Silvana Andri i Tatjana Kosti

Mehanizmi elijske
komunikacije
Skripta za sve zainteresovane studente

WUS Austria Daniel Print

Silvana Andri , PhD

vanredni profesor na grupi predmeta iz Fiziologije ivotinja
Departman za biologiju i ekologiju
Prirodno-matemati ki fakultet
Univerzitet u Novom Sadu
E-mail: silvana@ib.ns.ac.yu

Tatjana Kosti , PhD

vanredni profesor na grupi predmeta iz Fiziologije ivotinja
Departman za biologiju i ekologiju
Prirodno-matemati ki fakultet
Univerzitet u Novom Sadu
E-mail: tanjak@ib.ns.ac.yu

Naslovnu stranu osmislili:

NINI i TEJ

Grafi ko oblikovanje korica:

Predrag Nikoli

The publishing of this script is part of the project CDP+ 118/2006 financed by Austrian
Cooperation through WUS Austria
This copy is not for sale
Ova skripta je objavljena u okviru projekta WUS Austria CDP+ 118/2006 finansiranog od
strane Austrian Cooperation
Besplatan primerak

Predgovor
Ova skripta je rezultat realizacije projekta WUS Austria CDP+ 118/2006 finansiranog od strane Austrian
Cooperation, za uvodjenje novog predmeta Mehanizmi elijske komunikacije, namenjenog studentima
osnovnih, Master i PhD studija na Prirodno-matemati kom fakultetu, Univerziteta u Novom Sadu.
Namera autora je bila da studentima prue pisane informacije o glavnim komponentama medju elijske i
unutar elijske komunikacije, po evi od procesa nastajanja signalnih molekula, do krajnjeg odgovora elije.
Osnovna ideja kursa, pa i skripte, je da postupno korak po korak uvede studente u svet velikog broja
receptora i signalnih molekula, koji grade mreu signalnih puteva uklju enih u regulaciju specifi nih
funkcija elije.
Tekst skripte je organizovan tako da prati predavanja iz kursa Mehanizmi elijske komunikacije, koji se po
prvi put izvodi na Depatmanu za biologiju i ekologiju, PMF u Novom Sadu. S obzirom da je tekst skripte
pokuaj formiranja prvog pisanog materijala, iz kursa koji nastaje, sve kritike, sugestije i komentari su vie
nego dobrodoli.
Veliko hvala Mariji Janji i Natai Stojkov, saradnicama na grupi predmeta Fiziologija ivotinja, na pomo i
oko korekture teksta, kao i Predragu Nikoli u za tehni ko i grafi ko oblikovanje korica.
Na kraju, jedno jednostavno i ogromno hvala organizaciji WUS Austrija, Pokrajinskom sekretarijatu za
obrazovanje i kulturu, kao i gospodinu Gezi Danijelu (tamparija Danijel Print) na ogromnom razumevanju i
finansijskoj podrsci u nameri da naim studentima obezbedimo skriptu koja e im, nadamo se, bar donekle
olakati savla ivanje predvi enog programa kursa.
Autori

SADRAJ
01. OSNOVNI PRINCIPI ELIJSKE KOMUNIKACIJE
1.1. OSNOVNI PRINCIPI I MODELI ELIJSKE KOMUNIKACIJE
1.1.1. Hemijska komunikacija kao na in regulacije fiziolokih procesa
1.1.2. Osnovni pojmovi i karakteristike signalnih molekula
1.1.2.1. Sinteza, skladitenje i sekrecija signalnih molekula
1.1.2.2. Koncentracija signalnih molekula u okruenju elije varira
1.1.3. Ekstracelularni signalni molekuli se vezuju za specifi ne receptore
1.1.3.1. Signalni molekuli se vezuju za specifi ne receptorske molekule koje ekspresuju ciljne elije
1.1.3.2. Pojam, osobine i klasifikacija receptora
1.1.4. Ekstracelularni signalni molekuli mogu da deluju i na maloj i na velikoj distanci
1.1.4.1. Autokrina komunikacija moe da koordinie odluke grupe identi nih elija
1.1.4.2. Prozne ili pukotinaste veze (gap-junctions) dozvoljavaju da se signalne informacije dele izmedju susednih
elija
1.1.5. Svaka elija je programirana da odgovara na specifi nu kombinaciju ekstracelularnih signalnih molekula
1.1.5.1. Razli ite elije mogu da odgovaraju razli ito na isti signalni molekul
1.2. VEZIVANJE ZA RECEPTORE AKTIVIRA RAZLI ITE SIGNALNE PUTEVE
1.2.1. Tri klase receptornih proteina na povrini elije koji su vezani za jonske kanale, vezani za G proteine i
vezani za enzime ili ak i sami imaju enzimsku aktivnost
1.2.1.1. Ve ina aktiviranih receptora sa povrine elije aktivira signaling preko malih molekula i mree
intracelularnih signalnih proteina
1.2.2. NO aktivira signalne puteve vezuju i se direktno za enzim u unutranjosti ciljne elije
1.2.3. Nuklearni receptori su proteini koji aktivirani ligandom reguliu transkripciju gena
1.2.4. Neki intracelularni signalni proteini imaju ulogu molekularnih prekida a
1.2.5. Intracelularni signalni kompleksi poja avaju brzinu, efikasnost i specifi nost odgovora
1.2.6. Interakcija izmedju intracelularnih signalnih proteina je posredovana modularnim vezuju im domenima
1.2.7. elija moe da odgovori naglo na graduisano pove enje koncentracije ekstracelularnog signala
1.2.8. elija moe da zapamti/memorie efekat nekih signala
1.2.9. elija moe da podesi svoju senzitivnost na neki signal
1.3. MEHANIZMI ELIJSKE KOMUNIKACIJE I SIGNALNI PUTEVI KOD BILJAKA
1.3.1. Vie elijska organizacija i elijska komunikacija su evoluirali nezavisno kod biljaka i ivotinja
1.3.2. Receptori serin/treonin kinze funkcioniu kao receptori na povrini biljne elije
1.3.3. Etilen aktivira dvo-komponentni signalni put
1.3.4. Fitohromi detektuju crveno svetlo, a kriptohromi detektuju plavo svetlo

02. PRENOENJE SIGNALA SA POVRINE ELIJE

2.1. SIGNALNE MOLEKULE I RECEPTORI NA MEMBRANI ELIJE
2.1.1. Receptori aktiviraju limitiraju i broj signalnih puteva
2.1.2. Receptorni proteini ispoljavaju specifi nost prema vezivanju liganda i efektorima

1
2
3
4
4
9
9
10
11
12
15
16
17
18
19
19
21
23
25
28
30
32
34
37
37
39
39
40
42
44
47
48
49
50

2.1.3. Maksimalni odgovor elije na signalnu molekulu ne mora zahtevati aktivaciju svih receptora
2.1.4. Eseji za vezivanje se koriste za detekciju receptora i odredjivanje Kd vrednosti
2.2. INTRACELULARNA TRANSDUKCIJA SIGNALA PRENOS SIGNALA UNUTAR ELIJE
2.2.1. Drugi glasnici nose signale od mnogih receptora
2.2.2. Mnogi konzervisani intracelularni proteini imaju funkciju u transdukciji signala
2.2.2.1. GTPazni proteinski prekida i
2.2.2.2. Protein kinaze i protein fosfataze
2.2.3. Neki receptori i proteini signalne transdukcije su lokalizovani
2.2.3.1. Grupisanje/ clustering membranskih proteina posredovano adapternim domenima
2.2.3.2. Grupisanje/ clustering proteina u lipidne agregate
2.2.4. Razvijanje odgovaraju ih elijskih odgovora zavisi od interakcije i regulacije signalnih puteva

03. SIGNALNI PUTEVI PREKO MEMBRANSKIH RECEPTORA VEZANIH ZA G-PROTEINE

3.1. GPCR-zavisna AKTIVACIJA/INHIBICIJA ADENILIL CIKLAZE (AC)

3.1.1. G subjedinica G proteina ciklira izmedju aktivne / on i inaktivne / off forme
3.1.2. Epinefrin se vezuje za nekoliko razli itih GPCR
3.1.3. Identifikovani su kriti ni funkcionalni domeni receptora i vezanog G-proteina
3.1.4. Adenilil ciklaza je stimulisana / inhibisana razli itim ligand-receptor kompleksima
3.1.5. cAMP-zavisna aktivacija PKA posreduje raznolike odgovore u razli itim elijama
3.1.6. Hormonom indukovana aktivacija PKA regulie metabolkizam glikogena
3.1.7. Amplifikacija signala se uglavnom deava u donjem delu signalnog puta
3.1.8. Nekoliko mehanizama regulie signaling od GPCRs
3.1.9. Proteini za usidravanje lokalizuju efekat cAMP na specifi ne subcelularne regione
3.2. GPCR-zavisna REGULACIJA JONSKIH KANALA
3.2.1. Muskarinski receptor u srcu aktivira G protein koji otvara kanal za K+
3.2.2. Gt-zavisni receptori koje aktivira svetlost
3.2.2.1. Aktivacija rodopsina izaziva zatvaranje cGMP-zavisnog kanala za katjone
3.2.2.2. Adaptacija tapi a na razli ite nivoe osvetljenja
3.3. GPCR-zavisni RECEPTORI KOJI AKTIVIRAJI FOSFOLIPAZU C
3.3.1. Inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3) izaziva oslobadjanje Ca++ iz endoplazmatskog retikuluma
3.3.2. Diacilglicerol (DAG) aktivira protein kinazu C (PKC) koja regulie mnoge druge proteine
3.3.3. Ca++/ kalmodulin kompleks posreduje u odgovoru elija na spoljanje signale
3.3.3.1. Frekvenca oscilacija Ca++ uti e na odgovor elije
3.3.3.2. Ca++/ kalmodulin-zavisna protein kinaza (CaM-kinaza) posreduje u mnogim efektima Ca++u eliji
3.3.3.3. Ca++/ kalmodulin-zavisna aktivacija drugih efektornih proteina
3.3.3.4. cGMP aktivira protein kinazu G i izaziva relaksaciju elija glatke muskulature
3.4. GPCR-zavisni AKTIVACIJA TRANSKRIPCIJE GENA
3.4.1. Membranski-lokalizovan tubby transkripcioni faktor se otputa aktivacijom PKC
3.4.2. CREB vezuje cAMP signale za transkripciju

51
52
55
55
56
56
60
62
63
64
65
67
67
69
71
73
75
76
77
80
82
85
87
87
88
89
90
93
94
96
96
97
98
99
100
102
102
103

3.4.3. GPCR-vezani arestin aktivira nekoliko kinaznih kaskada koje kontroliu ekspresiju gena

04. SIGNALNI PUTEVI OD RECEPTOR-ENZIMA I OD RECEPTORA VEZANIH ZA ENZIM

4.1. SIGNALING PREKO TGF RECEPTORA I DIREKTNA AKTIVACIJA Smad PROTEINA
4.1.1. TGF se formira cepanjem sekretovanog inaktivnog prekursora
4.1.2. Receptori za TGF signaling imaju aktivnost serin/treonin kinaza
4.1.3. Aktivirani tip I TGF receptori fosforiliu Smad transkripcione faktore
4.1.4. Onkoproteini i I-Smad proteini reguliu Smad-signaling preko negativne povratne sprege
4.1.5. Gubitak TGF signalinga u estvuje u indukciji abnormalne proliferacije elija i malignim transformacijama
elija
4.2. CITOKINSKI RECEPTORI I JAK/STAT SIGNALNI PUTEVI
4.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedni ke karakteristike signalinga
4.2.2. Citokini uti u na razvoj mnogih tipova elija
4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sli nu strukturu i aktiviraju sli ne puteve signalne transdukcije
4.2.4. JAK kinaze asocirane za receptor aktiviraju STAT transkripcione faktore
4.2.5. SH2 i PTB domeni se vezuju za specifi nu sekvencu koja okruuje fosfoserinske ostatke
4.2.6. Signaling od citokinskih receptora je modulisan negativnim signalima
4.2.6.1. Kratkotrajna regulacija je indukovana SHP1 fosfatazama
4.2.6.2. Dugotrajna regulacija je indukovana SOCS proteinima
4.2.7. Mutant receptora za eritropoetin koji ne moe biti down-regulisan, prouzrokuje pove enje hematokrita
4.3. RECEPTORI KOJI IMAJU FUNKCIJU TIROZIN KINAZA (RTKs) I AKTIVACIJA Ras PROTEINA
4.3.1. Vezivanje liganda dovodi do transfosforilacije RTK
4.3.2. Aktivacija/inaktivacija Ras proteina
4.3.3. RTKse povezuje sa Ras-om preko adapternog proteina i faktora razmene guaninskih nukleotida
4.3.4. Vezivanje Sos proteina za neaktivni Ras izaziva promenu konformacije koja ga aktivira
4.4. SIGNALNI PUT MAP KINAZE
4.4.1. Signal se prenosi od aktiviranog Ras-a do kaskade protein kinaza
4.4.1.1. Aktivacija Raf kinaze
4.4.1.2. Aktivacija MAP kinaze
4.4.2. MAP kinaze reguliu aktivnost mnogih transkripcionih faktora koji kontroliu gene rane faze
4.4.3. G protein-zavisni receptori prenose signale do MAP kinaze
4.4.4. Scaffold proteini izoluju multiple puteve Map kinaza u elijama eukariota
4.5. FOSFOINOZITIDI KAO TRANSDUKTORI SIGNALA SIGNALNI PUT PI3 KINAZE
4.5.1. Neki RTKs i receptori za citokine aktiviraju fosfolipazu C
4.5.2. Regrutovanje PI-3 kinaze dovodi do aktivacije protein kinaze B
4.5.3. Receptor za insulin deluje preko signalnog puta PI-3 kinaze
4.5.4. Aktivirana protein kinaza B omogu ava preivljavanje elija aktivacijom nekoliko puteva
4.5.5. PTEN fosfataza je uklju ena u prekid PI-3 signalnog puta
4.5.6. Receptor za odredjeni faktor rasta je povezan sa multiplim signalnim putevima

104
107
112
113
114
114
118
119
122
122
125
127
132
135
136
136
138
139
141
141
142
143
144
146
146
148
148
149
150
152
154
154
154
156
157
158
158

4.6. RECEPTORI POVEZANI SA CITOPLAZMATI NIM TIROZIN KINAZAMA

4.7. SIGNALING PREKO GUANILIL CIKLAZA I cGMP-a
4.7.1. Receptori guanilil ciklaze generiu cGMP direktno
4.7.1.1. Molekularna biologija guanilil ciklaza
4.7.2. Membranski vezani receptori guanilil ciklaze
4.7.2.1. Izotipovi membranske/partikularne guanilil ciklaze
4.7.2.2. Struktura membranske/partikularne guanilil ciklaze
4.7.2.3. Receptor-efektor povezanost i funkcija membranske/partikularne guanilil ciklaze
4.7.3. Solubilna guanilil ciklaze
4.7.3.1. Struktura subjedinica i izotipova/izoforme solubilne guanilil ciklaze
4.7.3.2. Struktura domena solubilne guanilil ciklaze
4.7.3.3. Regulacija solubilne guanilil ciklaze ligandima
4.7.4. cGMP i elijski signaling
4.7.4.1. Elementi cGMP signalnog puta
4.7.4.2. cGMP i elijski signaling preko protein kinaza
4.7.4.3. cGMP i jonski kanali regulisani cikli nim nukleotidima
4.7.4.4. cGMP-regulie fosfodiesteraze, a fosfodiesteraze razgradjuju cGMP
4.7.4.5. cGMP i elijska fiziologija
4.8. SIGNALNA TRANSDUKCIJA PREKO RECEPTORA TIROZIN FOSFATAZA
4.9. SIGNALNA TRANSDUKCIJA PREKO TCR KOMPLEKSA
4.9.1. Struktura
TCR
4.9.2. CD3 i proteini
4.9.2.1. Struktura CD3 i proteina
4.9.2.2. Funkcija CD3 i proteina
4.9.3. CD4 i CD8 koreceptori uklju eni u aktivaciju T limfocita
4.9.3.1. Struktura CD4 i CD8 koreceptora
4.9.3.2. Funkcija CD4 i CD8 koreceptora
4.9.4. Aktivacija TCR kompleksa
4.9.4.1. Rani dogadjaji na membrani: formiranje imunoloke sinapse i aktivacija protein kinaza i adaptrnih proteina
4.9.5. Signalni put Ras-MAP kinaze u T limfocitima
4.9.6. Kalcijum- i protein kinaze C-posredovani signalni put u T limfocitima
4.9.7. Aktivacija transkripcionih faktora koji reguliu ekspresiju gena u T limfocitim

05. SIGNALING KOJI UKLJU UJE SIGNALOM REGULISANU PROTEOLIZU

5.1. NFSIGNALNI PUT
5.1.1. Signalom-indukovana degradacija citosolnog inhibitornog proteina aktivira NF- transkripcioni faktor
5.2. NOTCH/DELTA SIGNALNI PUT
5.2.1. Regulisana intramembranska proteoliza katalisana preselinom 1 aktivra Notch receptor
5.3. WNT SIGNALNI PUT

159
161
162
162
163
164
165
166
167
167
167
168
170
170
171
174
175
176
183
185
186
187
187
188
188
188
189
189
190
193
194
195
197
198
198
202
203
208

5.3.1. Wnt proteini se vezuju za Fizzled receptore i inhibiu degradaciju -katenina

5.4. HEDGEHOG SIGNALNI PUT
5.4.1. Hedgehog proteini deluju preko receptornog kompleksa Patched i Smoothened

06. SIGNALNI PUTEVI OD NUKLEARNIH RECEPTORA

6.1. SIGNALING PREKO NUKLEARNIH RECEPTORA

6.1.1. Ligandi za nuklearne receptore
6.1.2. Osnovni principi prenosa signala preko nuklarnih receptora
6.1.3. Klasifikacija i struktura nuklearnih receptora
6.1.3.1. DNA elementi koji se vezuju za nuklearne receptore (HREs)
6.1.3.2. DNA vezuju i domen nuklearnog receptora
6.1.3.3. Lignad vezuju i domen nuklearnog receptora
6.1.3.4. Elementi transaktivacije nuklearnog receptora
6.1.4. Nehanizmi preko kojih nukearni receptori reguliu transkripciju
6.1.5. Regulacija signalinga preko nuklearnog receptora
6.1.6. Signaling preko nuklearnih receptora za steroidne hormone
6.1.6.1. Aktivacija citoplazmati nog aporeceptornog kompleksa

07. REGULACIJA RECEPTORA

7.1. ENDOCITOZA MEMBRANSKIH RECEPTORA
7.2. SEKRETOVANI PROTEINI MOGU DA VEU HORMONE I NA TAJ NA IN SPRE E AKTIVACIJU
RECEPTORA

208
211
211
215
215
215
216
218
219
221
222
222
223
224
227
227
231
231
233

OSNOVNI PRINCIPI

ELIJSKE KOMUNIKACIJE

01

Prema fosilnim nalazima sofisticirani jedno elijski organizmi sli ni dananjim bakterijama bili su
prisutni na Zemlji oko 2.5 biliona godina pre nego to su se pojavili prvi vie elijski orgnizmi.
Smatra se da je jedan od mogu ih razloga ovako spore evolucije bilo nepostojanje dovoljno dobrih
mehanizama komunikacije koji su neophodni vie elijskim organizmima. Njihove elije moraju biti
veoma kompleksne i precizno koordinisane mehanizme medjusobne komunikacije kako bi bile
sposobne da odravaju svoje ponaanje/funkciju u korist homeostaze organizma kao celine.
Ovi mehanizmi komunikacije su esencijalno zavisni od signalnih molekula van elije
ekstracelularnih signalnih molekula koje produkuju elije (tzv. signalne elije) kao signal
svojim susednim elijama ili udaljenijim elijama. Pored toga, mehanizmi komunikacije zavise i od
ta no odredjenog sistema proteina koji omogu ava svakoj eliji da odgovori na specifi ne
grupe/podgrupe signala na svoj specifilan na in. Ovi proteini podrazumevaju: receptorne proteine
na povrini elije koji vezuju signalne molekule; raznovrsne intracelularne signalne proteine koji
estvuju u prenosu/transdukciji signala u eliju, ali i distribuiraju signal do odgovaraju ih
delova elije. Intracelularni proteini uklju uju razne kinaze, fosfataze, GTP-vezuju e proteine, kao
i mnoge druge sa kojima, ovi navedeni, ali i drugi, interaguju. Na kraju svakog signalnog puta, ili
kraj svakog signalnog puta, su ciljni/targetni proteini koji su afektirani aktivacijom puta, te tako
promenom svoga stanja/aktivnosti menjaju ponaanje elije formiraju i elijski/bioloki odgovor.
U zavisnosti od signala ciljni proteini mogu biti regulatori proteini, jonski kanali, komponenete
metaboli kih puteva, delovi citoskeleta, a ponekada i drugi proteini u nizu elemenata signalnog
puta (Slika. 1.1.). Na ovaj na in elija, a time i organizam, ima sposobnost ispoljavanja enormno
velikog broja razli itih odgovora u smislu koordinisanog funkcionisanja i o uvanja homeostaze.

U ovom poglavlju e biti opisani osnovni

principi i modeli elijske komunikacije, glavne
familije receptora na povrini i u unutranjosti
elije, kao i osnovni intracelularni putevi koji
se uklju uju aktvacijom ovih receptora.
Osnovni fokus teksta skripte je na animalnoj
eliji, ali e na kraju ovog prvog poglavlja biti
opisane i osnovne karakteristike mehanizama
elijske komunikacije kod biljaka.

Slika 1.1. Jednostavni intracelularni signalni put aktiviran

ekstracelularnim signalnim molekulom.
Estracelularni signalni molekul se vezuje za receptorni protein na povrini
elijske membrane i aktivira intracelularni signalni put posredovan serijom
signalnih proteina. Na kraju, jedan od njih ili vie njih interaguje sa ciljnim
proteinom, to rezultira promenom strukture/funkcije ciljnog proteina i
omogu ava promenu ponaanja elije.

1.1. OSNOVNI PRINCIPI I MODELI

ELIJSKE KOMUNIKACIJE

Mehanizmi koji omogu avaju jednoj eliji da uti e na ponaanje druge, skoro pa na odredjen
na in, postojali su, u nekom smislu, i u svetu jedno elijskih organizama jo mnogo pre nego to
su se vie elijski organizmi pojavili na Zemlji. Dokazi o ovome su
dobijeni savremenim istraivanjima jedno elijskih eukariota kakvi su
kvasci. Iako ove elije nezavisno ive, mogu da komuniciraju u doba
seksualnog parenja (npr. Saccharomyces cerevisae). Kada je haploidna
individua spremna za parenje sekretuje peptid, faktor parenja, koji
daje signale elije suprotnog tipa parenja da prestanu da proliferiu i da
se pripreme za parenje (Slika 1.2.). Posledi na fuzija haploidnih elija
suprotnog tipa parenja produkuje diploidnu eliju koja prolazi mejozu i
sporulaciju generiu i haploidne elije sa novim asortimanom gena.
Slika 1.2.

elije pivskog kvasca (Saccharomyces cerevisae) odgovaraju na faktor parenja.

A Uobi ajeno, u normalnim uslovima, elije su sferi ne. B Kao odgovor na faktor parenja sekretovan od strane
susednih elija, one isturaju protruzije prema izvoru faktora parenja kao pripremu za parenje.

Istraivanja na mutiranim elijama kvasca, koje su izgubile sposobnost parenja omogu ila su
identifikaciju proteina koji su neophodni za procese prenosa signala, a time i komunikaciju. Ovi
proteini formiraju signalnu mreu koja uklju uje: receptorne proteine na povrini elije, GTPvezuju e proteine i druge transduktore signala, kao i protein kinaze, od kojih je svaka veoma
blisko povezana sa proteinima koji omogu avaju signaling u ivotinjskoj eliji. Kroz duplikaciju i
divergenciju gena svakako je sistem/mrea signalnih puteva kod ivotinja mnogo uredjenija i
komplikovanija nego kod kvasaca.

1.1.1. Hemijska komunikacija kao na in regulacije fiziolokih procesa

Hemijska komunikacija medju elijama neophodna je za regulaciju razvi a, diferencijaciju elija,
organizaciju elija u tkiva, kao i za koordinaciju svih aktivnosti organizma. Prenos informacija od
jedne do druge elije odvija se pomo u hemijskih glasnika (signalnih molekula) koji se vezuju za
specifi ne receptore (proteinske prirode) na/u ciljnoj eliji. Ekstracelularni signal (informacija
iz spoljanje sredine
elije) dospeva
preko hemijskih medijatora do ciljne
elije koja poseduje mehanizme kojim e
signal biti prepoznat i mehanizme preko
kojih e on biti preveden i preko kojih e
se indukovati neki bioloki odgovor ciljne
elije. Postoji nekoliko tipova komunikacije posredovane hemijskim medijatorima (Slika 1.3.):
Autokrina
komunikacija
elije
oslobadjaju signalne molekule koji se
vezuju za receptore na membrani iste
elije koja ih je i produkovala.
Slika 1.3. Razli iti tipovi komunikacije

Parakrina komunikacija - signalne molekule se oslobadjaju iz odredjenih signalnih

deluju na susedne ciljne elije.

elija, a

Kriptokrina komunikacija - specifi an vid parakrine komunikacije. Jedan tip ove komunikacije
je da se signalne molekule oslobadjaju u neki zatvoren prostor izmedju elija. Ovaj vid
komunikacije zahteva obavezno prisustvo veoma specifi nih kontakata (veza) izmedju elija (npr.
veza izmedju Sertolijevih elija i spermatida). Drugi tip kriptokrine komunikacije je prenos
sekundarnog glasnika (cAMP ili IP3) kroz porozne veze (tzv. gap-junction) u susednu eliju.
Jukstakrina komunikacija - je takodje tip parakrine komunikacije. Difuzija signalne molekule
ograni ava se na taj na in to se signalna molekula sintetie kao membranski-vezan prekursor i
deluje (ne odvajaju i se od elije) na elije u neposrednoj okolini (npr. razni faktori rasta).
Intrakrina komunikacija - signalna molekula se sintetie u samoj eliji u kojoj se nalazi njen
intracelularni receptor (npr. faktori rasta, dihidrotesteosteron-DHT, azot oksid-NO, ugljen
monoksid-CO).
Nervna komunikacija - neurotransmiteri se oslobadjaju u sinapti ku pukotinu i deluju na
postsinapti ku eliju.
Endokrina komunikacija - produkti lu enja endokrinih elija oslobadjaju se direktno u optu
cirkulaciju i deluju na udaljene elije.
Vano je naglasiti da u razli itim delovima organizma, ista signalna molekula moe da deluje i kao
neurotransmiter, i kao parakrini posrednik, ali i kao hormon.

1.1.2. Osnovni pojmovi i karkateristike signalnih molekula

1.1.2.1. Sinteza, skladitenje i sekrecija signalnih molekula
U ovom odeljku se opisuju elijski mehanizmi sinteze, skladitenja (magacioniranja) i sekrecije
dve najve e i najkompleksnije klase signalnih molekula: peptida i steroida.
Peptidni singalni molekuli se sintetiu u ribozomima, skladite u vezikulama,
sekretuju u zavisnosti od potrebe i cirkuliu slobodni tj. rastvoreni u telesnoj te nosti. Ono
to je zajedni ko za sve signalne molekule sa polipeptidnom strukturom je da se nakon
transkripcije i translacije dobije specifi na pre-pro-signalna molekula koja se potom u procesu
posttranslacijske modifikacije obradjuje da bi se dobila karakteristi na bioloki aktivna signalna
molekula. Informacije koje determiniu sekvencu aminokiselina u polipeptidnom lancu kodirane
su jedarnom DNK. Sekvenca DNK koja kodira odredjeni polipeptidni lanac se prepisuje u
sekvencu nukleotida iRNK koja naputa jedro i interaguje sa ribozomima na grubom
endoplazmatskom retikulumu (ER). Sekvenca nukleotida iRNK e u ribozomima u procesu

translacije (prevodjenja) dati specifi nu aminokiselinsku sekvencu pre-pro-signalne molekule.

Inaktivna pre-pro-signalna molekula e u procesu posttranslacijske modifikacije u ER i Goldi
aparatu dati bioloki aktivnu signalnu molekulu. Uopteno posmatrano, redosled dogadjaja u
sintezi pre-pro-singalnog molekula i posttranslacijskom procesovanju je veoma sli an za sve
peptidne signalne molekule, ak ta vie, za sve peptide koji se sekretuju iz elije.
Najkarakteristi niji primeri pre-pro-signalnih molekula su pro-insulin i pro-opio-melano-kortin
(POMC). Dok se pro-insulin proizvodi i procesuje u jednom tipu elija (B elijama Langerhansovih
ostrvaca endokrinog pankreasa), POMC se
sintetie
u
razli itim
tipovima
elija
(adenohipofiza, mozak, placenta i koa).
Slika 1.4. Struktura molekule POMC i produkti koji se dobijaju
delovanjem razli itih enzimskih garnitura

Ovi razli iti tipovi elija poseduju razli ite

enzime za proces posttranslacijske modifikacije, te stoga i proizvode i sekretuju razli ite produkte
tj. hemijske medijatore. Neki tipovi elija sekretuju vie od jednog produkta. Primer za to su
adrenokortikotropni hormon (ACTH) i melano-stimuliraju i hormon (MSH) koji se produkuju u
razli itim elijama anteriornog dela hipofize, a usled prisustva razli itih enzimskih garnitura koje
vre hidrolizu molekule POMC na razli itim mestima, daju razli ite produkte (Slika 1.4.). Enzimi
koji se nalaze u ACTH-sekretuju im elijama hidroliti ki razlau POMC molekulu tako da se pored
ACTH sekretuje i -endorfin (ima veoma
vanu ulogu u kontroli bola).
elije
hipotalamusa takodje procesuju POMC i
produkuju zna ajne koli ine
-endorfina.
Novosintetisani peptidi se skladite u
vezikulama a izbacuju se iz elija procesom
Ca2+-zavisne egzocitoze (Slika 1.5.).

