ABSTRAK

Teknik fotometri digunakan dalam eksperimen ini untuk mengkaji

penentuan protein dan fosfat tak organik di dalam suatu ekstrak. Teknik fotometri
ini berasaskan kepada prinsip penyerapan cahaya dalam julat ultra lembayung
(200-400 nm), sinaran tampak (400-700 nm) dan sinaran infra merah dekat (700900 nm). Terdapat banyak kaedah yang boleh digunakan untuk menentukan
protein di dalam larutan. Contoh kaedah-kaedah yang boleh digunakan untuk
penentuan protein ini adalah seperti menggunakan kaedah Folin-Ciocalteau,
yang menggunakan jarak gelombang 700nm dan kaedah ujian Biuret, dengan
menggunakan jarak gelombang 550nm. Bagi fosfat pula, penentuan di lakukan
dengan menggunakan kaedah Tausky dan Sherr dimana jarak gelombang yang
digunakan ialah 725nm. Nilai bacaan yang diperolehi daripada daya penyerapan
larutan di catatkan, graf piawai bagi protein dan fosfat boleh di plotkan dengan
menendakan paksi-y sebagai nilai daya penyerapan dan paksi-x sebagai
kepekatan sampel. Dengan menggunakan graf piawai tersebut, kepekatan
sampel piawai protein menggunakan kaedah Folin-Ciocalteau boleh di dapati.
Melalui keputusan yang didapati ini, kesimpulan yang boleh dibuat adalah
eksperimen yang menggunakan campuran atau gabungan kaedah-kaedah di
atas sesuai digunakan untuk protein yang berkepekatan rendah hingga protein
yang berkepekatan tinggi.

TEORI
Ada beberapa kaedah yang boleh digunakan untuk menentukan protein
dalam larutan. Namun, tiada satu kaedah tunggal yang boleh dikatakan paling
baik. Kaedah yang dipilih tertakluk kepada ciri protein yang dikaji dan ciri bahan
lain yang berada dalam larutan sampel protein. Kaedah yang dipilih haruslah
memberi keputusan yang tepat dan boleh dipercayai serta mempunyai kepekaan
yang tinggi. Kaedah yang biasa di gunakan adalah seperti ujian Biuret, ujian

Folin-Ciocalteau, penitratan Kjeldahl dan spektrofotometri

ultralembayung.

Dalam eksperimen ini kaedah Biuret dan kaedah Folin-Ciocalteau di gunakan.

KAEDAH BIURET
Kaedah Biuret ini menggunakan sebatian yang mengandungi 2 atau lebih
ikatan peptida seperti yang terdapat dalam suatu protein boleh bertindakbalas
dengan reagen kuprum sulfat dalam larutan alkali yang menghasilkan warna
biru. Warna ini dihasilkan oleh kompleks atom kuprum yang berkoordinat dengan
4 atom nitrogen. Ujian Biuret digunakan untuk menentukan protein yang pekat
(1.20 mg). Ia dinamakan sebagai Biuret kerana sebatian Biuret (HN 2-CONH_CO-NH2) memberi ujian positif dengan reagen.
Protein + NaOH + CuSO4

Kompleks CU2+

- protein

(warna ungu)
UJIAN FOLIN-CIOCALTEAU
Kaedah ini adalah lebih peka dari ujian Biuret. Ianya digunakan untuk
menentukan protein yang terlarut dan menentukan protein yang tidak terlarut
dalam pelarut sebanyak 5 g protein per mililiter boleh ditentukan. Warna
kompleks terhasil ialah biru-tua iaitu sama dengan ujian Biuret, tetapi ia perlu di
ikuti dengan suatu tindakbalas lagi, iaitu penurunan fosfomolibdat-fosfotungstat
(dalam reagen) oleh tirosina dan triptofana yang hadir dalam molekul protein.
PENENTUAN FOSFAT
Kaedah Fiske-Subbarow yang

