Primjena nuklearne

mikroskopije u detekciji
metala kod
neurodegenerativnih bolesti

mag. biol. mol. Doktorski studij Molekularne bioznanosti

Nina Čorak Sveučilište Josipa Jurja Strossmayera u Osijeku

Institut Ruđer Bošković Nuklearne metode za analizu bioloških uzoraka

Laboratorij za evolucijsku genetiku dr. sc. Ivančica Bogdanović Radović

NEURODEGENERATIVNE BOLESTI

• Nepravilno smatanje proteina koji u zdravim stanicama

obavljaju normalne fiziološke funkcije
• Agregacija nepravilno smotanih proteina
• Oštećenje i smrt neurona uzrokuju gubitak njihove
funkcija
NEURODEGENERATIVNE BOLESTI

• ALZHEIMEROVA BOLEST
• AMILOIDNI PLAKOVI, NEUROFIBRILARNI FILAMENTI

• PARKINSONOVA BOLEST
• 𝛂-SINUKLEIN, NEUROMELANIN

• BOLEST MOTORNIH NEURONA (ALS)

• HUNTINGTONOVA BOLEST
• PRIONSKE BOLESTI
ULOGA METALA U RAZVOJU
NEURODEGENERATIVNIH BOLESTI
• mozak ima visok udio metala u odnosu na ostala tkiva
• mehanizmi kako metali oštećuju neurone:
• poremećaj prijenosa i skladištenja metalnih iona
• aberantno vezanje metalnih iona na proteine
• uzročnici oksidativnog stresa (nastanak slobodnih radikala)
• LIPIDNA PEROKSIDACIJA
• OKSIDACIJA PROTEINA
• OKSIDACIJA DNA
SLOBODNI RADIKALI LIPIDNA PEROKSIDACIJA

O2 + e− → •O−2
2 H+ + •O−2 + •O−2 → H2O2 + O2
H2O2 + e− → HO− + •OH
2 H + + 2 e − + H 2 O 2 → 2 H 2O
NUKLEARNE
ANALITIČKE
METODE

Inductively coupled plasma

OSTALE Tradicionalno bojanje
stanica
METODE
• PREDNOST: prostorno razlučenje
• NEDOSTATAK: veže samo slobodne
ione, teška detekcija malih količina,
teško za kvantizirati
mass spectrometry i
atomska spektrometrija
• PREDNOST: detekcija veoma malih
količina
• NEDOSTATAK: rade s homogeniziranim
uzorcima, nema informacija o distribuciji
unutar stanice
 IONSKA ENERGIJA ZRAKE veća energija
→ manja valna duljina → bolje razlučenje
→ analiza uzoraka veće debljine

ZRAKA APERTURA mala apertura → dubinsko izoštrenje → bitno za

analizu uzoraka velike debljine
premala apertura → difrakcija na pukotini → lošija
rezolucija
Nabijene čestice mogu
RJEŠENJE: manji
se uspješno fokusirati i
akcelerirati pomoću JAKOST STRUJE Više čestica dospije do detektora u kraćem vremenu
→ bolje prostorno razlučenje
magneta.

1.22 λ 0.61 λ
𝑟= =
2𝑛 𝑠𝑖𝑛 𝜃 𝑁𝐴

Premala numerička
apertura uzrokuje
difrakciju
→ smanjeno razlučenje
 PIXE (PARTICLE INDUCED X-RAY EMISSION)

GEOMETRIJSKI ANALITIČKI
ODAZIV NA PARAMETRI PARAMETRI
FIZIKALNI PARAMETRI Baždarenje Q – količina upadnih iona
DETEKTORU semiempirijski određeni transmisija kroz Nz – količina kemijskog
količina fotona detektor, prostorni kut elementa po volumenu
dx – debljina

𝑑 𝑁 𝑥 = 𝜎 𝑍 ( 𝐸 ) ∙ 𝜔 𝑍 ∙ 𝑏∙ 𝑇 𝑡𝑜𝑡 ∙ 𝜀 ∙ Ω ∙𝑄 ∙ 𝑁 𝑍 ∙ 𝑑𝑥
BS (BACKSCATTERING SPECTROSCOPY)

[( ]
2

𝐾=
𝐸1
𝐸0
=
1
𝑚+𝑀 )
∙ ( 𝑚 ∙ cos 𝜃 ± √ 𝑀 −𝑚 𝑠𝑖𝑛 𝜃 )
2 2 2

• Energija reflektirane čestice ovisi o:

• vrsti čestice u uzorku
• dubini sloja na kojoj je došlo do kolizije
• Prednosti:
• Detekcija lakih elemenata (C,O,N)
• Mjerenje Q (ukupni broj registriranih
čestica svih energija)
• Ograničenja: Adetektirani>Aupadne čestice
STIM (SCANNING TRANSMISSION ION SPECTROMETRY)