Slika 1.5. Sekrecija molekula insulina iz

B elija
Lanagerhansovih ostrvaca endokrinog pankreasa primer za
Ca2+-zavisnu-egzocitozom-posredovanu
sekreciju
svih
peptidnih i proteinskih signalnih molekula.
(Preuzeto uz modifikacije iz Hill, Wyse i Anderson: Animal Physiology ( 2004)

Uopteno, kada odredjeni stimulus depolarie membranu endokrine elije, otvaraju se voltanozavisni kanali za Ca2+ i struja Ca2+ ulazi u eliju, to pokre e itav niz dogadjaja koji dovode do
interakcije proteina na membrani vezikula v-SNARE (v-ozna ava vezikularni protein; engl.
Soluble N-ethylmalemite-sensitive factor Attachment REceptor) sa proteinima na membrani
endokrinih elija (t-SNARE) i do izbacivanja sadraja vezikula u krv (Slika 1.5.).

Slika 1.6. Pregled glavnih

puteva
za
sortiranje
proteina u eliji.
Translacija svih mRNK koje su
kodirane u nukleusu se odvija
u citosolnim ribozomima. Levo
(sekretorni put): Ribozomi
sintetiu nascentni protein u
sekretornom putu koji je usmeren ka grubom ER preko ER
signalne ekvence (1, 2). Nakon
zavene translacije u ER ovi
proteini mogu da se transportuju preko vezikula do Goldi
kompleksa (3). Dalje se sortiraju razli iti proteini ili do plazma
membrane ili do lizozoma (4a,
4b). Desno (nesekretorni put):
Sinteza proteina koji nemaju ER
signalnu sekvencu se odvija na
slobodnim ribozomima (1). Ovi
proteini koji nemaju targetnu
sekvencu se oslobadjaju u citosol i tu ostaju (2). Proteini koji
imaju targetnu sekvencu specifi nu za neku organelu prvo se
oslobadjaju u citosol (2) a
potom se importuju u organele
(3-6). Mitohondrijalni i hloroplastni proteini obi no prodju kroz
spoljanju i unutranju membranu da bi uli u matriks ili prostor
strome. Drugi proteini se dalje
sortiraju unutar organela.

Nivo i profil sekrecije je regulisan na razli ite na ine, a u zavisnosti od tipa peptida i vrste
endokrine elije koja ga sintetie i sekretuje, kao i fiziolokog stanja u kome se organizam
trenutno nalazi. S obzirom da su svi peptidi hidrofilne (lipofobne) signalne molekule, mnogi od
njih cirkuliu slobodno, odnosno rastvoreni u telesnim te nostima. Pored toga, peptidi zbog svoje
lipofobne prirode ne mogu da prodju lipofilni dvosloj elijske membrane, te svoje efekte ostvaruju
isklju ivo vezuju i se za specifi ne receptorne proteine na plazma membrani ciljne elije.

Slika 1.7. Sinteza sekretornih proteina i

njihova kotranslaciona translokacija du
membrane endoplazmatskog retikuluma.
1, 2 - Kada ER signalna sekvenca izadje iz
ribozomoa vee se za partikulu koja prepoznaje
signal (engl. Signal Recognition Particle SRP).
3 SRP ispou uje kompleks ribozom /nascentrni
polipeptid SRP receptoru na membrani ER. Ova
reakcija je poja ana vezivanjem GTP i za SRP i
za SRP receptor. 4 Transfer kompleksa
ribozom/nascentni polipeptid translokonu vodi ka
otvaranju kanala translokona i umetanju signalne
sekvence i pripojenog rastu eg polipeptida u
centralnu poru. I SRP i SRP receptor kada se
disociraju od translokona hidroliu svoje vezane
GTP i onda su spremni za umetanje
drugog/novog polipeptidnog lanca. 5 Kako se
polipeptidni lanac izduuje i prolazi kroz kanal
translokona u lumen ER u kome se signalna
sekvenca se e signalnim peptidazama i rapidno
degradira. 6 Peptidni lanac nastavlja da raste.
7, 8 Kada je translacija gotova otputa se
ribozom, zaostali protein se pomera u lumen ER,
a translokon se zatvara.

Slika
1.8.
Post-translaciona
translokacija
kroz
membranu
endoplazmatskog retikuluma.
Ovaj mehanizam je veoma uobi ajen kod
kvasaca, a deava se povremeno i u
elijama viih eukariota. Male strelice unutar
translokona
predstavljaju
randomno
presecanje
translociranog
peptida
napred/nazad.
Sukcesivno
vezivanje
kompleksa BiP (engl. Binding Peptide)
aperona i ADP za otvorene segmente
polipeptida prevenira lanac da sklizne
prema citosolu

Steroidni signalni molekuli se sintetiu od holesterola, ne skladite se, sekretuju se difuzijom

i cirkuliu vezani za specifi ne proteinske nosa e. Prekursor u sintezi svih steroidnih signalnih

molekula je holesterol. Kod ki menjaka, on se delom dobija ishranom, iz ivotinjske masti, a

delom se sintetie u elijama koje produkuju steroide. S obzirom da holesterol nije rastvorljiv u
vodi, u cirkulaciji se nalazi vezan za lipoproteinske transportne komplekse. Kompleks lipoproteina
male molekulske gustine (engl. Low-Density Lipoproteins - LDL) transportuje holesterol do tkiva.
Jetra i mnoga ekstrahepati na tkiva, medju kojima i steroidogene elije ekspresuju LDL receptore
na svojim membranama. Kada se LDL kompleks vee za membranski receptor, elija endocitozom
uvu e kompleks u eliju i na taj na in dobija holesterol. Kompleks lipoproteina velike
molekulske gustine (engl. Hhigh-Density Lipoproteins - HDL) transportuje holesterol do elija
jetre, gde ulazi u sastav u i i ekskretuje se. Na taj na in se smanjuje nivo holesterola u plazmi.
Kod ki menjaka, endokrine elije gonada i kore nadbubrene lezde, kao i placenta gravidnih
sisara, produkuju steroidne signalne molekule, koje naj e e imaju funkciju hormona, ali mogu
delovati i lokalno, u autokrinom i/ili parakrinom maniru. Kada steroidogenoj eliji holesterol
postane dostupan (bilo iz sopstvenog pula ili je poreklom iz cirkulacije) enzimatskom razgradnjom
se cepa bo ni lanac od 6 ugljenikovih atoma (izo-kapro-aldehid) i nastaje pregnenolon.
Pregnenolon dalje moe da bude transformisan preko nekoliko biohemijskih puteva, u zavisnosti
od enzimske garniture koja je prisutna u steroidogenoj eliji, daju i razli ite produkte
karakteristi ne za odredjeni tip steroidogenih elija. Enzimi koji su neophodni za proces
steroidogeneze nalaze se rasporedjeni u razli itim intra elijskim kompartmentima: oni koji
kataliu konverziju holesterola u pregnenolon su locirani na mitohondrijama, a ve ina drugih
enzima je locirana na glatkom endoplazmatskom retikulumu.
Na suprot peptidnim signalnim molekulima, steroidni signalni molekuli se ne skladite u
vezikulama sekretornih elija, nego se po potrebi sintetiu i odmah sekretuju procesom difuzije.
Shodno tome, koncentracija steroidnih signalnih molekula u cirkulaciji je determinisana odnosom
sinteza - trenutna sekrecija hormona, dok je koncentracija peptidnih signalnih molekula
determinisana sekrecijom ve postoje ih, skladitenih signalnih molekula.

1.1.2.2. Koncentracija signalnih molekula u okruenju elije varira

Da bi razli ite signalne molekule mogle da igraju ulogu fiziolokih regulatora, odnos njihove
sinteze i sekrecije mora biti kontrolisan. Veoma
esto se ova kontrola ostvaruje
neurotransmiterima i/ili drugim signalnim molekulima. Odredjen broj signalnih elija sintetie i
sekretuje signalne molekule stalno, ali veli ina sekrecije varira u zavisnosti od delovanja
kontrolnog mehanizma, dok drugi tipovi signalnih elija produkuju signalne molekule u zavisnosti
od potrebe organizma. Generalno, ve a sekrecija uslovi e ve u koncentraciju datog signalnog
molekula u cirkulaciji, pa i ve i odgovor ciljne elije. Ovaj proces nije beskrajan jer se signalne
molekule enzimskom degradacijom metaboliu u ciljnim tkivima ili u nekim drugim organima
(jetra i bubrezi kod ki menjaka). Koncentracija signalne molekule u cirkulaciji ili drugoj
ekstracelularnoj te nosti predstavlja odnos izmedju stepena i brzine dodavanja signalne
molekule u estracelularnu te nost procesom sekrecije, kao i stepena i brzine uklanjanja
signalne molekule procesima metaboli ke destrukcije i/ili ekskrecije.
Prakti no i primarno, koncentracija signalne molekule zavisi od procesa
dodavanja signalne molekule zato to je proces uklanjanja relativno
stalan. Vreme koje je potrebno da bi se koncentracija signalne molekule
smanjila na polovinu prvobitne naziva se polu-ivot i ukazuje na stepen
i brzinu uklanjanja signalne molekule iz ekstracelularne te nosti, pa
samim tim duinu njegove aktivnosti. Neki signalni molekuli mogu biti
konvertovani u aktivnije forme (potentnije u pogledu izazvanja
biolokog efekta) procesom tzv. periferne aktivacije. Primeri za
perifernu aktivaciju su konverzija tiroidnog hormona tetrajod-tiroinina
(T4) u trijod-tironin (T3), kao i testosterona (T) u dihidrotestosteron
(DHT).
Slika 1.9. Bioloki odgovor zavisi od koncentracije slobodnih hormonskih molekula u cirkulaciji,
kao i prisutnosti specifi nih receptora.
T4 je tiroidni hormon koji se dominantno sekretuje iz tiroidne lezde, ali se na periferiji, u ciljnim i drugim elijama,
enzimatskim delovanjem konvertuje u T3 koji je fizioloki aktivniji od T4. Sli no tome, T , polni hormon mujka (androgen),
se delovanjem enzima 5 -reduktaze prevodi u mnogo potentniji hormon DHT, prema kome receptori za androgene hormone ispoljavaju ve i afinitet.

1.1.3. Ekstracelularni signalni molekuli se vezuju za specifi ne receptore

elije kvasca komuniciraju medjusobno u svrhu parenja sekretuju i nekoliko vrsta malih
peptida. Suprotno tome, elije viih ivotinja komuniciraju koriste i hiljade razli itih signalnih

molekula i jo vie razli itih kombinacija signalnih puteva. Ove signalne molekule su po hemijskoj
prirodi aminokiseline, nukleotidi, retinoidi, mali peptidi, derivati masnih kiselina, pa ak i gasovi
koji su rastvorljivi u vodi kao to su azot oksid (engl. Nitric Oxide - NO) ili ugljen monoksid (engl.
Carbon Monoxide - CO). Neki od ovih signalnih molekula se
oslobadjaju difuzijom kroz plazmalemu, neki su iskazani prema
ekstracelularnom prostoru, ali ostaju vrsto vezani na povrini
elije koja ih produkuje, dok se neki procesom egzocitoze sekretuju
iz tzv. signaling elije. Bez obzira na prirodu signala, ciljna elija
odgovara tako to vezuje signalnu molekulu specifi nim
receptorom, to za posledicu ima promenu ponaanja ciljne elije i
bioloki odgovor.
Slika 1.10. Vezivanje ekstracelularnih signalnih molekula ili za receptor na povrini elije ili
za intracelularni receptor.
Ve ina signalnih molekula su hidrofilne i zbog toga ne mogu da prodju plazmalemu direktno, te je zbog toga
esencijalno postojanje receptornih proteina na povrini elije. Vezivanje specifinih liganda za ove receptore,
prouzrokuje njjihovu aktivaciju i generie jedan ili vie signala unutar ciljne elije. Nasuprot tome, neke male
signalne molekule difunduju kroz plazma membranu i vezuju se za receptore unutar ciljne elije bilo da su
receptori u citosolu ili nukleusu. Mnogi od ovih signalnih molekula su hidrofobni i prakti no nerastvorljivi u
vodenim rastvorima, te se stoga transportuju u krvi i drugim ekstracelularnim fluidima vezani za proteinske
nosa e od kojih disosuju pre nego to udju u ciljnu eliju.

Ekstracelularne signalne molekule vrlo

esto ispoljavaju aktivnost i pri vrlo niskim
koncentracijama (uobi ajeno je 10-8 M) a receptori koji ih prepoznaju obi no ih vezuju sa velikim
afinitetom (konstanta afiniteta K 10-8 M litara/molu). U najve em broju slu ajeva ovi receptori su
transmembranski proteini na povrini ciljne elije. Kada receptori veu ekstracelularne signalne
molekule tzv. ligande, aktiviraju se i generiu kaskadu intracelularnih signala koji uslovljavaju
ponaanje elije. Pored transmembranskih receptora, postoje i receptori u unutranjosti ciljne
elije tzv. Intracelularni receptori, koji se aktiviraju vezivanjem signalnih molekula (male molekule
i hidrofobne molekule) koje su bile sposobne da udju u eliju (Slika 1.10.).
1.1.3.1. Signalni molekuli se vezuju za specifi ne receptorske molekule koje ekspresuju
ciljne elije
Iako cirkuliu i signalni molekuli dospevaju do velikog broja elija, interaguju i ispoljavaju svoj
efekat jedino na ciljne elije tj. elije koje ekspresuju specifi ne receptorne proteine koji e biti
prepoznati od strane ekstracelularnog signalnog molekula i za koje e se on vezati. Npr. tiroidni
hormoni se sekretuju od strane elija tiroidne lezde i ispoljavaju iroki spektar metaboli kih,
strukturalnih i razvojnih efekata u razli itim tkivima, upravo zbog toga to veliki broj razli itih
elija ekspresuje receptore za te hormone. Tipi na ciljna elija ekspresuje hiljade receptornih

10

molekula za odredjeni signalni molekul. Pored toga, veliki broj elija poseduje i razli ite tipove
receptora i to ih ini sposobnim da odgovore na ve i broj signalnih molekula. Senzitivnost ciljne
elije za odredjeni signalni molekul zavisi od broja funkcionalnih receptornih molekula za dati
signal koje ekspresuje ciljna elija. Senzitivnost ciljne elije za
odredjeni signal moe se promeniti prisustvom razli itih drugih
hemijskih medijatora/signala i/ili u razli itim fiziolokim uslovima, jer
broj receptora za dati hormon moe da se pove a procesom regulacije
na gore (engl. up-regulation) ili da se smanji procesom regulacije na
dole (engl. down-regulation). Ove varijacije u tipovima i broju
receptorskih molekula ekspresovanih od strane ciljnih elija imaju
velikog udela i zna aja u beskrajnoj raznovrsnosti hemijske regulacije
u ivotinjskom svetu.
Slika 1.11. Regulacija broja receptora

Da bi inicirali promenu u ciljnoj eliji, signalne molekule se prvo vezuju za specifi ne receptorske
molekule koje se nalaze ili na membrani ili unutar elije. Molekule kao to su hormoni,
neurotransmiteri i drugi signalni molekuli koji donose informaciju do elijske membrane nazivaju
se primarni glasnici, dok se molekule koje se formiraju u unutranjosti elije kao posledica
vezivanja primarnog glasnika za receptor i koje prenose informacije dalje u unutranjost elije,
nazivaju sekundarni glasnici. Hidrofilni signalni molekuli koji se vezuju za receptore na plazma
membrani svoj efekat ispoljavaju preko sekundarnih glasnika (cikli ni adenozin monofosfat
cAMP; cikli ni guanozin monofosfat cGMP; Ca2+ joni; inozitol-3-fosfat IP3; diacil-glicerol
DAG). Hidrofobne signalne molekule koje se vezuju za intracelularne receptore mogu
prouzrokovati brze efekte (ukoliko aktiviraju neki protein/enzim, npr. vezivanje NO za njegov
receptor/enzim solubilnu guanil ciklazu) ili mogu prouzrokovati regulaciju transkripcije razli itih
gena (tzv. genomski efekti). Ranije se smatralo da se aktiviranjem membranskih receptora bioloki
odgovor bre ispoljava, dok se bioloki odgovor dobijen aktivacijom intracelularnih receptora
manifestuje sporije. Danas je se zna za veliki broj signalnih molekula da mogu da ispoljavaju i
brze (negenomske) i sporije (genomske efekte; regulacija transkripcije gena) efekte bilo vezivanjem
za receptorne proteine na plazma membrani ciljne elije ili za receptore unutar elije.
1.1.3.2. Pojam, osobine i klasifikacija receptora
Ekstracelularne signalne molekule ispoljavaju svoj efekat samo na one elije koje poseduju
receptore (specifi ne proteine) za dati signalni molekul. Prvi korak u mehanizmu delovanja

11

signalnih molekula je njihovo vezivanje za specifi ne vezuju e proteine receptore, na ili u eliji.
Molekula koja se specifi no i nekovalentno vee za receptor naziva se ligand za dati receptor.
Vezivanje liganda dovodi do promena u molekularnoj konformaciji receptorskog proteina to e
dalje izazvati niz uzro no-posledi nih reakcija koje e rezultirati biolokim odgovorom elije.
Iako je receptorska populacija veoma brojna i raznovrsna, mogu se izdvojiti osnovne
karakteristike koje su zajedni ke svim tipovima receptora. Receptori ispoljavaju veliki afinitet
(jer je koncentracija signalnog molekula obi no vrlo mala) i visoku specifi nost za odredjeni
signalni molekul. Receptor esto pokazuje mali afinitet i za nespecifi an signalni molekul tj. ligand
i to je tzv. kros vezivanje (engl. cross coupling), ali to ne predstavlja problem u normalnim
fiziolokim uslovima. Receptori mogu biti saturisani u uslovima koncentracije liganda koja
okupira sva receptorska mesta. Interakcija ligand-receptor je reverzibilan proces, a distribucija
receptora u ciljnom tkivu treba da odgovara aktivnosti liganda (da su prisutni u ciljnim tkivima
za taj signalni molekul). Na kraju, vezivanje za receptor treba da je u korelaciji sa biolokim
odgovorom.
Receptori se mogu podeliti u etiri osnovne funkcionalne klase: (1) ligand-zavisni (ligandvezuju i) jonski kanali; (2) G-protein zavisni receptori tj. receptori povezani sa Gproteinima (tzv. engl. G-Protein Coupled Receptors - GPCR); (3) receptor-enzim/receptorivezani za enzime; (4) intracelularni receptori. Detaljniji opis tipova receptora i osnovnih
mehanizama koji se uklju uju aktivacijom receptora dat je kasnije u tekstu.
1.1.4. Ekstracelularni signalni molekuli mogu da deluju i na maloj i na velikoj distanci
Mnoge signalne molekule ostaju vezane za povrinu signalne elije i uti u jedino na ciljne elije sa
kojima su u kontaktu ostvaruju i tzv. kontakt-zavisni signaling (Slika 1.12A.). Ovaj vid
komunikacije je veoma vaan tokom razvoja, kao i imunog odgovora. Ipak, naj e e se signalne
molekule sekretuju i one mogu cirkulacijom dospeti do ciljnih elija razli ito udaljenih od signalne
elije koja ih je sekretovala. Na osnovu udaljenosti ciljnih elija za koje se veu signalne molekule
i ispoljavaju svoj efekat, razlikuju se lokalni medijatori koji deluju ili na samu eliju koja ih je
sekretovala te se tako ostvaruje autokrini signaling ili autokrina komunikacija, ili na ciljne
elije u neposrednom okruenju to je parakrini singaling ili parakrina komunikacija (Slika
1.12B). Da bi neka signalna molekula mogla da ispolji ovakav vid komunikakcije neophodno je da
joj se ne dozvoli da difunduje daleko, te se zbog toga one veoma esto preuzimaju od strane
susednih elija, ili razlau ekstracelularnim enzimima, ili imobiliu ekstracelularnim matriksom.
Za velike, vie elijske ogranizme, signaling na kratkim udaljenostima ne zadovoljava njihove

12

potrebe za komunikacijom niti je dovoljan da koordinie ponaanje svih elija. Kod ovih
organizama se u toku evolucije razvio set specijalizovanih elija sa specifi nom funkcijom u
komunikaciji izmedju udaljenih i odvojenih delova organizma. Najsofisticiranije su neuroni koji su
sposobni da preko svojih dugih izrataja, aksona, ostvaruju komunikaciju sa udaljenim ciljnim
elijama. Aktivacija nervne elije spoljanjim signalim ili drugim nervnim elijama podrazumeva
genezu elektri nog signala, akcionog potencijala, i njegovo prostiranje du membrane aksona. Na
kraju aksona, u zoni terminalnih zavretaka, akcioni potencijal e prouzrokovati egzocitozu
hemijskih medijatora koji se zovu neurotransmiteri zbog toga to u estvuju u
prenosu/transmisiji signala sa jedne nervne elije na drugu nervnu eliju ili neku druge elije
(detaljniji opis je mogu e na i u skripti Opta fiziologija ivotinja, Kova evi i saradnici, 2005).
Neurotransmiteri se sekretuju u pukotinu izmedju elija koja se zove hemijska sinapsa i
predstavlja funkcionalni spoj dve elije, a dizajniran je tako da osigura dostavu neurotransmitera
do postsinapti ke
elije (Slika
1.12C). Na ovaj na in se ostvaruje
nervna
komunikacija,
odnosno
nervna
regulacija
funkcije
celokupnog organizma.
Slika 1.12. Forme medju elijske komunikacije ili
signalinga.
A Kontakt-zavisni vid komunikacije zahteva da elije budu
u direktom membrana-membrana kontaktu. B parakrina
komunikacija zavisi od signalnih molekula oslobodjenih u
ekstracelularni prostor, a koje deluju lokalno na susedne
elije. C sinapti ka komunikacija se ostvaruje neuronima
koji transmituju elektri ne signale du svojih aksona i kao
posledicu toga oslobadjaju neurotransmitere u sinapsu koja je
veoma esto locirana veoma daleko od tela neurona. D
endokrina komunikacija zavisi od endokrinih elija koje
sekretuju hormone u cirkulaciju kojom se transportuju do svih
elija organizma. Mnoge signalne molekule mogu da
posreduju i u parakrinom, sinapti kom i endokrinom vidu
komunikacije. Krucijalne razlike se odnose na brzinu i
slelektivnost kojom su signalne molekule dopremljene do
ciljne elije.

Drugi na in specijalizovane komunikacije/signalinga koji u estvuje u regulacija fukcije i

ponaanja celog organizma su endokrine elije. Ove elije svoje aktivne principe, hormone,
sekretuju u cirkulaciju, te na taj na in hromoni, kao signalne molekule, stiu i prenose signal i do
najudaljenijih ciljnih elija organizma. Dakle, endokrini sistem svoju regulatornu funkciju obavlja
putem hormona. Hormoni su specifi ne hemijski aktivne materije produkti lu enja endokrinih

13

lezda koji se izlu uju direktno u krv i putem krvi stiu do efektora. Endokrini sistem zajedno sa
nervnim ima veliku ulogu u obezbedjenju homeostaze organizma i njihove aktivnosti se
medjusobno dopunjuju. Postoje suprotonosti i razli itosti u pogledu funkcionisanja nervne i
endokrine komunikacije (Slika 1.13.). S obzirom da se endokrini
signaling oslanja na difuziju i protok krvi, ovaj na in komunikacije
je relativno spor. Na suprot tome, sinapti ki signaling je veoma brz i
mnogo precizniji. Nervne elije mogu da prenose informacije na
velike razdaljine posredstvom elektri nih impulisa koji putuju
brzinom od 100 metara u sekundi. Kada se neurotransmiter
oslobodi iz treminalnih zavretaka nerva moe da difunduje jedino
100 nm do ciljne elije, a ovaj proces traje manje od jedne
milisekunde. Druga razlika izmedju endokrinog i sinapti kog
signalinga je u pogledu efikasnih koncentracija signalnih molekula.
U endokrinom sistemu su hormoni jako razblaeni u cirkulaciji, te
stoga moraju biti sposobni da deluju i pri veoma malim
koncentracijama (uobi ajeno je <10-8 M), dok su neurotransmiteri
mnogo manje razblaeni i deluju u mnogo ve im koncentracijama
(npr. koncentracija acetil-holina u sinapti koj pukotini je 5x10-4 M).
Shodno ovome, receptori za neurotransmitere su malog afiniteta za
svoje ligande, te neurotransmiteri mogu vrlo lako da se disociraju
od receptora da bi zavrili odgovor. Pored toga, nakon oslobadjanja
neurotransmitera, on se veoma brzo uklanja iz sinapti ke pukotine,
ili specifi niim hidroliti kim enzimima koji ga unitavaju ili se
preuzima od strane specifi nih membranskih transportnih proteina
koji ga pumpaju nazad ili u terminalne zavretke nerve elije ili u
susedne glijalne elije. Prema tome, sinapti ki signaling je mnogo
precizniji od endokrinog i u vremenskom i u prostornom smislu.
Slika 1.13. Suprotnosti izmedju endokrine i sinapti ke komunikacije.
Kod kompleksnih ivotinjskih organizama nervne i endokrine elije rade zajedno u koordinaciji razli itih aktivnosti
biliona elija organizma. Dok razli ite endokrine elije moraju da koriste razli ite hormone kako bi specifi no
komunicirale sa ciljnim elijama, razli iti neuroni mogu da koriste isti neurotransmiter i pri tome da ostvaruju
komunikaciju u visoko specifi nom maniru.
A Endokirne elije sekretuju hormone u cirkulaciju, a hormoni e aktivirati signaling samo one ciljne elije koja ih
specifi no prepozna preko svojih receptora.
B U sinapti kom signalingu, suprotno od endokrinog, specifi nost je rezultat sinapti kog kontakta nervne elije i
specifi ne ciljne elije. Obi no samo ciljna elija koja je u komunikaciji sa nervnom elijom biva izloena delovanju
neurotransmitera oslobodjenog iz terminalnih zavretaka presinapti ke nervne elije (mada neki neurotransmiteri
deluju i u parakrinom maniru i imaju ulogu lokalnog medijatora koji uti e na veliki broj ciljnih elija u okolnoj zoni).

14

Medjuzavisnost nervnog i endokrinog sistema omogu ava integraciju i interakciju razli itih uticaja
iz spoljanje i unutranje sredine organizma. Primer nervno-endokrine regulacije efektora je
inervacija i regulacija sri nadbubrene lezde preganglijskim vlaknima simpati ke komponente
vegetativnog nervnog sistema, ime se omogu ava oslobadjanje adrenalina i noradrenalina u
cirkulaciju. Pored toga, specifi nom funkcionalno-organizacionom vezom izmedju hipotalamusa i
hipofize o ituje se jedinstven i sihronizovan, harmoni an odnos nervnog i endokrinog sistema, a u
cilju o uvanja homeostaze organizma.
Brzina odgovora na ekstracelularni signal zavisi ne samo do mehanizma isporu ivanja signala,
nego i od prirode odgovora u ciljnoj eliji. Ukoliko odgovor podrazumeva promenu u proteinima
ve prisutnim u ciljnoj eliji moe se odvijati u sekundama ili milisekundama. Kada odgovor
uklju uje promene u ekspresiji gena i/ili sintezu novih proteina, obi no zahteva sate, bez obzira
na tip isporu ivanja signala.
1.1.4.1. Autokrina komunikacija moe da koordinie odluke grupe identi nih elija
Sve do sada opisane forme komunikacije se odnose na efekat jedne elije na druge, u smislu da
su signalna i ciljna elija razli ite. Pored toga, elije mogu da alju signale i susednim elijama
istog tipa, kao i sebi samim (signalna elija je ujedno i ciljna) i tako se ostvaruje autokrina
komunikacija. Ovaj vid komunikacije koriste elije imunog sistema, a posebno je zna ajan
tokom razvoja, jer kada se usmeri jedna elija ka za nju odredjenom putu diferencijacije,
ona moe da po ne da sekretuje autokrine signale sebi samoj koji obnavljaju i dodatno poja avaju
razvojnu odluku. Autokirini signaling je najefektivniji kada se ostvaruje simultano u grupi
susednih elija istog tipa, i vaan je da podstakne i ohrabri grupu identi nih elija da odlu e o
istom tipu razvoja. Prema tome, autokirni signaling je jedan od mogu ih mehanizama koji
naglaava efekat komune koji je prime en u ranim fazama razvoja. Ovaj efekat podrazumeva da
grupe identi nih elija mogu da odgovaraju na signal koji indukuje diferencijaciju, dok jedna
izolovana elija istog tipa ne moe (Slika 1.14.).
Slika 1.14. Autokrina komunikacija.
Jedna signalna elija dobija veoma slab autokrini signal, dok grupe identi nih signalnih elija
dobijaju jak autokrini signal. Grupa identi nih elija produkuje ve u koncentraciju sekretovanih
signalnih molekula. Kada se signal potom vee za receptor na istoj eliji koja ga je i
produkovala ohrabruje elije da odgovaraju koordinisano kao grupa.

15

Na alost, elije kancera veoma esto koriste autokirni signaling da prevazidju normalnu kontrolu
elijske proliferacije i preivljavanja. Sekretuju i signalne molekule koje se potom veu za istu
eliju koja ih je sekretovala, elije kancera mogu da stimuliu svoje spostveno preivljavanje i
proliferaciju, te da veoma efikasno preivljavaju i proliferiu na mestima gde normalne elije istog
tipa ne mogu.
1.1.4.2.