di

ubahsuai dinamakan

Kaedah

pewarnaan Fiske-Subbarow atau kaedah Tausky dan Shorr. Ianya digunakan

dalam menentukan kepekatan fosfat tak organik. Kedua kaedah ini dapat
menentukan kepekatan fosfat antara 0.1 1.0 m fosfat/ ml dalam larutan.
Dalam kaedah Tausky dan Shorr yang digunakan dalam eksperimen ini, fosfat
tak organik di kompleks oleh kumpulan molibdat untuk membentuk kompleks

fosfomolibdat. Kompleks yang terhasil ini bertindakbalas dengan FeSO 4 untuk

membentuk warna biru.
SPEKTROFOTOMETRI
Satu alat yang digunakan untuk menentukan kepekatan protein atau fosfat
dalam larutan dinamakan Spektrofotometer. Ia adalah satu alat yang penting
bagi ahli biologi dan biokimia kerana banyak sebatian biologi dan biokimia boleh
menyerap

cahaya

dalam

julat

ultra-lembayung

(200-400nm),

sinaran

ternampakkan (400-700nm) dan sinaran inframerah dekat (700-900nm).

Spektrofotometer terdiri dari tiga komponen yang penting. Pertamanya adalah
sumber cahaya, kedua penganalisa dan ketiga pengesan yang dihubungkan
dengan meter atau perakam.
Cahaya putih dari lampu tungsten melalui celah masuk dan difokuskan
oleh kanta medan ke atas kanta objektif. Kanta objektif memfokuskan imej
medan keatas kanta objektif. Kanta objektif memfokuskan imej celah masuk
pada celah keluar selepas cahaya disebarkan oleh parutan atau prisma
(penganalisa) dan dipantulkan oleh silinder

(cam) memutarkan prisma atau

parutan supaya hanya panjang-gelombang yang dikehendaki melalui celah

keluar. Cahaya monokromatik yang keluar dari prisma atau parutan melalui
sampel yang berada di dalam suatu tabung uji atau kuvet dalam lintasan cahaya.
Cahaya monokromatik itu berakhir pada tabung-foto sukatan, dimana tenaga
cahaya

diubahbentukkan

kepada

suatu

isyarat

eletrik. Apabila

sampel

dikeluarkan dari spektrometer, satu alat halangan (occluder) akan tumbang untuk
merintang semua cahaya keatas tabung- foto secara automatik. Spektrometer ini
dapat di sesuaikan untuk mendapat 0%T pada meter. Suatu tombol untuk
menyesuaikan 100%T diberikan juga untuk menentukan 100%T (Daya
penyerapan sifar) dengan suatu larutan rujukan (biasanya pelarut) dalam
pemegang sampel.

PRINSIP FOTOMETRI.
Prinsip fotometri adalah berdasarkan kepada dua hukum yang terkenal
iaitu Hukum Lambert dan Hukum Beer. Apabila cahaya putih melalui larutan
yang mengandungi sebatian bewarna, jarak gelombang cahaya yang tertentu
diserap secara terpilih. Warna yang terhasil disebabkan dari cahaya terpancar. Io
ialah keamatan cahaya tuju dan I merupakan keamatan cahaya terpancar
melalui bekas/kuvet yang tebalnya b cm, mengandungi larutan berkepekatan c
mol/L :

Io

I
Larutan = c mol
L
Sebatian bewarna dalam larutan

Hukum Lambert menyatakan bahawa jika satu alur cahaya monokromatik

melalui suatu medium atau suatu larutan , daya penyerapan medium itu adalah
berkadar terus dengan jarak lintasan yang dilalui. Penyerapan cahaya ini boleh
dituliskan seperti berikut:
A= 10g

lo

= Kl

L
Dimana,
A

daya penyerapan atau ketumpatan optik

keamatan cahaya yang melalui sampel

lo

keamatan cahaya tuju kepada sampel

jarak lintasan cahaya atau panjang medium yang dilalui oleh

cahaya
K

suatu pemalar kekadaran yang bersandarkan kepada sifat molekul,

jarak gelombang kepekatan larutan dan lain-lain.