• Ne zahtijeva upotrebu
ionske zrake visoke 𝑀 𝑊 𝑑𝐸
energije
𝑚= ∫
𝑁 𝜀( 𝐸 )
𝑚
→ minimalno oštećenje uzorka 𝜌=
𝐴∙𝑑
• Mjeri se energija iona
transmitiranih kroz
uzorak
• Gubitak energije ovisi o
debljini i gustoći uzorka
THREE ION
BEAM METODA

CILJ: w=melementa/muzorka

EKSPERIMENTALNI SLIJED:
1. STIM
• Ne dolazi do oštećenja uzorka
jer se koriste alfa čestice malih
energija
2. BS I PIXE simultano
• Protoni visokih energija
• Omjer ugljika I vodika poznat iz
eksperimentalnih podataka za
svako tkivo
 • Materijali od kojih je građena goniometrijska glava ne
THREE ION smiju prilikom interakcije sa zračenjem stvarati
detekcijski šum
BEAM METODA • U komori za analizu mora biti niska temperatura kako bi
se spriječilo termičko gibanje čestica

NUKLEARNA PROBA
• Velika površina STIM
detektora I mala
udaljenost od uzorka
• Karbonski filter
• Zaštita detektora
• Filtriranje valnih duljina
elemenata koji nisu od
eksperimentalnog interesa
 THREE ION
BEAM METODA

PREDNOSTI METODE:

1. POGODNO ZA DETEKCIJU
ELEMENATA U TRAGOVIMA
2. DOBRA REZOLUCIJA – NA
SUBCELULARNOJ RAZINI
 THREE ION CARMONA, 2008.
BEAM METODA Quantitative micro-analysis of metal ions in
subcellular compartments of cultured dopaminergic
cells by combination of three ion beam techniques
A. Carmona, G. Devès, R. Ortega

poremećeni metabolizam željeza dovodi do

gubitka dopaminergičnih neurona u
substania nigra pars compacta.
PREDNOSTI METODE:

1. POGODNO ZA DETEKCIJU METALI Zn, K, Fe

ELEMENATA U TRAGOVIMA
2. DOBRA REZOLUCIJA – NA KOMPARTIMENTI jezgra, citosol,
SUBCELULARNOJ RAZINI distalni završetci neurona
CARMONA, 2008. - metodologija

PRIPREMA - stanice uzgajane izravno na nosaču

UZORKA freeze-dry metoda

TIPOVI - stanice uzgajanje u mediju s fiziološkom

UZORAKA koncentracijom željeza (kontrola)
- stanice uzgajane s povišenom
(netoksičnom) količinom željeza
- standardi poznatog sastava I
debljine - baždarenje i validacija metode

VELIČINE - 40 𝛍m × 40 𝛍m (1-2 stanice,

ANALIZIRANIH određivanje subcelularne koncentracije)
PODRUČJA - 200 𝛍m × 200 𝛍m (oko 50 stanica,
prosječna koncentracija, kontrola)
CARMONA, 2008. - rezultati
CARMONA, 2008. - zaključak
• Prilikom izlaganja dopamirgenergičnih neurona povišenim količinama
Fe2+ iona značajno se povećava količina željeza u distalnim krajevima
stanice
• Potencijalna interakcija željeza s dopaminom unutar
neurotransmiterskih vezikula
PRIPREMA UZORKA ZA ANALIZU
NUKLEARNIM METODAMA