Porozne ili pukotinaste veze (engl. gap-junctions) dozvoljavaju da se signalne

informacije dele izmedju susednih elija
Jo jedan na in koordinisane aktivnosti susednih elija su tzv. porozne ili pukotinaste veze
(engl. gap-junctions). To su specijalizovane elija- elija porozne veze koje mogu da se formiraju
izmedju dve elije kojima se membrane veoma blisko su eljavaju. Ovim tipom veze se preko
ravnih kanala ispunjenih vodom ostvaruje direktna veza izmedju citoplazmi dve udruene elije.
Ovi kanali dozvoljavaju razmenu malih intracelularnih signalnih molekula tzv. intracelularnih
medijatora, kao to su Na+, K+, Ca2+, cAMP, ali ne i makromolekula kao to su proteini ili
nukleinske kiseline. Prema tome, elije povezane preko gap-junctions veza mogu komunicirati
medjusobno direktno, zaobilaze i barijeru koju predstavlja plazma membrana (Slika. 1.15.).
Slika 1.15. Komunikacija preko poroznih ili pukotinastih veza tj. tzv. gap-junctios.
elije povezane poroznim/pukotinastim vezama tj. preko gap-junctions veza dele male molekule, kao to su intracelularne
signalne molekule i zbog toga mogu da odgovore na ekstracelularne signale u koordinisanom maniru.

Tip i obrazac gap-junctions veza u tkivu moe da se utvrdi ili elektrofiziolokim metodama,
aplikacijom intracelularnih elektroda, ili vizuelno, nakon mikroinekcije u vodi solubilne boje malih
molekula. Istraivanja ovakve prirode sugeriu da elije embriona u razvoju prave i raskidaju gapjunction veze po specifi nom i veoma interesantnom obrazcu, to ukazuje da ove veze imaju
veoma vanu ulogu u signalnim procesima koji se odvijaju izmedju embrionalnih elija u razvoju.
Mievi i ljudi koji imaju deficit za jedan odredjen gap-junction protein (npr. koneksin 43) imaju
velikih nedostataka u razvoju srca. Kao i autokrina komunikacija, gap-junction signaling
omogu ava elijama istog tipa koje se nalaze u bliskom okruenju, da koordiniu svoje ponaanje.
Medjutim, jo uvek se ne zna koji su to sve mali molekuli preko kojih se ostvaruje gap-junction
signaling.

16

1.1.5. Svaka elija je programirana da odgovara na specifi nu kombinaciju ekstracelularnih

signalnih molekula
Tipi na elija vie elijskog organizma je izloena delovanju stotina i hiljada razli itih signala iz
njenog okruenja. Ovi signali mogu biti solubilni molekuli, ili vezani za ekstracelularni matriks, ili
za povrinu susednih elija i mogu delovati u milion razli itih kombinacija. elije moraju da
odgovore na umu signala selektivno, shodno
svom specifi nom karakteru koji su stekle u
procesu
progresivne
specijalizacije
tokom
razvoja. elija moe biti programirana tako da
na
jednu
kombinaciju
signala
odgovara
diferencijacijom, na drugu kombinaciju signala
umnoavanjem, ili na neku drugu kombinaciju
ostvaruju i specifi ne funkcije, kao to su
sekrecija ili kontrakcija.

Slika 1.16.
signala.

Animalna

elija zavisi od brojnih ekstracelularnih

Svaki elijski tip ekspresuje i izlae set receptora koji im omogu ava da odgovaraju
na set signalnih molekula produkovan od strane drugih elija, a koji korespondira
setu receptora. Ovi signalni molekuli deluju u kombinaciji u nameri da reguliu
ponaanje elije. Kao to je prikazano na slici, pojedina na elija zahteva veliki
broj signala da bi preivela, i dodatne signale kako bi se delila ili diferencirala.
Ukoliko nedostaje odgovaraju i signal za preivljavanje elija e prolaziti kroz
proces samoubistva koji se naziva programirana elijska smrt ili apoptoza.

Ve ina elija u kompleksnom ivom organizmu je takodje programirana da u zavisnosti od

specifi ne kombinacije signala ima sposobnost da preivi. U nedostatku ovih signala (npr. u
elijskoj kulturi) elija aktivira tzv. suicidni program i sama sebe ubija u procesu koji se naziva
programirana elijska smrt ili apoptoza. Sposobnost da prolaze proces apoptoze je fundamentalna
karakteristika animalnih elija. S obzirom da razli iti tipovi elija zahtevaju razli ite kombinacije
signala za preivljavanja, svaki tip elije ima specifi no topoloko mesto u organizmu i ograni en
je razli itim okruenjem.
U principu, stotine i hiljade signalnih molekula koje ivotinje stvaraju moe biti kori eno da se
kreira skoro neograni en broj razli itih signalnih kombinacija. Kori enje ovih kombinacija u

17

kontroli ponaanja elije omogu ava ivotinji da kontrolie svoje elije na veoma specifi an na in
kori enjem limitirane raznolikosti signalnih molekula.
1.1.5.1. Razli ite elije mogu da odgovaraju razli ito na isti signalni molekul
Specifi an na in na koji elije reaguju na svoju okolinu veoma varira. Ovo variranje zavisi od seta
receptornih proteina koje elija poseduje, a koji determinie specifi nu i odredjenu grupu signala
na koju elja moe da odgovori, a takodje varira u odnosu na intracelularnu maineriju kojom
elija integrie i intepretira signale koje dobija (Slika 1.1.). Prema tome, jedan signalni molekul
veoma esto ima razli ite efekte na razli ite tipove ciljnih elija. Na primer, neurotransmiter
acetil-holin stimulie kontrakciju skeletnih mii nih elija, ali smanjuje brzinu i snagu
kontrakcija mii nih elja srca. Ovo se deava zbog toga to su acetil-holinski receptori na
mii nim elijama skeletne i sr ane muskulature razli iti. Medjutim, nije uvek razlika u strukturi
receptora objanjenje za razli iti efekat. U velikom broju slu ajeva ista signalna molekula se
vezuje za iste receptore, a opet produkuje veoma razli ite odgovore u razli itim tipovima ciljnih
elija reflektuju i time razliku u unutranjoj, intracelularnoj maineriji za koju su receptori
povezani/kaplovani.

Slika 1.17. Razli iti odgovori elije indukovani neurotransmiterom acetil-holinom.

Razli iti elijski tipovi su specijalizovani da odgovaraju na prisustvo acetil-holina na razli ite na ine. A i B za ova dva elijska tipa acetil-holin se vezuje za iste
receptorne proteine, ali se intracelularni signali koji se produkuju inetrpretiraju na razli ite na ine kod elija specijalizovanih za razli ite funkcije. C mii na elija
produkuje specifi an/odredjeni tip receptornog proteina za acetil-holin koji generie intracelularne signale razli ite od onih koji nastaju aktivacijom receptora na
elijama A i B, to i rezultira razli itim efektom.

18

1.2. VEZIVANJE ZA RECEPTORE AKTIVIRA RAZLI ITE SIGNALNE PUTEVE

S obzirom na hemijsku prirodu signalinih molekula, odnosno njihovu rastvorljivost/solubilnost
(hidrofilne-lipofobne i hidrofobne-lipofilne signalne molekule), razlikuju se mehanizmi kojima ovi
hemijski medijatori ispoljavaju svoje efekate. Iako ve ina ekstracelularnih signala pripada grupi
hidrofilinih molekula koji se vezuju za receptore na povrini elije, neki signalni molekuli su
dovoljno hidrofobni i/ili mali da prodju lako kroz plazma membranu ciljne elije i da se u
unutranjosti elije vezuju ili za specifi ne receptore ili da pak direktno aktiviraju enzime, koji su
ujedno i receptori za dati signalni molekul. U daljem tekstu e ukratko biti prikazani
najmarkantniji primeri receptora i za jedan i za drugi tip ekstracelularnih signalnih molekula.

1.2.1. Tri velike klase receptornih proteina na povrini elije koji su vezani za jonske
kanale, vezani za G proteini i vezani za enzime ili ak i sami imaju enzimsku aktivnost
Hidrofilini signalni molekuli, uklju uju i neurotransmitere i signalne proteine, vezuju se za
specifi ne receptorne proteine na povrini ciljne elije na koju deluju. Ovi receptorni proteini
imaju funkciji prenosnika, tzv. transduktora signala (signalnih transduktora). Oni
prevode/konvertuju ekstracelularne ligad-vezuju e dogadjaje (promene nastale vezivanjem
liganda) u intracelularne signale koji menjaju ponaanje ciljne elije.
Ve ina receptornih proteina na povrni elije pripada jednoj od tri klase koje su definisane na
osnovu mehanizama transdukcije koje receptori koriste.
(1) Receptori vezani za jonske kanale se jo nazivaju transmiterima-regulisani jonski
kanali ili jonotrponi receptori koji su uklju eni u veoma brz signaling izmedju elektri no-aktivnih
ekscitabilnih
elija (Slika 1.18A). Ovaj tip signalinga je posredovan malim brojem
neurotransmitera koji tranzijentno (prolazno) otvaraju ili zatvaraju jonski kanal formiran od
proteina za koji se signalni molekul vezuje, te na taj na in menjaju permeabilitet plazma
membrane, a time i ekscitabilnost postsinapti ke elije. Receptori ove klase pripadaju velikoj
familiji holmologih proteina koji nekoliko puta prolaze/presecaju elijsku membranu (engl.
multipass transmembrane proteins).
(2) Receptori vezani za G-proteine (engl. G Protein Coupled Receptors - GPCR)
indirektno reguliu neki ciljni protein koji je odvojen od receptora i nalazi se na drugom mestu u
plazma membrani ciljne elije, a moe biti enzim ili jonski kanal. Regulacija, odnosno interakcija
izmedju receptora i ciljnog proteina se ostvaruje preko tre eg proteina-posrednika, koji se zove

19

trimerni GTP-vezuju i protein ili G-protein (Slika 1.18B). Aktivacija ciljnog proteina moe da
promeni koncentraciju jednog ili vie intracelularnih medijatora (ukoliko je ciljni protein enzim) ili
moe da promeni permeabilitet plazma membrane ciljne elije (ukoliko je ciljni protein jonski
kanal). Svi receptori iz ove klase pripadaju velikoj familiji homologih proteina koji sedam puta
prolaze/presecaju elijsku membranu (engl. seven-pass transmembrane proteins).
(3) Receptori koji su vezani za enzime ili ak i sami imaju enzimsku aktivnost,
odnosno, ili funkcioniu direktno/sami kao enzimi ili su direktno vezani sa enzimima koje mogu
da aktiviraju kada se za receptor vee ligand (Slika 1.18C). Ovu grupu receptora formiraju
transmembranski proteini koji samo jednom prolaze/presecaju elijsku membranu (engl. signlepass transmembrane proteins), a ligand-vezuju e mesto receptora je izvan elije, dok je kataliti ki
deo receptora ili deo koji je vezan za enzim u unutranjosti ciljne elije. Receptori ove klase su
heterogeni u strukturi u poredjenu sa prethodne dve klase receptora. Najve u podklasu ine
protein kinaze ili receptori asocirani sa protein kinazama, te vezivanje liganda, odnosno aktivacija
receptora prouzrokuje fosforilaciju specifi nog seta proteina u ciljnoj eliji.
Postoje i neke receptorne molekule na povrini ciljne elije koje ne spadaju ni u jednu od
tri navedene klase. Neki od njih su tzv. receptori zavisni od proteoliti kih dogadjaja/procesa u
ciljnoj eliji, te se na taj
na in inicira signaling. I o
ovom na inu signalinga, kao i
o
signalingu
preko
tri
osnovne klase receptora, bi e
vie prezentovano u narednim
poglavljima.

Slika 1.18. Tri klase receptora na povrini

elije.
A Receptori vezani za jonske kanale. B
Receptori vezani za G-proteine. C receptori
vezani za enzime ili
receptori koji imaju
unutranju enzimsku aktivnosti, tj. sam receptor
ima enzimsku aktivnost (iako veliki broj enzimskivezanih receptora ispoljava u jednom delu svoje
molekule enzimsku aktivnost, kao to je prikazano
na levoj strani slike, mnogi drugi se oslanjaju i
zavisni su od enzima sa kojim su vezani, kao to
je prikazano na desnoj strani slike).

20

1.2.1.1. Ve ina aktiviranih receptora sa povrine elije aktivira signaling preko malih
molekula i mree intracelularnih signalnih proteina
Ve ina signala koji se primaju na povrini elije preko pomenutih klasa receptora se uvodi u
unutranjost elije kombinacijom malih i/ili velikih intracelularnih signalnih molekula. Na taj
na in se formira lanac tzv. intracelularni signalni put koji na kraju aktivira ciljni protein koji
dalje afektuje druge proteine i/ili molekule odgovorne za ponaanje ciljne elije (Slika 1.1.).
Mali intracelularni signalni molekuli se nazivaju mali intracelularni medijatori ili
sekundarni glasnici (prvi glasnici su ekstracelularni signalni molekuli). Ovi molekuli se
generiu u velikom brooju kao odgovor na aktivaciju receptora i difunduju rapidno udaljavaju i se
od izvora koji ih generie, te na taj na in ire signal u druge delove elije, afektuju i ponaanje
specifi nih signalnih ili ciljnih proteina. Neki od sekundarnih glasnika su hidrofilni (cAMP, cGMP,
Ca2+), a neki su hidrofobni (diacil glicerol DAG; inozitol trifosfat IP3).
Veliki intracelularni signalni molekuli su intracelularni signalni proteini. Mnogi od
njih prenose signale tako to ili aktiviraju naredne u nizu intracelularne signalne proteine i/ili
iniciraju produkciju sekundarnih glasnika. Veliki intracelularni signalni molekuli mogu biti
klasifikovani na osnovu svoje specifi ne i odredjene funkcije, mada mnogi od njih mogu da
zadovoljavaju karakteristike nekoliko kategorija (Slika 1.19.). Po funkciji, razlikuju se: (1) Relejni
proteini tj. proteini koji samo vode/nose signal do naredne komponente u lancu. (2) Mesengerni
proteini koji prenose signal iz jednog dela elije u drugi (npr. iz citosola u nukleus). (3) Adapterni
proteini (proteini adapteri) koji su izgubili unutranju enzimsku aktivnost i imaju funkciju
adaptera povezuju i jednu signalnu molekulu sa drugom bez u e a u prenosu signala. (4)
Amplifikatorni proteini (proteini amplifikatori) mnogo puta pove avaju signal koji su primili i to
ili produkcijom velike koli ine malih intracelularnih signalnih medijatora (sekundadrnih
glasnika), ili aktivacijom velikog broja intracelularnih signalnih proteina koji su naredni u nizu ka
unutranjosti elije (engl. down-stream intracellular signaling proteins). Amplifikatorni proteini su
naj ee enzimi ili jonski kanali, a ukolko je uklju eno nekoliko amplifikacionih koraka/faza u
relejnom lancu/nizu, onda se takav signalni put/niz naziva signalna kaskada. (5) Transduktorni
proteini (proteini transduktori) prevode signal u druga iju formu (npr. enzim koji produkuje
cAMP, mada je on i transduktor i amplifikator). (6) Bifurkacioni proteini ire signal sa jednog
signalnog puta na drugi. (7) Integratorni proteini primaju signal od jednog ili vie signalnih
puteva i integriu ga pre nego to ga prenesu dalje. (8) Regulatorni proteini latentnih gena se
aktiviraju na povrini elije aktiviranim receptorima, a potom migriraju u nukleus gde stimuliu
transkripciju gena. Pored navedenih postoje i drugi tipovi intracelularnih proteina sa vanim
ulogama u intracelularnom signalingu (Slika 1.19).

21

Slika 1.19. Razli ite vrste

intracelularnih
signalnih
proteina
nalazi se du
signalnog puta od receptora
na povrini elije do nukelusa.
U primeru prikazanom na slici, serije
signalnih
proteina
i
malih
intracelularnih medijatora sprovode
ekstracelularni signal u unutranjost
ciljne elije prouzrokuju i regulaciju
genske ekspresije. Ekstracelularni
signal se amplifikuje, transdukuje ili
prevodi i distribuira/usmereva na n
razli itih pravaca. Mnogi od ovih
koraka i faza mogu biti modulisani
raznim drugim ekstracelularnim i
intracelularnim signalima, tako da
finalni rezultat zavisi i od drugih
faktora koji afektuju eliju (videti sliku
1.16.). U zavisnosti od tipa signala i
uslova u ciljnoj elije, signalni put
moe da aktivira/inhibira ciljne
proteine koji remete ponaanje
elija. U primeru prikazanom na slici
target/cilj je protein koji regulie
gensku ekspresiju.

22

Modulatorni proteini modifikuju aktivnost intracelularnih proteina i zna ajno reguliu ja inu
signalinga du puta. Proteini za usidravanje (engl. anchoring proteins) odravaju specifi ni
signalni protein na preciznoj lokaciji u ciljnoj eliji dre i ga vezanim za membranu ili elemente
citoskeleta. Proteini koji imaju ulogu postolja/skela (engl. scaffold proteins) su adapteri i/ili
proteini za usidravanje koji vezuju ve i broj signalnih proteina zajedno u funkcionalan
kompleks i veoma esto ga dre na specifi nim lokacijama.

1.2.2. NO aktivira signalne puteve vezuju i se direktno za enzim u unutranjosti ciljne

elije
Gas azot oksid (engl. Nitric Oxide NO) je markantan i veoma vaan predstavnik grupe malih
molekula koji mogu nesmetano da prodju plazma membranu i da u unuranjosti ciljne elije
aktiviraju intracelularne proteine, a u ovom slu aju to je receptor koji ima enzimsku aktivnost
(tzv. receptor-enzim). NO funkcionie kao signalni molekul i u biljnim i u ivotinjskim elijama.
Zahvaljuju i svojoj lipofilnoj prirodi, NO moe da difunduje kroz elijske membrane bez
specifi nih membranskih transportera, i funkcionie kao intra- i inter-celularni glasnik. NO se
lako vezuje za enzime/proteine koji sadre hem ili Fe-S aktivna mesta i izaziva stimulaciju ili
inhibiciju njihove aktivnosti, a moe da uti e i na transkripciju gena. Ovaj gas je i slobodan
radikal, relativno nestabilan i potencijalno toksi an, a u estvuje u brojnim fiziolokim procesima
u organizmu (neurotransmisija u centralnom i perifernom nervnom sistemu; relaksacija glatkih
mii a; sekreciji hormona; liza tumorskih i bakterijskih elija; erekcija penisa; agregacija
trombocita; modulacija imunih funkcija; itd).
NO nastaje deaminacijom prilikom transforamcije aminokiseline L-arginina u L-citrulin, a uz
kataliti ko delovanje enzima azot oksid sintaza (engl. Nitric Oxide Synthase - NOS). S obzirom da
veoma lako prolazi kroz memebranu, rastvoreni NO brzo difunduje iz signalne elije i brzo
difuzijom ulazi u okolne-ciljne elije. Deluje samo kao lokalni medijator jer ima veoma kratak
poluivot (5-10 sekundi) i u kontaktu sa kiseonikom NO oksidie u manje aktivne nitrate i nitrite,
a formira i nitrosotiole (RSNO). U reakciji sa superoksidnim anjonom (SO2-) nastaje visoko
reaktivan peroksinitrit (ONOO -), odnosno radikali OH i NO2, koji mogu naruiti aktivnost velikog
broja elijskih konstituenata, pa i trajno inaktivisati mitohondrijalne enzime. Mehanizam
delovanja NO se ostvaruje vezivanjem za njegov receptor koji se zove solubilna guanil ciklaza
(sGC), receptor sa enzimskom aktivno u koji katalizuje konverziju GTP u cGMP (Slika 1.20.).

23

Ovaj mali molekul ima funkciju sekundarnog glasnika i moe da aktivira brojne efektorne proteine
(bi e opisano u nekom od narednih odeljaka skripte). Efekat NO se ispoljava u roku od nekoliko
sekundi zbog toga to je normalna brzina turnover-a cGMP-a veoma velika i ona se veoma brzo
razgradjuje fosfodiesterazama koje konstantno balansiraju produkciju cGMP-a. Farmaceutski
preparat Vijagra inhibie aktivnost cGMP fosfodiesteraza u penisu, te time inhibie i razgradnju
cGMP, odnosno, doprinosi akumulaciji cGMP, to rezultira produenom vazodilatacijom krvnih
sudova i kulminira produenom erekcijom penisa.

Slika 1.20. Uloga azot oksida (NO) u relaksaciji glatke muskulature zidova krvnih sudova.
Acetil-holin oslobodjen iz terminalnih zaretaka nerava vezuju i se za svoje receptore aktivira signalne puteve koji podsti u NO sintaze u endotelijalnim elijama (koje
oblau zid krvnog suda) da produkuju NO. NO difunduje iz endotelijalnih elija u subendotelijalne mii ne elije glatke muskulature u kojima se vezuje za sGC i
aktivira je da produkuje cGMP. Ovaj sekundarni glasnik aktivira druge proteine, to rezultira odgovorom koji omogu ava relaksaciju glatko-mii nih elija i na kraju
kulminira poja anim protokom krvi kroz dati krvni sud.

Ugljen monoksid (engl. Carbon Monoxide - CO) je drugi gas koji elije koriste kao medju elijski
signalni molekul. Moe da deluje na isti ili sli an na in kao i NO, stimulacijom sGC. Ovi gasovi
nisu jedini signalni molekuli koji mogu da prodju direktno kroz plazma membranu ciljne elije.
Grupa hidrofobnih signalnih molekula (derivati holesterola, derivati tirozina, derivati retinoi ne
kiseline i sl.) takodje moe da prodje kroz memebranu ciljne elije, ali se umesto vezivanja za
receptore tj. aktiviranja receptora koji imaju funkciju enzima, vezuju za specifi ne receptorne
proteine u citoplazmi i/ili jedru.

24

1.2.3. Nuklearni receptori su proteini koji aktivirani ligandom reguliu transkripciju gena
Veliki broj malih hidrofobnih molekula moe neometeno da prodje plazmalemu ciljne elije i da se
vee za intracelularne receptorne proteine. U ove signalne molekule spadaju steroidni hormoni,
tiroidni hormoni, retinoidi i vitamin D. Iako se veoma razlikuju i po hemijskoj strukturi (Slika
1.21.), kao i po funkciji, mehanizam kojim oni ispoljavaju svoj bioloki efekat je veoma sli an.
Kada se ovi signalni molekuli veu za svoj intracelularni receptorni protein, receptor menja
konformaciju, aktivira se, a potom se kompleks hormon receptor vee za specifi na mesta na DNK
(engl. Hormone Responsive Element - HRE) i tako regulie transkripciju specifi nih gena. Ova
grupa receptora je veoma sli na po strukturi i pripada tzv. superfamiliji nuklearnih receptora.
Ova superfamilija je veoma velika i uklju uje takodje i neke receptorne proteine koji se aktiviraju
intracelularnim metabolitima pre nego sekretovanim signalnim molekulima. Mnogi lanovi familije
su identifikovani jedino preko sekvence DNK, dok su njihovi ligandi jo uvek nepoznati, te se
stoga receptorni proteini iz ove grupe zovu orfanski nuklearni receptori. Vanost ovakvih
nuklearnih receptora kod nekih ivotinja ilustrovana je time da je ak 1-2% gena kod nematode
C.elegans za orfanske receptore, dok je kod oveka neto manje od 50-tak gena za ove receptore.

Slika 1.21. Neki signalni molekuli koji se vezuju za nuklearne receptore.

Uo iti da su svi signalni molekuli koji se vezuju za nukelarne receptore mali i hidrofobni.
Prikazana je aktivna, hidroksilna forma vitamina D3.

Hidrofobne signalne molekule (steroidni hormoni kore nadbubrene lezde, seksualni steroidi,
vitamin D, tiroidni hormoni, retinoidi, ekdison-hormon presvla enja kod insekata i sl.) se u
cirkulaciji i drugim ekstracelularnim fluidima transportuju vezani za specifi ne proteinske nosa e
od kojih se disociraju pre nego to udju u eliju (Slika 1.10.). Pored fundamentalne razlike u
signalingu u ciljnoj eliji, hidroforbni signalni molekuli se razlikuju od hidrofilnih i po duini
perzistentnosti u cirkulaciji i tkivnim fluidima. Veliki broj hidrofilnih signalnih molekula koji su

25

hormoni, ukloni se ili razgradi u roku od nekoliko minuta nakon ulaska u cirkulaciju, dok se
lokalni hidrofilni medijatori i neurotransmiteri uklanjaju iz ekstracelularnog prostora ak i mnogo
bre, u roku od nekoliko sekundi ili ak i milisekundi. Na suprot tome, hidrofobni signalni
molekuli kakvi su steroidni hormoni opstaju u cirkulaciji satima, a tiroidni hormoni ak i danima.
Uporedo sa poluivotom u ekstracelularnim te nostima i prostorima, hidrofilni signalni molekuli
obi no posreduju efekte koji kratko traju, dok hidrofobni signalni molekuli posreduju efekte koji
due traju. Mada ima i izuzetaka, pa tako npr. hidrofilni signalni molekuli koji se veu za
receptorne proteine na membrani ciljne elije mogu da reguliu transkripciju gena tj. posreduju
efekte koji due traju, ili pak steroidni hormoni, kao hidrofobne signalne molekule mogu da se
veu za membranske receptore i prozrokuju tzv. brze efekte. Intracelularni receptori za steroidne i
tiroidne hormone, retinoide i vitamin D se vezuju za specifi nu HRE sekvencu DNK u
promotornom regionu gena koji ligad regulie. Neki od receptora (npr. za kortizol) su lokalizovani
primarno u citosolu i vezivanjem
liganda menjaju konformaciju,
Slika 1.22. Superfamilija nuklearnih receptora.
A Svi receptori imaju sli nu strukturu. Nazna ene je kratki DNK-vezuju i domen.
pa se potom kompleks ligandB receptorni protein je u inaktivnom stanju vezan za inhibitorni proteinski kompleks.
receptor translocira u jedro.
C vezivanje liganda za receptor prouzrokuje konformacione promene receptorne
molekule, te se ligand-vezuju i domen receptora nadvije/obavije receptor,
Drugi recepori (npr. receptori za
inhibitorni proteini disociraju, a koantivatorni proteini se vezuju za trans-aktivacioni
domen receptora, zna ajno pove avaju i transkripciju gena. D trodimenzionalna
tiroidne hormone i retinoide) su
struktura ligan-vezuju eg domena bez (levo) i sa (desno) vezanim ligandom.
vezani za specifi ne regione na
Uo iti da -helix (tamnije sivi, sa karboksi terminalnim krajem) ima ulogu poklopca
koji se nadvije/preklopi preko vezanog ligada i tako zarobi ligand na
DNK u nukleusu
ak i u
ligan-vezuju em domenu receptorne molekule.
odsustvu liganda. U oba slu aja
inaktivni receptor je vezan za
specifi an inhibitorni kompleks
proteina (tzv. kompleks proteina
toplotnog oka; engl. Heat Shock
Protein

HSP
complex).
Vezivanje liganda prouzrokuje
konformacione
promene
receptorne molekule to rezultira
disocijacijom/uklanjanjem
inhibitornog
proteinskog
kompleksa. Vezivanje liganda
prozuzrokuje takodje da receptor vee koaktivatorne proteine koji indukuju transkripciju gena
(Slika 1.22.).

26

Transkripcioni odgovor ciljne elije je uglavnom vremenski graduisan i odvija se kroz nekoliko
uspenih faza: po inje direktnom aktivacijom malog broja specifi nih gena koja se deava za oko
30 minuta i konstituie se tzv. rani, primarni odgovor; proteinski produkti gena primarnog
odgovora dalje aktiviraju druge gene i konstituie se tzv. odgodjeni, sekundarni odgovor. Na ovaj
na in jednostavni hormonski okida prouzrokuje veoma kompleksne promene u obrazcu genske
ekspresije (Slika 1.23.).

Slika 1.23. Odgovori indukovani aktivacijom nuklearnih receptora za hormone.

A Rani primarni odgovor (engl. early primary response) i B Odgodjeni sekundarni odgovor (engl. delayed secondary response). Slike prikazuju odgovore ciljne
elije na steroidne hormone, ali se isti pincipi mogu primeniti za sve ligande koji aktiviraju superfamiliju nuklearnih receptornih proteina. Neki od proteina primarnog
odgovora mogu aktivirati gene sekundarnog odgovora (engl. turn on secondary-response genes), dok drugi mogu inaktivirati gene primarnog odgovora (engl. turn
off primary-response genes). Stvaran broj gena primarnog i sekundarnog odgovora je mnogo ve i nego to je predstavljeno.

Odgovor na steroidne i tiroidne hormone, vitamin D i retinoide, kao i odgovor na sve

ekstracelularne signale generalno je prili no determinisan prirodom ciljne elije kao i prirodom
signalnog molekula. Mnogi tipovi elija imaju identi ne intracelularne receptore, ali je set gena
regulisan aktivacijom receptora razli it kod razli itih tipova elija. Ovo se deava zbog toga to je
generalno za regulaciju transkripcije gena u eukariotskoj eliji potrebno vie od jednog
regulatornog proteina, a mnogi od ovih regulatornih proteina su specifi ni za tip elije. Prema
tome, svaki od hormona koji se vezuje za superfamiliju nuklearnih receptora indukuje
karakteristi an set odgovora iz dva razloga: (1) jedino ta no odredjeni tip elija ima receptor

27

specifi an za odredjeni hormon; (2) svaki od ovih tipova elija sadri razli ite kombinacije drugih
specifi nih regulatornih proteina specifi nih za ta no odredjeni tip elije i oni kolaboriraju sa
aktiviranim receptorom u smislu uticaja na regulaciju transkripcije specifi nog seta gena.

