Slobodni radikali i reaktivne

kiseonične vrste (ROS)

 Slobodni radikali
Slobodni radikali su atomi, joni ili molekuli, koji imaju jedan ili više
nesparenih elektrona u svojoj strukturi, a mogu nastati transferom
jednog elektrona na neradikalsku vrstu ili homolitičkim raskidanjem
kovalentne veze. Usled nesparenog elektrona, slobodni radikali su
veoma reaktivni. Većina slobodnih radikala su kratkoživeći i veoma lako
podležu monomolekularnim i bimolekularnim reakcijama razlaganja.

Zbog oštećenja koji slobodni radikali izazivaju postoji niz odbrambenih

mehanizama kojim organizam održava vijabinost sopstvenih ćelija.
Postoji balans između antioksidanasa i slobodnih radikala.
Antioksidansi snižavaju nivo slobodnih radikala omogućavajući im da
bez pričinjavanja velike štete vrše korisne biološke funkcije. Iako
slobodni radikali imaju značajnu ulogu u nizu fizioloških procesa,
poremećaj balansa između ovih reaktivnih vrsta i antioksidativnog
sistema može da dovede do ozbiljnog narušavanja normalne homeostaze
ćelije. Narušavanje oksido-reduktivne ravnoteže usled povišenog nivoa
slobodnih radikala, uz visok stepen njihove neselektivne reaktivnosti i
nestabilnosti, dovodi do stanja oksidativnog stresa.
 Slobodni radikali se u organizmu stvaraju:

1. U fiziološkim uslovima procesom oksidativne fosforilacije u

mitohondrijama, tj. ćelijskog disanja, oksidoredukcije u prisustvu
metala sa promenljivom valencom, autooksidacije malih molekula.
2. U inflamaciji tokom procesa fagocitoze.
3. Sa nastankom autoimunih, neurodegenerativnih, malignih,
kardiovaskularnih bolesti, kao i u različitim nefiziološkim uslovima,
kao što su ishemija, hipoksija, hiperoksija, reperfuzija i dr.,
4. Biotransformacijom ksenobiotika, egzogeno unetih jedinjenja
(lekovi, hrana itd.)
5. Pod uticajem UV zračenja (homolitičko raskidanje O-O veze u H2O2
daje dva •OH radikala) ili iz vode (raskidanje O-H veze pod uticajem
X i γ-zraka daje •H i •OH). Hidroksil radikal čini više štete živim
organizmima od jonizujućeg zračenja.
6. Pri pojačanoj fizičkoj aktivnosti.
7. Trovanjem, (aerozagađenje).
 Prooksidanti
U prooksidante se ubrajaju različite hemijske vrste koje u
biološkim i hemijskim sistemima uzrokuju ili ubrzavaju reakcije
oksidacije. Reaktivne prooksidativne vrste se dele na reaktivne
slobodnoradikalske i neradikalske vrste (oksidaciona sredstva
koja lako prelaze u slobodne radikale). Najvažnije reaktivne vrste
kiseonika (ROS), hlora (RCS) i azota (RNS) date su u tabeli 1.

Za ljudsku vrstu su svakako najznačajniji oni radikali koji

učestvuju u metaboličkim procesima, a to su superoksidni anjon
radikal, hidroksil i peroksil radikali, kao i azot-monoksid,
kiseonični singlet i peroksinitritni anjon.
Mehanizam nastanka kiseoničnih slobodnih radikala
 Reaktivne kiseonične vrste (ROS)
Reactive Oxygen Species (ROS) predstavljaju metabolite nastale iz
molekulskog kiseonika koji sadrže atom(e) kiseonika i poseduju veću
reaktivnost od kiseonika u osnovnom molekulskom stanju.

Relativno male količine ROS-a, trajno se proizvode u svim aerobnim

organizmima (2-3%). Kontrolisano stvaranje reaktivnih kiseoničnih vrsta
ima veoma važnu ulogu u različitim fiziološkim procesima, kao što su
unutarćelijska signalizacija proliferacija, apoptoza, i imunološki odgovor.
 Mehanizam stvaranja ROS-a

Superoksidni anjon radikal (•O2-) se dobija ukoliko se molekulskom

kiseoniku doda jedan elektron. Jedna je od veoma reaktivnih formi
kiseonika. Superoksidni anjon radikal protonovanjem prelazi u
hidroperoksilni radikal (•OOH).

