovima teke
ishemije
kad postoji nedostatak
kiseonika kao krajnjeg
akceptora elektrona
RESPIRATORNI LANAC
 MIKROZOMALNI SISTEM
CITOHROMA P450
NADPH-cyt P450 reduktaza je
svojim hidrofobnim repom
vezana za membranu
endoplazmatinog retikuluma
sadri i FAD i FMN kao
prostetinu grupu
citohrom P450 je duboko
umetnut u membranu
u elijama jetre, bubrega,
respiratornog sistema

citohrom b5 moe da uestvuje u

nekim reakcijama sistema
citohroma P450
MIKROZOMALNI SISTEM
CITOHROMA P450
redosled reakcija na
citohromu P450 :
vezivanje supstrata
transfer prvog i drugog
elektrona sa NADPH-
citohrom P450 reduktaze i
vezivanje kiseonika na
supstrat

jedinjenja koja lako ulaze u

redoks ciklus elije:
herbicid parakvat
ugljen tetrahlorid
antikancerogeni antibiotici
hinonske prirode
kateholamini
 MIKROZOMALNI SISTEM
CITOHROMA P450

izoaloksazinski prsten FMN ili FAD u svom

oksidovanom, semihinonskom (jednoelektronski
redukovanom obliku) i potpuno redukovan
(redukovan sa dva elektrona)
 MITOHONDRIJALNI SISTEM
CITOHROMA P450
NADPH- adrenodoksin
reduktaza slabo je
asocirana za
unutranju membranu
mitohondrija
ima samo FAD kao
prostetinu grupu
ne moe direktno da
preda elektrone hem-
Fe u cyt P450
adrenodoksin prenosi
elektrone sa reduktaze
na mitohondrijalni cyt
P450
redoks centar je Fe2S2
grupa
 NASTANAK KSR KOD
FAGOCITNIH ELIJA
aktivacijom NADPH
oksidaze nastaje
superoksid radikal
njegovom dizmutacijom
nastaje vodonik peroksid
lizozomalna
mijeloperoksidaza stvara
hipohlornu kiselinu i
hidroksil radikal
sve ovo vodi do lize
bakterijske elije
traje 30 do 60 minuta uz
veliki utroak kiseonika
 NASTANAK KSR TOKOM
SINTEZE EIKOSANOIDA
nastaju delovanjem
ciklooksigenaze,
lipoksigenaze i
citohroma P450
istovremeno nastaju i
KSR
metabolika kaskada
arahidonske kiseline je
enzimski kontrolisan
proces produkcije
radikala
NASTANAK KSR TOKOM
SINTEZE EIKOSANOIDA
membranska
arahidonska kiselina
oslobaa se iz
fosfolipida aktivacijom
membranske fosfolipaze
A2 ili fosfolipaze C
fosfolipaza A2 je
specifina za drugu
poziciju fosfoacilglicerola
fosfolipaza C iz inozitol-
glicerofosfolipida izdvaja
DAG i arahidonsku
kiselinu
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA
ANTIOKSIDANTI supstance koje prisutne u maloj
koliini u odnosu na koliinu supstrata, mogu odloiti
ili spreiti oksidaciju supstrata
prvi nivo zatite sistemi koji u potpunosti spreavaju
endogeno stvaranje radikala
drugi nivo odbrane sistemi koji deluju u uslovima
normalnog i pojaanog nastanka radikala
enzimski i neenzimski antioksidansi
hidrosolubilni i liposolubilni antioksidansi
elijski i vanelijski antioksidansi
trei nivo zatite enzimski sistemi koji uestvuju u
reparaciji oksidativnih oteenja makromolekula
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA

mehanizam dejstva :
- smanjenjem lokalne koncentracije kiseonika
- spreavanjem nastanka slobodnih radikala
- vezivanjem metalnih jona
- razlaganjem peroksida
- prekidanjem lanca stvaranja novih radikala
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA

enzimi prve linije odbrane od KSR :