1.2.4. Neki intracelularni signalni proteini imaju ulogu molekularnih prekida a

Mnogi intracelularni signalni proteini se ponaaju kao molekularni prekida i/izmenjiva i: po
primanju signala oni prelaze iz inaktivnog u aktivno stanje (engl. switch on) i u njemu ostaju
sve dok ih neki drugi proces opet ne prebaci u inaktivno stanje tj. ne ugasi u smislu aktivnosti
(engl. switch off). Inaktivacija (engl. switch off) intracelularnihg signalnih proteina je jednako
vaan proces kao i aktivacija (engl. switch on). Kako bi se signalni put oporavio i povratio od
transmisije signala, i bio spreman da izvri transmisiju drugog signala, neophodno je da se sve
aktivirane molekule signalnog puta vrate u prvobitno/originalno inaktivisano stanje.
Postoje dve glavne klase molekularnih prekida a koje koriste razli ite mehanizme da bi preli iz
jednog u drugo stanje, iako i kod jedne i kod druge grupe dobijanje ili gubitak fosfatne grupe
determinie da li je protein aktivan ili inaktivan. Najve a klasa se sastoji od proteina koji se
aktiviraju ili inhibiu fosforilacijom. Ovi proteini se uklju uju (engl. switch on) u jednom smeru
fosforilacijom katalisanom protein kinazama koje dodaju jednu ili vie fosfatnih grupa u signalni
put u jednom smeru, a u drugom smeru se inaktiviu (engl. switch on) defosforilacijom uz
kataliti ko delovanje protein fosfataza koje uklanjaju fosfatne grupe sa proteina (Slika 1.24.).
Procenjeno je da je jedna tre ina
proteina
u
eukariotskoj
eliji
fosforilisana u odredjeno vreme.

Slika 1.24. Dva tipa intracelularnih signalnih proteina

koji deluju kao molekularni prekida i/izmenjiva i.
U oba slu aja, signalni protein se aktivira dodavanjem fosfatne
grupe, a inhibie ukanjanjem fosfata.
A Fosfatna grupa se dodaje kovalentno signalnom proteinu
kataliti kim delovanjem protein kinaza.
B Signalni protein je indukovan/nateran da promeni vezani
GDP za GTP.
Da bi se naglasila sli nost ova dva mehanizma, ATP je prikazan
kao APPP, ADP kao APP, GTP kao GPPP i GDP kao GPP

28

Mnogi od ovih signalnih proteina koji su kontrolisani fosforilacijom su i sami protein kinaze tj.
sposobni da kontroliu fosforilacije, te su oni veoma esto organizovani u tzv. kaskade
fosforilacija (kaskadne fosforilacije). Jednom aktivirana protein kinaza, fosforilie narednu
protein kinazu u nizu kaskade, a ova narednu, te se tako prenosi signal, a ujedno se i amplifikuje,
a ponekada se iri i na druge signalne puteve. Dva glavna tipa protein kinaza su operativna kao
intracelularni signalni proteini: serin/treonin kinaze (najbrojnije; fosforiliu proteine naj e e na
mestu gde se u sekvenci nalazi aminokiselina serin, ali i gde se nalazi treonin, samo redje) i
tirozin kinaze (manje brojne; fosforiliu proteine na mestu gde se u sekvenci nalazi
aminokiselina tirozin). Sekvenciranjem humanog genoma utvrdjeno je da oko 2 % naih gena
kodira protein kinaze, a smatra se da je stotine, pa i vie, razli itih protein kinaza prisutno u
tipi noj sisarskoj eliji.
Druga veoma velika klasa molekularnih izmenjiva a/prekida a uklju enih u intracelularni
signaling su GTP-vezuju i proteini. Oni prelaze iz aktivnog stanja u kome vezuju GTP u
inaktivno stanje u kome je vezan GDP. Kada se jednom aktiviraju, imaju unutranju GTPaznu
aktivnost i sami sebe isklju uju/inaktiviu tako to hidrolizuju molekule GTP koje su vezale u
GDP (Slika 1.24B.). Razlikuju se dva osnovna tipa GTP-vezuju ih proteina: (1) veliki trimerni
GTP-vezuju i proteini (G-proteini) koji su funkcionalno vezani tj. prenose signale od receptora
koji su vezani za njih (Slika 1.18B.); (2) male monomerne GTPaze (monomerni GTP-vezuju i
proteini) koje provode intracelularne signale, ali su pored toga uklju ene i u kretanje vezikula tj.
vezikularni saobra aj (engl. vesicular traffic), kao i mnoge druge procese u eukariotskoj eliji.

Slika 1.25. Integracija signala.

A Ekstracelularni signali A i B i jedan i drugi aktiviraju razli ite
serije proteinske fosforilacije, a svaka vodi fosforilaciji proteina Y,
ali na razli itim mestima na proteinu. Protein Y je aktiviran
isklju ivo ako su oba mesta fosforilisana, te prema tome postaje
aktivan jedino kada su signali A i B simultano prisutni. Zbog ovog
razloga integratorni proteini se nekada nazivaju detektori
koincidence.
B Ekstracelularni signali A i B vode ka fosforilaciji dva proteina
a i b koji se tek tako fosforilisani medjusobno vezuju grade i
aktivni proteinski kompleks.
U oba prikazana primera proteini se autofosforiliu tj. sami sebe
fosforiliu. Takodje, ekvivalentna forma intracelularne kontrole
moe se odvijati ukoliko se menja GTP za GDP na GTPvezuju im proteinima (Slika 1.24.).

29

Kako je ranije napomenuto, kompleksni elijski odgovori i ponaanje ciljne elije, kao to je
preivljvanje, ili elijska proliferacija, generalno su stimulisani kompleksnom i specifi nom
kombinacijom ekstracelularnih signala pre nego delovanjem jednog jedinog signala samostalno
(videti sliku 1.16.). Zbog svega toga elija mora da integrie informacije koje dolaze od razli itih
signala, kao i da napravi/pripremi odgovaraju i odgovor da ivi ili da umre, da se deli ili ne itd.
Ove integracije su obi no zavisne od integratornih proteina (videti sliku 1.19.) koji su ekvivalentni
mikroprocesorima u kompjuteru: oni zahtevaju veliki broj signalnih ulaza/inputa da bi
produkovali izlaz/output koji prouzrokuje potreban bioloki efekat. Dva kompleksa koja pokazuju
kako ovakvi integratorni proteini operiu ilustrovana su na slici 1. 25.

1.2.5. Intracelularni signalni kompleksi poja avaju brzinu, efikasnost i specifi nost
odgovora
ak i jedan tip ekstracelulrnog signala koji deluje preko jednog tipa GPCR receptora ili receptora
vezanih za enzime obi no paralelno aktivira mulitiple signalne puteve i moe zna ajno da uti e na
viestruke aspekte ponaanja ciljne elije (oblik, pokretljivost, metabolizam, ekspresiju gena itd). I
ne samo to, ove dve glavne klase receptora na povrini ciljne elije veoma esto aktiviraju neke od
istih signalnih puteva i obi no ne postoji objektivan razlog zbog kojeg odredjeni signal koristi
jednu klasu receptora radije nego neku drugu.
Kompleksnost ovih sistema koji odgovaraju na signal, zajedno sa svim multiplim relejnim lancima
signalnih proteina, zastrauje. Nije jasno kako jedna jedina elija uspeva da razvije specifi ne
odgovore na toliko veliki broj razli itih ekstracelularnih signala, od kojih se veliki broj njih vee za
istu klasu receptora i aktivira brojne signalne puteve. Jedna od strategija koju elija koristi da bi
postigla specifi nost uklju uje tzv. scaffold proteine tj. proteine koji imaju funkciju
postolja/skela (videti sliku 1.19.) i koji organizuju grupu signalnih proteina u signalne
komplekse (Slika 1.26A.). Zbog toga to scaffold navodi na interakcije izmedju uspenih
komponenti signaling kompleksa, signal moe biti sproveden sa precizno u, brzinom i
efikasno u, a istovremeno je izbegnuta i neeljena medjusobna komunikacija (engl. cross-talk)
izmedju pojedinih signalnih puteva. Pored toga, da bi se obezbedila amplifikacija signala i njegovo
irenje u druge delove ciljne elije, bar neke komponenete u ve ini signalnih puteva imaju
sposobnost slobodne difuzije.

30

U drugim slu ajevima signaling

kompleksi
se
formiraju
tranzijentno (prolazno), kada se
okupe kao ansambl signalnih
proteina oko receptora nakon
to
je
on
aktiviran
ekstracelularnim
signalnim
molekulom.
U
nekim
od
ovakvih slu ajeva citoplazmatski kraj aktiviranog receptora
se fosforilie tokom procesa
aktivacije i fosforilisana aminokiselina ima ulogu mesta za
vezivanje/pristajanje (engl. docking
site)
i
okupljanje
ansambla
drugih
signalnih
proteina u tranzijentni kompleks (Slika 1.26B.).

Slika 1.26. Dva tipa intracelularnih signalnih

kompleksa.
A Receptor i neki od intracelularnih signalnih
proteina koje aktivacija receptora sekvencionalno
aktivira su okupljeni u signalni kompleks velikim
scaffold proteinom (protein koji slui kao postolje).
B Veliki signalni kompleks je sklopljen nakon to je
receptor aktiviran ekstracelularnim signalnim
molekulom. U ovom slu aju aktivirani receptor
autofosforilacijom fosforilie samog sebe na nekoliko
mesta koja potom imaju ulogu docking mesta za
intracelularne signalne proteine.

Takodje, u nekim drugim slu ajevima aktivacija receptora vodi ka produkciji modifikovanih
fosfolipidnih molekula koji su vezani za plazma membranu i ovi lipidi potom regrutuju specifi ne
intracelularne signalne proteine u ovaj region membrane. Svi ovi signalni kompleksi se formiraju
samo tranzijentno i rasformiraju se veoma brzo nakon disocijacije ekstracelularnog liganda sa
receptora.

31

1.2.6. Interakcija izmedju intracelularnih signalnih proteina je posredovana modularnim

vezuju im domenima
Sklapanje i stabilnih i tranzijentnih signalnih kompleksa zavisi od razli itih, visokokonzervisanih,
malih vezuju ih domena koji su pronadjeni na intracelularnim signalnim proteinima. Svaki od
ovih kompaktnih proteinskih modula se vezuje za odredjeni strukturalni motiv na molekuli
proteina (ili lipida) sa kojom signalni protein interaguje. Zbog ovih modularnih domena signalni
proteini se vezuju medjusobno u multiplim kombinacijama, kao Lego kocke, sa proteinima koji
esto formiraju trodimenzionalne mree interakcija koje determiniu rutu koju prati signalni put.
Pridruivanje postoje ih domena zajedno u nove kombinacije kori enjem ovih modularnih
vezuju ih domena facilitira evoluciju novih signalnih puteva.
Na primer, Src homologi 2 (engl. Src Homology 2 SH2) domeni i fosfotirozin-vezuju i (engl.
Phospho Thyrosine Binding -PTB) domeni se vezuju za fosforilisani tirozin na odredjenoj sekvenci
peptida aktiviranog receptora ili intracelularnog signalnog peptida. Adapterni protein sa SH2domenom je GRB7 (engl. Growth factor Receptor-Bound protein 7 GRB7) koji se vezuje za
receptore-tirozin kinazne aktivnosti i omogu ava direktnu intracelularnu vezu za Ras protoonkogen. Src homologi 3 (SH3) domeni se vezuju za prolinima bogate aminokiselinske sekvence.
Plekstrin homologi (engl. Pleckstrin homology - PH) domeni (prvi put su opisani kod proteina
Plekstrina u krvnim plo icama/trombocitima) se vezuju za naelektrisanu vode u grupu
specifi nih fosforilisanih inozitol fosfolipida koji se produkuju u plazma membrani kao odgovor na
ekstracelularni signal, te oni omogu avaju proteinu iji su deo da se priblii/pristane na
membranu i da intereaguje sa drugim regrutovanim signalnim proteinima. Neki signalni proteini
funkcioniu jedino kao adapteri i vezuju dva druga proteina zajedno u signalnom putu, te stoga
imaju dva ili vie vezuju ih domena (Slika 1.27.).
Jo jedna vrsta domena koji su veoma zastupljeni kod scaffold proteina je tzv. multipli PDZ
domeni (PDZ je skra enica koja je nastala kombinovanjem prvih slova tri proteina za koje je prvo
otkriveno da imaju isti domen: PSD-95 (engl. Post Synaptic Density protein 95), DlgA (engl.
Drosophila disc large tumor suppressor A ) i Zo-1 protein. Svaki od ovih domena se vezuje za
specifi an motiv na receptoru ili signalnom proteinu. Veoma dobar primer za ovo je InaD
scaffold protein na fotoreceptornim elijama Drosophile. Ovaj protein sadri pet PDZ domena, pri
emu jedan od njih vezuje jonski kanal koji se aktivie svetlom, dok se svaki od ostalih vezuje za
razli iti signalni protein uklju en u odgovor elije na svetlo. Ukoliko bilo koji od ovih pet PDZ

32

domena nedostaje, singalni protein koji mu korespondira ne e biti sklopljen u kompleks, to e

poremetiti transdukciju signala i rezultirati defektima u procesu vidjenja.

Slika 1.27. Hipoteti ki signalni put koji koristi modularne

vezuju e domene.
Signalni protein 1 ima tri razli ita
vezuju a domena, a i kataliti ki
domen sa aktivno u protein
kinaze. Ovaj signalni protein se
translocira na plazma membranu
onda kada ekstracelularni signal
dovede do formiranja /kreiranja
razli itih mesta pogodnih za
pristajanje (engl. docking sites)
na citosolnoj strani membrane.
Njegov SH2 domen se vezuje za
fosforilisane
tirozine
na
receptornom proteinu, a njegov PH
domen se vezuje za fosforilisane
inozitol fosfolipide unutranjeg
sloja
fosfo-lipidne dvoslojne
membrane. Nakon toga, signalni
protein 1 fosforilie signalni protein
2 na mestima gde se nalazi tirozin,
a na taj na in se dozvoljava
vezivanje proteina 2 za PTB
domen na proteinu 1 i za SH2
domen
adapternog
proteina.
Nakon toga, adapterni protein
povezuje signalni protein 2 sa
signalnim proteinom 3. Adapterni
protein se sastovoji od dva
modularna vezuju a domena SH2 i
SH3, te ima sposobnost da se
preko SH2 domena vezuje za
fosfotirozin na signalnom proteinu
2, a preko SH3 se vezuje za
prolinima-bogat
motiv
na
signalnom proteinu 3.

Neki receptori na povrini ciljne elije i neki intracelularni signalni proteini mogu da budu
tranzijentno sakupljeni zajedno fromiraju i skupinu u obliku grozda (engl. cluster) koja je
mikrodomenima vezana u lipidni dvosloj plazma membrane koji je oboga en holesterolom i
glikolipidima. Neki od proteina se usmeravaju u ovakve tzv. lipidne kreve (engl. lipid rafts)
preko kovalentno vezanih lipidnih molekula. Kao i scaffold proteini, ovi scaffold lipidi
promoviu brzinu i efikasnost signalnog procesa tako to preuzimaju ulogu mesta ili postolja na
kojima signalni molekuli mogu da se sklope, uklope i interaguju.

33

1.2.7.

elija moe da odgovori naglo na graduisano pove anje koncentracije

ekstracelularnog signala

Neki elijski odgovori na ekstracelularne signalne molekule su ravnomerno i polako graduisani u

jednostavnoj proporciji u odnosu na koncentraciju signalne ekstracelularne molekule. Primarni
odgovor na steroidne hormone (videti sliku 1.23.) veoma esto prati ovakav obrazac, prvenstveno
zbog toga to nuklearni hormonski receptor vezuje jednu molekulu hormona, a svaki specifi ni
deo DNK sekvence (HRE region; odgovoran za vezivanje kompleksa hormon-receptor u promotoru
gena koji odgovaraju na steroidne hormone), deluje nezavisno. Sa pove avanjem koncentracije
hormona, proporcionalno se pove ava i koli ina hormon-receptor kompleksa, a time i koli ina
kompleksa vezanog za HRE u promotoru gena koji odgovara na dati ligand, te je i odgovor elije
graduisan i linearno proporcionalan.
Mnogi odgovori na ekstracelularne signalne molekule po inju naglo i neo ekivano sa
pove avanjem koncentracije ekstracelularne molekule. Neki odgovori mogu da se odvijaju u
maniru sve-ili-nita, odnosno, nemogu e ih je detektovati ukoliko je koncentracija ekstracelularne
signalne molekule ispod pragovnog nivoa, a dostizanjem pragovnog nivoa koncentracije detektuje
se maksimalni odgovor ciljne elije. ta je molekularna osnova ovakvog strmog odgovora (koji
nekada ak li i i na odgovor tipa uklju ivanje/isklju ivanje) na graduisani ekstracelularni signal?
Jedan od mehanizama zaotravanja odgovora je zahtev da se vie od jedne intracelularne
efektorne molekule ili vie od jednog signalnog kompleksa vezuju za neke ciljne makromolekule u
cilju indukovanja odgovora. Na primer, u nekim steroidima-indukovanim-odgovorima izgleda da
se vie od jednog kompleksa hormon-aktivirani receptor vezuje simultano za HRE i aktivira
odredjeni gen. Kao rezultat, kako raste koncentracija hormona, aktivacija gena postaje sve vie
nagla i neo ekivana nego kada bi jedan vezani kompleks bio
dovoljan za aktivaciju (Slika 1.28.).

Slika 1.28. Primarni odgovor elija ovidukta (jajovoda) pileta na steroidni seksualni
hormon estradiol.
Kada su aktivirani, receptori za estradiol ulju uju/aktiviraju transkripciju nekoliko gena. Prikazana je doznozavisna kriva dva ovakva gena, pri emu jedan od ovih gena kodira protein jajeta koji se naziva konalbumin
(engl. conalbumin), a drugi kodira protein jajeta koji se naziva ovalbumin (engl. ovalbumin). Linearna kriva
odgovora za konalbumin ukazuje da svaki aktivirani receptorni molekul koji se vezuje za conalbumin-gen
pove ava aktivnost gena u istoj koli ini tj. postoji linearna zavisnost. Na suprot tome, kriva odgovora za
ovalbumin je na po etku spora, a potom strma, sugeriu i da mora biti vie od jednog aktiviranog receptora
(u ovom slu aju su dva) koji su se simultano vezali za ovalbumin-gen da bi inicirali njegovu transkripciju.

34

Sli an kooperativni mehanizam je veoma esto operativan i u signalnoj kaskadi koja ide od
receptornih proteina na povrini plazma membrane ciljne elije. Na primer, etiri molekula malog
intracelularnog medijatora (sekundarnog glasnika) cAMP
mora da se vee za svaki molekul cAMP zavisne protein
kinaze (PKA) da bi se ona aktivirala. Ovakav odgovor postaje
otriji/strmiji kako se broj kooperativnih molekula
pove ava, a kada je broj dovoljno veliki, moe se dosti i
odgovor koji li i na sve-ili-nita tip odgovora (Slike 1.29. i
1.30.).

Slika 1.29. Aktivacione krive kao funkcije koncentracije signalne molekule.

Krive pokazuju kako se otrina/strmina odgovora pove ava sa pove anjem broja efektornih molekula
koje se moraju vezivati simultano da bi aktivirale targetne makromolekule. Prikazane krive su
ekivane ukoliko aktivacija zahteva 1, 2, 8 ili 16 efektornih molekula.

Takodje, odgovori se zaotravaju ukoliko intracelularna signalna molekula aktivira jedan enzim i
istovremeno inhibie drugi enzim koji katalie suprotnu reakciju. Dobro
prou en primer ovakvog tipa regulacije je adrenalinom (epinefrinom)
indukovana stimulacija razgradnje glikogena u elijama skeletnih mii a.
Vezivanje adrenalina za GPCR receptore na povrini elija skeletnog
mii a vodi ka pove anju koncentracije intracelularnog cAMP, a rezultat
oba procesa je stimulacija enzima koji favorizuje razgradnju glikogena i
inhibicija enzima koji favorizuje singezu glikogena.

Slika 1.30. Jedan tip signalnog mehanizma za koji se o ekuje da pokae strm-pragovni tip odgovora.
Simultano vezivanje osam molekula signalnog liganda za set od osam proteinskih subjedinica je neophodno da bi se formirao
aktivni proteinski kompleks. Sposobnost subjedinica da se sklope u aktivni kompleks zavisi od alsoternih konformacionih
promena kroz koje subjedinice prolaze tokom vezivanja svojih liganda. Vezivanje liganda u formi ovakvog kompleksa je
generalno kooperativan proces. Pri niskoj koncentraciji liganda broj aktivnih kompleksa se pove ava, grubo procenjeno, u
proporciji otprilike osam puta snanijoj nego to je koncentracija liganda.

35

Svi pomenuti primeri mogu produkovati odgovore koji su veoma strmi, ali koji su graduisani u
odnosu na koncentraciju ekstracelularnog signalnog molekula. Drugi mehanizmi mogu da
produkuju tipi an sve-ili-nita odgovor, kada se ekstracelularni signal pove a iznad kriti nog
nivoa praga, pa se aktivira nagli odgovor ciljne elije. Sve-ili-nita pragovni odgovori ovog tipa su
generalno zavisni od pozitivne povratne sprege. Ovim mehanizmom nervne i mii ne elije
generiu akcione potencijale kao odgovore tipa sve-ili-nita na neurotransmitere. Aktivacija acetilholinskih receptora koji su vezani za jonske kanale u neuromuskularnoj vezi rezultira u neto
influksu Na+ koji lokalno depolarie membranu motorne plo e mii ne elije. Ova depolarizacija
prouzrokuje otvaranje voltano-zavisnih Na+ kanala u istom regionu membrane, pa se opet dalje
inicira influks Na+, to opet dodatno depolarie membranu motorne plo e i otvara jo vie Na+
kanala. Ukoliko inicijalna depolarizacija premai odredjeni pragovni nivo, ova pozitivna povratna
sprega ima eksplozivni efekat i neumitno produkuje prostiru u depolarizaciju u formi akcionog
potencijala koji se propagira du membrane mii ne elije.
Mehanizam akcelerativne (ubrzavaju e) pozitivne povratne sprege
moe takodje da bude operativan i kod signalnih proteina koji su
enzimi. Na primer, ukoliko odredjeni intracelularni signalni ligand
aktivira enzim koji je lociran u donjem delu/toku (engl. downstream) signalnog puta i dva ili vie molekula koji su produkti
aktivnosti tog enzima mogu da se veu za enzim koji ih je
produkovao i da ga povratnom spregom aktiviraju (Slika 1.31.).
Posledica je veoma nizak nivo sinteze produkta u odsustvu liganda.
Brzina sinteze se pove ava sporo sa pove anjem koncentracije
lignada sve dok, pri nekoj pragovnoj vrednosti koncentracije
liganda, dovoljno produkta bude sintetisano da sam produkt
aktivira enzim u samo-akcelerativnom, ubrzanom maniru.
Koncentracija produkta se zbog toga odjednom naglo pove a

Slika 1.31. Mehanizam akcelerativne (ubrzavaju e) pozitivne povratne sprege.

U ovom primeru inicijalno vezivanje signalnog liganda aktivira enzim da generie produkt koji se vezuje za isti taj
enzim koji ga je produkovao/stvorio i time pove ava aktivnost enzima tj. sopstvenu produkciju.

36

1.2.8.

elija moe da zapamti/memorie efekat nekih signala

Efekat nekog ekstracelularnog signalnog molekula na ciljnu eliju, u nekim slu ajevima, moe se
zadrati dosta dugo, iako je ekstracelularni signal disocirao i nestao. Jedan od mehanizama koji
omogu ava ovakav vid perzistentnosti signala je sistem enzimatske akcelerativne pozitivne
povratne sprege. Ukoliko se ovakav sistem uklju i (pove avanjem koncentracije intracelularnog
liganda iznad pragovnog nivoa) on e ostati uklju en iako je ekstracelularni signal nestao, te
umesto da odano reflektuje postoje i nivo signala, sistem koji odgovara ispoljava svojsvo
pam enja/memorisanja. Primer koji e i kasnije biti diskutovan je protein kinaza koja se aktivira
Ca2+ jonima da fosforilie samu-sebe (autofosforilacija), kao i druge proteine, pri emu
autofosforilacija odrava kinazu aktivnom dosta dugo i nakon to se nivo Ca2+ vrati na normalu.
Time se omogu avaju memorijski tragovi/zapisi inicijalnog signala. Tranzijentni ekstracelularni
signali veoma esto indukuju mnogo due promene u eliji tokom razvoja vie elijskog organizma.
Neke od ovih promena mogu biti perzistentne tokom celog ivota organizma. One su obi no
zavisne od samo-aktiviraju ih memorijskih mehanizama koji su operativni u donjim tokovima
signalnih puteva, na nivou transkripcije gena. Na primer, signal moe da inicira determinaciju
elija mii a tako to e uklju iti mii nih-gena-specifi ne regulatorne proteine tj. aktivirati ih
da stimuliu transkripciju svojih sopstvenih gena, kao i gena koji produkuju druge proteine
mii ne elije. Na ovaj na in odluka o opstanku mii ne elije postaje stalna.

1.2.9.

elija moe da podesi svoju senzitivnost na neki signal

U odgovoru na mnoge tipove stimulusa, elije i organizmi su sposobni da detektuju isti procenat
promene signala u okviru veoma velikog raspona intenziteta stimulusa. Ovo zahteva da ciljna
elija prolazi kroz reverzibilni proces adaptacije ili desenzitizacije zk. neosetljivosti, u kome
produeno izlaganje stimulusu smanjuje elijski odgovor karakteristi an za taj nivo izlaganja u
normalnim uslovima. U hemijskom signalingu adaptacija omogu ava eliji da odgovara na
promene u koncentraciji signalnog liganda (pre nego na apsolutnu koncentraciju liganda) u okviru
vrlo irokog ranga koncentracije liganda. Osnovni princip je jedna od negativnih povratnih sprega
koja je operativna sa zadrkom/zakanjenjem. Snaan odgovor modifikuje maineriju za
pravljenje tog odgovora, tako da mainerija resetuje sebe u off poziciju, tj. isklju uje sama sebe.

37

Desenzitivizacija ili neosetljivost prema signalnom molekulu moe se desiti na nekoliko na ina. Na
primer, vezivanje ekstracelularnih signalnih liganda za receptorne molekule na povrini plazma
membrane ciljne elije moe indukovati njihovu endocitozu i prolaznu zarobljenost u endozomu.
Ovakva ligandom-indukovana endocitoza receptora moe dovesti do destrukcije receptora
sadrajem lizozoma, a ovaj proces se naziva tzv. regulacija receptora na dole ili down-regulacija
receptora (engl. receptors down-regulation). U drugim slu ajevima, desenzitivizacija moe biti
rezultat rapidne inaktivacije receptora kao rezultat fosforilacije koja prati aktivaciju, ali sa
zadrkom/kanjenjem i to je tzv. odgodjena desenzitivizacija fosforilacijom. Takodje,
neosetljivost moe biti rezultat promene u proteinu uklju enom u transdukciju signala ili
produkcije inhibitora koji blokiraju proces transdukcije signala (Slika 1.32.).

Slika 1.32. Pet na ina na koje ciljna elija moe postati neosetljiva na signalnu molekulu.
Inaktivacioni mehanizmi koji su prikazani i za receptor i za intracelularni signalni protein veoma esto uklju uju fosforilaciju proteina koji se inaktivie, iako se zna da
se i ostali tipovi modifikacije mogu odvijati. Kod bakterijske hemotaksije desenzitivizacija zavisi od metilacije receptornog proteina.

38

1.3. MEHANIZMI

ELIJSKE KOMUNIKACIJE I SIGNALNI PUTEVI KOD BILJAKA

I kod biljaka, kao i kod ivotinja elije su u stalnoj medjusobnoj komunikaciji. elije biljaka
komuniciraju kako bi koordinisale svoju aktivnost u zajedni kom odgovoru na konstante promene
uslova svetla/tame, vlanosti i temperature koji vode biljni ciklus rasta, cvetanja i plodonoenja.
Takodje, elija biljaka medjusobno komuniciraju da bi koordinisale deavanja u njihovom korenu,
stablu, listovima, cvetovima, plodovima i semenu. U ovom delu e biti ukratko dat pregled i opis
medjusobne komunikacije i signalinga biljnih elija, kao i signalinga koji se aktivira u odgovoru
na svetlosni reim kojem su biljke izloene. injenica je da se mnogo manje zna o receptorima i
mehanizmima elijskog signalinga i komunikacije koji se odvijaju u svetu biljnih elija, nego to se
zna o istim ovim pojmovima i fenomenima u svetu ivotinjskih elija. Ima i nekih sli nosti, a ovde
e opis biti fokusiran na ono to je razli ito u mehanizmima elijske komunikacije i signalinga
biljnih elija.

1.3.1. Vie elijska organizacija i elijska komunikacija su evoluirali nezavisno kod biljaka
i ivotinja
Iako su i biljke i ivotinje eukarioti, oni imaju na neki na in odvojenu evolutivnu istoriju vie od
bilion godina. Njihov zadnji zajedni ki predak je bio jedno elijski eukaritski organizam koji je imao
mitohondrije ali nije imao hloroplast. Biljkama su neophodni holoroplasti, te se izdvojila tokom
evolucije linija eukariotskih elija sa hloroplastima kao prete a vie elijskih biljnih organizama.
Najraniji fosili vie elijskih organizama datiraju pre oko 600 miliona godina i smatra se da su
biljke i ivotinje evoluirale u vie elijske organizme nezavisno, svaki po evi od jedno elijskog
eukariota negde
izmedju 1.6 i
0.6
biliona
godina
ranije
(Slika 1.33.).
Slika 1.33. Predpostavljena divergencija biljnog i ivotinjskog
stabla od zajedni kog
jedn elijskog eukariotskog pretka.

39

Ukoliko se evolucija vie elijskih biljaka i ivotinja odvijala nezavisno, molekuli i mehanizmi koji
se koriste u elijskoj komunikaciji su takodje evoluirali odvojeno i za o ekivati je da su razli iti, ali
ima i nekih koji su isti. Gasovi NO i CO, kao i joni Ca2+, su veoma rasprostranjeni signalni
molekuli i u biljnim i u ivotinjskim elijama. S'obzirom da je genom biljke Arabidopsis thaliana
komplentno sekvencioniran, danas se zna da kod ovog organizma nema homologa receptornim
klasama Wnt, Hedgehog, Notch, JAK/STAT, TGF- , Ras ili nukelarnoj familiji receptora. Takodje,
nije jasno pokazano da cAMP uzima u e a u intracelularnoj transdukciji signala u biljnoj eliji,
dok za cGMP ima mnogo vie podataka koji ukazuju na to da je cGMP mogu i sekundarni glasnik
i/ili signalni molekul u medju elijskoj komunikaciji biljaka. Najve i broj informacija o
molekularnim mehanizmima uklju enim u signaling biljne elije dolazi iz molekularnih
istraivanja na Arabidopsisu.