Ukoliko superoksidnom radikalu

dodamo još jedan elektron, on će
postati peroksidni anjon O22-
(neradikal sa slabijom O-O
vezom) od koga se redukcijom
može dobiti vodonik peroksid
(H2O2).
Nakon dodavanja još 2 elektrona
ovom sistemu dobijamo dva O2-
jona od kojih se redukcijom mogu
dobiti dva molekula vode.
 Reaktivne kiseonične vrste (ROS)

Hidroksilni radikali (•OH) su najreaktivnija kiseonična vrsta

radikala. Nakon nastanka in vivo, ovi radikali traju manje od 10-3
sekunde jer se brzo kombinuju sa drugim molekulima iz
neposredne blizine, uključujući i makromolekule. Ovaj kiseonični
radikal može biti generisan sa velikom produktivnošću u svakom
delu ćelije. Pored direktne štete koju nanose, hidroksilni radikali
imaju važnu ulogu u formiranju peroksil radikala (•OOR) i
podsticanju lančanih reakcija lipidne peroksidacije. Za hidroksil
radikale se smatra da utiču na nastajanje ateroskleroze,
onkogeneze, katarakte i DNK mutacija.

Superoksidnom anjon radikalu (•O2-) se pripisuje kako

pozitivna, tako i negativna biološka funkcija, dok hidroksil radikal
(•OH) deluje isključivo negativno, zbog svoje visoke reaktivnosti.
U fiziološkim uslovima superoksidni anjon radikal ne izaziva
toksične efekte jer ga enzim superoksid-dismutaza (SOD)
transformiše u manje aktivan vodonik peroksid.
 Reaktivne kiseonične vrste (ROS)
Neki od najpoznatijih negativnih efekata povećanog stvaranja ROS-a
u biološkim sistemima obuhvataju peroksidaciju membranskih lipida,
oksidativno oštećenje nukleinskih kiselina i šećera, kao i oksidaciju
sulfhidrilnih i drugih grupa u proteinima. Za slobodne radikale koji
imaju kiseonik u strukturi se smatra da su sposobni da iniciraju i
propagiraju kancerogenezu. Postoji povećan interes za ispitivanje
uloge ROS-a kod arterioskleroze, moždanog udara, oštećenja
miokarda, trauma, artritisa, kao i sumarnog uticaja ovih vrsta na
starenje organizma.

Neizbalansirano stvaranje stabilnih radikala visoko je korelisano sa

mnogim patofiziološkim bolestima, kao što su neurodegenerativne i
maligne bolesti, diabetes mellitus i druge. ROS imaju centralnu ulogu
u delovanju raznih stranih supstanci (npr. ksenobiotika), a njihov
povećan sadržaj može biti prvi pokazatelj progresije ili sekundarna
posledica prilikom oštećenja tkiva.
 Uticaj gvožđa na stvaranje ROS

Gvožđe ima zadatak prenosa elektrona između kiseonika i bioloških

molekula. Fentonova reakcija je jedna od najvažnijih rekcija koja je možda
ključ za razumevanje mnogih biohemijskih procesa u organizmu. Kao
rezultat ove reakcije imamo proizvodnju visokoreaktivnog i toksičnog
hidroksilnog radikala (•OH).

Fe2+ + H2O2 → intermedijerni kompleksi → Fe3+ + OH− + •OH

Živi organizmi pažljivo kontrolišu intenzitet Fentonove reakcije

ograničavajući raspoloživost Fe2+ i H2O2. Bilo bi izuzetno teško održati život
na Zemlji koja je preplavljena gvožđem u Fe2+ obliku. Takođe, u živim
organizmima možemo naći posebnu grupu proteina, enzima katalaza koje
katalizuju reakciju razlaganja H2O2.