superoksid dizmutaza (SOD)
katalaza (CAT)
glutation peroksidaza (GSH-Px)
 ENZIMSKI ANTIOKSIDANSI
Antioksidans Osobine
Enzimski
superoksid dizmutaze Mn- ili Cu/Zn-zavisne; citosolne ili mitohondrijske; inaktiviu -
O2
glutation peroksidaze Se-zavisne, ne-Se-enzimi (neke glutation S-transferaze);
citosolne, mitohondrijske; inaktiviu perokside
katalaza hem-enzim; peroksizomi; inaktivie perokside
Pomoni enzimi
glutation reduktaza prevodi GSSG u GSH
NADPH-hinon verovatno ukljuena u produkciju KSR kod infertilnih
okidoreduktaza mukaraca
(DT-dijaforaza)
hidroksilaza epoksida
enzimi konjugacije UDP - glukuroniltransferaza
sulfonil transferaza
glutation S-transferaze
donori NADPH dehidrogenaza glukozo-6-fosfata
dehidrogenaza 6-fosfoglukonata
dehidrogenaza izocitrata
transhidrogenaze
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA
SUPEROKSID DIZMUTAZA
E.C. 1. 15. 1. 1.
reakcija dizmutacije superoksida :
2H+ + O2 + O2 H2O2 + O2
identifikovana su tri izoenzima SOD
citosolna Cu- Zn-SOD - dimer
mitohondrijalna Mn-SOD - tetramer
ekstracelularna EC SOD
tetramerni
glikoprotein
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA
KATALAZA E.C. 1. 11. 1. 6.
ubrzava razlaganje vodonik peroksida
kataliui dve vrste reakcija: katalaznu i
peroksidaznu
CAT + H2O2 CAT-H2O2 (kompleks I)
CAT-H2O2 + H2O2 CAT + 2H2O + O2
tetramer, svaka subjedinica sadri hem-
grupu koja ulazi u aktivni centar enzima,
aktivno mesto svake subjedinice
stabilizovano sa vrsto vezanim NADPH
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA
KATALAZA E.C. 1. 11. 1. 6.
aktivna pri povienoj koncentraciji vodonik
peroksida (ima vei Km od peroksidaze)
belei se izraena aktivnost katalaze u jetri,
bubrezima i Er
sintetie se u ribozomima, prenosi do
peroksizoma, gde postoji u dva oblika:
- solubilna
- vezana za membrane peroksizoma
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA
GLUTATION PEROKSIDAZA
E.C. 1. 11. 1. 9.
razlae vodonik peroksid, organske hidroperokside i lipidne
perokside uz oksidaciju glutationa kao kosupstrata
prisutne su u citosolu (92%) i matriksu mitohondrija
prema prisustvu seleno-cisteinske rezidue u aktivnom
centru GSH-Px se dele na:
- seleno - zavisne i
- seleno - nezavisne GSH-Px su izoenzimi glutation-S-
transferaza (ne deluju na H2O2)
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA
GLUTATION PEROKSIDAZA
E.C. 1. 11. 1. 9.
do sada su identifikovane etiri forme
humanih seleno-zavisnih GSH-Px:
klasina Se zavisna GSH-Px (tetramer)
fosfolipid hidroperoksid GSH- Px
(monomer)
plazmatska Se zavisna GSH-Px
(tetramer, glikozilirana)
gastrointestinalna Se zavisna GSH-Px
(tetramer)
 NEENZIMSKI ANTIOKSIDANSI
Antioksidans Osobine

Neezimski
-tokoferol (vitamin liposolubilan; membranski; prekida reakcije radikala
E)
-karoten liposolubilan; hvata singlet kiseonika

askorbinska kis. (vit. hidrosolubilna; citosolna; regenerie -tokoferol; prekida

C) reakcije radikala
glutation (GSH) hidrosolubilan; razliite antioksidantne funkcije

mokrana kiselina plazma; sakuplja radikala

albumin plazma; vezuje jone Fe i Cu

ceruloplazmin plazma; vezuje jone Cu

transferin plazma; vezuje slobodno gvoe

haptoglobin plazma; vezuje slobodni hemoglobin
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA
GLUTATION ( GSH )
najznaajnije neproteinsko
niskomolekularno tiol jedinjenje
u elijama prisutan u milimolarnim
koncentracijama
u elijama ima brojne uloge; veoma je
znaajan u antioksidativnoj zatiti
redukovana forma je kofaktor GSH-Px i
glutation-S-transferaza
reaguje sa -tokoferil radikalom i
regenerie -tokoferol
ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA
ALFA - TOKOFEROL I ALFA -
TOKOTRIENOL VITAMIN
E

prirodni membranski
antioksidansi
liposolubilni
prekida propagaciju lanane
reakcije peroksidacije
membranskih lipida
tokoferil radikal vrlo brzo postie
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA

KAROTENOIDI; BETA KAROTEN; VITAMIN A

ima ga mnogo manje od tokoferola

rastvorljiviji je od tokoferola; prua bolju zatitu
hidrofobnim delovima elije; deluje pri niskom pritisku
kiseonika
fiziki hvata singlet kiseonik
spreava lanane reakcije radikala
inhibicija lipoksigenazne aktivnosti
 ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA
ASKORBINSKA KISELINA ; VITAMIN C
najznaajniji hidrosolubilni antioksidans; deluje unutar
elije ali i ekstracelularno
regenerie alfa tokoferol; odrava integritet LDL
direktno reaguje sa superoksid anjonom i hidroksilnim
radikalom i hipohlorastom kiselinom prekidajui lanane
reakcije radikala
ZATITA OD SLOBODNIH
RADIKALA
ELIJSKA ODBRANA OD
KISEONIKIH
RADIKALA
dejstvo enzima
uklanjanje KSR
antioksidantnim vitaminima
enzimatska popravka
oksidativno oteenih
membrana i DNK
kompartmentizacija
lokalizacija reparativnih
procesa u iste elijske delove
gde nastaju KSR
 OKSIDATIVNI STRES

poremeaj ravnotee izmeu prooksidanasa i

antioksidanasa na raun prooksidanasa
(Sies, 1991)

svi procesi i fizioloki i nefizioloki gde dolazi

do gubitka kontrole nad produkcijom
slobodnih radikala i gde se oni stvaraju u
ekstremnim koliinama, a za posledicu imaju
prevazilaenje antioksidativnih kapaciteta
elija i tkiva
 OKSIDATIVNO OTEENJE
TKIVA
EGZOGENI FAKTORI :
jonizaciono zraenje
viak jona prelaznih metala
metabolizam toksinih jedinjenja i
lekova
viak kiseonika i poveana
koncentracija kiseonika
 OKSIDATIVNO OTEENJE
TKIVA
ENDOGENI FAKTORI :
poveana fagocitna aktivnost na mestu
oteenja tkiva
oteenje mitohondrijalnog respiratornog
lanca
aktivacija metabolizma arahidonske
kiseline
delokalizacija metala sa promenljivom
valencom i oslobaanje hem proteina
smanjenje zatitnog kapaciteta elije
 PEROKSIDACIJA LIPIDA
INICIJACIJA
oksidans oduzima atom
vodonika iz metilenske grupe
koja je u -poloaju od
mesta dvogube veze
PROPAGACIJA
alkil radikal i molekularni
kiseonik daju peroksil radikal
peroksil radikal moe da
oduzima vodonik od
susednog molekula MK pa
nastaje lipidni hidroperoksid i
novi alkil radikal
 PEROKSIDACIJA LIPIDA
DEGRDACIJA
relativno stabilni lipidni
hidroperoksidi u prisustvu jona
metala se razgrauju i nastaju
novi peroksil/alkoksil radikali
proizvodi degradacije lipida su
: nonenal, 4-hidroksi pentenal
i malondialdehid MDA
MDA je hidrosolubilan,
najee odreivan indikator
LPO
TERMINACIJA
vitamin E daje elektrone za
prekid reakcije
 PEROKSIDACIJA LIPIDA
POSLEDICE LPO :
gubitak polinezasienih masnih kiselina
promene u permeabilnosti membrana
efekti na membranske proteine
promenjen jonski transport
nastanak citotoksinih metabolita lipidnih
peroksida
 OKSIDATIVNO OTEENJE
PROTEINA
modifikacija AK radikalima izaziva promene u
tercijernoj strukturi proteina
interreakcija radikala sa kosturom polipeptidnog lanca
dovodi do modifikacije sekundarne strukture
indirektno oteenje aktivacijom proteolitikih enzima
(HOCl)
oteenje proteina produktima LPO
POSLEDICE:
promenjena enzimska aktivnost
agregacija receptorskih proteina
poremeaj transportnih proteina i jonske homeostaze
OKSIDATIVNO OTEENJE
DNK
nespecifino vezivanje Fe izaziva
lokalizovanu produkciju hidroksilnog
radikala
odvajanje i cepanje lanaca DNK
hidroksilacija konstitutivnih baza DNK
POSLEDICA
mutageno oteenje DNK i elijska smrt
I NA KRAJU...
oteenje
membranskih lipida
oteenje
receptorskih
proteina
oteenje DNK
oteenje elijskih
organela