1.3.2. Receptor serin/treonin kinaze funkcioniu kao receptori na povrini biljne elije
Kao i ivotinje, i biljke u veoma velikom stepenu koriste receptore na povrini elije. Dok je kod
ivotinjske elije ve ina receptora na povrini elije vezana za G-proteina, ve ina do sada
detektovanih i definisanih receptora na povrini biljne elije su receptori vezani sa enzimom.
Pored toga, dok su kod ivotinjskih elije ve ina receptora vezanih za enzime zapravo receptori sa
aktivnosti tirozin kinaze, ovaj tip receptora je ekstremno redak kod biljnih elija iako one imaju
veliki broj citplazmati nih tirozin kinaza. Tirozin kinaze, kao i fosforilacija i defosforilacija tirozina
imaju veoma vanu ulogu u signalingu biljne elije. Umesto tirozin kinaze izgleda da se biljna
elija oslanja na ogroman diverzitet transmembranskih receptora serin/treonin kinazne
aktivnosti, a koje su razli ite od ovakovg tipa kinaza u animalnoj eliji. Medjutim, kao i receptori
u animalnoj eliji, serin/treonin kinaze u biljnoj eliji imaju tipi ni citoplazmati ni domen sa
serin/treonin kinaznom aktivnosti, kao i ekstracelularni ligand-vezuju i domen. Najprominentniji
tip identifikovan do danas ima tandem ekstracelularnih zona gradjen od ponovljenih regiona koji
su bogati leucinima (Slika 1.34.) te se ovaj tip serin/treonin
kinaza jo zove proteini sa ponovljenim motivima koji su
bogati leucinima (engl. Leucine-Rich Repeat LRR proteins).

Slika 1.34. Trodimenzionalna struktura leucinima-bogatih ponovljenih motiva koji su sli ni

motivima nadjenim na LRR serin/treonin receptor kinazama.

40

Postoji oko 80 razli itih LRR-receptor kinaza kodiranih u genomu Arabidopsisa. Jedan od
najbolje prou enih primera je CLAVATA 1 CLV1. Mutacije koje inaktiviu protein prouzrokuju
produkciju cvetova sa ekstra floralnim organima, kao i progresivno uve avanje floralnih
meristemskih tkiva, koja su grupe tzv. samoobnavljaju ih stem elija koje produkuju elije na
osnovu kojih raste stablo, listovi i cvetovi. Ekstracelulani signalni molekul za CLV1 receptor je
mali protein koji se zove CLV3 protein, a koga sekretuju susedne elije. Vezivanje CLV3 proteina
za njegov CLV1 receptor supresuje rast meristema, ili inhibicijom deobe elija koje su tu prisutne,
ili, to je verovatnije, stimulacijom
elijske diferencijacije (Slika 1.35A.). Najve i deo
intracelularnog signalnog puta od CLV1 receptora do elijskog odgovora je uglavnom nepoznat, ali
se zna da uklju uje serin/treonin protein fosfataze koje inhibiu CLV1 signaling. Pored toga,
smatra se da GTP-vezuju i preoteini Rho klase imaju ulogu u signalingu, kao i nuklearni genski
regulatorni proteini koji su razli ito povezani sa homeodomanskim proteinima. Mutacije koje
inaktiviu ove genske regulatorne proteine imaju suprotne efekte od mutacija koje inaktiviu
CLV1 receptor, odnosno, deoba elija meristema je jako smanjena, a biljka produkuje cvetove sa
tek nekoliko organa. Prema tome, smatra se da intracelularni signalni put aktiviran preko CLV1
receptora normalno stimulie diferencijaciju elija inhbicijom genskih regulatornih proteina koji
normalno inhibiu elijsku diferencijaciju (Slika 1.35B.).
Slika 1.35. Hipoteti ki model za CLV1
receptor-serin/treonin
kinaznu
regulaciju elijske proliferacije i/ili
diferencijacije u meristemu.
A elije u spoljanjem sloju meristema
sekretuju CLV3 protein koji se vezuje za
CLV1 receptorne proteine targetne elije u
dodatom, vie centralnom regionu meristema,
uglavnom stimuliraju i diferencijaciju ciljnih
elija. B Neki delovi intracelularnog
signalnog puta aktiviranog vezivanjem CLV3.
Smatra se da je CLV receptorni protein
homodimer ili heterodimer koji ima
sposobnost autofosforilacije (fosforilie samog
sebe) na serinima i treoninima, te na taj na in
aktivira receptor i vodi ka aktivaciji Rho-sli nih
GTPaza. Precizni dalji tok signalnog puta
nakon ove ta ke je nepoznat, ali je pokazano
da vodi inhibiciji proteina koji reguliu gene u
nukleusu, to dalje blokira transkripciju gena
koji bi ina e mogli da inhibiu diferencijaciju.
Fosfataze defosforiliu receptor, te stoga
negativno reguliu signalni put.

Jedan tip LRR-receptor kinaza koji je nazvan BRI1 ima funkciju elijskog-povrinskog receptora
za steroide kod Arabidopsisa. Biljke sintetiu klasu steroida koja je nazvana brasinosteroidi

41

(engl. brassinosteroids) zbog toga to je originalno identifikovana u familiji Brassicaceae koja

uklju uje i Arabidopsis. Tokom razvoja biljke, faktori rasta stimuliu elijsku ekspanziju i pomau
posredovanje odgovora na tmu. Mutantne biljke kojima nedostaje BRI1 receptor kinaza su
insenzitivne na brasinosteroide. Uobi ajeno je da su Arabidopsis biljke koje su uzgajane u mraku
bele i da imaju izraene ganglije kao rezultat aktivacije brasinosteroidnog signalinga. U odsustvu
ovog signalnog puta, biljke postaju zelene, kao da rastu u uslovima svetla, a odrasla biljka je
zna ajno patuljasta. Kao i za druge LRR receptor kinaze kod biljaka, priroda puta transdukcije
signala koja vodi od aktivacije receptora do fiziolokog odgovora ostaje misterija do daljnjeg.
LRR-receptor kinaze su samo jedna od mnogih klasa transmembranskih- receptor-serin/treonin
kinaza kod biljaka. Postoji bar jo est dodatnih familija, od kojih svaka ima svoj karakteristi an
set ekstracelularnih domena. Na primer, lektin-receptor kinaze imaju ekstracelularni domen
koji vezuje ugljeno-hidratne signalne molekule. U genomu Arabidopsisa je kodirano vie od 300
receptor-serin/treonin kinaza, to ini ovu familiju receptora najve om, trenutno poznatom, kod
biljaka. Mnoge od ovih kinaza su uklju ene u mehanizme odbranih odgovora uperene protiv
raznih vrsta patogena.

1.3.3. Etilen aktivira dvo-komponentni signalni put

Razli iti regulatori rasta, koji se jo nazivaju hormoni biljaka/biljni hormoni, zn ajno pomau
koordinaciji razvoja biljaka. Ova grupa aktivnih materija uklju uje etilen, auksin, citokine,
gibereline i abcisinsku kiselinu. Svi regulatori rasta su mali molekuli koje sintetie ve ina
biljnih elija. Ovi molekuli difunduju kroz elijski zid biljne elije i mogu delovati lokalno ili pak
mogu biti transportovani i uticati na fizioloke procese na drugim, udaljenijim mestima od
signalne elije koja ih je sintetisala i sekretovala. Svaki regulator rasta moe da ima
multiple/viestruke efekte. Specifi an efekat zavisi od toga: da li i koji jo drugi faktori rasta
deluju; od uslova u okruenju; od nutritivnog stanja/statusa biljke, kao i od sposobnosti ciljne
elije da odgovori.
Veoma vaan primer je etilen. Ovaj mali molekul gasa moe uticati na razvoj biljke na razli ite
na ine, uklju uju i promociju stvaranja ploda, abcisiju listova itd. Pored toga, deluje kao stres
signal u odgovoru na ozledu, infekciju, izmenjen reim svetlosti/tame, vlage itd. Biljke imaju veliki
broj razli itih receptora za etilen (etilenskih receptora) koji su strukturno povezani i sli ni. Ovi

42

receptori su dimerni transmembranski proteini za koje se smatra da funkcioniu kao histidin

kinaze. Etilenski receptori imaju ekstracelularni domen koji sadri atom bakra koji vezuje etilen,
kao i intracelularni histidin-kinazi-sli an domen koji ispoljava histidin-kinaznu aktivnost. U
maniru kao i dvo-komponentni signalni put uklju en u bakterijsku hemotaksiju, kada je aktivan
kinazni domen on autofosforilacijom fosforilie sam sebe na histidinskom ostatku i veruje se da
on potom vri transfer fosfata do aspartatne kiseline drugog domena receptora. Kod bakterijske
hemotaksije vezivanje atraktanta inaktivira receptor. Sli no tome vezivanje etilena inaktivie
etilenski receptor, inhibiu i kinazni domen, a time down-stream singalni put koji je vezan sa
njim. Kada za receptor nije vezan ligand tj. kada je on u aktivnom stanju prouzrokova e aktivaciju
prve komponente MAP-kinaznog signalnog modula. Aktivacija ove MAP-kinazne kaskade vodi ka
inaktivaciji genskih regulatornih proteina u nukleusu koji su odgovorni za stimulaciju gena ija je
transkripcija regulisana etilenom (engl. ethylene-responsive genes). Vezivanje etilena za receptor
inaktivie ovaj signalni put, te
prema
tome
uklju uje
transkripciju ovih gena (Slika
1.36A.,B.).
Dvokomponentni
sistem signalinga je operativan
i kod bakterija i gljiva, kao i
kod biljaka, ali ne i kod
ivotinja. Zbog ega su ivotinje
odustale od ovakvog vida
signalinga ostaje misterija.

Slika 1.36.
Trenutno postoje a ema
etilensko dvo-komponenetnog signalnog
puta.
A U odsustvu etilena, receptori i MAP-kinazni
modul su aktivni, to dovodi do inhibicije genskih
regulatornih proteina u nukleusu koji su odgovorni za
transkripciju gena koji odgovaraju na etilen (engl.
ethylene-responsive genes). B U prisustvu etilena,
receptori i MAP-kinazni modul su inaktivni , pa je
dozvoljena transkripcija etilen-responsive gena.

Razvoj biljaka je pod veoma velikim uticajem uslova spoljanje sredine. Biljke ne mogu kao
ivotinje da se kre u kada uslovi postanu nekonformni i nepovoljni, nego moraju da odlu e da se
adaptiraju ili da umru. Veoma vaan spoljanji uticaj na biljke ima svetlo, koje je njihov izvor

43

energije i ima klju nu ulogu kroz celokupan svetlosni ciklus biljke: od germinacije, razvoja klice,
organogeneze, do cvetanja i iznoenja ploda. Biljke su u toku evolucije razvile veoma veliki set
proteina koji su osetljivi na svetlo (engl. light-sensitive proteins) kako bi mogle da uspeno vre
monitoring kvantiteta, kvaliteta, usmerenja i toka svetlosti, kao i duine trajanja svetlosti.

1.3.4. Fitohromi detektuju crveno svetlo, a kriptohromi detektuju plavo svetlo

I biljke i ivotinje su u toku evolucije razvile i koriste raznovrsnu paletu svetlosno-senzitivnih
proteina kako bi osetili/prepoznali svetlost razli itih talasnih duina. Kod biljaka se ovakav tip
proteina obi no nazva fotoreceptori, ali s obzirom da se termin fotoreceptori takodje koristi kod
svetlosno-senzitivnih elija u retini ivotinja (videti poglavlje 3), u ovom tekstu e za svetlosnosenzitivne proteine kod biljaka, prema literaturi,
biti kori en termin fotoproteini. Svi
fotoproteini registruju svetlo preko kovalentno vezanih hromofora koje absorbuju svetlost i koje
menjaju svoj oblik u odgovoru na svetlo, a time indukuju promenu u konformaciji fotoproteina.
ivotinje takodje koriste neke od fotoproteina koje koriste i biljke. Najekskluzivnije istraivani
animalni fotoproteini su rodopsini, koji su membranski-vezani, za G-proteine-linkovani
fotoproteini koji reguliu jonske kanale u svetlosno-senzitivnim elijama retine oka (videti
poglavlje 3).
Najpoznatiji biljni fotoproteini su fitohromi koji su prisutni kod svih biljaka i nekih algi. Oni su
dimerne, citoplazmatske serin/treonin kinaze koje razli ito i reverzibilno odgovaraju na crveno
svetlo i svetlo koje je udaljeno od crvenog (engl. far-red light): dok crveno svetlo obi no aktivira
kinaznu aktivnost fitohroma, druga vrsta svetla je inaktivie. Smatra se da kada su fitohrome
aktivirane crvenim svetlom inicira se autofosforilaciona aktivnost, te one fosforiliu same sebe, a
potom i fosforiliu jedan ili vie drugih signalnih proteina u eliji. U nekim odgovorima na svetlo,
aktivirana fitohroma migrira u nukleus i tamo stupa u interakciju sa regulatornim proteinima
gena te tako uti e na transkripciju gena (Slika 1.37.). U drugim slu ajevima, aktivirana fitohroma
aktivira regulatorne proteine gena koji se nalaze u citoplazmi, a oni potom migriraju u nukleus
gde reguliu transkripciju gena. Pored toga, u nekim slu ajevima, fotoprotein moe da uklju i
signalni put u citosolu, a to e kulminirati promenom ponaanja elije i bez u e a nukleusa.
Iako fitohrome imaju serin/treonin kinaznu aktivnost, deo njihove strukture jako podse a na
strukturu histidin kinaza uklju enih u bakterijsku hemotaksiju. Ovaj pronalazak sugerie da su

44

biljne fitohrome originalno proizale od bakterijskih

histidin kinaza, a da su kasnije u evoluciji
promenile specifi nost prema supstratu od histidina
prema serinu i treoninu.

Slika 1.37. Trenutno postoje a ema jednog na ina preko koga fitohrom
posreduje odgovor na svetlo u biljnoj eliji.
Kada se aktivira svetlom, fitohrom koji je dimer fosforilie samog sebe (autofosforilacija) i
translocira se u nukleus gde aktivira genske regulatorne proteina da stimuliu
transkripciju specifi nih gena.

Biljke prepoznaju i odgovaraju na plavu svetlost kori enjem dva tipa fotoproteina: fototropina i
kriptohroma. Fototropin je asociran za plazma membranu i delimi no je odgovoran za
fototropizam (fenomen koji podrazumeva tendenciju biljaka da rastu prema svetlosti).
Fototropizam se odvija na osnovu dirigovane i usmerene elongacije elija koja je stimulisana
regulatorom rasta auksinom, ali je veza izmedju fototropina i auksina nepoznata. Kriptohrome
su flavoproteini senzitivni na plavu svetlost. Oni su strukturno sli ni sa fotoliazama, enzimima
senzitivnim na plavu svetlost koji su uklju eni u reparaciju ote enja DNK koja su prozrokovana
ultraviolentnom svetlosti kod svih organizama, izuzev velike ve ine sisara. Za razliku od
fitohroma, kriptohromi su takodje pronadjeni i kod ivotinja, gde igraju veoma vanu ulogu u
cirkadijalnom ritmu/satu koji je operativan u ve ini elija sa 24- asovnim ritmom. Kriptohrome
nemaju sposobnost reparacije DNK, ali se smatra da su evoluirale od fotoliaza.

45

46

PRENOENJE SIGNALA SA

POVRINE

ELIJE

02

Kao to je ranije naglaeno, ne postoji iva elija koja ivi u izolaciji. Ekstracelularne signalne
molekule se sintetiu i oslobadjaju iz signalnih elija, a produkuju specifi ne odgovore jedino u
ciljnim (targetnim) elijama koje poseduju specifi ne receptorne proteine za razli ite signalne
molekule. Ovaj deo teksta skripte je fokusiran na signaling koji ide od razli itih grupa receptornih
proteina koji su locirani u plazma membrani, odnosno, na povrini ciljne elije (Slika 2.1.).
Prenoenje signala sa povrine elije ili signaling sa povrine elije podrazumeva sve kompleksne
mehanizme koji se deavaju od momenta vezivanja ekstracelularnog signala za receptorne
proteine u plazma membrani pa do krajnjeg cilja, specifi nog odgovora ili grupe odgovora ciljne
elije koja se ogleda u promeni ponaanja ciljne elije. Ekstracelularna signalna molekula deluje
kao ligand i vezuje se za strukturalno komplementarno mesto na ekstracelularnom domenu
receptora ili domenu receptora koji preseca membranu. Vezivanje liganda za njegov receptor
prouzrokuje konformacione promene u citosolnom domenu ili domenu receptora koji uslovno
indukuje specifi ne elijske odgovore. Celokupan proces konvertovanja signala u elijski odgovor,
kao i individualni koraci/faze u ovom procesu naziva se transdukcija signala ili signalna
transdukcija. U ovom poglavlju se kroz dve sekcije opisuju osnovni principi prenoenja signala sa
povrine ciljne elije pa sve do elijskog odgovora. Posebna poglavlja su posve ena signalingu koji
se uklju uje aktiviranjem pojedinih tipova receptornih proteina na povrini ili u unutranjosti
ciljne elije.

47

Slika 2.1. Pregled sedam glavnih klasa receptora na povrini elije.

U mnogim signalnim putevima vezivanje ligand za receptor vodi aktivaciji transkripcionih faktora u citosolu, dozvoljavaju i im da se translociraju u nukleus i da
reguliu ( e e stimuliu, a redje inhibiu) transkripciju njihovih ciljnih gena. Alternativno, aktivacija receptora moe da vodi ka aktivaciji citosolnih protein kinaza koje
se potom translociraju u nukleus i reguliu aktivnost transkripcionih faktora. Neki aktivirani receptori, prvenstveno GPCR, mogu da indukuju promene u aktivnosti
postoje ih proteina. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; videti Bivanlou & Darnell (2002), Science
295:813.).

2.1. SIGNALNE MOLEKULE I RECEPTORI NA MEMBRANI

ELIJE

Kao to je ranije naglaeno, ekstracelularni signali uklju uju membranski vezane i sekretovane
proteine i peptide, male lipofilne molekule (npr. steroidne hormone, tiroidne hormone, retinoide,

48

itd.), male hidrofilne molekule derivate aminokiselina (npr. epinefrin, dopamin), gasove (npr. NO i
CO), kao i fizi ke stimuluse (npr. mehani ke/dodir/pritisak, svetlo, zvuk, itd).
Komunikacija preko ekstracelularnih signalnih molekula obi no uklju uje slede e korake (svi oni
su bili diskutovani u prethodnom poglavlju): (1) sintezu i (2) sekreciju signalne molekule od
strane signalne elije; (3) transport signalne molekule do ciljne elije; (4) vezivanje signalne
molekule za specifi ni receptorni protein vodi aktivaciji receptora; (5) inicijiju jednog ili vie
intracelularnog signalnog-transdukcionog puta; (6) specifi an odgovor ciljne elije u smislu
specifi nih promena funkcije, metabolizma ili razvoja; (7) uklanjanje signala to esto zavrava i
elijski odgovor (videti sliku 2.1.). Kao to je ranije naglaeno, ve ina receptora se aktivira
vezivanjem sekretovanih ili za membranu vezanih molekula (hormoni, feromoni, faktori rasta,
citokini, neurotransmiteri, itd.). Neki receptori se aktiviraju i promenama u koncentraciji
metbolita (npr. kiseonik, nutritijenti, itd.), ili fizi kim sitmulusima (npr. svetlo, dodir,
temperatura, itd.).
2.1.1. Receptori aktiviraju limitiraju i broj signalnih puteva
Broj receptora i signalnih puteva koji se pominje u ovoj skripti moe na prvi pogled delovati
preteran, medjutim svaki dan se otkriva sve ve i broj receptora i njihovih signalnih puteva, tako
da je deo koji je ovde opisan samo pokuaj prezentovanja osnovnih receptornih proteina i
elemenata njihovih signalnih puteva. Takodje, terminologija dizajniranih signalnih puteva koja se
koristi, a koja je preuzeta iz svetske literature iz ove oblasti, je moda konfuzna, zbog toga to ne
postoji sistematizovana nomenklatura. Najve i broj signalnih puteva je imenovan na osnovu
glavne klase receptora koja ga aktivira (npr. GPCRs, receptori tirozin kinaze), ili tipa liganda
(npr. TGF , Wnt, Hedgehog), ili pak klju ne intracelularne signal-transdukcione komponente
(NF- B). U nekim slu ajevima ak i isti put moe da referira razli itim imenima. Na sre u, s
obzirom da su otkiriveni i prou eni molekularni detalji velikog broja receptora i njihovih puteva
signalne transdukciije, neki principi i mehanizmi su po eli da se preklapaju i ujedna avaju. Ove
zajedni e osobine pomau da se napravi smisao bogatstva novih informacija koje se odnose na
mehanizme elijske komunikacije.
Prvo, eksternalni signali idukuju dva osnovna tipa elijskog odgovora: (1) promene u aktivnosti
i/ili funkciji ve postoje ih proteina; (2) promene u koli ini specifi nih proteina koje produkuje
elija, naj e e kao rezultat modifikacije transkripcionih faktora koji vodi aktivaciji ili represiji
transkripcije gena. Generalno, prvi tip se odvija mnogo bre nego drugi. Signaling preko G-

49

protein-vezanih receptora veoma esto rezultira promenom aktivnosti ve postoje ih proteina, iako
akivacija ovih receptora u nekim elijama moe takodje da indukuje promene u ekspresiji gena.
Druge klase receptora primarno su operativne u smislu modulacije genske ekspresije. U nekim
slu ajevima, aktivacija receptora direktno aktivira transkripcioni faktor u citosolu (npr. TGF i
signalni putevi od citokinskog receptora) ili direktno sklapa intracelularni signalni kompleks koji
aktivira citosolni transkripcioni faktor (npr. Wnt signalni putevi). Pored toga, u nekim drugim
putevima transdukcije signala, specifi no proteoliti ko razlaganje/cepanje aktiviranog receptora
na povrini elije ili intracelularnog signalnog proteina otputa transkripcioni faktor (npr.
Hedgehog, Notch i NF- B signalni putevi). Transkripcioni faktori aktivirani ovim signalnim
putevima u citosolu, translociraju se u nukleus i reguliu aktivnost nuklearnih transkripcionih
faktora. O ovim signalnim putevima koji reguliu transkripciju mnogih gena esencijlnih za rast,
diferencijaciju, deobu i druge funkcije elija, bi e diskutovano u odvojenim poglavljima.
Drugo, neke klase receptornih proteina mogu inicirati singaling preko vie od jednog
intracelularnog signal-transdukcionog puta, prouzrokuju i tako razli ite elijske odgovore. Ova
komplikacija je tipi na za G-protein-vezane receptore, receptore tirozin kinaze, kao i citokinske
receptore.
Tre e, bez obzira na ogroman broj razli itih liganda i njihovih specifi nih receptora, relativno mali
broj mehanizama transdukcije signala i veoma visoko konzervisani intracelularni proteini igraju
glavnu i veoma vanu ulogu u transdukciji signala intracelularnim signalnim putevima. Bez
obzira na ogromnu kompleksnost, postoji ogromna akumulacija dovoljne koli ine znanja iz ove
oblasti tako da je mogu e trasirati i pratiti ceo signalni put od momenta vezivanja ligand za
receptore nekoliko klasa, pa du/preko puteva transdukcije signala, sve do finalnih odgovora
elije.

2.1.2. Receptorni proteini ispoljavaju specifi nost prema vezivanju liganda i efektorima
Odgovor elije ili tkiva na specifi ne eksternalne signale je diktiran odredjenim i specifi nim
receptorima koje poseduju, putevima transdukcije signala koji se aktiviraju, kao i
intracelularnim procesima koji se eventualno afektuju. Svaki receptor generalno vezuje samo
jedan jedini signalni molekul ili grupu strukturno-veoma blisko povezanih molekula. Receptori
vezuju ligande sa odgovaraju om specifi no u koja je determinisana nekovalentnim

50

interakcijama izmedju liganda i specifi nih aminokiselina receptornog proteina. Na suprot tome,
mnoge signalne molekule se vezuju za multiple tipove receptora, od kojih svaki moe da aktivira
razli iti signlni put i prema tome da indukuje razli ite elijske odgovore. Na primer, razli iti tipovi
acetilholinskih receptora su pronadjeni na povrini skeletnih mii nih elija, sr anih mii nih
elija i pankreasnih acinusnih elija. Sekrecija acetilholina iz neurona funkcionalno povezanog
(neuromuskularna veza) sa elijom skeletne muskulature inicira kontrakciju aktivacijom ligandzavisnih jonskih kanala, dok sekrecija vezana za elije sr ane muskulature smanjuje brzinu rada
srca preko aktivacije GPCR. Sekrecija vezana za pankreasne acinusne elije inicira egzocitozu
sekretornih grnula koje sadre enzime. Sli no acetil-holinu, epinefrin se vezuje za razli ite Gprotein-vezane receptore od kojih svaki indukuje raznovrsne odgovore elije. Prema tome, svaki
receptorni protein se karakterie veznom specifi no u za ta no odredjen ligand, a nastali
receptor-ligand kompleks ispoljava efektornu specifi nost (posreduje specifi an elijski
odgovor).
Sa druge strane, razli iti receptori iste klase koji vezuju razli ite ligande veoma esto indukuju isti
bioloki odgovor u eliji. Na primer, u elijama jetre hormoni epinefrin, glukagon i ACTH se
veuzuju za razli ite lanove GPCR familije recepora, ali svi oni aktiviraju iste puteve transdukcije
signala (one koji uklju uju cAMP), to regulie razli ite metaboli ke funkcije, uklju uju i i
razgradnju glikogena. Sumirano, tri razli ita signala imaju isti efekat na metabolizam elija jetre.

2.1.3. Maksimalni odgovor elije na signalnu molekulu ne mora zahtevati

aktivaciju svih receptora
Kao to je navedeno, aktivacija receptornih proteina na povrini ciljne elije i regrutovanje
specifi nih puteva transdukcije signala se inicira vezivanjem signalne molekule (liganda) za
receptor. Vezivanje zavisi od slabih, nekovalentnih sila (npr. jonskih, van der Walsovih i
hidrofobnih interakcija) i molekularne komplementarnosti izmedju povrina koje interaguju na
receptoru i ligandu. Specifi nost receptora se ogleda u sposobnosti da razlikuje strukturno vrlo
sli ne supstance/molekule (npr. insulinski receptor vezuje insulin i insulinu sli an faktor rasta 1,
ali ne i druge peptidne hormone ili molekule). Mera afiniteta receptora za ligand je konstanta
disocijacije, Kd, tj. ona koncentracija liganda pri kojoj je polovina od maksimalnog broja
receptora okupirana ligandom. U velikom broju slu ajeva maksimalan odgovor elije na dati
ligand obi no se deava pri koncentraciji liganda pri kojoj ve ina receptora jo uvek nije

51

okupirana ligandom. Ovaj fenomen se moe uo iti ukoliko se prati odgovor

lignada za receptor pri rastu im koncentracijama liganda (Slika 2.2.).

elije i vezivanje

Slika 2.2. Maksimalni fizioloki odgovor na mnoge eksternalne signale

deava se kada je samo frakcija receptornih molekula okupirana ligandom.
U ovom slu aju su plot koji prikazuje vezivanje liganda i fizioloki odgovor, pri rastu im
koncentracijama liganda, razli iti. U prikazanom primeru 50% od maksimalnog fiziolokog
odgovora se dobija ukoliko je samo 18% od ukupnog broja receptornih mesta zauzeto, a
80% od maksimalnog fiziolokog odgovora se dobija kada je koncentracija liganda jednaka
Kd, odnosno kada je samo 50% od ukupnog broja receptorskih mesta okupirano.

Senzitivnost elije prema spoljanjim signalima je determinisana brojem receptora

Zbog toga to elijski odgovor na odredjeni signalni molekul zavisi od broja ligand-receptor
kompleksa, logi no je da e mali broj receptora prisutnih na povrini elije usloviti da je elija
slabo senzitivna na dati ligand. Kao posledica, potrebna je mnogo ve a koncentracija liganda da
prouzrokuje uobi ajeni fizioloki odgovor koji bi se dobijo da je vie receptora prisutno. Regulacija
broja ekspresovanih receptora za dati signalni molekul, a samim tim i senzitivnost ciljne elije za
dati signal ima veoma vanu, klju nu ulogu u usmerenoj fiziologiji i razvojnim procesima.
Alternativno, endocitoza receptora na povrini elije moe dovoljno redukovati broj prisutnih
receptora i tako zavriti uobi ajeni elijski odgovor na datu koncentraciju signalnog molekula.