2H2O2 → 2H2O + O2
 Lipidna peroksidacija

Kiseonikovi slobodni radikali reaguju sa širokim spektrom

biomolekula, izazivajući na njima promene, odnosno
oštećenja. Mada su svi biomolekuli osetljivi na napad
radikala, lipidi iz ćelije su najpodložniji oštećenjima. ROS u
reakciji sa lipidima izaziva oksidativnu destrukciju
nezasićenih, odnosno polinezasićenih masnih kiselina,
poznatu kao proces lipidne peroksidacije (LP). Ovom
procesu podležu kako lipidi u biosistemima, tako i lipidi u
hrani. Osnovni supstrat za oksidativno oštećenje lipida
predstavljaju polinezasićene masne kiseline u fosfolipidima i
glikolipidima, kao i holesterol u biološkim membranama.
 Lipidna peroksidacija

Dvostruka veza u molekulama nezasićenih masnih

kiselina je najčešća meta slobodnih radikala. Tom
prilikom molekul masne kiseline postaje nosilac
nesparenog elektrona, a u prisustvu kiseonika se dalje
stvara lipidni peroksi radikal. Lipidni peroksi radikal
reaguje sa susednom molekulom masne kiseline
stvarajući novi radikalski molekul a sam postaje
lipidni hidroperoksid. Ovaj autokatalitički ciklus se
može propagirati sve dok se lanac reakcija ne prekine
sjedinjavanjem dva radikala u neradikalski proizvod.
Međutim, najčešće dolazi do stacionarnog ali ne i do
trajnog zaustavljanja procesa jer akumulirani produkti
LP mogu biti sami po sebi reaktivni.
 Mehanizam lipidne peroksidacije
Tri različita mehanizma mogu indukovati lipidnu peroksidaciju:
1. Autooksidacija
2. fotooksidacija
3. enzimska aktivnost.
Autooksidacija i fotooksidacija su neenzimski
procesi i indukuju se ROS-om.
Nezavisno od načina indukcije,
LP se odvija kroz tri faze:
1. Inicijalnu;
2. propagacionu (stadijum dalje
peroksidacije i grananja
reakcija oksidacije);
3. terminalnu fazu.

Ukoliko se proces LP trenutno ne zaustavi, prevođenje jednog molekula masti u

radikalsku formu može pokrenuti niz lančanih reakcija, i dovesti do strukturnog i
funkcionalnog oštećenja membrane i smrti ćelije.
 Mehanizam lipidne peroksidacije
Proces LP započinje reakcijom hidroksil radikala koji od svih kiseoničnih
radikala ima najveći oksidacioni potencijal i sposoban je da oduzme atom
vodonika koji se nalazi u α-položaju od mesta dvostruke veze u molekulu
masne kiseline iz lipidne membrane. U ovoj fazi inicijacije pored alkil
radikala nastaju i drugi primarni produkti lipidne peroksidacije (konjugovani
dieni, peroksidni radikali i lipidni hidroperoksidi).
Molekul lipida sam postaje radikal i u prisustvu kiseonika se prevodi u
peroksiradikal koji je izuzetno reaktivan i kao takav reaguje sa najbližim,
susednim lipidnim molekulom pri čemu susedni molekul postaje radikal a
peroksiradikal se prevodi u lipidni hidroperoksid. Ova faza lipidne
peroksidacije se naziva propagacija i krajnji produkt ove reakcije su lipidni
hidroperoksidi koji predstavljaju meru oksidativnog oštećenja.
Oksidacija polizasićenih masnih kiselina koje se nalaze u sastavu ćelijske
membrane dejstvom slobodnih radikala je lančani proces koji uzrokuje
stvaranje lipidnih peroksida i hidroperoksida a zatim i nastajanje
konjugovanih diena, kao i krajnjeg proizvoda lipidne peroksidacije-
malondialdehida (MDA). Кvantifikacija oksidativnog stresa je složena i u tu
svrhu se najčešće koristi upravo određivanje sadržaja MDA pomoću 2-
tiobarbiturne kiseline.
Lipidna peroksidacija γ-linolenske kiseline
 Posledice lipidne peroksidacije
Najčešće mete oksidativnog napada su lipidi ćelijskih membrana
(fosfolipidi, glikolipidi i holesterol), ali i neki proteini, odnosno enzimi.
Vrlo reaktivni sekundarni produkti, posebno MDA, reaguju sa
slobodnim SH i NH2 grupama aminokiselina, peptida, proteina,
nukleotida i fosfolipida dovodeći do kovalentne modifikacije ovih
makromolekula što rezultuje gubitkom njihove funkcije.