• Očuvanje bioloških struktura

• Očuvanje distribucije elemenata unutar
uzorka
• Minimalna kontaminacija eksternim
izvorom biometala
PRIPREMA UZORKA ZA ANALIZU
NUKLEARNIM METODAMA – objekt istraživanja
STANIČNA KULTURA
Carmona, 2008.
Stanice uzgajane izravno na sterilnom
nosaču.
Dodatno zaštićene polikarbonatnim filmom
debljine koja dopušta analizu.
MODELNI ORGANIZAM
Fiedler, 2007. • Rajendran, 2009.
Priprema životinje prije izolacije mozga:
- anestezija CO2
- transkardijalna perfuzija (antikoagulans,
fiziološka otopina)
očuvanje volumena mozga
ispiranje krvi
(sadrži Fe koji može utjecati na analizu)
PRIPREMA UZORKA ZA ANALIZU
NUKLEARNIM METODAMA – fiksacija
KEMIJSKA FIKSACIJA
Fiedler, 2007.
FIKSACIJA
(paraformaldehid)
DEHIDRATACIJA →
PARAFIN
REZANJE PREPARATA
UKLANJANJE PARAFINA
REHIDRATACIJA→ PUFER
FREEZE – DRY METODA FROZEN – HYDRATED
Carmona, 2008. • Rajendran, 2009.
Vavpetić, 2015.
METODA
Vavpetić, 2015.
KRIOFIKSACIJA = imobilizacija svih Uzorak ohlađen u propanu ohlađenom pomoću
tekućeg dušika I narezan pomoću kriotoma.
molekula u stanici + sublimacija vode
(niska temperatura) Uzorci između zaštitnih folija
– održavanje vakuuma u komori za analizu
RAJENDRAN, VEVPETIĆ
Uzorak → kriofiksacija → rezanje uzorka (listovi, izopod)
nema sublimacije + manje
CARMONA
Tretiranje stanica → PBS → sterilna H2O → kriofiksacija
oštećenje protonskom zrakom →
→ promjera očuvanosti stanica svjetlosnom očuvanje integriteta uzorka
mikroskopijom
VAVPETIĆ, 2015.
Elemental distribution and sample integrity comparison of freeze-dried and frozen-
hydrated biological tissue samples with nuclear microprobe
P. Vavpetić, K. Vogel-Mikuš, L. Jeromel, N. Ogrinc Potočnik, P. Pongrac, D. Drobne, Ž. Pipan Tkalec, S. Novak, M. Kos, Š̌.
Koren, M. Regvar, P. Pelicon

FREEZE-DRIED FREEZE-DRIED
FROZEN-HYDRATED
FROZEN-HYDRATED FROZEN-HYDRATED
VAVPETIĆ, 2015.
• CILJ: usporedba freeze-dried metode i frozen-hydrated metode pripreme
uzoraka za potrebe kvalitativnog opisa prostorne distribucije biometala
pomoću three ion beam metode (STIM/RBS/PIXE)

FREEZE-DRIED FREEZE-DRIED
FROZEN-HYDRATED
FROZEN-HYDRATED FROZEN-HYDRATED
 NISKA VISOKA
KONCENTRACIJA KONCENTRACIJA
VAVPETIĆ, 2015. - rezultati

HYDRATED
FROZEN

Thlaspi praecox
FREEZE
DRIED
 NISKA VISOKA
KONCENTRACIJA KONCENTRACIJA
VAVPETIĆ, 2015. - rezultati

HYDRATED
FROZEN
FREEZE
DRIED
Porcellio scaber
 NISKA VISOKA
KONCENTRACIJA KONCENTRACIJA
VAVPETIĆ, 2015. - rezultati

FROZEN HYDRATED
Daphnia magna
VAVPETIĆ, 2015. - zaključak
• Uzorci nisu oštećeni prilikom analize pomoću protonske zrake (nema
ujednačenog zamućenja slika)
• Postoji razlika u distribuciji nekih metala između uzoraka pripremljenih
pomoću freeze-dried i frozen-hydrated metode
• Frozen-hydrated metoda je pogodna za analizu bioloških uzoraka jer
nema degradacije uzorka prilikom izlaganja zračenju
 Intracellular iron concentration of neurons with and
FIEDLER without perineuronal nets
2007. A. Fiedler, T, Reinert, M. Morawski, G. Bru ̈ckner, T. Arendt, T. Butz

PERINEURALNA - vrsta ekstracelularnog matriksa

MREŽA - polianionski karakter – vezanje Fe
- prisutna kod subpopulacije stanica koje su manje osjetljive
ne degeneraciju kod neurodegenerativnih bolesti

TIPOVI UZORAKA dijelovi mozga štakora (5 različitih)

KOMPARTIMENTI citoplazma, jezgra, jezgrica

METALI Fe, Ni, S, P, Ca

FIEDLER DETEKTIRANJE CRNOG REAKCIJSKOG
PRODUKTA KOJI DAJE NIKAL
SVJETLOSNOM MIKROSKOPIJOM
Promjera da je metoda detekcije
perineuralne mreže three ion beam
metodom uspješna
2007. KONTROLA - UZORAK NIJE FIKSIRAN Provjera da fiksiranje ne utječe na
količinu metala
vizualizacije
perineuralne KONTROLA - NIJE PROVEDENO BOJANJE Provjera da bojanje niklom ne utječe na
NIKLOM količinu ostalih metala
mreže

antitijela koja se
specifično vežu na
perineuralnu mrežu

DAB-Ni = indikator za
H 2O 2
FIEDLER, 2007. - rezultati
FIEDLER,
2007.
rezultati
FIEDLER, 2007. - rezultati
FIEDLER, 2007. - rezultati

• U jezgrici dolazi do
značajnoj povećanja
količine Fe
• rRNA
• Enzimi

• Jezgrica je malog
volumena – malo
doprinosi ukupnoj
koncentraciji Fe
FIEDLER, 2007. - zaključak