2.1.4. Eseji za vezivanje se koriste za detekciju receptora i odredjivanje Kd vrednosti

Receptorne proteine na povrini elijske membrane ( elijske-povrinske receptore) je veoma teko
identifikovati i purifikovati (izdvojiti i pre istiti iz frakcije) uglavnom zbog toga to su prisutni u
relativno maloj koli ini. Receptor za odredjeni signalni molekul uglavnom ini samo oko 10-6
ukupnih proteina elije ili oko 10-4 proteina plazma membrane elije. Purifikacija je takodje veoma
teka zbog toga to su receptori integralni membranski proteini, te ih prvo treba solubilizovati
nejonskim deterdentima kako bi mogli biti separatisani od drugih proteina. Kao to je
napomenuto, koncentracija liganda pri kojoj je polovina od maksimalnog broja receptora
okupirana naziva se konstanta disocijacije i obeleava se sa Kd. Moe biti determinisana
eksperimentalno i ona je mera afiniteta receptora za ligand. Obi no se receptori detektuju i

52

determiniu na osnovu njihove sposobnosti da veu radioaktivni ligand za elije ili njihove
fragmente u tzv. esejima za vezivanje (engl. binding assays) ili bajnding esejima (Slika 2.3.).
Slika 2.3. Binding esej za receptore na povrini elije moe
determinisati Kd za ligande visokog afiniteta, kao i broj receptora po
eliji.
Ovde su prikazani rezultati za receptor specifi an za insulin na povrini hepatocita
elija jetre). Suspenzija elija je inkubirana 1 sat na 4oC sa rastu im koncentracijama
125I-obeleenim-insulinom. Niska temperatura je neophodna kako bi se spre ila
endocitoza elijskih-povrinskih receptora. elije se odvajaju od slobodnog/nevezanog
insulina obi no centrifugiranjem, a koli ina radioaktivnosti koja je prisutna u elijama
se potom odredjuje. Kriva totalnog vezivanja (A) predstavlja insulin koji je specifi no
vezan za receptore visokog afiniteta kao i insulin koji je nespecifi no vezan za druge
molekule malog afiniteta na povrini elije. Udeo nespecifi nog vezivanja u totalnom
vezivanju se determinie paralelnim ponavljanjem eseja u prisustvu 100 puta ve e
koncentracije neobeleenog insulina nego to je potrebno da bi se saturisala sva
vezna mesta visokog afiniteta za insulin. U ovom slu aju sav obleeni insulin se vee
za nespecifi na vezna mesta, te se dobijaju podaci za krivu C. Kriva specifi nog
vezivanja (B) se dobija prera unavanjem razlika izmedju krive A (ukupno vezivanje) i
krive C (nespecifi no vezivanje). Sa krive B se moe prera unati Kd vezivanja insulina
(oko 1.4x10-8 M ili oko 14 nM ) kao i broj receptora po eliji (oko 33000).

Ipak, mnogi ligandi se vezuju za svoje receptore sa mnogo manjim afinitetom. Ukoliko je Kd ve a
od 1x10-7 M, svaki ligand vezan za receptor se disocira za nekoliko sekundi koliko je potrebno da
se centrifugiranjem odvoji ligand vezan za elijske-povrinske receptore i od slobodnog liganda,
kako bi se determinisao procenat vezivanja. Da bi se ovo prevazilo, jedan od na ina kojima se
detektuje slabo vezivanje liganda za receptor su kompetitivni eseji u kojima se koristi i drugi
ligand sa ve im afinitetom za isti receptor (ima manju vrednost Kd). U ovim tipovima eseja rastu e
koncentracije neobeleenog liganda malog afiniteta, tzv. kompetitora, se dodaje u uzorak elija sa
konstantnom koncentracijom radioaktvino obeleenog liganda velikog afiniteta (Slika 2.4).

Slika 2.4. Vezivanje liganda malog afiniteta za

receptore na povrini elije moe biti detektovana
kompetitivnim esejima.
U ovom primeru je za detekciju vezivanja dva liganda malog
afiniteta za epinefrinske receptore, prirodni hormon epinefrin (EP)
i sinteti ki ligand izoproterenol (IP), kori en sinteti ki ligand
aloprenolol koji se vezuje sa velikim afinitetom (Kd je oko 3 nM)
za epinefrinske receptore na hepatocitima. Esej je izveden kao to
je opisano u legendi za sliku 2.3., samo to je kori ena
konstantna koncentracija radioaktivnog [3H]aloprenolola, a
dodavane su rastu e koncentracije neobeleenog epinefrina ili
neobeleenog izoproterenola.

53

Vezivanje neobeleenog kompetitora blokira vezivanje radioaktivno obeleenog liganda za receptor,

te se preko smanjivanja radioaktivnosti koja poti e od kompleksa radioaktivno obeleenog liganda
i receptora, sudi o koncentraciji neobeleenog kompetitora. Koncentracija kompetitora koja je
neophodna da inhibie vezivanje polovine radioaktivno obeleenog liganda predstavlja
aproksimativnu vrednost Kd za vezivanje kompetitora za receptor.

54

2.2. INTRACELULARNA TRANSDUKCIJA SIGNALA - PRENOS SIGNALA UNUTAR

ELIJE

Razli iti intracelularni putevi koji transdukuju signal od

aktiviranog receptora na povrini ciljne elije u donje
tokove/delove (engl. down-stream) signalnog puta se
razikuju po svojoj kompleksnosti i po na inu na koji vre
transdukciju signala. Ovde e biti opisane komponente
neki generalni principi transdukcije signala koji se mogu
biti primenjeni na razli ite signalne puteve. Komponente i
operativnost individualnih puteva signalne transdukcije
bi e opisana u odvojenim poglavljima i sekcijama.
2.2.1.
Drugi glasnici nose signale od mnogih
receptora
Vezivanje liganda, tzv. prvog glasnika, za mnoge
receptore na povrini ciljne elije vodi ka kratkotrajnom
pove anju (ili smanjenju) kratkoive ih intracelularnih
signalnih molekula male molekulske mase koji se zovu
sekundarni glasnici. Ovi molekuli uklju uju 3,5-cikli ni
AMP (cAMP); 3,5-cikli ni GMP (cGMP); 1,2-diacilglicerol
(DAG) i inozitol-1,4,5-trifosfat (IP3)(Slika 2.5.). Pored
navedenih, veoma vani sekundarni glasnici su i joni
Ca2+, kao i inozitol fosfolipidi koji se nazivaju
fosfoinozitidi.

Slika 2.5. Sekundarni glasnici.

Osnovni direktni efekat ili efekti svakog sekundarnog glasnika su nazna eni ispod njegove
strukturne formule. Jon Ca2+ i nekoliko membranski-vezanih fosfoinozitida takodje imaju funkciju
sekundarnih glasnika.

Pove ana intracelularna koncentracija jednog ili vie sekundarnih glasnika koja prati vezivanje
eksternalne signalne molekule okida rapidnu promenu u aktivnosti jednog ili vie enzima ili
neenzimskih proteina. Sli nosti u porastu koncentracije nekog sekundarnog glasnika (npr. cAMP)
indukuje razli ite promene u elijskom metabolizmu koje se razlikuju u razli itim tipovima elija.

55

2.2.2. Mnogi konzervisani intracelularni proteini imaju funkciju u transdukciji signala

Pored receptora na povrini elije i sekundarnih glasika, jo dve grupe evolutivno visoko
konzervisanih protiena imaju funkcije u putevima signalne transdukcije aktiviranim od stran
ekstracelularnog signala. Ovde su samo ukratko opisani, a njihova specifi na funkcija u svakom
individualnom i odredjenom putu transdukcije signala je opisna kasnije.
2.2.2.1. GTPazni proteinski izmenjiva i/prekida i
Ovo je prili no velika grupa intracelularnih prekida a koja formira tzv. GTPaznu superfamiliju.
Ovi proteini koji vezuju guaninske nukleotide se aktiviraju ili uklju uju (engl. turned on) kada
veu GTP, a inaktiviu se ili isklju uju (engl. turned off) kada je vezan GDP. Signalom
indukovana konverzija iz inaktivnog/off u aktivno/on stanje je posredovana sa faktorom za
izmenu guanin nukleotida (engl. Guanine nucleotide Exchange Factor - GEF) koji prouzrokuje
otputanje GTP sa proteina-prekida a. Posledi no vezivanje GTP (favorizovano je njegovom
visokom intracelularnom koncentracijom) indukuje konformacione promene proteina u dva
segmenta, te se to naziva prekida I i prekida II (engl. switch I, switch II), a one dozvoljvaju
proteinu da se dalje vezuje i aktivira druge signalne proteine u donjem toku (engl. down-stream)
signalnog puta (Slika 2.6.). Unutranja GTPazna aktivnost proteina hidrolizuje vezani GTP u GDP
i Pi, pa se zbog toga menja konformaciono stanje prekida a I i prekida a II od aktivne forme
natrag u inaktivnu formu. Brzina hidrolize GTP je vrlo esto poja ana sa proteinima koji
ubrzavaju GTPaznu aktivnost tj. GTPaza-akceleratornim proteinima (engl. GTPase-Accelerating
Proteins - GAPs) ija aktivnost moe biti kontrolisana ekstracelularnim signalima. Brzina GTP
hidrolize odredjuje kolliko dugo e protein-prekida ostati u aktivnoj konformaciji i biti sposoban
da transdukuje signal dalje. Postoje dve klase prekida kih proteina: (1) Trimerni ili veliki G
proteini koji se vezuju direktno za neke receptore i aktivirani su direktno od strane nekih
receptora. (2) Monomerni ili mali G proteini (Ras ili razli iti Ras-sli ni proteini) su vezani
indirektno za receptor preko adapternih proteina i GEF proteina. Svi G proteini sadre regione kao
to su izmenjiva /prekida I i izmenjiva /prekida II da bi mogli da moduliu aktivnost
specifi nih efektornih proteina preko direktne protein-protein interakcije koja se ostvaruje kada je
G protein vezan za GTP. Bez obzira na sli nost, ove dve klase GTP-vezuju ih proteina su
regulisane na veoma razli ite na ine.

56

Slika 2.6.
Izmenjiva ki/switching
monomerne i trimerne G proteine.

mehanizam za

Sposobnost G proteina da interaguju sa drugim proteinima i na taj na in

vre transdukciju signala se razlikuje u GTP-vezanom on stanju i GDPvezanom of stanju. A U aktivnom on stanju, dva domena koja se
nazivaju prekida I i prekida II su vezani za terminalni fosfat GTP preko
interakcija sa zadnjom amidnom grupom konzervisane treoninske i
glicinske rezidue. B Otputanje fosfata hidrolizom, katalizovanom
GTPazama, prouzrokuje relaksaciju prekida a I i prekida a II u druga ije
konformaciono stanje, off stanje. Ovde su prikazani tzv. ribon modeli
oba konformaciona stanja (on i off) monomernog G proteina koji se
zove Ras. Sli an mehanizam izmenjuje -subjedinicu trimernog G
proteina izmedju aktivne (on) i inaktivne (off) konformaicije. (Preuzeto
iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and
Company; adaptirano od Vetter & Wittnighofer (2001), Science
294:1299.).

G proteini su zaka eni za citoplazmati no lice plazma membrane gde imaju ulogu relejnih
molekula funkcionalno prenose i signal sa receptora za enzime ili jonske kanale u toj membrani.
Postoji veliki broj G proteina koji su specifi ni za odredjene setove serpentinskih receptora i za
odredjeni set down-stream targetnih proteina u plazma membrani. Svi oni imaju sli nu
strukturu i operativni su na sli an na in, ali regulacija njihove aktivnosti moe biti razli ita. G
proteini su gradjeni od tri proteinske subjedinice: , i . U nestimulisanom stanju, subjedinica
ima vezan GDP i tada je G protein je inaktivan (Slika 2.7.).

Slika 2.7. Struktura inaktivnog trimernog G proteina.

A Uo iti da i i subjedinica imaju kovalentno vezane lipidne
molekule koje im pomau da se veu za plazma membranu, a subjedinica ima vezan i GDP.
B Trodimenzionalna struktura inaktivnog G proteina bazirana na
transducinu, G proteinu vanom za vizuelnu transdukciju (videti
kasnije). -subjedinica ima GTPazni domen i vezuje se za jednu
stranu -subjedinice to zaklju ava GTPazni domen u inaktivnu
konformaciju kada je vezan GDP. -subedinica se vee za stranu
suprotnu od mesta vezivanja -subjedinice.

57

Kada je stimulisana aktiviranim receptorom

subjedinica otputa njen vezani GDP,
dozvoljavaju i da se vee GTP. Ova izmena inicira disocijaciju trimernog G proteina u dve aktivne
kompnenete:
subjedinicu i
kompleks (Slika 2.8.). Disocijacija trimernog G proteina aktivira
njegove dve komenente na razli it na in.
GTP vezivanje prouzrokuje konformacione
promene
koje
afektuju
povrinu
subjedinice koja je asocirana sa
kompleksom u trimer, te dolazi do
otputanja
-kompleksa, a -subjedinica
se adaptira u novi oblik koji joj dozvoljava
da interaguje sa svojim ciljnim proteinima.
-kompleks ne menja svoju konformaciju,
ali je povrina koja je ranije bila maskirana
-subjedinicom
sada
dostupna
za
interakciju sa drugim setom targetnih
proteina.
Ciljni
proteini
disociranih
komponeneti G-proteina su ili enzimi ili
jonski kanali u plazma mebrani koji dalje
prenose signal.
Slika 2.8. Disocijacija/rasklapanje aktiviranog trimernog G
proteina .
A U nestimulisanom stanju i receptor i G protein su inaktivni. Iako su
ovde prikazani odvojeno, oni su, bar u nekim slu ajevima, asocirani u
kompleks. B vezivanje ekstracelularnog liganda za receptor menja
konformaciju receptora, to dovodi do promene konformacije G proteina
vezanog za receptor. C Promena konformaiconog stanja -subjedinice
G proteina dozvoljava zamenu njenog GDP za GTP. Vezivanje GTP
prouzrokuje disocijaciju G proteina na dve aktivne komponenete: subjdeinicu i
-kompleks, i obe mogu da reguliu akativnost ciljnih
proteina u plazma membrani.

-subjdeinica G proteina je GTPaza i kada jednom hidrolizuje njen vezani GTP u GDP, ona se
vra a u inaktivno konformaiciono stanje koje joj omogu ava da se ponovo reasocira sa
kompleksom i re-formira inaktivni G protein (Slika 2.9.). Vreme tokom koga su -subjedinica i kompleks razdvojeni i aktivni je obi no relativno kratko i zavisi od toga koliko e brzo subjedinca hidrolizovati njen vezani GTP. Izolovana -subjedinica je neefikasna GTPaza i
ostavljena tako sa samo svojom opremljno u bez uticaja drugih signalnih molekula

58

inaktivisa e se za nekoliko minuta. Njena

inaktivacija se u eliji obnavalja veoma
brzo zato to je GTPazna aktivnost subjedinice
veoma
mnogo
poja ana
vezivanjem drugog proteina koji moe biti
ili njen targetni protein ili specifi ni
modulator poznat kao regulator G protein
signalinga (engl. Regulator of G protein
Signaling - RGS). RGS proteini deluju kao
-subjedinice
specifi ni
GTPaze
aktiviraju i proteini, tj. ranije pomenuti
GAPs i imaju krucijalnu ulogu u off
regulaciji
G proteinima-posredovanih
odgovora u svim eukariotskim elijama.
Detektovano je i definisano oko 25
razli itih RGS proteina kodiranih u
humanom genomu, a smatra se da svaki
od njih interaguje sa odredjenim setom
Gproteina.

Slika 2.9. Inaktivacija/switching off -subjedinice G

proteina njenom GTPaznom aktivnosti tj. hidrolizom za nju
vezanog GTP .
A Nakon to -subjeidnica G proteina aktivira njen targetni protein,
ona sama sebe inaktivie tj. prebacuje u off stanje tako to
GTPaznom aktivnosti hidrolizuje GTP koji je vezan za nju u GDP. Ovo
inaktivie -subjedinicu koja se disocira od targetnog proteina i
reasocira se sa -kompleksom re-formiraju i inaktivni trimerni G
protein. Vezivanje za targetni protein ili za membranski vezani RGS
protein (nije prikazan na slici) obi no stimulie GTPaznu aktivnost subjedinice, a ova stimulacija veoma mnogo ubrzava proces inaktivacije
-subjedinice.

59

2.2.2.2. Protein kinaze i protein fosfataze

Aktivacija receptora na povrini ciljne elije vodi direktno ili indirektno preko aktivacije protein
kinaza ili protein fosfataza ka promenama u fosforilaciji proteina. Prema tome, ovi enzimi su
odgovorni za odravanje stanja fosforilacije/defosforilacije mnogih proteina koje doprinosi
aktivaciji/inaktivaciji datog proteina, a samim tim ima uticaja na fizioloke procese i odgovor
elije. Animalna elija sadri dva tipa protein kinaza: (1) one koje dodaju fosfat hidroksilnoj
grupi tirozinskih rezidua i (2) one koje dodaju fosfat hidroksilnoj grupi serinskih ili
treoninskih rezidua ili obema aminokiselinama. Fosfataze koje uklanjaju fosfatnu grupu mogu
delovati u koncernu sa kinazama u smislu da uklju uju ili isklju uju aktivnost nekog
proteina. Prema poslednjim prera unima humani genom kodira oko 500 protein kinaza i 100
razli itih fosfataza. U nekim signalnim putevima receptor sam po sebi poseduje unutranju
kinaznu ili fosfataznu aktivnost, dok u drugim putevima transdukcije signala receptor interaguje
sa citosolnim ili membranski vezanim kinazama. Generalno, protein kinaze fosforiliu specifi ne
rezidue u setu ciljnih proteina iji je obrazac ekspresije generalno razli it u razli itim tipovima
elija. Mnogi proteini su supstrati za nekoliko tipova kinaza, a svaki proces fosforilacije na
razli itoj aminokiselini modifikuje aktivnost odredjenog ciljnog proteina u razli itom pravcu tj.
nekada ga aktivira, a nekada ga inhibie. Kataliti ka aktivnost same protein kinaze je veoma
esto modifikovana ili drugim kinazama, ili direktnim vezivanjem signalnih proteina, ili pak
promenama nivoa razli itih sekundarnih glasnika. Aktivnosti svih protein kinaza se
suprotstavljaju protein fosfataze, od kojih su neke regulisane ekstracelularnim signalima. Prema
tome, aktivnost proteina u eliji moe biti kompleksna funkcija viestruke aktivnosti raznih
kinaza i fosfataza koje deluju na dati protein.
Iako cAMP moe direktno da aktivira odredjene tipove jonskih kanala u plazma membrani
nekih visoko-specijalizovanih elija, u ve ini elija svoj efekat ostvaruje aktivacijom cAMP-zavisne
protein kinaze A, PKA. Ovaj enzim katalizuje transfer terminalne fosfatne grupe od ATP do
specifi nih serina ili treonina selektovanih ciljnih proteina i u tom maniru regulie njihovu
aktivnost. PKA je pronadjena u ve ini ivotinjskih elija i odgovorna je za efekat cAMP u ve ini
elija. Supstrat za PKA je razli it u razli itim elijskim tipovima, to objnjava zbog ega su efekti
cAMP toliko razli iti u zavisnosti od tipa elija. U inaktivnom stanju PKA se sastoji od kompleksa
dve kataliti ke i dve regulatorne subjedinice. Vezivanje cAMP za regulatornu subjedinice PKA
menja njihovu konformaciju i prouzrokuje da one disociraju od kompleksa. Oslobodjene
kataliti ke subjedinice su zbog toga aktivirane/slobodne da fosforiliu proteinske molekule
specifi nih substrata. Regulatorna subjedinica je takodje vana za lokalizaciju kinaze unutar
elije. Poseban protein, tzv. PKA protein za usidravanje (engl. PKA anchoring protein) vri

60

usidravanje i vezuje obe regulatorne subjedinice, a vezuje se i za membranu ili komponente

citoskeleta, te na taj na in dri enzimski kompleks u odredjenom subcelularnom kompartmentu.
Neki od ovih proteina za
usidravanje vezuju i druge
kinaze i neke fosfataze i tako
ine signalni kompleks.
Slika 2.10. Aktivacija cAMP zavisne protein
kinaze (PKA) .
Vezivanje cAMP za regulatorne subjedinice indukuje
konformacione promene i prozrokuje disocijaciju ovih
subjedinica od kataliti kih, to aktivira kataliti ke
subjedinice. Otputanje kataliti ih subjedinica zateva
vezivanje vie od dva molekula cAMP za regulatornu
subjedinicu i formiranje tetramera. Ovaj zahtev
omogu ava da odgovor PKA na pove anje
koncentracije cAMP bude veoma otar.

elije sisara imaju bar dva tipa PKA: tip I (uglavnom u citosolu) i tip II (vezana je preko svojih
regulatornih subjedinica i specijalnog anchoring proteina za plazma membranu, nuklearnu
membranu, spoljanju membranu mitohondrija i mikrotubule). Bez obzira na tim, u svim
slu ajevima aktivacije, jednom kada su kataliti ke subjedinice slobodne i aktivne, one migriraju u
nukleus (gde mogu da fosforiliu genske regulatorne proteine), dok regulatorne subjedinice ostaju
u citoplazmi. Neki odgovori cAMP su rapidni, dok su neki drugi spori. Na primer, u elijama koje
sekretuju polipeptidni hormon somatostatin, cAMP aktivira gene koji kodiraju sintezu ovog
hormona. Regulatorni region somatostatinskog gena sadri kratku sekvencu DNK koja je
odgovorna za vezivanja cAMP tj. element odgovoran za cAMP (engl. Cyclic AMP Responsive
Element CRE) i koji je pronadjen u regulatornom regionu mnogih gena koje aktivira cAMP.
Specifi an genski regulatorni protein koji se zove, CRE-vezuju i protein (engl. CRE-Binding
protein - CREB). Kada je CREB fosforilisan na jednom jedinom serinu od strane PKA regrutuje
transkripcioni koaktivator koji se zove CREB-vezuju i potein (engl. CREB-Binding Protein - CBP)
to stimulie transkripciju gena za pomenuti hormon (Slika 2.11.). Ukoliko je serin koga fosforilie
PKA mutiran, CREB ne moe da regrutuje CBP, te ne moe vie da stimulie transkripciju gena
kao odgovor na pove anje nivoa intracelularnog cAMP.
Fosfataze ine efeakt PKA, kao i drugih kinaza tranzijentnim. I ovo je veoma dobra
evolutivna adaptacija zbog toga to je neophodno prvo vratiti protein u inaktivno stanje
defosforilacijom kako bi on mogao biti ponovo aktiviran fosforilacijom. Defosforilaciju
fosforilisanih serina i treonina katalizuje etiri osnovna tipa serin/treonin protein fosfataza:

61

protein fosfataze I, IIA, IIB i IIC. Izuzev protein fosfataze IIC ( ija je fosfatazna aktivnost
minorna u poredjenju sa drugima) sve ostale fosfataze su gradjene od homologih kataliti kih
subjedinica koje su u kompleksu sa jednim ili vie velikih setova regulatornih subjedinica.
Regulatorne subjedinice pomau u kontroli
fosfatazne aktivnosti i omogu avaju enzimu
da selektuje specifi an ciljni molekul. Protein
fosfataza I je odgovorna za defosforilaciju
mnogih proteina fosforilisanih od strane PKA.
Na primer, inaktivie CREB uklanjaju i
njegov aktivni fosfat, te time isklju uje
transkripcioni
odgovor
prouzrokovan
porastom nivoa cAMP. Protein fosfataza IIA
ima veoma iroku specifi nost i smatra se da
je
glavna
fosfataza
odgovorna
za
reverzibilnost mnogih efekata fosforilacije
katalisanih serin/treonin kinazama. Protein
fosfataza IIB se jo naziva i kalcineurin.
Aktivira se jonima Ca2+ i posebno je
dominantna u mozgu.

Slika 2.11. Kako se aktivira transkripcija gena porastom

koncentracije cAMP.
Vezivanje ekstracelularne molekule za njen G-protein vezani receptor vodi
aktivaciji adenilil ciklaze i pove anju koncentracije cAMP. Ovo pove anje
koncentracije cAMP aktivira PKA u citosolu i oslobodjene kataliti ke
subjedinice se translociraju u nuklesu gde fosforiliu CREB-regualtorne gene.
Jednom fosforilisan CREB e regrutovati koaktivator CRB to dovodi do
transkripcije gena. Ovaj signalni put kontrolie mnoge procese u eliji,
po evi od sinteze hormona u endokrinim elijama, pa do produkcije proteina
neophodnih za proces dugotrajnog pam enja u mozgu. Pored PKA, postoje i
Ca2+-zavisne protein kinaze koje mogu fosforilisati,a time i aktivirati CREB.

2.2.3. Neki receptori i proteini signalne transdukcije su lokalizovani

Iako je epinefrinski receptor ekspresovan na adipocitima ( elijama masnog tkiva koje
magacioniraju lipide) uniformno distribuiran na povrini ovih sfernih elija, ovakav na in

62

uniformne distribucije receptora je veoma redak. Mnogo e i na in distribucije je tzv. grupisanje

receptora u grozdove/skupine (engl. clustering of receptors), a i ne samo receptora nego i drugih
proteina asociranih za membranu elije. Ovo grupisanje receptora i membranski-asociranih
proteina se odvija u ta no odredjenom regionu povrine elije. U ovoj sekciji bi e opisano kako
multipla protein-protein i protein-lipid interakcija moe da grupie signalne proteine na plazma
membranu i kakve su prednosti od ovog grupisanja /clustering-a.
2.2.3.1. Grupisanje/clustering membranskih proteina posredovano adapternim
domenima
Verovatno najbolji primer grupisanja receptora i proteina na membrani su hemijske sinapse.
Poznato je da su sinapti ke veze veoma visoko specijalizovane strukture i specifi ni funkcionalni
spojevi izmedju dve ekscitabilne elije. Ovakav vid komunikacije se ostvaruje neurotransmiterima
koji se egzocitozom sekretuju iz presinapti ke elije i vezuju za specifi ne receptore na membrani
postsinapti ke elije. Grupisanje/clustering receptora za neurotransmitere u regionu membrane
postsinapti ke elije koji se su eljava sa presinapit kom elijom favorizuje rapidnu i efikasnu
transmisiju signala. Drugi proteini na membrani postsinapti ke elije interaguju sa proteinima
ekstracelularnog matriksa u cilju da zarobe/zaklju aju eliju u sinapsu.
Proteini koji sadre ve pomenuti PDZ domen (videti poglavlje 1) imaju fundamentalnu
ulogu u organizovanju plazma membrane postsinapti ke elije. PDZ domen je identifikovan kao
zajedni ki element koji ima nekoliko citosolnih proteina koji se vezuju za integralne proteine
plazma membrane, a svaki od ovih domena se vezuje za specifi an motiv na receptoru ili
signalnom proteinu. PDZ je skra enica koja je nastala kombinovanjem prvih slova tri proteina za
koje je prvo otkriveno da imaju isti domen: PSD-95 (engl. Post Synaptic Density protein 95), DlgA
(engl. Drosophila disc large tumor suppressor A ) i Zo-1 protein. PDZ domen je relativno mali
domen (sadri oko 90 aminokiselinskih ostataka) koje se vezuje za sekvencu od tri rezidue Cterminalnog domena ciljnog proteina (Slika 2.11A.). Neki PDZ domeni se vezuju za sekvencu
motiva serin/treonin-X- (Ser/Thr-X- ), gde X ozna ava bilo koju aminokiselinu, a
ozna ava
hidrofobnu aminokiselinu, dok se drugi PDZ domeni vezuju za sekvencu motiva -X- . Ve ina
elijskih, povrinskih receptora i transportera sadri ve i broj subjedinica od kojih svaka moe da
se vee za PDZ domen. Pored toga, mnogi citosolni proteini sadre multiple PDZ domene kao i
druge tipove modularnih domena koji participiraju u protein-protein interakcijama, pa prema
tome. mogu da se vezuju za nekoliko membranskih proteina istovremeno. Ovaj vid interakcija
dozvoljava grupisanje/clustering razli itih membranskih proteina u velike komplekse (Slika
2.11B.). Druge protein-protein interakcije dozvoljavaju ovim kompleksima da se veu za aktinske

63

filamente koji lee ispod plazma membrane. S obzirom da jedan aktinski filament moe da vee
ve i broj klastera, na ovaj na in jo ve i broj molekula plazma membrane moe biti dodatno
klasterovan/grupisan zajedno i specifi no. Ovo je jedan od mehanizama kojim su mnogi receptori
koji vezuju isti ili razli iti ligand lokalizovani u specifinom regionu postisinapti kih i drugih elija.

Slika 2.11. Grupisanje/clustering membranskih proteina je posredovano citosolnim adapternim proteinima koji imaju viestruke tj.
multiple protein-vezuju e domene.
PDZ domen (vezuje odredjene C-terminalne sekvence) i SH3 domen (vezuje prolinima-bogate sekvence) su dva od nekoliko veoma konzervisanih modularnih
domena koji participiraju u interakcijama izmedju proteina tj. protein-protein interakcijama. A trodimenzionalna struktura PDZ domena. B ematski dijagram
protein-protein interakcije koja grupie nekoliko razli itih membranskih proteina u postsinapti ki segment nervne elije i usidruje dobijeni kompleks za aktinski
filament citoskeleta. U okviru adapternog proteina PSD-95 prikazana su dva od tri PDZ, kao i jedan SH3 domen koji vezuju tri razli ita membranska proteina u
kompleks. Guanilar kinazni (GuK) domen PSD-95 proteina povezuje kompleks preko nekoliko interventnih adapternih proteina (uklju uju i jedan koji takodje sadri
PDZ i SH3 domene) za aktinsku nit podvu enu ispod plazma membrane. Neuroglin je adhezivni protein koji interaguje sa komponenetama ekstracelularnog matriksa,
a ankirinski ponovci (Ank) su drugi multi-vezuju i adapterni proteini koji lokalizuju i grupiu razli ite receptore u sinapti kom regionu plazma membrane.