Intenzivna lipidna peroksidacija menja fluidnost i permeabilnost

ćelijske membrane što rezultira poremećajem u transportu elektrolita,
sadržaju proteina i promenjenom funkcionisanju organela. Posledica LP
su promene u aktivnosti membranskih enzima, transportu jona,
funkcionisanje receptora, permeabilnosti ćelijske membrane, što dovodi
do poremećaja funkcije same ćelije i brojnih patogenih stanja
organizma.
 Antioksidansi
Biološki antioksidanasi su supstance koji prisutne u malim koncentracijama u
odnosu na supstrat (biomolekul) koji se oksiduje, značajno usporavaju ili
sprečavaju oksidaciju tog supstrata.

Antioksidansi se prema načinu delovanja u ljudskom organizmu mogu podeliti

na:
1. Preventivni antioksidansi sprečavaju nastanak slobodnih radikala.
2. “Skevendžer” antioksidansi poseduju sposobnost da “hvataju” slobodne
radikale.
3. “Reparacioni” antioksidansi deluju posebnim mehanizmima,
obnavljujući ili uklanjajući oštećene vitalne biomolekule koji nastaju u
uslovima oksidativnog stresa. U “reparacione” antioksidanse ubrajaju se
fosfolipaze, proteaze, enzimi koji obnavljaju DNK, transferaze, itd.

Prema mestu nastajanja antioksidansi značajni za ljudski organizam dele se

na: endogene i egzogene. Endogeni antioksidansi predstavljaju
antioksidanse koji nastaju u ljudskom organizmu, dok se egzogeni
antioksidansi unose putem hrane ili lekova. Fenolna jedinjenja su jedna od
najvažnijih grupa prirodnih egzogenih antioksidanasa, čija je aktivnost
uslovljena strukturnim karakteristikama.
 Antioksidativna zaštita
Mehanizmi antioksidativne zaštite aerobnih organizama dele se na
primarnu i sekundarnu antioksidativna zaštitu.

Enzimski sistemi u primarnoj antioksidativnoj zaštiti

Primarnu antioksidativnu zaštitu čine nekoliko enzimskih sistema od kojih su

najznačajniji: superoksid dismutaza (SOD), katalaza (CAT), glutation
peroksidaza (GSHPx), peroksidaza.

Superoksid dismutaza (SOD) katalizuje dismutaciju superoksid anjon

radikala do vodonik peroksida i kiseonika. Ona je jedini enzim koji reaguje
direktno sa slobodnim radikalima. Neutralizaciju nastalog H2O2 vrše glutation
peroksidaza ili katalaza.
2O2•− + 2H+ → H2O2 + O2

Katalaza (CAT, prisutna u peroksizomima), katalizuje razgradnju nastalog

H2O2.
2H2O2 → O2 + 2H2O
Glutation peroksidaza (GSHPx) redukuje i H2O2 hidroperokside masnih
kiselina. Ovaj enzim je prisutan u citosolu gde štiti fosfo- i sfingolipide
membrana od oksidativne destrukcije.

2GSH + H2O2→ GSSG + 2H2O

2GSH + ROOH → GSSG + ROH + H2O

Intracelularni odnos oksidisanog i redukovanog glutationa (GSSG/GSH)

ukazuje na oksidativno stanje ćelije i njen detoksikacioni kapacitet.

Glutation reduktaza (GR) je flavoprotein koji katalizuje transformaciju

oksidovanog glutationa (GSSG) u redukovani (GSH) u prisustvu NADPH kao
koenzima, kao i redukciju drugih disulfida koji nastaju reakcijom glutationa i
jedinjenja koja sadrže –SH grupe (koenzim H, cistein, SH-proteini i dr.).

Peroksidaza eliminiše H2O2 tako što ga koristi za oksidaciju drugog supstrata.

RH2 + H2O2 → R• + 2H2O

Pored ovih enzima, postoji i niz drugih sa sličnom funkcijom kao što su selen-
nezavisna GSHPx, i glukozo-6-fosfatdehidrogenaza.
Glavni enzimskih sistemi u in vivo antioksidativnoj zaštiti.
SOD, superoksid dismutaza; CAT, katalaza; GPx, glutation
peroksidaza; i GR, glutation reduktaza.
 Neenzimski sistemi u primarnoj antioksidativnoj zaštiti
Jedan od načina sprečavanja prooksidativnog dejstva gvožđa i bakra je njihova
eliminacija iz biološkog sistema. Poznato je da su ovi metali pored toga što su
esencijalni mikronutrijenti, ulaze i u sastav nekih enzima, imaju značajnu
ulogu za imunitet pa je fiziološki neprihvatljivo uklanjanje gvožđa i bakra iz
organizma Metali se stoga vezuju u redoks-neaktivne komlekse. Oni se nalaze
u veoma malim količinama u slobodnom stanju, uglavnom su vezani za
proteine i neproteinske helirajuće agense.

