SEPARACIONE

HROMATOGRAFSKE
METODE
 HROMATOGRAFIJA
• Hromatografija (od grč. χρώμα:chroma - boja i
γραφειν:grafein - pisati) je zajednički naziv za
grupu laboratorijskih tehnika za razdvajanje
smeša
• Ona uključuje kretanje ispitivane supstance,
rastvorene u "mobilnoj fazi", kroz "stacionarnu
fazu", čime se DELOVI SMEŠE RAZDVAJAJU
I IZOLUJU, te ih je moguće analizirati i
kvantitativno odrediti
• Hromatografija može biti analitička i
preparativna
 HROMATOGRAFIJA
• PREPARATIVNA HROMATOGRAFIJA se bavi
razdvajanjem komponenti iz smeše radi dalje obrade, pa
se može smatrati metodom prečišćavanja
• U ANALITIČKOJ HROMATOGRAFIJI se obično radi sa
malim uzorcima gde se pokušava izmeriti relativni odnos
komponenti u smeši
• Hromatografija je jedna od vodećih analitičkih metoda i
omogućava RAZDVAJANJE I KVANTITATIVNO
ODREĐIVANJE supstanci veoma slične strukture i
hemijskih osobina
• Pod hromatografijom se podrazumevaju metode
razdvajanja koje se zasnivaju na različitoj raspodeli
komponenata uzorka između dve faze, od kojih je jedna
nepokretna (STACIONARNA), a druga pokretna
(MOBILNA) u odnosu na prvu
 HROMATOGRAFIJA - Istorija
• Prvu hromatografsku tehniku je pronašao ruski botaničar Mihail
Cvet 1900. godine tokom svog istraživanja hlorofila. Koristio je
staklenu kolonu koja je sadržavala CaCO3 da bi razdvojio biljne
pigmente

• Zanimljivo je da Mikhailovo prezime "Tsvet" na ruskom jeziku

znači boja, tako da je moguće da je hromatografiju nazvao po
svom prezimenu

• Godine 1952. britanski naučnici Archer John Porter Martin i

Richard Laurence Millington Synge su dobili Nobelovu nagradu za
hemiju za svoje otkriće PARTICIONE HROMATOGRAFIJE

• Od tada, hromatografija se brzo razvija. Naučnici su ubrzo otkrili

da se principi Tsvetove hromatografije mogu primeniti na različite
načine i varijante. U isto vreme, poboljšane su i unapređene
tehničke performanse hromatografije, omogućavajući razdvajanje
veoma sličnih molekula
 Pojmovi u hromatografiji
• Analit je supstanca koja se razdvaja u hromatografiji
• Analitička hromatografija se koristi za određivanje prisustva i
koncentracije analita u uzorku
• Hromatogram je vizuelni prikaz rezultata hromatografskog postupka.
Svakoj supstanci odgovara određeni pik na hromatogramu
• Hromatograf je instrument za hromatografiju
• Eluent je komponenta separacijskog sistema koja pokreće uzorak kroz
kolonu
• Efluent je kompletna mobilna faza koja izlazi iz kolone
• Mobilna faza je faza koja se kreće u određenom pravcu. Može biti tečna
(LC) ili gasovita (GC). Mobilna faza se kreće kroz kolonu noseći uzorak
koji se razdvaja
• Preparativna hromatografija služi za prečišćavanje supstanci za
određene svrhe (ne za analizu)
• Retenciono vreme je vreme za koje analit prođe kroz hromatografski
sistem u određenim uslovima
• Stacionarna faza je supstanca koja je fiksirana u koloni (GC i LC) ili
ploči (npr. silikagel u TLC), na čijoj se površini određeno vreme
zadržavaju supstance koje se razdvajaju
Hromatogram

Hromatogram

Hromatografsko
razdvajanje crnog
mastila
 Klasifikacija hromatografskih
metoda
• Hromatografske metode je moguće podeliti prema
različitim kriterijumima:
• prema FIZIČKOM STANJU FAZA
• prema fizičko-hemijskim fenomenima koji se dešavaju prilikom
razdvajanja (MEHANIZMU RAZDVAJANJA)
• Podela prema fizičkom stanju faza
• Tečna hromatografija:
– Adsorpciona (tečno/čvrsto), npr. TLC, HPLC
– Jonska
– Ekskluziona
– Particiona (tečno/tečno)
• Gasna hromatografija:
– Gas/tečno
– Gas/čvrsto
• Superkritična fluidna hromatografija
 Klasifikacija hromatografskih
metoda
• Podela prema obliku sistema
– Kolonska hromatografija – hromatografija na
koloni
– Planarna hromatografija, npr. TLC