Hukum

Beer

menyatakan

bahawa

apabila

suatu

alur

cahaya

monokromatik melalui suatu larutan atau medium, jika jarak lintasan di tetapkan,
daya penyerapan berkadar terus kepada kepekatan sampel dalam larutan.Daya
penyerapan A boleh di ungkap sebagai :
A = 1010 I0 = KC
I
di mana C = kepekatan sampel
K =

pemalar kadar yang bersandaran kepada sifat sampel, jarak

gelombang,
jarak lintasan dan lain-lain.
Dengan menggabungkan kedua hukum ini , kita dapati
A = log10 I0 = ecl

atau

I=

Ioe-kcl

I
dimana E = keserapan molar jika c dalam unit mol/liter dan I dalam unit cm.
Ia adalah pemalar kekadaran yang di kenali sebagai pekali pemadanan
molar.
Kadangkala nilai penghantaran T%

boleh digunakan untuk menentukan

kepekatan
sampel. Nilai tersebut diberi oleh persamaan T = I

= e-kcl

dimana I

pemancaran.
I0

I0

Persamaan itu memberi kepekatan daya penyerapan linear jika e dan I

adalah tetap. Suatu larutan akan mempunyai suatu pemalar spesifik pada suatu

panjang gelombang tertentu. Plot daya penyerapan lawan kepekatan larutan

yang mengikut hukum Beer-Lambert kelihatan seperti rajah di bawah.

Daya
Serapan
A

Kepekatan
Terdapat juga banyak larutan kimia dan protein yang tidak bewarna di
dalam air. Keadaan yang sedemikian memerlukan sebatian tadi ditindakbalaskan
dengan satu atau banyak reagenuntuk menghasilkan suatu kompleks yang
mempunyai warna khas. Keamatan warna yang terbentuk adalah berkadar
dengan kepekatan sebatian asal yang tidak mempunyai warna jika tindakbalas
ituberlaku secara kuantitatif. Sebatian yang tidak diketahui kepekatannya,
biasanya kiya menggunakan satu siri larutan piawai yang mempunyai kepekatan
yang kita telah ketahui dan suatu larutan blank (terdiri daripada pelarut sahaja).
Kepekatan sebatian yang belum diketahui boleh ditetukan dengan mengukur
daya penyerapannya daripada plot piawai yang dibuat berdasarkan siri larutan
piawai tadi.

KEPUTUSAN DAN ANALISIS

Jadual 1.1: Penentuan protein dengan Kaedah Folin Ciocalteau.
Protein

Isipadu

Kepekatan

Larutan

Reagen

Daya

Tabung

Piawai

Air (ml)

Protein

Cu-

Folin

Penyerapan

uji

(ml)

(g)

(g/ml)

Beralkalin

(nm)

(ml)
1

0.0

1.00

0.0

0.5

0.05

0.95

50.0

0.5

0.085

0.10

0.90

100.0

0.5

0.220

0.15

0.85

150.0

0.5

0.273

0.20

0.80

200.0

0.5

0.419

0.30

0.70

300.0

0.5

0.449

1.00

0.00

338.0

0.5

0.616

1.00

0.00

234.0

0.5

0.428

(blank)

7
(sampel 1)
8
(sampel 2)

i) Dari jadual 1.1, nilai daya penyerapan adalah berkadar terus dengan
kepekatan protein.
ii) Dari graf ,kepekatan protein dalam larutan sampel 1 tabung uji 7 adalah
338.0 g.
iii) Dari graf, kepekatan protein dalam larutan sampel 2 tabung uji 8 adalah
234.0 g.

Jadual 1.2 : Penentuan protein dengan menggunakan Kaedah Biuret.

Air

Larutan

Larutan

Reagen

Kepekatan

Daya

Tabung

Suling

Protein

Protein

Biuret

Protein

Penyerapan

uji

(ml)

Piawai

Uji

(ml)

(g)

(nm)

1mg/ml(ml)

(ml)

0.8

0.2

200

0.008

0.6

0.4

400

0.019

0.4

0.6

600

0.030

0.2

0.8

0.0

1.0

0.5

0.5

0.1

0.9

1.0

6
(sampel 1)
7
(sampel 1)
8
(blank)

800
1000
245
490
0

0.040
0.049
0.012
0.024
0

Pengiraan Kepekatan Protein.

