THỰC HÀNH SINH HÓA

TS. ĐỖ HIẾU LIÊM

THỰC HÀNH SINH HÓA ĐỘNG VẬT
• Bài 1: Thực nghiệm các hợp chất glucid
• Bài 2: Thực nghiệm các hợp chất lipid và enzyme
• Bài 3: Thực nghiệm các hợp chất amno acid và protein
• Bài 4: Thực nghiệm các hợp chất vitamin và khoáng chất

• Nhóm thực hành 4 tiểu nhóm

• Mỗi tiểu nhóm thực hành 1 bài

Sinh viên mặc áo blouse và tuân theo nội qui

 BÀI 1

THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT

GLUCID
1. PHẦN ĐỊNH TÍNH
1.1. Phản ứng Molisch
1.2. Phản ứng Seliwanoff
1.3. Phản ứng Benedict
1.4. Phản ứng định tính amidon
- Phản ứng màu amidon với iod
- Phản ứng phân giải amidon bằng acid vô cơ đậm đặc

2. PHẦN ĐỊNH LƯỢNG

Định hàm lượng glucose trong máu
 1. PHẦN ĐỊNH TÍNH
Polysaccharide
Glucose
α.1, 4 H2SO4 đđ Thuốc thử Màu
H2SO4 đđ
α.1, 6 Hexose
Fructose
Ribose
Glucose
CHO CH2OH đặc
HOH
HOH22C
C CHO
Monosaccharide Fructose trưng
Hydroxymethyl
O O Dihydroxymethyl
Furfural
Pentose Ribose furfural
furfural
OH
1.1. Phản ứng Molisch Xác định sự hiện diệnGLUCOSE
hợp 4 đđ glucid
chất
H2SO
α Napthol
GLUCOSE

H2SO4 đđ

Hydroxymethyl furfural
Vòng nhẫn
α.Napthol màu tím
giữa 2 lớp
dung dịch
Vòng nhẫn màu tím
1.2. Phản ứng Seliwanoff Xác định sự hiện diện ketose
Resorcinol
Fructose
+
HCl đđ
FRUCTOSE
HCl đđ

Dihydroxymethyl furfural
Resorcinol

Dung dịch màu đỏ Sodium Citrate

Glucose
+ CuSO
1.3. Phản ứng Benedict Xác định tính khử
4

GLUCOSE
TT Benedict Nhiệt độ
Kết tủa vàng cam
Nhiệt độ
Kết tủa đỏ
Cu
CuO2O
Nhiệt độ
Kết tủa đen
1.4. Phản ứng định tính amidon
Iod
1.4.1. Phản ứng màu amidon + iod Na2S2O3
AMILOSE (Lugol)
AMILOSE
AMIDON Làm lạnh Làm lạnh

AMILOPECTIN

1.4.2. Phản ứng phân giải amidon bằng

acid vô cơ đậm đặc
AMIDON
Phenolphtalein
H 2NaOH
SO4 20%

Benedict
Seliwanoff
 2. ĐỊNH HÀM LƯỢNG GLUCOSE TRONG MÁU
(Phương pháp Somogyi-Nelson)
H2O
1.Máu + Ba(OH)2 + ZnSO4 DDDDSomogyi
Nelson
(Arsenomolybdate)
(Cu2SO4)
2.Ly tâm + lấy nước trong
3.DD Somogyi
4.DD Nelson

5.QUANG PHỔ KẾ
λ = 520 nm A2: Độ hấp thu của glucose máu xét nghiệm
A3: Độ hấp thu của glucose chuẩn
 
Cách thủy
Công70thức
0C tính: 
0.05 x A 2 x 100
Glucose máu (mg%) 
1 2 A 3 x 0.05
3
Nước cất Glucose máu Glucose chuẩn
0.000 A2 A3
 BÀI 2

THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT

LIPID VÀ ENZYME

1.THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT LIPID

1.1. Độ hòa tan và nhũ hóa triacylglycerol
1.2. Khảo sát sắc tố mật
1.3. Khảo sát thể ketone

2.THỰC NGHIỆM CÁC ENZYME

2.1.Khảo sát enzyme catalase trong hồng cầu
2.2.Khảo sát hoạt lực enzyme amylase trong huyết thanh
1.THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT LIPID
1.1.Độ hòa tan và nhũ hóa triacylglycerol
Độ hòa tan
Dầu + Alcohol Dầu + Acetone

Độ nhũ hóa

Dầu + Muối kiềm Dầu + Xà phòng Dầu + Mật

 1.2. Khảo sát sắc tố mật (Bilirubine và biliverdine)
Mật
HNO 3 đđ Mật
I2

Phản ứng Gmelin Phản ứng Smith

1.3. Khảo sát thể ketone

SodiumKetone
NaOH
nitroprusside Sodium Ketone
(NHnitroprusside
NH4)42OH
SO4
• Acetone
• Acetoacetic acid
• β.Hydroxy butyric acid

Phản ứng Legal Phản ứng Rothera

2. THỰC NGHIỆM CÁC ENZYME
2.1. Khảo sát enzyme catalase trong hồng cầu
MÁU
H2O2 MÁU
H2O2
NaCN MÁU
H2O2

Hồng cầu
Hồng cầu(đ)
1 Hồng cầu 2 NaCN 3
Catalase Catalase
Catalase

2.2. Khảo sát hoạt lực enzyme catalase trong huyết thanh
Huyết thanh NaCl
Amidon
Iod0.9%

370C 370C 370C

1 2 3 4 5 6 7 8 9
 BÀI 3

THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT

PROTEIN VÀ AMINO ACID
1. PHẦN ĐỊNH TÍNH
1.1. Phản ứng Ninhydrin
1.2. Phản ứng Xanthoproteic
1.3. Phản ứng Hopkins Cole
1.4. Phản ứng Biurrette
1.5. Phản ứng sa lắng và biến tính của protein