• Podela prema mehanizmu razdvajanja

– Jonoizmenjivačka (jonska) hromatografija
– Ekskluziona hromatografija
Hromatografija na koloni Hromatografsko razdvajanje hlorofila
 GASNA HROMATOGRAFIJA
• Gasna hromatografija (GC) je metoda razdvajanja i detekcije volatilnih -
ISPARLJIVIH organskih jedinjenja i nekih neorganskih gasova iz smeše
• GC je nastala 1950. godine i danas se razvila u jednu od primarnih tehnika u
hemijskoj analizi
• U GC dolazi do particionisanja - RASPODELE GASOVITOG UZORKA između
inertnog gasa kao mobilne faze i tečne ili čvrste stacionarne faze
• Uređaj za GC se naziva GASNI HROMATOGRAF
• Kao mobilna faza (GAS NOSAČ) najčešće se upotrebljavaju helijum, azot,
vodonik ili smeša argona i metana
• Izbor gasa zavisi od uzorka i detektora, a najviše se koristi HELIJUM
• Uzorak se unosi pomoću injektora (manuelni ili automatski) i nošen gasom prelazi
u kolonu
• Kolone za GC koje su se u početku koristile su tzv. pakovane kolone.
• Danas su u upotrebi KAPILARNE KOLONE, zbog bolje efikasnosti razdvajanja.
Unutrašnji zidovi kapilarne kolone su prevučeni čvrstim poroznim materijalom ili
viskoznom tečnošću
• U GC se koristi više tipova detektora, čiji se izbor vrši na osnovu komponente
koja se analizira
GASNA HROMATOGRAFIJA
 TEČNA HROMATOGRAFIJA
• Tečna hromatografija (LC) je razdvajanje supstanci na osnovu
distribucije između čvrste stacionarne faze i TEČNE MOBILNE FAZE
• Postoje dva tipa LC: klasična i LC visokih performansi (HPLC)
• Klasična LC koristi velike kolone, dužine i do 50 cm, pakovane poroznim
materijalom, a mobilna faza prolazi gravitaciono, pa je zbog toga mali
protok i metoda nije efikasna
• HPLC je moderna analitička tehnika kod koje se mobilna faza dovodi
pomoću pumpe. Uzorak se ubacuje pomoću manuelnog ili automatskog
injektora. Kolone za HPLC su punjene silikatnim ili polimernim
materijalom
• Postoji više tipova DETEKTORA za HPLC. Najčešće se koristi UV-VIS
detektor, a osim njega i fotodiodni, fluorescentni, elekrohemijski i dr.
• Na osnovu polarnosti razlikuje se LC na normalnim i obrnutim - reverznim
fazama
• Razdvajanje na NORMALNIM FAZAMA podrazumeva da je stacionarna
faza polarna (npr. silikatna), a mobilna faza nepolarna (npr.heksan)
• Kod razdvajanja na OBRNUTIM - REVERZNIM FAZAMA stacionarna
faza je nepolarna (npr. C-18 ugljovodonik), a MOBILNA FAZA
POLARNA (npr. voda i metanol)
TEČNA HROMATOGRAFIJA
Izgled hromatograma

1. boca sa gasom/tečnosti
2. regulator pritiska
3. uzorak
4. injektor
5. kolona
6. termostat
7. detektor
8. PC
9. štampač
10. hromatogram
Šema tečnog ili gasnog hromatografa
 TANKOSLOJNA
HROMATOGRAFIJA
• Tankoslojna hromatografija (TLC) koristi tanak sloj (0.10 –
0.25 mm) adsorbujućeg materijala (SILIKAGEL, aluminijum
oksid, celuloza) nanesen na čvrsti nosač od stakla,
aluminijuma ili plastike
• Uzorak rastvoren u odgovarajućem rastvaraču se nanosi u
vidu mrlje na jednu stranu ploče, na udaljenosti 1 cm od
ivice
• Ploča se unosi u komoru na čijem dnu se nalazi rastvarač koji
kapilarnim silama prolazi kroz adsorbens noseći sa sobom
komponente uzorka, koje se kreću do određene udaljenosti
na ploči i na taj način ih razdvaja
• Zbog različitog afiniteta prema adsorbujućem materijalu
komponente se zaustavljaju na različitim mestima na
ploči, što omogućava njihovu identifikaciju (razvijanjem
boje ili posmatranjem pod UV lampom)
 TANKOSLOJNA
HROMATOGRAFIJA
 JONOIZMENJIVAČKA
HROMATOGRAFIJA
• Jonoizmenjivačka hromatografija (IEC) ili jonska
hromatografija je tehnika koja ima dosta sličnosti sa HPLC
tehnikom
• Kao stacionarna faza koriste se umrežene polimerne smole
(najčešće polistirenske smole umrežene pomoću divinil-
benzena), na koje su kovalentno vezane jonske funkcionalne
grupe
• Te grupe su neutralisane jonima suprotnog naelektrisanja i
oni mogu biti zamenjeni jonima koji su prisutni u ispitivanom
uzorku
• U zavisnosti od afiniteta, joni će se različito vreme
zadržavati na stacionarnoj fazi, što omogućava njihovo
razdvajanje
• Generalno, jonoizmenjivač favorizuje vezivanje jona većeg
naelektrisanja i manjeg radijusa
• Kao mobilna faza najčešće se upotrebljavaju puferi
 Jonoizmenjivačka hromatografija
Uređaj za jonoizmeljivačku hromatografiju

