Phương pháp phân tích hàm lượng

histamine tồn tại trong cá ngừ nguyên liệu

bằng phương pháp sắc kí lỏng cao áp HPLC
 Giới thiệu
Histamin là một amin sinh học
CTCT : C5H9N3
Tồn tại ở trong các sản phẩm từ cá do sự chuyển hóa từ a.a histidin dưới
tác dụng
của enzyme L hitidin decacboxylase
 Đặc điểm và tình trạng ngộ độc
histamine

•  Histamin có đặc tính chịu • Nếu lượng ăn vào từ 8 mg -

nhiệt, thậm chí khi được nấu
chín cũng không bị phá hủy.  cảm sẽ bị chảy nước mắt,
• Histamine biểu hiện tác dụng
của mình bằng việc kết hợp
với các thụ thể histamine tế
bào đặc hiệu. Có bốn loại thụ
thể histamine đã được xác
định đó là thụ thể thư H1 đến
H4.
40 mg Histamine, người nhạy
nước bọt
• Nếu lượng ăn vào từ 1.500
mg – 4.000 mg, người ăn có
̣ n như nhức đầu, đau
biểu hiê
bụng, tiêu chảy, mạch nhanh,
khó thở, nổi ban...
 Phương pháp sắc kí lỏng cao áp

• Cơ chế
• Histamin có trong mẫu thủy sản
và sản phẩm thủy sản được tách
chiết bằng metanol. Dịch chiết
được làm sạch trên cột trao đổi
anion, sau đó được tạo dẫn xuất
huỳnh quang với o-phthal aldehyt
(OPT). Hàm lượng dẫn xuất
histamin được xác định bằng hệ
thống HPLC với detector huỳnh
quang theo phương pháp ngoại
chuẩn.
 • Thuốc thử và vật liệu thử • Thiết bị, dụng cụ

1. Metanol 1. Cân phân tích,

2. Dung dịch axit HCl, 2,5 M 2. Bình nón
3. Dung dịch axit HCl, 1 M 3. Bình định mức
4. Dung dịch axit HCl, 0,1 M 4. Pipet thủy tinh
5. Dung dịch OPT
5. Bể siêu âm
6. Dung dịch H3PO4, 1,19 M
6. Giấy lọc
7. Các dung dịch chuẩn histamin
7. Máy nghiền
8. Dung dịch chuẩn gốc histami
9. Dung dịch chuẩn trung gian histamin
10.Các dung dịch chuẩn làm việc histamin
11.Dung dịch pha động
12.Nhựa trao đổi anion,
 Chuẩn bị mẫu thử

Nghiền
(200g mẫu) Cho vào bình định Tráng bình nón
mức bằng metanol

Cân (10g)
Định mức 100ml

Cho vào bình nón

50ml metanol
150ml
Lọc

Đồng hóa (2p)

