V – Laboratorijske

eksperimentalne studije
 Osnovna podela
eksperimentalnih studija

In vitro
In vivo
In silico
 In vitro studije
In vitro – “u staklu” (lat.)
Studije sprovedene u strogo
kontrolisanom okruženju van
živog organizma
 Prednosti in vitro studija
Strogo kontrolisana sredina
Mogućnost promene samo jedne
varijable i registrovanje (merenje,
kvantifikacija) promene zavisne varijable
Primer: dodavanje antibiotika u
suspenziju kulture bakterija i
određivanje njihove koncentracije pre i
posle toga
Nedostaci in vitro studija (1)
Arteficijelnost in vitro test-
sistema – nedostaje prirodno
okruženje organizma sa
korektivnom mehanizmima
Primer: na bakteriju in vivo,
pored antibiotika, deluju i
prirodni imunski mehanizmi
organizma
Nedostaci in vitro studija (2)
Rezultati dobijeni u in vitro studijama
nije lako ekstrapolisati na živi
organizam
Primer: kalcijumski antagonisti in
vitro inhibišu P-glikoprotein,
odgovoran za tumorsku rezistenciju,
ali takve koncentracije ovih lekova
nije moguće postići u živom
organizmu
 In vivo studije

In vivo – “unutar živog,

u živom” (lat.)
Studije sprovedene u
čitavom i to živom
organizmu
Prednosti in vivo studija
Nema potrebe za ekstrapolacijom –
rezultati su već dobijeni na čitavom
organizmu
Moguće je realistično proceniti efekte
nekog tretmana na organizam, uključujući
i efekte kompenzatornih mehanizama
Primer: infuzija noradrenalina ubrzava rad
srca i povisuje krvni pritisak kod pacova,
ali finalni efekat odražava i refleksnu
aktivaciju vagusa
 Nedostaci in vivo
studija
Ne mogu da “izoluju” posmatrani
organ ili organski sistem, nedovoljno
su metodološki “duboke”
Ne obezbeđuju konstantnost uslova
eksperimenta (kompenzatorni
mehanizmi)
Primer: Neki tretman da povoljne
rezultate kratkotrajno, ali nepovoljne
dugotrajno
 In silico studije
Termin datira iz 1989. godine
(matematičar Pedro Miramontes iz
Meksika)
Označava eksperimente izvedene na
računaru ili kompjuterskom simulacijom
Sve se više koriste radi predviđanja kako
će lek interagovati sa organizmom ili
mikroorganizmom
Glavne in silico tehnike
Molekulsko modelovanje – kako lekovi i
endogene molekule interaguju sa nuklearnim
receptorima
Tehnika bakterijske sekvencije vezana za
Polymerase Chain Reaction (PCR) – određuju
sekvencu DNA i RNA bakterija
Simulacija čitave ćelije – kompjuterski model
unutrašnjosti ćelije (“in silico cell”)
Ostale eksperimentalne studije

Ex vivo
In situ
In extenso (?)
 Ex vivo studije
Ex vivo – “van živog” (lat.)
Sam eksperiment se ne odigrava u
čitavom organizmu, nego u njegovom
delu (ćeliji, tkivu, organu)
Eksperiment (tretman) započeo je dok
se organ još uvek nalazio u intaktnom
organizmu, a analiza (merenje,
registracija parametara) obavlja se in
vitro
Razlike in vitro i ex vivo studija
 In vitro studije se odigravaju u potpunosti –
tretman i merenje – in vitro
 Ex vivo studije uključuju živi organizam u fazi
intervencije, a merenje se vrši in vitro
 Primer in vitro studija: uticaj antikancerskog leka
na rast kulture HeLa ćelija
 Primer ex vivo studije: u genskoj terapiji se iz
organizma uzimaju ćelije, transdukcijom im se
dodaju neki geni in vitro i one se potom vraćaju u
organizam
Zašto ex vivo, a ne in vivo?

Ex vivo studije koriste se kada neke

intervencije ne bi bilo tehnički
moguće izvesti u čitavom živom
organimu ili kada takav eksperiment
in vivo ne bi bio etički opravdan
Primer: Ispitivanje osetljivosti ćelija
tumora čoveka na antikancerske
lekove
 In situ studije
In situ – “na mestu”, “na poziciji”
Negde između in vitro i in vivo studija
Predmet proučavanja je organ, koji je još uvek
unutar živog organizma, ali delimično izdvojen
iz svog prirodnog okruženja
Primer: model registrovanja kontrakcija
dijafragme pacova in situ, stimulisanih
arteficijalno preko n. phrenicus. Pacov je živ,
pod anestezijom.
Prednosti in situ studija
Proučavani organ je vitalniji - još uvek
prima kardio-cirkulatornu podršku
organizma, za razliku od in vitro studija
Moguće je primenjivati klinički
moguće doze lekova (SC, IM, IV) i
postizati njihove realistične
koncentracije oko receptora
Mogućnost kliničkih ekstrapolacija je
veća
Nedostaci in situ studija
Kao i kod in vivo studija
Nedovoljna izolovanost ciljnog
organa ili organskog sistema –
kompenzatorni mehanizmi maskiraju
dobijene efekte
Nedovoljna naučna fundamentalnost
 In extenso
In extenso – “u čitavoj dužini”
Ovo nije izraz koji se koristi za
opisivanje tipa eksperimenta,
nego u publicistitici, kada želi da
se naglasi da je publikacija data
ne samo kao apstrakt, nego u
celini
Rad sa eksperimentalnim
životinjama
Albino pacov
 Albino pacov