2.2.3.2. Grupisanje/clustering proteina u lipidne agregate

Pojedini lipidi u plazma membrani, posebno holesterol i sfingolipidi su organizovani u agregate
koji se nazivaju lipidni agregati/skupine/guve ili tzv. lipidni krevi (engl. lipid rafts) koji takodje
sadre i specifi ne proteine (Slika 2.12.). U sisarskim elijama, specifi ni lipidni agregati se
nazivaju kalveole (engl. caveolae) koji su od veoma posebnog interesa zbog toga to je pronadjeno
da one sadre nekoliko razli itih receptora i drugih proteina sposobnih da transdukuju signal.
Ove nakupine su markirane prisustvom specifi nih proteinina, kaveolina, (engl. caveolin) familije
od oko 25 kDa proteina. Kaveolinski proteini imaju centralni hidrofobni segment za koji se smatra
da preseca dva puta membranu, a oba kraja, i N-terminalni i C-treminalni kraj kaveolina su u

64

citosolu. Veliki oligomeri kaveolina formiraju proteinizirani prekriva na citosolnoj povrni kaveola
vidljiv elektronskim mikroskopom. Nije sasvim precizno pokazano kako pojedini signalni molekuli
mogu biti zaka eni za kaveole. Proksimalni signalni molekuli u okviru kaveole mogu da facilitiraju
medjusobne interakcije, te da na taj na in promoviu odredjene signalne puteve koji bi ina e bili
neefikasno operativni.
Slika 2.12. Neki membranski lipidi i
proteini su koloklizovani u lipidnim
nakupinama/krevima.
Rezultati biohemijskih istraivanja sugeriu
da GM1, glikosfingolipid, i placentalna
alkalna fosfataza (engl. PLacental Alkaline
Phosphatase PLAP), lipida-usidravaju i
(engl. lipid-anchored) membranski protein,
su agregirani u lipidne kreve, dok
transferinski receptor (TfR) koji prolazi
skroz kroz membranu nije. Za lokalizaciju
ovih komponeneti u plazma membrani
elije su tretirane sa fluorescentno-zelenoobeleenim kolera toksinom, koji uporedovezuje GM1 molekule koji su priblieni, i sa
fluorescentno-crveno-obeleenim antitelima specifi nim ili za PLAP ili zaTfR. Svako
antitelo moe da unakrsno vezuje bliske
molekule proteina koje prepoznaje.
Unakrsno vezivanje prouzrokuje da
proteini ili lipidi formiraju velike obojene
zakrpe koje mogu biti detektovane
fluorescentnim mikroskopom.

2.2.4. Razvijanje odgovaraju ih elijskih odgovora zavisi od interakcije i regulacije

signalnih puteva
U ovom i narednom poglavlju tekst je fokusiran primarno na vrlo jednostavnim putevima
transdukcije signala koji se uklju uju jednostavnim vezivanjem jednog liganda za jedan tip
receptora. Medjutim, esto aktivacija jednog tipa receptora vodi ka produkciji nekoliko razli itih
sekundrnih galsnika koji imaju razli ite efekte. Pored toga, isti elijski odgovor (npr. razgradnja
glikogena) moe biti indukovana multiplim signalnim putevima.Ovakva interakcija razli itih
signalnih puteva dozvoljava veoma fino podeavanje elijskih aktivnosti koje su neophodne da
obezbede kompleksne razvojne i fizioloke procese. Sposobnost elija da odgovaraju na
odgovaraju i na in na ekstracelularne signale takodje zavisi i od sopstvene regulacije signalnih
puteva. Na primer, kada koncentracija eksternalnog signala opadne, signaling preko nekih

65

intracelularnih puteva se zavrava degradacijom sekundarnih glasnika, dok se kod drugih

signalnih puteva signaling zavrava deaktivacijom proteina koji vre transdukciju signala. Jo
jedan veoma vaan mehanizam koji osigurava odgovaraju i elijski odgovor je, ve pominjana
(videti poglavlje 1), desenzitivizacija receptora pri visokoj koncentraciji signala ili nakon
produenog izlaganja istom signalu. Senzitivnost elije prema odredjenom signalnom molekulu
moe biti regulisana na dole (engl. down-regulated) endocitozom receptora, ime se smanjuje
broj receptora na povrini, ili modifikacijom aktivnosti receptora, te receptori ili ne mogu da veu
ligand ili formirani kompleks receptor-ligand ne moe da indukuje normalni odgovor elije.
Ovakva modifikacija receptora je esto posledica fosforilacije receptora, ili vezivanja drugih
proteina, ili i jednog i drugog. Razli iti mehanizmi kojima se reguliu signalni putevi bi e detaljnije
opisani prilikom predstavljanja individualnih signalnih puteva.

66

SIGNALNI PUTEVI PREKO MEMBRANSKIH

RECEPTORA VEZANIH ZA G-PROTEINE

03

3.1. GPCR-zavisna AKTIVACIJA/INHIBICIJA ADENILIL CIKLAZE (AC)

Kao to je napomenuto ranije, adenilil ciklaza (AC) je enzim koji katalie formiranje sekundarnog
glasnika cAMP-a od ATP-a kao prekursora. Jedan od na ina kojim aktivirani recepor indukuje
aktivaciju adenilil ciklaze je preko G proteina. Svi receptori kojima G proteini prevode signal
odnosno koji su G proteinima kaplovani (engl. G Protein-Coupled Receptors - GPCRs) imaju
sedam transmembranskih regiona tj. sedam puta presecaju plazma membranu, pri emu im se
N-terminalni segment nalazi na ekstracelularnoj strani plazma
membrane. C-terminalni segment se nalazi na citosolnoj strani
plazma membrane ciljne elije (Slika 3.1.)
Slika 3.1. ematski dijagram generalne strukture G protein-vezanih receptora.
Svi receptori ovog tipa imaju istu orjentaciju na membrani i sadre sedam transmembranskih -heliksa (H1H7), etiri ekstracelularna segmenta (E1-E4) i etiri citotosolna segmenta (C1-C4). Karboksil-terminalni
segment (C4), C3 petlja, a kod nekih receptora, takodje C2 petlja, su uklju eni u interakciju sa povezanim
trimernim G proteinom.

GPCR familija je veoma brojana i ulju uje receptore za veliki broj hormona i neurotransmitera,
receptore koji se aktiviraju svetlom (rodopsini), i doslovno na hiljade receptora za miris u nosu sisara.

Heterotrimerni G proteini koji transdukuju signal su gradjeni od tri subjedinice obeleene kao ,
i . Tokom intracelularnog signalinga
i
subjedinice ostaju vezane i uobi ajeno je da se
obeleavaju sa G subjeidnica. G subjedinica je tzv. GTPazni izmenjiva ki protein (engl. GTPase

67

switch protein) koji se menja izmedju aktivnog (on) stanja sa vezanim GTP i inaktivnog (off)
stanja sa vezanim GDP. Stimulacija receptora povezanih sa G proteinom prouzrokuje aktivaciju
G proteina, koji potom modifikuje aktivnost odredjenog, na bilo koji na in asociranog, efektornog
proteina. Iako je u najve em broju slu ajeva efektroni protein aktiviran sa G GTP, u nekim
slu ajevima je inhibisan. Takodje, u zavisnosti od elije i lignada, G subjedinica e pre nego G
transdukovati signal efektornom proteinu. Pored toga, aktivnost nekoliko razli itih efektornih
proteina je kontrolisana preko nekoliko razli itih GPCR-ligand kompleksa. Svi efektorni proteini su
membranskivezani jonski kanali ili enzimi koji kataliu formiranje sekundarnih grlasnika (npr.
cAMP, DAG, IP3). Ove varijacije na temu GPCR signalinga postoje zbog toga to su multiple forme G

proteina kodirane genomom eukariotske elije. Na primer, humani genom kodira 27 razli itih G ,
5 G i 13 G subjedinica. Koliko je poznatno do danas, izgleda da sve G funkcioniu sli no, dok
se funkcije G razlikuju (Tabela 3.1.).
Tabela 3.1. Glavne klase sisarskih trimernih proteina i njihovih efektora
G klasa

UDRUENI EFEKTOR

SEKUNDARNI GLASNIK

PRIMER RECEPTORA

Gs

Adenilil ciklaza

cAMP (porast)

-Adrenergi ki (epinefrinski) receptor; receptor za glukagon,

serotonin, vazopresin

Gi

Adenilil ciklaza
K+ kanal (G aktivira efektor)

cAMP (smanjenje)
Promena membranskog potencijala

1-Adrenergi ki receptor
Muskarinski acetilholinski receptor

Golf

Adenilil ciklaza

cAMP (porast)

Gq

Fosfolipaza C

IP3, DAG (porast)

Mirisni receptori u nosu

2-Adrenergi ki receptori

Go

Fosfolipaza C

IP3, DAG (porast)

Acetilholinski receptori endotelijalnih elija

Gt

cGMP fosfodiesteraza

cGMP (smanjenje)

Rodopsin (receptor za svetlost u tapi ima retine)

Prikazane G podklase mogu biti udruene sa vie efektornih proteina. Do danas je samo jedan glavni G s identifikovan ali multipli Gq i Gi su opisani. Efektorni proteini su naj e e
regulisani sa G , ali u nekim slu ajevima sa G ili kombinovanim delovanjem G i G . IP3= inozitol 1,4,5-trifosfat; DAG= 1,2- diacilglicerol.

Pored hetrotrimernih G proteina, velika grupa heterogenih G proteina takodje uklju uje veliku
familiju tzv. malih GTP-vezuju ih izmenjiva kih proteina (engl. small GTP-binding proteins)
koja uklju uje faktore za inicijaciju i elongaciju (u estvuju u sintezi proteina); Ras (uklju eni
su u signalnu kaskadu aktiviranu faktorima rasta); Rab (u estvuju u izboru, sortiranju i fuziji
membranskih vezikula); ARF (uklju eni su u formiranje vezikularnih koatomernih omota a); Ran
(u estvuju u transportu proteina u nukleus i iz njega); Rho (reguliu funkciju aktinskog
citoskeleta). Sve razli itosti u konformaciji GTP-vezuju ih proteina zavise od toga da li je GDP ili

68

GTP prisutan na njihovom nukleotid-vezuju em mestu. U ovoj sekciji e prvo biti opisan proces
transdukcije signala od GPCR, a to je proces koji je isti za sve receptore koji su GPCR tipa.

3.1.1. G subjedinica G proteina ciklira izmedju aktivne/on i inaktivne/off forme

Kao to je ranije napomenuto, GTP vezivanje indukuje aktivnu konformaciju ili tzv. on stanje, dok
prisustvo GDP indukuje inaktivnu konformaciju tj. tzv. off stanje.Ve ina GTP-vezuju ih proteina
zavisi od svojih tzv. pomaga kih proteina (engl. helper proteins). Kao to je ranije napomenuto,
GTPaze aktiviraju i proteini (engl. GTPase Activating Proteins GAPs) favorizuju hidrolizu GTP-a
(Slika 3.2.). GAP moe da obezbedi esencijalno aktivno mesto rezidui favorizuju i korektnu
poziciju glutamatnog ostatka na izmenjiva kom domenu II (engl. swich II domain). Veoma esto se
pozitivno naelektrisani ostatak arginina od GAP polekule ubacuje u aktivno mesto i tokom
hidrolize pomae stabilizaciji tranzicionog stanja tako to interaguje sa negativno naelektrisanim
atomom kiseonika terminalnog fosfata GTP molekule. G heterotrimernog G proteina inicira
sposobnost hidrolize i ima esencijalni argininski ostatak koju za male GTP-vezuju e proteine
obi no obezbedjuje GAP. Stimulaciju G -zavisne GTP hidrolize vre proteini regulatori G protein
signalinga (engl. Regulators of G protein Signaling - RGS) i oni zapravo vre funkciju negativnih
regulatora G protein signalinga zato to ubrzavaju i hidrolizu GTP-a redukuju vreme tokom kog
efektor ostaje aktivan. Pored toga, guanin nukleotida izmenjiva ki factori (engl. Guanine
nucleotide Exchange Factors - GEFs) favorizuju izmenu GDP/GTP. Aktivirani GPCR normalno
ima funkciju GEF za heterotrimerni G protein, zato to aktivacija GPCR
zapravo promovie izmenu GDP/GTP nukleotida. Alternativno, proteini
aktivatori G protein signalinga (engl. Activator of G protein Signaling AGS) mogu aktivirati neke heterotrimerne G proteine nezavisno od
receptora, a neki AGS mogu imati GEF aktivnost.
Slika 3.2. ematski dijagram funkcije GAP i GEF proteina.

Kao to je napomenuto, svi receptori koji preko G proteina transdukuju ekstracelularni signal do
efektronih molekula na sli an na ina aktiviraju trimerne G proteine (Slika 3.3.). I G i G
subjedinice su vezane za membranu preko kovalentno zaka enih lipida. U stanju mirovanja, tj.
kada receptor nije aktiviran vezivanjem liganda, G je vezana za GDP i u kompleksu je sa G .
Vezivanje normalnog hormonalnog liganda (npr. epinefrina) ili njegovog agoniste (npr.
izoprotenerola) za receptor menja konformaciju receptora, prouzrokuju i njegovo vezivanje za G ,
u takvom maniru, da se odvaja GDP od G a vezuje se GTP. Prema tome, aktivirani ligand-

69

vezuju i receptor funkcionie kao GEF za G

subjedinicu. Nakon izmene nukleotida, odnosno

vezivanja GTP, G GTP kompleks se disocira
od G subjedinice, ali i kompleks i subjedinica
ostaju zaka eni/usidreni za membranu. U
najve em broju slu ajeva G GTP kompleks
potom interaguje sa asociranim efektorinim
proteinom i aktivira ga (Slika 3.3). Ova
aktivacija je kratkog veka ili tzv. kratko-ive a
aktivacija, zbog toga to se GTP vezan za G
veoma brzo (za nekoliko sekundi) hidrolizuje u
GDP. Ova hidroliza je katalizovana enzimskom
molekulom
koja
je
unutranji
deo
G subjedinice, pa se zato kae da G
subjedinica heterotrimernog G proteina ima
unutranju GTPaznu aktivnost. Na taj na in
nastaje G GDP kompleks koji se veoma brzo
re-asocira sa G subjedinicom reforimraju i
heterotrimerni G protein, te se na taj na in
prekida/zavrava
aktivacija efektora.
U
mnogim slu ajevima RGS ubrzavaju G zavisnu GTP hidrolizu redukuju i time vreme
tokom koga efektor ostaje aktivan.

Slika 3.3. Operativni model ligand-indukovane ativacije efektornih proteina asociranih sa GPCR.
G i G subjedinice heterotirmernog G proteina su pri vr ene za membranu
preko kovalentno zaka enih lipidnih molekula (izreckane crne linije). Vezivanje
liganda (1), pra eno disocijacijom G proteina (2), a potom izmenom GDP za
GTP (3), prouzrokuje da se slobodna G GTP vezuje i aktivira efektorni
protein (4). Hidroliza GTP-a vri terminaciju signalinga i vodi ka ponovnom
sklapanju/asocijaciji heterotrimerne forme, vra aju i time sistem u stanje
mirovanja koje je bilo pre vezivanja liganda za receptor. Vezivanje drugog
molekula liganda prouzrokuje ponavljanje ciklusa. U nekim signalnim putevima
efekorni protein se aktivira slobodnom G subjedinicom.

70

U novije vreme je detektovana in vivo (u ivim elijama) GPCR-posredovana disocijacija

heterotrimernog G proteina. U ovim istraivanjima je eksploatisan fenomen transfera
fluorescentne rezonantne energije (engl. Fluorescent Resonance Energy Transfer FRET) koji
menja talasnu duinu emitovane fluorescencije kada dva fluorescentna proteina interaguju.
Ovakvim eksperimentalnim pristupom je mogu e demonstrirati i registrovati disocijaciju G G
heterotrimernog kompleksa tokom nekoliko sekundi nakon dodavanja liganda, a podaci dobijeni u
ovom in vivo modelu (ivim i funkcionalnim elijama) dodatno potvrdjuju model G protein
cikliranja izmedju aktivnog/on i inaktivnog/off stanja (Slika 3.4.). Ovakav generalni
ekspreimentalni protokol moe biti kori en za pra enje procesa formiranja i disocijacije i drugih
protein-protein kompleksa u ivim elijama.

Slika 3.4. Receptorom-posredovana aktivacija G-proteina u ivim elijama se deava u toku nekoliko sekundi nakon vezivanja ligada.
Ameba Dictyostelium discoideum je transfekovana genima koji kodiraju dva fuzionisana proteina: G je fuzionisan sa cijan fluorescentnim proteinom (engl. Cian
Fluorescent Protein - CFP), mutantom zelenog fluorescentnog proteina (engl. Green Fluorescent Protein - GFP), dok je Gb subjeidnica fuzionisana sa drugom
varijantom GFP, utim fluorescentnim proteinom (engl. Yellow Fluorescent Protein YFP). CFP normalno fluorescira na 490-nm svetlosti; dok YFP normalno
fluorecira na 527-nm svetlosti. A kada su CFP i YFP blizu (kao u slu aju mirovanja tj. kada receptor nije okupiran ligandom i kada su G G u kompleksu) odigrava
se transfer fluorescentne energije izmedju CFP i YFP (levo). Kao posledica toga, iradijacija elija u stanju mirovanja sa 440-nm svetlosti (koja direktno ekscitira CFP,
ali ne i YFP) prouzrokuje emisiju od 527-nm ute svetlosti koja je karakteristi na za YFP. Medjutim, ako vezivanje liganda pruzrokuje disocijaciju G G kompleksa i
odvajanje G G subjedinica, ne dolazi do transfera fluorescentne energije. U ovom slu aju irradijacija elija sa 440-nm svetlosti prouzrokuje emisiju od 490-nm
crvene svetlosti karakteristi nu za CFP (desno). B - Plot emisije ute svetlosti (527 nm) od jedne transfekovane elije amebe pre i nakon dodavanja cAMP (strelica
ozna ava momenat kada je cAMP dodat u sistem) koji je ekstracelularni ligand za GPCR u ovim elijama. Pad flurescencije koji je rezultat disocijacije G -CFP
fuzionog proteina od G -YFP fuzinog proteina deava se u toku nekoliko sekundi nakon dodavanja cAMP-a. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell
Biology. WH Freeman and Company, gde je adaptirano od Janetopoulos i sar. (2001), Science 291:2408.).

3.1.2. Epinefrin se vezuje za nekoliko razli itih GPCR

Epinefrin je neobi no vaan u posredovanju odgovora organizma na stresnu situaciju, kao to je
strah ili naporno vebanje, kada sva tkiva imaju pove anu potrebu da katabolu glukozu i masne
kiseline i da produkuju ATP. Ovaj osnovni metaboli ki pokreta i osnovno gorivo organizma,
moe se dostaviti u cirkulaciju za par sekundi preko rapidne glikogenolize (razgradnje glikogena u

71

glukozu) u jetri, a takodje i brzom lipolizom (razgradnjom triglicerida do masnih kiselina u

adipocitima tj. masnim elijama). Kod sisara je oslobadjanje glukoze i masnih kiselina aktivirano
vezivanjem epinefrina (ili norepinefrina) za -adrenergi ne receptore na povrini hepatocita i
adipocita. Epinefrin vezan za -adrenegi ne receptore na mii nim elijama srca pove ava i brzinu
i snagu kontrakcije ovih elija, to doprinosi pove anju dopremanja krvi do tkiva. Suprotno
ovome, vezivanje epinefrina za -adrenergi ne receptore eliija glatkih mii a intestinuma dovodi
do relaksacije glatke muskulature digestivnog trakta. Drugi tip epinefrinskih receptora,
arenergi ni receptori pronadjen je na elijama glatkih mii a koji obavijaju krvne sudove
digestivnog trakta, koe i bubrega. Vezivanjem epinefrina za ove receptore aktiviraju se signalni
putevi koji prouzrokuju konstrikciju arterija, te na taj na in prekidaju cirkulaciju u ovim
perifernim organima. Ovako razli iti efekti epinefrina su usmereni i vode ka zajedni kom cilju:
obezbedjivanju i dopremanju energije za rapidne pokrete glavnih lokomotornih mii a kao odgovor na
stres organizma.

Iako su svi epinefrinski receptori GPCR tipa, signal od razlii itih tipova epinefrinskih receptora
se prevodi preko razli itih G proteina. Prema tome, pored veoma zna ajnog fiziolokog
efekta/udela epinefrinskih receptora, oni su veoma
interesantni i zbog toga to iniciraju veliki broj razli itih
intracelularnih puteva transdukcije signala. Oba subtipa adrenergi nih receptora, 1 i 2, su kaplovani (prevode
signal) preko stimulatornih G proteina (Gs) koji aktiviraju
membranski-vezan enzim adenilil ciklazu (AC), koja kada je
aktivirana katalizuje sintezu sekundarnog glasnika cAMP.
Dokaz da vezivanje epinefrina za -adrenergi ne receptore
indukuje porast cAMP moe se dobiti u eseju sa
funkcionalnom ekspresijom cDNK koja kodira -adrenergi ni
recepor (Slika 3.5.). Ukoliko se klonirana cDNK koja kodira
gen za -adrenergi ni receptor transfekuje u receptornegativne
elije ( elije koje ne poseduju receptor),
transfekovane elije e akumulirati cAMP kao odgovor na
stimulaciju epinefrinom. Sli ni eksperimenti u kojima su
mutantni receptori ekspresovani pomogli su da se definie
funkcija specifi nih aminokiselina u vezivanju i aktivaciji
razli itih G proteina.
Slika 3.5. Esej funkcionalne ekspresije receptora na povrni elije.

72

Dva subtipa -adrenergi nih receptora, 1 i 2, koriste za prenos signala razli ite G proteine. 1adrenergi ni receptor je kaplovan sa Gi proteinom koji inhibie aktivnost AC, dok je isti
efektnorni enzim asociran i kao efektor za -adrenergi ni receptor, ali ga aktivacija adrenergi nog receptora aktivira. Suprotno 1-adrenergi nom receptoru ijom aktivacijom se
inhibie efektorni protein (AC), aktivacija -adrenergi nog receptora i prenoenje signala preko
Gq proteina prozrokuje aktivaciju razli itih efektornih enzima koji generiu razli ite
sekundrne glasnika, a koji potom aktiviraju razne druge puteve transdukcije signala.
Neki bakterijski toksini imaju subjedinice koje penetriraju kroz plazma membranu

elija i
kataliu hemijsku modifikaciju Gs GTP kompleksa koja prevenira hidrolizu vezanog GTP-a u GDP.
Kao posledica spre avanja hidrolize, Gs ostaje u aktivnom stanju, te kontinualno aktivira AC i u
odsustvu hormonske stimulacije. Kolera toksin koji je produkt aktivnosti bacila Vibrium cholera i
enterotoksini produkovani od strane odredjenih posebnih sojeva E.coli imaju sposobnost da
kataliu hemijsku modifikaciju Gs GTP kompleksa i time inhibiu hidrolizu GTP u intestinalnim
epitelijalnim elijama. Posledi no veoma veliko i brzo pove aje intracelularnog nivoa cAMP vodi ka
gubitku elektrolita i vode u intestinalni lumen i rezultira vodenom dijarejom karakteristi nom za
infekciju ovim bakterijama. Bordela pertussis, bakterija koja obi no inficira respiratorni trakt,
produkuje pertusis toksin koji katalizuje modifikaicju Gi koja prevenira otputanje vezanog
GDP-a, te prema tome zaklju ava/blokira Gi u inaktivnom stanju. Ova inaktivacija Gi vodi
pove anju koncnetracije cAMP u epitelijalnim elijama vazdunih puteva, to promovie gubitak
fluida i elektrolita i mukoznu sekreciju.

3.1.3. Identifikovani su kriti ni funkcionalni domeni receptora i vezanog G-proteina

Kao to je napomenuto ranije, svi GPCR sadre sedam transmembranskih
heliksa koji
najverovatnije imaju sli nu trodimenzionalnu strukturu. Istraivanja sa himernim adrenergi nim
receptorima (Slika 3.6.) sugeriu da je duga ka C3 petlja izmedju heliksa 5 i 6 veoma vana za
interakciju izmedju receptora i njegovog G proteina prenosnika, odnosno G proteina za koji je
GPCR kuplovan. Smatra se da vezivanje liganda prouzrokuje da se ovi heliksi pomeraju blie
jedan prema drugome, to rezultira da C3 petlja, koja povezuje ova dva heliksa, promeni
konformaciju u smislu da je omogu eno petlji da vezuje i aktivira transdukuju u G subjedinicu.
Smatralo se da specifi ni regioni u okviru C3 petlje konzerviu unikatnu tro-dimenzionalnu
strukturu karakteristi nu za sve receptore koji vezuju isti G protein (npr. Gs ili Gi). Neki drugi

73

rezultati ukazuju da C2 petlja koja povezuje helikse 3 i 4

takodje ima udela u interakciji nekih receptora sa G
proteinima i da rezidue sa bar etiri transmembranska
heliksa participiraju u vezivanju liganda.

Slika 3.6. Istraivanja u kojima su kori eni himerni adrenergi ni receptori

identifikovala su da je duga ka C3 petlja kriti na za interakciju sa G proteinima.
U oocite Xenopusa je mikroinekcijom uba ena mRNA koj kodira divlji/normalni tip (engl. wild type) 2adreneri nog, 2-adrenergi nog, ili himernog - receptora. Iako oociti Xenopusa normalno ne
ekspresuju adrenergi ne receptore, oni ekspresuju G proteine koji mogu da prenose signal sa stranih
receptora ekspresovanih na povrni oocite koja je primila mikroinekciju. Determinisana je aktivnost
adenilil ciklaze u eliji koja je dobila mikroinekciju, a u uslovima kada je bio prisutan agonista
epinefrinskih receptora, to je ukazivalo na to da li je adrenergi ni receptor vezan za stimulatorni (Gs) ili
inhibtorni (Gi) tip G proteina oocite. Poredjenje himernog receptora 1 koji interaguje sa Gs, sa himernim
receptorom 2 koji interaguje sa Gi, pokazalo je da je specifi nost G proteina determinisana prvenstveno
izvorom citosolu-okrenute C3 petlje izmedju -heliksa 5 i 6. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004):
Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; videti Kobilka i sar. (1988), Science
278:1907.).

X-ray kristalografska analiza (engl. X-ray crystallographic analysis) je precizirala regione u

Gs GTP kompleksu koji interaguju sa AC. Adenilil ciklaza je
protein iji domeni nekoliko puta prolaze kroz plazma
membranu
te
se
zato
naziva
multipassing
transmembranski protein sa dva velika citosolna segmenta
koja sadre kataliti ke domene (Slika 3.7A.).
Slika 3.7. Strukutra sisarskih adenilil ciklaza (ACs) i njihova interakcija sa Gs GTP.
A ematski dijagram sisarskih ACs. Membranski-vezani enzim sadri dva ista kaltaliti ka domena na
citosolu-okrenutoj strani membrane, kao i dva integralna domena, za koje se smatra da svaki od njih
sadri est transmembranskih heliksa. B Trodimenzionalna struktura Gs GTP kompleksovanog
sa dva fragmenta koja okruuju kataliti ki domen AC determinisan x-ray kristalografijom. 3- 5 petlja i
heliks u izmenjiva kom regionu II Gs GTP kompleksa interaguju simulatano sa specifi nim regionima
AC. Tamnije obojeni deo Gs je GTPazni domen koji je sli ne strukture kao kod Ras-a (videti sliku
2.6.), dok je svetliji deo heli ni domen tj. domen sa heliksima. Forskolin zaklju ava/imobilie/dri dva
fragmenta AC u njihovoj aktivnoj konformaciji. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell
Biology. WH Freeman and Company; A videti Tang & Gilman (1992), Cell 70:869; B
adaptirano od Tesmer i sar (1997), Science 278:1907.).

74

S obzirom da je membranske proteine kakva je AC veoma teko, skoro nemogu e kristalisati u

celosti, nau nici su pripremili dva proteinska fragmenta koja okruuju kataliti ke domene AC i
dozvoljavaju im da se asociraju u prisustvu Gs GTP i forskolina, to stabilie kataliti ke
fragmente AC u njihovoj aktivnoj konformaciji. Formirani kompleks je kataliti ki aktivan i
pokazuje farmakoloke i biohemijske karakteristike sli ne onima koje ima intaktna AC potpune
duine. U ovom kompleksu, dva regiona Gs GTP, izmenjiva II heliks i 3- 5 petlja, stupaju u
kontakt sa fragmentima AC (Slika 3.7B.). Kao to je ranije napomenuto (videti prethodno
poglavlje), izmenjiva II je jedan od segmenata G proteina ija se konformacija menja
izmenjivanjem GDP/GTP nukleotida, tj. izmenjiva II segment ima jednu konformaciju kada je
vezan GDP,a drugu kada je vezan GTP (videti sliku 2.6.). GTP-indukovana konformacija Gs koja
favorizuje njenu disocijaciju od G je zpravo i preciznije konformacija Gs koja je esencijalna za
vezivanja Gs za AC. Neka istraivanja ukazuju da se Gi vezuje za neki drugi region AC koji je
odgovoran za njegov razli iti efekat na efektore.
Da bi razumeli kako vezivanje G s GTP kompleksa promovie aktivnost AC, nau nici e prvo
morati da ree strukturu kataliti kih domena AC u njihovom inaktivnom stanju (u odsustvu
vezanog Gs GTP kompleksa). Jedna od hipoteza je da vezivanje heliksa izmenjiva a II u pukotinu
jednog kataliti kog domena AC prouzrokuje rotaciji drugog kataliti kog domena. Hipotetie se da
ova rotacija vodi stabilizaciji tranzicionog stanja, a posledica je stimulacija kataliti ke aktivnost.