M1 V1 = M2 V2, dimana: M1 ialah kepekatan larutan Protein piawai (g)
V1 ialah isipadu protein piawai (ml)
M2 ialah kepekatan Protein di cari (g)
V2 ialah isipadu keseluruhan (ml)
Kepekatan Protein Tabung uji 1:
M1 V1 = M2 V2
1000 g x 0.2ml = M2 x 1ml
M2 = 200
1
M2 = 200g. Kepekatan Protein Tabung Uji 1 ialah 200g.
Kepekatan Protein Tabung uji 2:
M1 V1 = M2 V2

1000 g x 0.4ml = M2 x 1ml

M2 = 400
1
M2 = 400g. Kepekatan Protein Tabung Uji 2 ialah 400g.
Kepekatan Protein Tabung uji 3:
M1 V1 = M2 V2
1000 g x 0.6ml = M2 x 1ml
M2 = 600
1
M2 = 600g. Kepekatan Protein Tabung Uji 3 ialah 600g.
Kepekatan Protein Tabung uji 4:
M1 V1 = M2 V2
1000 g x 0.8ml = M2 x 1ml
M2 = 800
1
M2 = 800g. Kepekatan Protein Tabung Uji 4 ialah 800g.
Kepekatan Protein Tabung uji 5:
M1 V1 = M2 V2
1000 g x 1.0ml = M2 x 1ml
M2 = 1000
1
M2 = 1000g. Kepekatan Protein Tabung Uji 5 ialah 1000g.
i)

Dari jadual di atas nilai daya penyerapan adalah berkadar terus dengan

kepekatan protein.
ii)

Dari graf , kepekatan protein dalam larutan sampel 1 tabung uji 6 adalah
224 g

iii)

Dari graf, kepekatan protein dalam larutan sampel 2 tabung uji 7 adalah
490 g
Jadual 1.3 : Penentuan fosfat.

Air

Larutan

Larutan

Reagen

Kepekatan

Tabung

Suling

Fosfat

Fosfat Uji

Fosfat

Fosfat

uji

(ml)

Piawai

(ml)

(ml)

(g)

1mg/ml

Daya
Penyerapan
(nm)

(ml)
1

3.0

0.0

2.7

0.3

100

0.202

2.5

0.5

166.7

0.329

2.0

1.0

1.5

1.5

1.0

2.0

2.5

0.5

2.0

1.0

(blank)

7
(sampel 1)
8
(sampel 2)

333.3
500
666.7
50.0
96.0

0.622
0.911
1.234
0.090
0.172

Pengiraan Kepekatan Fosfat.

M1 V1 = M2 V2, dimana: M1 ialah kepekatan larutan Fosfat piawai (g)
V1 ialah isipadu Fosfat piawai (ml)
M2 ialah kepekatan Fosfat di cari (g)
V2 ialah isipadu keseluruhan (ml)

Kepekatan Fosfat Tabung uji 2:

M1 V1 = M2 V2
1000 g x 0.3ml = M2 x 3ml

10

M2 = 300
3
M2 = 100g. Kepekatan Fosfat Tabung Uji 2 ialah 100g.
Kepekatan Fosfat Tabung uji 3:
M1 V1 = M2 V2
1000 g x 0.5ml = M2 x 3ml
M2 = 500
3
M2 = 166.7g. Kepekatan Fosfat Tabung Uji 3 ialah 166.7g.
Kepekatan Fosfat Tabung uji 4:
M1 V1 = M2 V2
1000 g x 1.0ml = M2 x 3ml
M2 = 1000
3
M2 = 333.3g. Kepekatan Fosfat Tabung Uji 4 ialah 333.3g.
Kepekatan Fosfat Tabung uji 5:
M1 V1 = M2 V2
1000 g x 1.5ml = M2 x 3ml
M2 = 1500
3
M2 = 500g. Kepekatan Fosfat Tabung Uji 5 ialah 500g.
Kepekatan Fosfat Tabung uji 6:
M1 V1 = M2 V2
1000 g x 2.0ml = M2 x 3ml
M2 = 2000
3
M2 = 666.7g. Kepekatan Fosfat Tabung Uji 6 ialah 666.7g.
i)

Dari jadual di atas nilai daya penyerapan adalah berkadar terus dengan
kepekatan fosfat tak organik