Transportni proteini i proteini za deponovanje Fe2+ i Cu2+ (vežu

potencijalno opasne jone gvožđa i bakra i na taj način onemogućavaju njihovo
učešće u produkciji slobodnih radikala). To su između ostalih transferin,
feritin, laktoferin i ceruloplazmin. Trećina gvožđa u organizmu vezana je uz
transferin, čime se sprečava njegovo taloženje i reakcija s ROS-om. Gvožđe se
skladišti obliku feritina, rastvorljivog u vodi, koji se sastoji od kristala
hidroksida gvožđa prekrivenog ljuskom proteina apoferitina. Laktoferin je
protein koji služi u transportu gvožđa i pripada grupi transferina.
Cerulopazmin takođe ima ulogu uklanjanja Fe2+ jona iz plazme uz
istovremenu redukciju kiseonika u vodu, a reaguje i sa superoksidnim
radikalom i vodonik peroksidom.
 Neenzimski sistemi u primarnoj antioksidativnoj zaštiti

Pored ovih proteina koji imaju bitnu ulogu u transportu metalnih jona, u
neenzimske antioksidanse spada i albumin (vezuje bakar i hem i uklanja
HOCl), mokraćna kiselina (uklanja radikale i vezuje metale) i bilirubin
(uklanja peroksidne radikale).

Takođe u primarnoj antioksidativnoj zaštiti učestvuje i redukovani

glutation (GSH) (γ-glutamil-cisteinil-glicin) tripeptid koji se u skoro
svim ćelijama nalazi u visokim koncentacijama i predstavlja glavni
endogeni antioksidans. GSH je najviše zastupljen neproteinski tiol, čini
90% ukupnih neproteinskih sulfidnih jedinjenja ćelije i esencijalni je
kofaktor nekih enzima (glutation-peroksidaza, glutation S-transferaza,
glutation transhidrogenaza, glutation reduktaza). GSH je prisutan samo u
aerobnim organizmima. Glutation se može konjugovati sa terminalnim
grupama ili jedinjenjima nastalima u reakcijama prve faze metaboličke
biotransformacije ksenobiotika, pri čemu nastaje merkapturna kiselina.

Svi navedeni primarni antioksidanti čine koordiniranu odbranu organizma

od reaktivnih radikalskih oblika.
 Sekundarna antioksidativna zaštita

Sistem sekundarne antioksidantne zaštite čine brojna

niskomolekularna jedinjenja različitog porekla i karaktera,
kao što su biogeni amini, estrogen, derivati histidina,
melanini, α-lipoična, dihidrolipoična kiselina i njihovi
analozi, α-ketokiseline, indoli i jedinjenja slična indolu,
melatonin, ubihinon, L-askorbinska kiselina, tokoferoli,
karotenoidi, fenoli i njihove kiseline, flavonoidi, derivati
hidroksicinamata i dr.
Kako je struktura ovih jedinjenja veoma raznovrsna, tako su
različiti i mehanizmi kojima ona ostvaruju svoju aktivnost u
sistemu antioksidantne zaštite. Najčešce su to hvatači
(skevendžeri) slobodnih radikala, donori protona, inhibitori
enzimskih sistema, helatori jona prelaznih metala itd.
 Sekundarna antioksidativna zaštita