Ovaj laboratorisjki soj predstavlja

albino varijantu smeđeg pacova
(Rattus norvegicus)
Prvi takad soj nastao je na Wistar
Institute 1906. godine – Wistar pacov
Iz njega je nastao 1925. godine soj
Sprague-Dawley, koji je nešto lakši
za rukovanje i ima duži rep
Wistar pacov
Sprague-Dawley pacov
Ostali sojevi nastali iz
Wistar pacova
 Long-Evans pacov – dobijen 1915. ukrštanjem ženki
Wistara i sivih mužjaka
 Lewisov pacov – mirniji soj, sklon tumorima

 Spontano hipertenzivni pacov

 Knockout pacov – koristi se kao model za:

 Diabetes
 Hipertenziju
 Parkinsonovu bolest
 Alzheimerovu bolest
Zucker (ZDF) pacov
 Zucker pacov
Zucker pacov (ZDF = Zucker Diabetic Fat)
je soj inbrednih pacova nastao 1985.
godine na osnovu mutacije
Recesivno svojstvo fa/fa za leptinski
receptor
Lois and Theodore Zucker
Predstavlja model za diabetes tipa 2 i za
gojaznost
Swiss Albino miš
 Albino miš
Mus musculus
Lausanne, Švajcarska
Najrasprostranjeniji soj – kao
Wistar pacov
Knockout fat mouse
 Knockout debeli miševi

Imaju veštački izazvani genski

deficit karboksipeptidaze E
Poseban soj čine negojazni
dijabetični miševi (NOD = Non-
Obese Diabetic), koji su model za
diabetes tipa 1
C57BL/6 miš
 C57BL/6 miševi
Veoma osetljivi na hladnoću i bol
– analgetici na njih slabije deluju
Spontano unose alkohol
Osetljiviji su na adikciju na
morfin, aterosklerozu i prerani
gubitak sluha
BALB/c miš
 BALB/c miševi
Veoma su agresivni – mužjaci se
tuku međusobno
BALB/Lac soj je mnogo mirniji
Otporni su na aterosklerozu
izazvanu ishranom i pogodni za
kardiovaskularna istraživanja
Mongolski pustinjski
pacov (gerbil)
Debelorepi gerbili
 Mongolski gerbil
Meriones unguiculatus
Nekompletan Willisov arterijski
prsten na bazi mozga – nema
komunikacije između karotidne i
bazilarne arterije
Zato se koristi kao model za
proučavanje moždane ishemije (nema
revaskularizacije iz slivova drugih
arterija)
Zlatni (Sirijski) hrčak
 Zlatni hrčak
Mesocritecus auratus
Koristi se u istraživanju alkoholizma,
jer imaju veliku jetru, sposobnu da
metabolizuje mnogo etanola
Inbredni hrčci se upotrebljavaju kao
model za dilatacijsku
kardiomiopatiju
Zamorac
Zamorac
 Zamorac
Cavia porcellus
Veoma pitomi i laki za rukovanje
Koriste se u opšte eksperimentalne svrhe
Model su za ispitivanje efikasnosti
profilaktičkih antidota u trovanjima
organofosfornim inhibitorima holinesteraze
 Inbredne životinje
“Outbreeding” – parenje životinja koje nisu u
srodstvu
“Inbreeding” – parenje bliskih srodnika
Inbredne životinje su homozigotne, pa recesivni
geni imaju veće šanse za ispoljavanje (genetski
drift)
Inbredne životinje su genetski skoro identične
Primeri: Wistar-Kyoto pacovi, C57BL/6 i BALB/c
miševi
 “Konockout”
životinje
Životinje kod kojih je genetskim
inženjeringom otklonjen jedan od dva
gena
Svrha: dobijanje modelno obolelih
životnja
Koriste se za izučavanje gojaznosti,
ateroskleroze, diabetesa ….
KO, DKO, TKO, QKO itd.
 Transgene životinje
Životinje kojima je genom
izmenjen prebacivanjem u
njega tuđih gena
Ovakve životinje se koriste kao
modeli mnogih bolesti (tumori,
reumatološka oboljenja itd.)