2. PHẦN ĐỊNH LƯỢNG

2.1. Định lượng nitrogen amin
2.2. Định lượng albumin và globulin trong huyết thanh
2.3. Định lượng protein tổng số trong huyết thanh
 1. PHẦN ĐỊNH TÍNH
Xác định Nitrogen
1.1.Phản ứng Ninhydrin
(Amino acid, protein…)
TT
DDNinhydrin
Nitrogen

1.2.Phản ứng Xanthoproteic Xác định amino acid có vòng

LòngNH
trắng
HNO4OH3trứng
1.3.Phản ứng Hopkins Cole Xác định amino acid có vòng
Paradimethylamino
LòngHtrắng trứng
2SO4 đđ
benzaldehyde

1.4.Phản ứng Biurette Xác định liên kết peptide

Lòng
TTtrắng trứng
Biurette
1.5.Phản ứng sa lắng và biến tính protein
Ammonium sulfate Lòng trắng Acetate
Acetone trứng chì Trichloroacetic acid

2. PHẦN ĐỊNH LƯỢNG NaOH

2.1. Định lượng nitrogen amin (PP Sorenxen)

Formadehyde
Công thức tính: Phenolphthalein
X = (A-B) x 2.8 mg/10ml
X: Số mg nitrogen trong 10 ml dung dịch glycine
A: Số ml NaOH định phân bình A
B: Số ml
DD NaOH
glycine Ađịnh phân bình B
B Nước cất
2.2. Định lượng albumin và globulin huyết thanh (PP Reinhold)
Na2SO
TT4 Serum
Biurette Nước cất+NaSO4
NaCl 0.9%
Hàm lượng albumin
và globulin trong
huyết thanh được xác
định dựa vào hàm
   lượng protein tổng số
ở nội dung 2.3
1 Nước lọc 1 1 2 Nước lọc 2 2 3 Nước
2 cất
Độ hấp thu A1 Độ hấp thu A2 Cân bằng 0.000

2.3. Định lượng protein tổng số huyết thanh (PP khúc xạ)
Huyết thanh
Protein tổng số:
Ánh sáng Độ hấp thu A2 X (g%)
Protein tổng
Albumin : Độ hấp thu A1
số trong huyết
? Y (g%) Chỉ số
khúc xạ
Globulin = Protein tổngthanh(g%)
số (g%) - Albumin (g%)
= X (g%)
Hàm lượng protein tổng -số Y (g%)
trong huyết thanh (g%)
 BÀI 4

THỰC NGHIỆM CÁC HỢP CHẤT

VITAMIN VÀ KHÓANG CHẤT

1.Định lượng vitamin C trong huyết thanh

2.Định lượng calcium trong huyết thanh
3.Định lượng phospho vô cơ trong huyết thanh
 1. ĐỊNH LƯỢNG VITAMIN C TRONG HUYẾT THANH
(Phương pháp định phân 2,6 dichlorophenol indophenol)
2,6 dichlorophenol indophenol
Huyết thanh HPO3 Nước cất

O
C
C-OH
C=O Cl
O Cl
C-OH
C=O O= =N- -OH
H-C HO- -NH- -OH
A: Số ml thuốc
Cl thử định chuẩn mẫu huyết thanh
HO- C-H Cl
CH2OH B: Số ml thuốc thử định chuẩn nước cất
X: Số mg vitamin C trong 100 ml huyết thanh
Màu hồng
nhạt bền
(A - B) x 0.088 x 5 x 100
1 phút X
3
 2. ĐỊNH LƯỢNG CALCIUM TRONG HUYẾT THANH
KMnO4 (Phương pháp Clark Colip)
HuyếtAmmonium
thanh NH
H2SO
4OH4 Nước cất
oxalate
COO-NH4 COO
Ca2+ Ca 2 NH4+
COO-NH4 COO

Rữa cặn 3 lần

COO COOH
Ca H2SO4 CaSO4
COO COOH
Nước nóng 700C

COOH
A: Số ml KMnO
2KMnO 4 4
định
2Hchuẩn
2SO4
mẫu huyết thanh
COOH
B: Số ml KMnO4 định chuẩn mẫu nước cất
Màu hồng
nhạt bền X: Số mg Ca trong 100 ml huyết thanh
1 phút 2MnSO4 K2SO4 10CO2 8H2O
X  (A - B) x 0.02 x 50
3. ĐỊNH LƯỢNG PHOSPHO VÔ CƠ TRONG HUYẾT THANH
(Phương pháp Urbach và Raabe)
Huyết
4.Sodiumthanh
2.Ammonium
1.Sodium Phospho
sulfite chuẩn
3.Hydroquinone
carbonate+Sodium
molybdatesulfite Nước cất

   0.000

1 2

A1: Độ hấp thu phospho trong huyết thanh

A2: Độ hấp thu phospho chuẩn
X: Lượng phospho vô cơ trong huyết thanh (mg%)

A1 x 0.001 x 500
X
A2