-Tokoferol, glavni sastojak liposolubilnog vitamina E, je jedan od

najznačajnijih prirodnih antioksidanasa u ćelijskim membranama i
lipoproteinima. Reakcije -tokoferola sa peroksi-radikalima,
perhidroksi-radikalima i singlet kiseonikom su osnova njegove
antioksidantne uloge.
-Tokoferol prekida propagaciju lančanu
reakcije lipidne peroksidacije tako što
predaje proton lipidnim peroksil
radikalima (LO2•) koji tako prelaze u
stabilnije proizvode, lipidne
hidroperokside (LOOH).
Tokom ove reakcije -tokoferol prelazi u
slobodnoradikalski oblik -tokoferil
radikal koji se rezonantno stabilizuje i ne
izaziva dalja oštećenja. D--Tokoferol
Mehanizam antioksidativnog delovanja -tokoferola
 Sekundarna antioksidativna zaštita
-Karoten, jedan od najrasprostranjenijih karotena u biljnom svetu,
deluje kao hvatač tiil-, nitroksid- i sulfenil radikala, sposobnih da
iniciraju peroksidaciju lipida, pri cemu nastaju-karoten-katjon-radikali i
radikal adukti (nastali interakcijom karotena i radikala).

L-askorbinska kiselina (ili vitamin C u

L-askorbinska kiselina
užem smislu) je najefikasniji
hidrosolubilni antioksidans. Vitamin C
se lako redukuje. Ima ulogu koenzima u
brojnim reakcijama hidroksiacije i
amidiranja. U živim organizmima
deluje kao antioksidans, i štiti telo od
oksidativnog stresa. Vitamin C se u
organizmu nalazi u dva hemijska
oblika, kao redukovani (L-askorbinska
kiselina; i njen jonizovani oblik L-
askorbat) i kao oksidovani oblik (L-
dehidroaskorbinska kiselina; i njen
jonizovani oblik L-dehidroaskorbat).
U sekundarnu antioksidativnu zaštitu ubrajaju se i
enzimi koji učestvuju u “popravljaju” nastalog oksidativnog
oštećenja nukleinskih kiselina, proteina i lipida. To su
prvenstveno proteolitički enzimi, fosfolipaza A2 (fosfolipid-
nezavisna i fosfolipid zavisna), glikozilaze, endo- i egzo-
nukleaze, DNK ligaze, DNK polimeraze, itd.
Ovi enzimi “popravljaju” oštećene molekule DNK,
odstranjuju oksidovane masne kiseline membranskih lipida i
kroz procese degradacije i resinteze obnavljaju oksidovane
aminokiseline, odnosno proteine.
 Oksidativni stres
Efikasna zaštita od štetnih efekata ROS-a postiže se intervencijom u raznim
fazama slobodnih radikalskih procesa zaštitnim dejstvom antioksidativnog
odbranbenog mehanizma organizma. Ukoliko je količina "ROS" mnogo
veća od količine antioksidanasa dolazi do oksidativnog stresa. U stanju
oksidativnog stresa dolazi do oksidativnih oštećenja biomolekula.
Oksidativni stres nastaje ili ako dolazi do povećanja proizvodnje "ROS" ili
ukoliko opadne nivo antioksidanasa. Takođe može nastati i zbog pojačane
aktivnosti prirodnih sistema za proizvodnju "ROS“-a, često nepoznatog
uzroka.
 Šta se događa sa ćelijama pod oksidativnim stresom?

Dolazi do porasta unutarćelijskog nivoa slobodnih metala

gvožđa i bakra što izaziva Fentonovu reakciju. Može se
izazvati proliferacija ćelija (što može biti korisno u zarastanju
rana ali loše ukoliko se dogodi fibroza tkiva). Ćelije se
adaptiraju na stres pokretanjem anti-stres mehanizama što ih
štiti od oštećenja ali nekada može uzrokovati i "preteranu
zaštitu" od stresa (ćelije postaju rezizstentne na povišen nivo
"ROS"). Teži nivo izaziva prekid ćelijskih ciklusa i njihovo
ubrzano starenje a težak nivo osksidativnog stresa izaziva
oštećenja DNK, apoptozu i nekrozu.
 Posledice interakcije slobodnih radikala
sa molekulima unutar ćelije

Supstanca Promene Posledice po ćeliju

Perforacija membrane i
Lipidna
Lipidi povećana propustljivost
peroksidacija
Smrt ćelije
Ubrzan katabolizam proteina i
Karbonilacija
skraćen poluvek ovih molekula
Unakrsno vezivanje
Proteini Snižena enzimska aktivnost
aminokiselina
Promena antigeničnosti
Fragmentacija
molekula
Promena genske ekspresije
DNK Genske mutacije
Gubitak heterozigotnosti