• Neuroni koji posjeduju perineuralnu mrežu imaju značajno veću

koncentraciju željeza u jezgrici od neurona koji nemaju perineuralnu
mrežu
• Neuroni koji posjeduju perineuralnu mrežu imaju veću koncentraciju
željeza od neurona koji nemaju perineuralnu mrežu
• Distribucija željeznih iona u perineuralnoj mreži ne pokazuje odstupanje
od distribucije željeznih iona u citoplazmi neuralnih stanica
POTENCIJALNA OBJAŠNJENJA:
• oksidacija Fe2+ u Fe3+ na perineuralnoj mreži i transport u glia stanice
• neuroni sa perineuralnom mrežom imaju brži metabolizam te zahtijevaju veće
količine Fe
 A novel approach to the identification and quantitative elemental
RAJENDRAN analysis of amyloid deposits—Insights into the pathology of Alzheimer’s
disease - R. Rajendran , R. Minqin, M. D. Ynsa, G. Casadesus, M. A. Smith, G.
2009. Perry, B. Halliwell, F. Watt

CILJ Mjerenje količine biometala u amiloidnom plakovima

ZAŠTO? Fe, Cu i Zn povezani s oksidativnim stresom te formiranjem i

agregiranjem amiloidnih plakova kod pacijenata s Alzheimerovom
bolesti

OBJEKT mozak modelnog miša za Alzheimerovu bolest (mutacija)

ISTRAŽIVANJA
KONTROLE - miševi koji ne posjeduju mutaciju (zdravi miševi)
- stanične regije modelnog miša za Alzheimerovu bolest bez
amiloidnih plakova

METALI Fe, Zn, Cu, P, S, K, Ca

RAJENDRAN, 2009.

AMILOIDNI PLAKOVI
→ lipidna peroksidacija, REAKTIVNI
OBLICI
oksidacija proteina, KISIKA

oksidacija DNA

ANTIOKSIDANSI → sprečavaju toksično

djelovanje amiloidnih vlakana AMILOIDNI
PLAKOVI
RAJENDRAN, 2009.

Regulacija metabolizma
Zn amiloidnih prekursora

Vežu se na histidinske REAKTIVNI

OBLICI
ostatke amiloidnih KISIKA
vlakana
Cu
Kovalentno povezivanje
amiloidnih vlakana

Agregiranje amiloidnih
Fe plakova u blago kiselim AMILOIDNI
uvjetima PLAKOVI
RAJENDRAN, 2009. - metodologija
PRIPREMA UZORKA izolacija mozga miša, freeze-dry metoda

THREE ION BEAM 1. STIM Detekcija amiloidnih plakova na

METODA 2. BS/PIXE osnovu razlike u gustoći - STIM metoda

VALIDACIJA METODE Imunohistokemijsko bojanje

– uspješna detekcija amiloidnih plakova STIM mikroskopijom

PREDNOSTI METODE Nema izolacije plakova, gubitka I redistribucije metalnih iona

Nema bojanja uzorka
Simultana detekcija metala od interesa
 RAJENDRAN, 2009. – rezultati i zaključak

• Amiloidni plakovi imaju povišenu količinu Fe, Cu i Zn u odnosu dijelove tkiva bez plakova
• Oksidativni stres potiče razvoj amiloidnih plakova, a amiloidni plakovi potiču oksidativni
stres
 FIEDLER 2007.
Intracellular iron concentration of
neurons with and without
perineuronal nets
A. Fiedler, T, Reinert, M. Morawski, G. Bru
̈ckner, T. Arendt, T. Butz
Nuclear Instruments and Methods in
Physics Research
(2007)
CARMONA, 2008.
Quantitative micro-analysis of metal
ions in subcellular compartments of
cultured dopaminergic cells by
combination of three ion beam
techniques
A. Carmona, G. Devès, R. Ortega
Analytical and Bioanalytical Chemistry
(2008)
RAJENDRAN 2009.
A novel approach to the
identification and quantitative
elemental analysis of amyloid
deposits—Insights into the
pathology of Alzheimer’s disease
R. Rajendran , R. Minqin, M. D. Ynsa, G.
Casadesus, M. A. Smith, G. Perry, B.
Halliwell, F. Watt
Biochemical and Biophysical Research
Communications
(2009)
VAVPETIĆ, 2015.
Elemental distribution and sample
integrity comparison of freeze-dried
and frozen-hydrated biological tissue
samples with nuclear microprobe
P. Vavpetić, K. Vogel-Mikuš, L. Jeromel, N.
Ogrinc Potočnik, P. Pongrac, D. Drobne, Ž.
Pipan Tkalec, S. Novak, M. Kos, Š̌. Koren, M.
Regvar, P. Pelicon
Nuclear Instruments and Methods in Physics
Research
(2015)