Thu dung dịch

Đều nhiệt
(60oC, 15p
• Chuẩn bị mẫu trắng
Mẫu trắng là mẫu thuỷ sản đã được xác định không chứa histamin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng
như chuẩn bị với mẫu thử
• Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi 100 ppm
Thêm chính xác 1 ml dung dịch chuẩn histamin 1 000 mg/l vào 10 g mẫu trắng đã được nghiền. Tiến
hành chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi như chuẩn bị với mẫu thử
• Làm sạch mẫu
• Chuẩn bị cột làm sạch
Nhồi nhựa trao đổi anion đã được chuẩn bị vào cột thủy tinh đến chiều cao khoảng 8 cm và giữ
không để khô cột. Trước khi sử dụng phải rửa cột thủy tinh với 10 ml nước.
• Làm sạch mẫu
Lần lượt cho 1 ml dịch chiết thu được (kí hiệu V2) qua cột, rồi rửa cột bằng 4 ml đến 5 ml nước. Thu
dịch chảy ra vào bình định mức 50 ml đã chứa 5 ml dung dịch axit HCl 1 M . Khi lớp dung dịch cách
mặt trên lớp nhựa khoảng 2 mm phải cho tiếp nước vào cột cho đến khi thu được khoảng 35 ml dịch
giải hấp. Khóa cột rồi định mức phần dịch giải hấp thu được bằng nước để có 50 ml (kí hiệu V3).
 Tạo dẫn xuất huỳnh quang
• Dung dịch xác định đường chuẩn
Hút chính xác 5 ml các dung dịch chuẩn histamin làm việc vào các bình định mức 50 ml thêm 3 ml dung dịch NaOH 1
M vào mỗi bình rồi lắc đều. Sau khoảng 5 min, thêm 1 ml dung dịch OPT vào mỗi bình. Sau đúng 4 min, tiếp tục thêm
3 ml dung dịch H3PO4 1,19 M vào mỗi bình, định mức đến vạch bằng dung dịch HCl 0,1 M rồi lắc đều các bình.
Chú ý cần lắc đều dung dịch sau mỗi lần thêm thuốc thử, ít nhất 1 lần trong quá trình tạo phản ứng với dung dịch
OPT
• Mẫu trắng
Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu trắng đã được làm sạch vào bình định mức 50 ml. Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất
như đối với dung dịch xác định đường chuẩn theo.
• Mẫu xác định độ thu hồi
Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu xác định độ thu hồi đã được làm sạch vào bình định mức 50 ml. Sau đó, tiến hành
tạo dẫn xuất như đối với dung dịch xác định đường chuẩn.
• Mẫu thử
Hút chính xác 5 ml dịch chiết mẫu thử đã được làm sạch vào bình định mức 50 ml . Sau đó, tiến hành tạo dẫn xuất
như đối với dung dịch xác định đường chuẩn
 Tiến hành phân tích trên HPLC
Điều kiện phân tích
• cột sắc ký: cột C18
• nhiệt độ cột: 40 0C
• pha động: hỗn hợp gồm: KH2PO4 , axetonitril và TEA
• Tốc độ dòng : 1 ml/min
• bước sóng kích thích: 350 nm
• bước sóng phát xạ: 444 nm
• thể tích tiêm: 20 l
 Tính kết quả
Hàm lượng histamin có trong mẫu thử, C, biểu thị bằng miligam trên kilogam
(mg/kg) được tính theo công thức sau:

• Co là nồng độ histamin có trong dịch chiết mẫu (5.6.4), tính bằng microgam trên
mililit (g/ml);
• V1 là thể tích dịch mẫu thử (100 ml) đã được định mức (5.1);
V2 là thể tích dịch chiết được làm sạch (5.4.2) (1 ml dịch chiết thủy sản
hoặc 0,1 ml dịch nước mắm pha loãng);
V3 là thể tích dịch đã được làm sạch (5.4.2) chứa trong bình định mức (V3 =
50 ml);
m là khối lượng (10 g) của mẫu thử đã được nghiền (5.1).
• Ưu điểm • Nhược điểm
• Kết quả
• tiêu chuẩn codex cho đóng hộp
• cá ngừ và cá ngừ
• codex stan 119 Tuy1981
• rev 1995
Biện pháp
•  phòng ngừa ngộ độc histamine, Cục An toàn thực phẩm khuyến cáo chỉ lựa
chọn cá biển còn tươi, cá được bảo quản lạnh ngay sau khi đánh bắt, thịt cá
chắc, mắt trong, mang đỏ, cắt ra còn máu đỏ tươi, bụng cá còn kín, vây cá
dính chặt vào thân. Khi chế biến cá cần phải rửa sạch và nấu chín kỹ, chế biến
cá ngay sau khi mua về hoặc dã đông. Tuyệt đối không ăn cá biển ươn có biểu
hiện mắt đục, bề mặt cá nhớt, mang thâm, thịt nhão, màu thịt nhợt nhạt.
• Theo Thông tư số 29/2010/TT-BNNPTNT của Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn ban hành ngày 6/5/2010, hàm lượng histamine cho phép trong các
loại cá biển là 100mg/kg. Người tiêu dùng không nên sử dụng thịt cá chứa
hàm lượng histamine vượt mức cho phép để bảo đảm an toàn thực phẩm và
phòng chống ngộ độc.