11

ii)

Dari graf , kepekatan fosfat tak organik dalam larutan sampel 1 tabung uji
7 adalah

iii)

0.100 mol

Dari graf, kepekatan fosfat tak organik dalam larutan sampel 2 tabung uji
8 adalah

0.340 mol

12

PERBINCANGAN
Pemerhatian daripada eksperimen yang dijalankan mendapati daya
penyerapan adalah berkadar terus dengan kepekatan larutan piawai protein
dalam kaedah Folin- Ciocalteau dan kaedah Biuret, manakala dalam ujian
Fosfat, daya penyerapan juga berkadar terus dengan kepekatan larutan piawai
fosfat.

Dalam ujian yang menggunakan kaedah Folin Ciocalteau , apabila

protein bertindakbalas dengan reagen Folin Ciocalteau, kompleks Cu 2+- protein

fosfomolibdat akan terbentuk. Larutan ini akan berwarna ungu dan dibaca
dengan menggunakan spektrofotometer pada jarak gelombang 700 nm. Pada
jarak gelombang ini didapati daya penyerapan adalah berkadar terus dengan
kepekatan protein.
Jika hukum Beer-Lambert di patuhi, dan l (jarak lintasan cahaya ) adalah
tetap, satu plot daya penyerapan melawan kepekatan protein akan memberikan
satu graf bergaris linear. Dari eksperimen yang dilakukan , didapati grafnya juga
berbentuk lurus. Ini bermakna graf yang didapati secara amali adalah sama
dengan graf yang di dapati secara teori. Dengan ini boleh dikatakan bahawa
larutan protein piawai dan larutan protein sampel 1 dan 2 mematuhi Hukum
Beer-Lambert. Bagi ujian yang menggunakan kaedah Biuret , satu graf
bergarisan lurus juga diperolehi. Untuk ujian fosfat , graf bergaris lurus juga
diperolehi. Ini bermakna semua ujian yang dilakukan, Hukum Beer Lambert
adalah dipatuhi.,walaupun terdapat data-data berada di luar kawasan lurus.
Untuk keputusan yang lebih tepat,pastikan kuvet spektrofotometer
berkeadaan baik dan tidak calar. Ini kerana sekiranya menggunakan kuvet yang
kotor, ini akan menyebabkan ralat. Sebelum membaca bacaan absorbance,
lapkan bahagian licin/rata kuvet untuk memastikan kuvet benar-benar bersih.
Isipadu larutan ujian perlu memenuhi dua per tiga kuvet tersebut bagi
membolehkan lampu mengenai larutan tersebut. Penerangan mengenai
penggunaan

alat

spektrofotometer

juga

perlu

supaya

pengendali

tahu

bagaimana untuk mengendalikan alat tersebut. Selain dari itu, aspek yang tidak
kurang penting adalah selenggaraan alat spektrofotometer. Ia adalah untuk
mendapat bacaan yang di perolehi itu boleh dipercayai.

13

KESIMPULAN
Dalam eksperimen ini, kita telah melakukan tiga eksperimen iaitu
penentuan protein menggunakan kaedah Folin-Ciocalteau, yang menggunakan
jarak gelombang 700nm dan kaedah ujian Biuret, dengan menggunakan jarak
gelombang

550nm.

Bagi

fosfat

pula,

penentuan

di

lakukan

dengan

menggunakan kaedah Tausky dan Sherr dimana jarak gelombang yang

digunakan ialah 725nm. Prinsip fotometri telah digunakan dan eksperimen ini
telah menepati dua hukum yang terkenal iaitu Hukum Lambert dan Hukum Beer.
Eksperimen ini telah berjaya kerana pada ketiga-tiga graf, plot daya penyerapan
melawan kepekatan protein dan fosfat akan memberikan satu graf bergaris
linear. Dari eksperimen yang dilakukan , didapati grafnya juga berbentuk lurus.
Jadi, kepekatan protein dan kepekatan fosfat sampel-sampel ujian telah berjaya
diketahui kepekatannya apabila ia di plotkan pada graf. Graf-graf ini bolehlah
digunakan untuk eksperimen-eksperimen akan datang.

14