Combining IEC DEAE-825 (a column for weak

anion exchange chromatography) with an
electrochemical detector (ECD) has permitted
sensitive detection of cyanide.
With this method, the detection limit of cyanide
is 0.2 micro-g/L.
Column: Shodex IEC DEAE-825 (8.0mmID*75mm
Eluent: (10mM Sodium carbonate + 1mM
Ethylenediamine) aq./CH3OH=90/10
Flow rate: 1.0mL/min
Detector: ECD(Electrode; Ag 0mV SCE)
Column temp. : 40deg-C
Sample: 1μg/L, 100μL
EKSKLUZIONA HROMATOGRAFIJA
• Ekskluziona hromatografija je metoda kod koje se
separacija komponenata vrši na osnovu veličine čestica
• Kao stacionarna faza koriste se porozni materijali (silikagel
ili polimerne smole)
• Manje čestice mogu ući u pore stacionarne faze i
zadržavaju se duže vremena
• Veće čestice koje su prisutne u uzorku ne mogu ući u pore i
eliuraju se pre
• Ovaj tip hromatografije se naziva još i gel-filtracija ili
hromatografija na molekularnim sitima
• Engleski naziv je size exclusion chromatography, pa se
koristi akronim SEC. Ova metoda je pogodna za razdvajanje
proteina
EKSKLUZIONA HROMATOGRAFIJA

Size Exclusion Chromatography

 SUPERKRITIČNA FLUIDNA
HROMATOGRAFIJA
• Superkritična fluidna hromatografija
(SFC) je metoda kod koje je
MOBILNA FAZA gas na temperaturi i
pritisku iznad kritičnih vrednosti
(pod ovim uslovima mobilna faza je
superkritični fluid – niti je gas niti
tečnost)
• Superkritični fluidi imaju viskoznost
sličnu gasovima, pa lako prolaze kroz
kapilarne i pakovane kolone bez
potrebe za visokim pritiskom kao kod Aparat za SFC
HPLC metode
• Gustina superkritičnih fluida je slična
tečnostima, pa se ponašaju kao rastvarač
• Najčešće se koristi CO2
• Njegova kritična temperatura je 31°C i
kritični pritisak 72.9 bar-a (atm) što se
relativno lako postiže
 SUPERKRITIČNA FLUIDNA
HROMATOGRAFIJA

Fazni dijagram za superkritični fluid Dijagram i šema SFC

SUPERKRITIČNA FLUIDNA
HROMATOGRAFIJA
REFERENCE

• Savić,J., Savić, M.: Osnovi analitičke hemije, Svjetlost Sarajevo, 1987

• Sadek, P.C.:Illustrated pocket dictionary of chromatography, John Wiley & Sons,
2004 ISBN 0471200212
• Rouessac, F., Rouessac, A.: Chemical Analysis: Modern Instrumentation methods
And Technques, John Wiley & Sons, 2007 ISBN 9780470859025
• Settle, F.A.: Handbook of instrumental techniques for analytical chemistry, Prentice
Hall, 1997 ISBN 0131773380
• Robert Meyers (Editor): Encyclopedia of physical science and technology, Third
edition, Ramtech Limited, Kalifornija, 2001 ISBN 0122274105
• Harvey, D.: Modern Analytical Chemistry, McGraw Hill, 2000 ISBN 0072375477
• http://ull.chemisty.uakron.edu/chemsep/super/
• Smith R. M.; Nomenclature for supercritical chromatography and extraction, IUPAC
Recommendations, Pure Appl. Chem. 1993, 65(11), 2397-2403.
• Christie W. W.; Supercritical Fluid Chromatography and Lipids, Lipid Technology ,
1990, 2, 107-109.
• Dixon D. J. and Jhonston K. P.; Encyclopedia of Separation Technology, Ruthven
D. M.Ed., John Wiley, 1997, 1544-1569.
• http://www.j-chrom-sci.com/jan-apr95.htm
• Rozzi N.L. and Singh R.K.; Supercritical fluids and the food industry,
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety , 2002, 1, 33-40.
• Supercritical Fluids-Fundamentals and Applications,
http://chemeng.iisc.ernet.in./giridhar/rect.html