3.1.4. Adenilil ciklaza je simulisana/ inhibisana razli itim ligand-receptor kompleksima

Raznovrsni G proteini omogu avaju razliitim ligand-receptor kompleksima da moduliu aktivnost
istog efektora. Na primer, u jetri se glukagon i epinefrin vezuju za razli ite receptore, ali oba
receptora interaguju i aktiviraju isti Gs protein, to aktivira AC, a potom kao posledicu ima i
aktivaciju istog metaboli kog odgovora. Aktivacija AC, pa prema tome i nivo cAMP, su
proporcionalni totalnoj koncentraciji Gs GTP kompleksa koji nastaje kao rezultat vezivanja oba
hormona za njihove odgovaraju e receptore.
Pozitivna i negativna regulacija aktivnosti AC se deava u nekim tipovima elija, a time se
obezbedjuje fino podeavanje kontrole nivoa cAMP-a. Na primer, stimulacija adipocita epinefrinom
ili glukagonom ili sa ACTH, aktivira AC, dok prisustvo prostaglandina PGE1 ili adenozina inhibie
AC (Slika 3.8.). Receptori za prostaglandin PGE1 i adenozin interaguju sa inhibitornim Gi

75

heterotrimernim proteinom koji ima iste

i subjedinice kao i stimulatorni Gs heterotrimerni
proteina, ali razli itu subjedinicu (Gi ). Kao odgovor na vezivanje inhibitornog liganda za njegov
receptor, asocirani Gi protein otputa svoj vezani GDP i vezuje GTP, to prouzrokuje da aktivni
Gi GTP kompleks potom disocira od G subjedinice i inhibie (radije nego to stimulie) AC.
Slika 3.8. Ligandima-indukovana aktivacija
i inhibicija AC u adipocitima.
Vezivanje liganda za Gs-kaplovane receptore
prouzrokuje aktivaciju AC, dok vezivanje liganda za
Gi-kaplovane receptore prozrokuje inhibiciju AC.
G subjedinica kod oba heterotrimerna G proteina,
i kod stimulatornog (Gs) i kod inhibitornog (Gi) je
identi na, ali su njihove G subjedinice razli ite,
kao i njen korespondiraju i receptor. Ligandomstimulisano formiranje G GTP kompleksa se
deava istim mehanizmima u oba heterotrimerna G
proteina, i Gs i Gi proteinu (videti sliku 3.6.).
Medjutim, nakon formiranja G GTP kompleksa,
Gs GTP kompleks i Gi GTP kompleks razli ito
interaguju sa AC, te tako jedan stimuie, a drugi
inhibie kataliti ku aktivnost AC. (Preuzeto iz Lodish
i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH
Freeman and Company; videti Gilman
(1984), Cell 36:577.).

3.1.5. cAMP-zavisna aktivacija PKA posreduje raznolike odgovore u razli itim elijama
Kod vie elijskih ivotinja skoro svi raznovrsni efekti cAMP-a su posredovani preko protein
kinaze A (PKA) koja se jo naziva i cAMP-zavisna protein kinaza. Kao to je ranije napomenuto
(videti u poglavlju 2, sekciju 2.2.2.2.), inaktivna PKA je tetramer koji se sastoji od dve regulatorne
i dve kataliti ke subjedinice. Svaka regulatorna subjedinica ima dva odvojena cAMP-vezuju a
mesta. Vezivanje cAMP za oba mesta u regulatornoj subjedinici vodi ka otputanju asocirane
kataliti ke subjedinice, to ini dostupnim tj. razotkriva kataliti ko mesto i aktivira njegovu
kinaznu aktivnost (videti sliku 2.11). Vezivanje cAMP za regulatornu subjedinicu se deava u
kooperativnom maniru, pri emu vezivanje prvog molekula cAMP smanjuje Kd za vezivanje drugog.
Zbog toga male promene u nivou citosolnog cAMP-a mogu prouzrokovati proporcionalno velike
promene u koli ini disociranih kataliti kih subjedinica, a time i u njihovoj kinaznoj aktivnosti.
Rapidna aktivacija enzima preko hormonom-indukovane disocijacije inhibitora je uobi ajena
karakteristika razli itih puteva intracelularne transdukcije signala.

76

Ve ina sisarskih elija ekspresuje GPCR tip recepora. Stimulacija ovih receptora razli itim
hormonima, ali i drugim ligandima, vodi aktivaciji PKA, ali rezultiraju i odgovor elije zavisi od
ta no odredjene PKA izoforme, kao i od PKA supstrata/efektora koji su ekspresovani u eliji. Na
primer, efekti epinefrina na metabolizam glikogena koji su posredovani preko cAMP i PKA su
locirani uglavnom u elijama jetre i mii a koje ekspresuju enzime za stvaranje i degradaciju
glikogena. U adipocitima epinefrinom-indukovana aktivacija PKA promovie fosforilaciju i
atkivaciju fosfolipaze koja katalie hidrolizu deponovanih triglicerida, to doprinosi stvaranju
slobodnih masnih kiseina i glicerola. Ove slobodne masne kiseline se otputaju u cirkulaciju i
preuzimaju i koriste kao izvor energije u elijama drugih tkiva kao to je bubreg, srce i mii i.
Sli no, gonadotropinima-indukovana stimulacija GPCR u elijama ovarijuma vodi aktivaciji PKA,
to kao posledicu ima promovisanje sinteze dva steroidna hormona, estrogena i progesterona, koji
su krucijalni za razvoj enskih seksualnih karakteristika.
Kao to je i ranije napomenuto (videti u poglavlju 2, sekciju 2.2.2.2.), iako PKA deluje na razli ite
substrate u razli itim tipovima elija, ovaj enzim uvek fosforilie serinski (Ser) ili treoninski (Thr)
ostatak u okviru iste sekvence motiva: X-Arg-(Arg/Lys)-X-(Ser/Thr)- , gde X ozna ava bilo koju
aminokiselinu, a ozna ava hidrofobnu aminokiselinu.

3.1.6. Hormonom-indukovana aktivacija PKA regulie metabolizam glikogena

Prvi elijski odgovor posredovan preko cAMP koji je otkriven je bio oslobadjanje glukoze od
glikogena koje se deava u mii nim elijama i u elijama jetre koje su stimulisane epinefrinom ili
nekim drugim hormonom/ligandom iji receptori prevode signal preko G s proteina. Ovaj odgovor
daje primer kako aktivacija PKA moe da koordinie grupu intracelularnih enzima da obavljaju
funkciju koja ima zajedni ku svrhu i vodi prema zajedni kom cilju.
Glikogen, veliki polimer glukoze, je glavni depo glukoze u animalnim elijama. Kao i svi
biopolimeri, glikogen se sintetie kataliti kim delovanjem jednog seta enzima, a razgradjuje se
kataliti kim delovanjem drugog seta enzima. Tri enzima konvertuju glikogen u uridin
difosfoglukozu (UDP-glukoza), primarni intermedijer sinteze glikogena. Glukozna rezidua UDPglukoze se premeta glikogen sintazom na slobodnu hidroksilnu grupu ugljenika 4 glukozne
rezidue na kraju rastu eg lanca glikogena. Degradacija glikogena uklju uje postepeno (u
koracima) uklanjanje rezidua glukoze, od istog kraja, reakcijom fosforolize katalizovane glikogen

77

fosforilazom, pri emu se

dobija glukoza 1-fosfat (Slika
3.9.). I u elijama mii a i u
elijama jetre (hepatocitima),
glukoza 1-fosfat produkovana
razgradnjom glikogena, se
konvertuje u glukozu 6-fosfat.

Slika 3.9. Sinteza i degradacija glikogena.

Inkorporacija glukoze od UDP-glukoze u glikogen
je katalisana glikogen sintazom. Uklanjanje
glukoznih jedinica iz glikogena je katalisano
glikogen fosforilazom. Zbog toga to dva razli ita
enzima kataliu formiranje i degradaciju glikogena,
ove dve reakcije mogu biti nezavisno regulisane.

U mii nim elijama ovaj metabolit ulazi u glikoliti ki put i metabolizira se da bi generisao ATP
neophodan za procese mii ne kontrakcije i relaksacije. Za razliku od mii nih elija, hepatociti
imaju fosfatazu koja hidrolizuje glukozu 6-fosfat u glukozu koja se eksportuje iz heptocita delom
transporterom glukoze (GLUT2) u plazma membrani. Prema tome, depoi glikogena u jetri se
prvenstveno razgradjuju u glukozu, koja se odmah otputa u cirkulaciju i transportuje u druga
tkiva, prvenstveno u mii no i nervno tivo.
Epinefrinom-stimulisano pove anje cAMP-a i posledi na aktivacija PKA poja ava konverziju
glikogena u glukozu 1-fosfat na dva na ina: inhibicijom sinteze glikogena i stimulacijom
degradacije glikogena (Slika 3.10A). PKA fosforilie, a time i inaktivie glikogen sintazu, enzim
koji sintetie glikogen. Pored toga, PKA promovie degradaciju glikogena indirektno,
fosforilacijom, a time i aktivacijom intermedijerne kinaze, tzv. glikogen fosforilaze kinaze (engl.
Glicogen Phosphorylase Kinase - GPK), koja potom fosforilie i aktivira glikogen fosforilazu (engl.
Glicogen Phosphorylase - GP), enzim koji razgradjuje glikogen. Ceo proces se obrne u drugom
smeru kada se epinefrin ukloni i kada nivo cAMP-a padne. Ovaj obrnuti proces je posredovan

78

fosfoprotein fosfatazom (engl. Phosphoprotein Phosphatase - PP), koja uklanja fosfatne rezidue
sa inaktivne forme glikogen sintaze, te je na taj na in aktivira, a istovremeno uklanja ostatke
fosfata i sa glikogen fosforilaze kinaze i glikogen fosforilaze, te ih na taj na in inaktivie (Slika
3.10B.).

Slika 3.10. cAMP-zavisna regulacija metabolizma glikogena u elijama jetre i mii a .

Inaktivni enzimi su u svetlijim poljima, a aktivni enzimi su u tamnijim poljima. A Pove anje nivoa citosolnog cAMP-a aktivira PKA koja direktno inhibie sintezu
glikogena i istovremeno, indirektno, promovie razgradnju glikogena preko kaskade protein kinaza. Pri viskom nivou cAMP-a, PKA takodje fosforilie inhibitor PP.
Vezivanje fosforilisanog inhibitora za PP spre ava ovu fosfatazu da defosforilie enzime aktivirane u kaskadi protein kinaza ili inaktivnu glikogen sintazu. B
Smanjenje nivoa cAMP inaktivira PKA, to prouzrokuje oslobadjanje aktivne forme PP, a aktivnost ovog enzima promovie sintezu glikogena i inhibie razgradnju
glikogena u obrnutoj reakciji od one koja je opisana za porast nivoa citosolnog cAMP-a.

Fosfoprotein fosfataza je takodje regulisana preko PKA. Pri viskom nivou cAMP-a, PKA takodje
fosforilie inhibitor fosfoprotein fosfataze. Vezivanje fosforilisanog inhibitora za PP spre ava ovu
fosfatazu da defosforilie enzime aktivirane u kaskadi protein kinaza ili inaktivnu glikogen
sintazu. Pri niskom nivou cAMP-a, kada je PKA inaktivna, inhibitor fosforprotein fosfataze nije
fosforilisan te ne inhibie kinaznu aktivnost fosfoprotein fosfataze i ona je aktivna tj. sposobna je
da uklanja fosfatne ostatke sa enzima aktiviranih u kaskadi protein kinaza (time ih inhibie, to
prouzrokuje inhibiciju razgradnje glikogena), ali i sa inaktivne glikogen sintaze (time je aktivira,

79

to prouzrokuje stimulaciju sinteze glikogena). Kao rezultat, sinteza glikogena katalisana glikogen
sintazom je poja ana, a razgradnja glikogena katalisana glikogen fosforilazom je inhibisana.
Prema tome, epinefrinom-indukovana glikogenoliza ispoljava dvostruku regulaciju: aktivaciju
enzima koji kataliu degradaciju glikogena i inhibiciju enzima koji favorizuju sintezu glikogena.
Ovakva koordinisana regulacija stimulatornih i inhibitornih puteva transdukcije signala
obezbedjuje efikasan mehanizam za dostizanje odredjenih elijskih odgovora i uobi ajeni je
fenomen u biologiji regulacije fiziolokih procesa.

3.1.7. Amplifikacija signala se uglavnom deava u donjem delu signalnog puta

elijski odgovor indukovan GPCR-zavisnom aktivacijom AC moe zahtevati desetine, stotine,
hiljade, pa i milione cAMP molekula po eliji. Stoga je neophodno da eksternalni signal bude
amplifikovan u cilju generisanja dovoljnog broja molekula sekundarnog glasnika od nekoliko
hiljada receptora za odredjeni hormon prisutnih na eliji. Amplifikacija signala je mogu a zbog
toga to i receptor i G protein mogu da difunduju rapidno u membrani. Jedan kompleks receptorhormon prouzrokuje konverziju preko 100 inaktivnih molekula Gs u aktivnu formu. Svaka
aktivna forma Gs GTP potom aktivira verovatno jedan molekul AC, ali koji potom katalie sintezu
i produkciju velikog broja cAMP molekula tokom vremena u kome je Gs GTP vezana za molekul
AC. Iako je veoma teko izmeriti ta no pove anje amplifikacije, vezivanje jednog molekula liganda
za jedan molekul GPCR moe rezultirati sintezom bar nekoliko stotina cAMP molekula pre nego
to se kompleks receptor-ligand disocira i prekine se aktivacija AC. Verovatno se sli na
amplifikacija odvija i u signalingu vezanom za druge heterotrimerne G proteine, ali i druge tipove
receptora
ija
aktivacija
prouzrokuje
sintezu
sekundarnog glasnika (prvi nivo amplifikacije). Drugi
nivo amplifikacije je ilustrovan cAMP-posredovanom
sitmulacijom glikogenolize (Slika 3.11. i Slika 3.12.).
Slika 3.11. Amplifikacija eksternalnog signala u donjim delovima (downstream) signalnog puta od receptora na povrini elije.
A ematski prikaz amplifikacije prilikom vezivanja jednog molekula epinefrina. Vezivanje
jednog molekula epinefrina za jedan GPCR indukuje sintezu velikog broja cAMP molekula i
to je prvi nivo amplifikacije (nivo sekundarnog glasnika). etiri molekula cAMP-a aktiviraju
dva molekula PKA, ali svaki aktivirani molekul PKA fosforilie i aktivira veliki broj molekula.
Ovaj drugi nivo amplifikacije moe da uklju uje nekoliko povezanih reakcija u kojima produkt
jedne reakcije aktivira enzim koji katalizuje slede u reakciju. to je vie koraka/faza u
ovakvoj signalnoj kaskadi, ve a je mogu nost amplifikacije signala.

80

Kao to je napomenuto cAMP promovie degradaciju glikogena preko tri-nivoa kaskada koje su
serije reakcija u kojima je enzim koji katalie jedan korak (jednu reakciju) aktiviran ili inibisan
produktom prethodnog koraka (prethodne reakcije). Amplifikacija koja se odvija u ovakvoj kaskadi
zavisi od broja koraka (kaskadnih) reakcija u njoj. Na primer, nivo epinefrina u cirkulaciji oko 1011 M moe stimulisati glikogenolizu i oslobadjanje glukoze u jetri. Epinefrinski stimulus ovakve
magnitude generie intracelularni cAMP koncentracije 10-6 M, to je amplifikacija od 104. Zbog
toga to moraju pro i tri
naredna koraka do otputanja glukoze, moe se
dogoditi jo jedna dodatna amplifikacija od 104
M. U popre no-prugastoj
muskulaturi su koncentracije tri sukcesivna
enzima u glikogenolitikoj kaskadi (PKA glikogen fosforilaze kinaze
glikogen fosforilaze) u
odnosu 1:10:240, to
dramati no
ilustruje
amplifikacione efekte epinefrina i cAMP-a (Slika
3.11. i Slika 3.12.).

Slika 3.12.
ematski prikaz
amplifikacije
na
primeru
epinefrinom-regulisane razgradnje
glikogena.

Iako ovakve kaskade mogu izgledati previe komplikovane one ne samo da u velikoj meri
amplifikuju eksternalni signal, nego takodje, dozvoljavaju celoj grupi enzimski-katalisanih
reakcija da budu koordinisano regulisane preko jednog tipa singalnog molekula. Pored toga, veliki
broj koraka/reakcija izmedju stimulusa i finalnog odgovora prua mogu nost za regulaciju preko
drugih signalnih puteva, te time omogu ava precizno regulisanje, kao i fino podeavanje elijskog
odgovora. Drugi primeri kaskada signalnih puteva bi e predstavljeni u drugim sekcijama.

81

3.1.8. Nekoliko mehanizama regulie signalning od GPCRs

Kao to je ranije napomenuto (videti u poglavlju 1, sekciju 1.2.9.) ciljne elije koriste razli ite
mehanizme da postanu neosetljive ili manje osetljive (da se desenzitiviu), odnosno da se
adaptiraju kada su izloene velikoj koncetraciji stimuliu eg liganda dui period (videti sliku 1.31.
u poglavlju 1). Ovde e biti diskutovani samo oni mehanizmi koji su uklju eni u promenu funkcije
receptora koji su vezani za G proteine. GPCRs se desenzitiviu na tri generalna na ina: (1)
Inaktivacijom receptora promena receptorne molekule u smislu da ne moe vie da interaguje
sa G proteinima. (2) Odvajanjem/seqvestracijom receptora receptori mogu da budu
privremeno uklonjeni internalizacijom te tako vie nisu dostupni ligandima.
(3) Downregulacijom receptora - receptori mogu da budu uniteni u lizozomima nakon internalizacije. U
svim slu ajevima proces desenzitivizacije zavisi od fosforilacije receptora preko PKA, PKC ili
lanova familije kinaza receptora vezanih za G proteine (engl. G Protein-linked Receptor Kinases GRKs). GRKs fosforiliu ve i broj serina i treonina na receptoru, ali samo kada je receptor ve
okupiran ligandom. GRKs uklju uju i rodopsin-specifi ne kinaze uklju ene u desenzitivzaciju
rod-fotoreceptora. Kao i kod rodopsina, kada je receptor jednom fosforilisan na ovaj na in vezuje
se sa velikim afinitetom za protein koji je lan arestinske familije proteina (Slika 3.13.). Vezani
arestin moe da doprinosi procesu desenzitivizacije na bar dva na ina: (1) Inaktivie
receptor i spre ava njegovo vezivanje za G protein, ime je onemogu ena uloga G proteina kao
prenosnika signala sa receptora (engl. receptor uncupling). (2) Moe da ima ulogu adapternog
proteina i vezivati receptor za klatrinom-obloene jamice, indukuju i na taj na in receptoromposredovanu endocitozu. Endocitoza rezultira ili odvajanjem (engl. sequestration) ili
degradacijom/down-regulacijom receptora, a to zavisi od specifi nosti receptora i tipa elije,
koncentracije stimuliu eg liganda, kao i duine trajanja prisustva liganda.

Slika 3.13. Uloga GRKs i arestina u

desenzitivizaciji receptora.
Vezivanje arestina za fosforilisani receptor spre ava
vezivanje receptora za njegov G protein i moe da
ga usmerava u pravcu receptorom-posredovane
endocitoze. Mievi koji su deficitarni u jednoj formi
arestina nemaju sposobnost desenzitivizacije kao
odgovor na prolongiranu stimulaciju morfinom, to
potvrdjuje zna ajnu ulogu arestina u procesima
desenzitivizacije.

82

Nekoliko faktora uzima u e e u prekidu (terminaciji) odgovora na ligande koji su prepoznati adrenergi nim receptorima, kao i drugim GPCR vezanim za Gs. Prvo, afinitet receptora za ligand
opada kada se GDP vezan za Gs zameni sa GTP, a to prati vezivanje liganda. Ovo pove anje Kd
receptor-ligand kompleksa poja ava disocijaciju liganda od receptora. Drugo, GTP vezan za Gs se
veoma brzo hidrolizuje, te se ukida stimulus za aktivaciju AC, a time i produkciju cAMP-a.
Tre e, cAMP-zavisne fosfodiesteraze (engl. PhosphoDiEsterases - PDEs) kataliu hidrolizu cAMP
na 5-cAMP, te na taj na in iniciraju terminaciju elijskog odgovora. Prema tome, kontinualno
prisustvo liganda/hormona u koncentraciji dovoljno visokoj je neophodno ua kontinualnu
aktivaciju AC i odravanje pove anog nivoa cAMP-a. Ako koncentracija liganda dovoljno opadne,
elijski odogovor se veoma brzo prekida.
Kao to je napomenuto, kada je Gs GPCR izloen stimulaciji ligandom/hormonom nekoliko
asova, nekoliko rezidua serina i treonina u citosolnom domenu receptora biva fosforilisano od
strane PKA. Fosforilisani receptor moe da vee svoj ligand, ali vezivanje liganda vodi redukovanoj
aktivaciji AC, odnosno receptor je manje osetljiv ili ak neosetljiv tj. desenzitivisan. Ovo je tipi an
primer povratne supresije u kojoj jedan od krajnjih produkata signalnog puta (u ovom slu aju
PKA) blokira rani korak u signalnom putu (u ovom slu aju aktivaciju receptora). Zbog toga to je
aktivnost PKA poja ana visokim koncentracijama cAMP-a koje su indukovane svakim ligandom
koji moe da aktivira Gs, produeno izlaganje ovakvim ligandima, recimo epinefrinu, prouzrokuje
desenzitizaciju ne samo -adrenergi nih receptora, nego i GsPCRs koji vezuju druge ligande (npr.
glukagon). Ovakva unakrsna regulacija (engl. kross-regulation) se zove heterologna
desenzitivizacija.
Pored navedenih, dodatne rezidue u citosolnom domenu -adrenergi nog receptora se fosforiliu
kataliti kim delovanjem receptor-specifi nog enzima koji se zove kinaza -adrenergi nog
receptora (engl. Beta-Adrenergic Receptor Kinase - BARK), ali ova fosforilacija je mogu a jedino
ukoliko je epinefrin ili agonista vezan za receptor tj. jedino ukoliko je receptor okupiran ligandom.
S obzirom da BARK fosforilie jedino aktivirani -adrenergi ni receptor ovaj proces se zove
homologna desenzitivizacija. Prolongiran tretman elija epinefrinom prouzrokuje ekstenziranu
fosforilaciju a time i desenzitivizaciju -adrenergi nih receptora i preko PKA i preko BARK.
Fosforilisani (desenzitivisani) receptori se konstantno ponovo senzitiviu (resenzitiviu se),
odnosno vra aju se u provobitno stanje osetljivosti, zahvaljuju i defosforilaciji katalisanoj
konstitutivno aktivnim fosfatazama. Prema tome, broj fosfata po receptornom molekulu reflektuje

83

koliko dugo je ligand vezan za receptor u bliskoj prolosti (npr. 1-10 minuta). Ovo zna i da ako je
elija konstantno izloena odredjenoj koncentraciji hemijskog medijatora (npr. hormona), ta
koncentracija bi eventualno prekinula da stimulie receptor. Ukoliko se koncentracija horomona
potom pove a na novu vrednost, receptor e aktivirati dalje signalne puteve, ali mnogo manje nego
u slu aju da je elija bila u medijumu bez hormon i da je ovaj medijum bez hormona zamenjen sa
medijumom koji sadri ovu odredjenu koncentraciju hormona. Ukoliko se hormon kompletno
ukloni, receptor postaje kompletno defosforilisan i vra a se (resetuje se) u stanje maksimalne
osetljivosti u kojem moe da odgovara na veoma niske nivoe liganda. Prema tome, povratna sprega
koja uklju uje fosforilaciju i defosforilaciju receptora modulie aktivnost -adrenergi nih i drugih
sli nih receptora tipa GPCRs, dozvoljavaju i time eliji da podesi senzitivnost receptora prema
nivou liganda kojim je stimulisana.
Kao to je napomenuto, klju ni u esnik u regulaciji GPCRs su proteini iz familije arestina. Jedan
od lanova ove familije, -arestin je uklju en u regulaciju -adrenegri nih receptora. -arestin je
citosolni protein koji se vezuje za receptore koji su produeno fosforlisani BARK i kompletno
inhibie interakciju receptora sa Gs, odnosno njihovu sposobnost da aktiviraju Gs. Pokazano je
da overekspresija BARK i -arestina prouzrokuje gubitak -adrenegri nih receptora sa povrine
elije, to dodatno ukazuje na vanost funkcije -arestina u regulaciji receptora sa povrine elije.
Potvrdjeno je da se -arestin ne vee samo za fosforilisane receptore, nego i za klatrin, kao i za
asocirani protein koji se zove AP2, a oba su esencijalne komponente obloenih vezikula koje su
omogu avaju jedan tip endocitoze. Ova interakcija -arestina sa receptorom, ali i sa klatrinom i
AP2 promovie formiranje tzv. obloenih jamica (engl. coated pits) i endocitozu asociranog
receptora, te na taj na in smanjuje broj receptora izloenih na povrini elije (Slika 3.14.).

Slika 3.14. Uloga

transdukcije.

-arestina u GPCR desenzitivizaciji i signalnoj

-arestin se vezuje za fosforilisane serinske i treoninske ostake C-terminalnog

segmenta GPCRs. Klatrin i AP2, dva druga proteina koja su vezana -arestinom,
favorizuju endocitozu receptora. Pored toga, -arestin ima funkciju u transdukciji
signala od aktiviranog receptora zbog toga to se vezuje za nekoliko citosolnih protein
kinaza i aktivira ih. c-Src aktivira signalnu transdukciju preko MAP kinaze signalnog
puta, to vodi fosforilaciji klju nih transkripcionih faktora. Interakcija -arestina sa tri
druga proteina koja uklju uju JNK-1 (engl. Jun N-terminal Kinse) rezultira fosforilacijom
i aktivacijom c-Jun transkripcionog faktora. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004):
Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; adaptirano od Miller &
Lefkowitz (2001), Curr Opin Cell Biol 13:139 and Pierce i sar. (2002), Nature
Rev Mol cell Biol 3:639.).

84

U nekim slu ajevima, eventualno, internalizovani receptori postaju defosforilisani u endozomima,

-arestin se disocira, i receptor se ponovo senzitivie (resenzitivie) tj. ponovo postaje osetljiv i
reciklira se na povrinu elije. Smatra se da regulacija drugih GPCRs takodje uklju uje
endocitozu ligadom-okupiranog receptora i njegovo odvajanje unutar elije.
Kao to e kasnije biti opisano detaljnije, -arestin takodje funkcionie i kao adapterni protein u
transdukciji signala od GsPCRs u nukleus. Viestruka funkcija -arestina ilustruje vanost
adapternih proteina i u transdukciji signala od receptora sa povrine elije, ali i u regulaciji
signalne transdukcije od receptora sa povrine elije.

3.1.9. Proteini za usidravanje lokalizuju efekat cAMP na specifi ne subcelularne regione

U mnogim tipovima elija, pove anje nivoa cAMP-a moe da produkuje odgovor koji je potreban u
jednom delu elije, ali je istovremeno, nepotreban, ili ak remeti fizioloke procese u drugom delu
elije. Familija proteina za usidravanje lokalizuje PKA izoforme na specifi ne subcelularne
lokalizacije, te time ograni ava cAMP-zavisne odgovore na ove lokacije. Ovi proteini koji lokalizuju
PKA se nazivaju proteini povezani sa A kinazom (engl. A Kinase-Associated Proteins AKAPs).
AKAPs imaju dva domena, od kojih je jedan odgovoran za specifi nost subcelularne lokalizacije, a
drugi za vezivanje sa regulatornom subjedinicom PKA.
Jedan od proteina za usidravanje (AKAP15) je zaka en/sputan za citosolu-okrenutu stranu
plazma membrane nekih elija sr anog mii a, i to pored ta no odredjenog tipa Ca2+ kanala ije
je otvaranje regulisano. Epinefrinom-indukovana aktivacija -adrenergi nih receptora u srcu (kao
deo odgovora borba-ili-beg; engl. fight-or-flight)vodi ka PKA-katalizovanoj fosforilaciji ovih Ca2+
kanala, prouzrokuju i njihovo otvaranje, a posledica toga je influks Ca2+ koji pove ava brzinu i
snagu kontrakcije sr anog mii a. Interakcija AKAP15 sa PKA lokalizuje PKA veoma blizu ovih
Ca2+ kanala, te time redukuje vreme koje bi ina e bilo potrebno da za difuziju katalitit kih
subjedinica PKA sa mesta gde se one generiu do mesta gde se nalazi njihov supstrat tj. Ca2+
kanala u ovom slu aju.
Jo jedan protein koji je u elijama sr anog mii a asociran sa A kinazom je mAKAP, koji
ka i/usidrava i PKA i cAMP-zavisnu fosfordiesterazu (engl. PhosphoDiEsterase - PDE) za
spoljanju membranu nukleusa. Zbog bliskog su eljavanja PDE i PKA, negativna povratna sprega

85

obezbedjuje blisku lokalnu kontrolu nivoa cAMP-a, a time i regualciju aktivnost PKA (Slika 3.15).
Pored toga, lokalizacija PKA blizu nuklearne membrane facilitira ulazak kataliti kih subjedinica u
nukleus gde one fosforiliu i aktiviraju odredjene transkripcione faktore (videti u sekciji 3.5.).

Slika 3.15. Lokalizacija protein kinaze A (PKA) u nuklearnoj membrani elija sr anog mii a.
mAKAP ka i/ usidrava i PKA i cAMP-zavisnu PDE za membranu nukleusa, odravaju i ih u negativnoj povratnoj sprezi koja obezbedjuje blisku lokalnu kontrolu
nivoa cAMP-a.
1 Bazalni nivo aktivnosti PDE u odsustvu hormona (stanje mirovanja) odrava cAMP nivo ispod onoga koji je neophodan za aktivaciju PKA. 2 Aktivacija adrenergi nih receptora prouzrokuje pove anje nivoa cAMP-a koje premauje nivo koji je PDE u mogu nosti da degradira, to prozrokuje vezivanje cAMP-a za
regulatornu (R) subjedinicu PKA i posledi no oslobadjanje aktivne kataliti ke (C) subjedinice. 3 Posledi na fosforilacija PDE od strane PKA stimulie kataliti ku
aktivnost PDE, te time smanjuje nivo cAMP-a i vodi ga nazad ka bazalnom nivou to prouzrokuje reformiranje inaktivne PKA. 4 Posledi na defosforilacija PDE
vra a kompleks u stanje mirovanja. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company;adaptirano od Dodge i sar.
(2001), EMBO J 20:1921.).

86

3.2. GPCR-zavisna REGULACIJA JONSKIH KANALA

Dobro je poznato da su receptori za neurotransmitere (glutamate, serotonin, kao i nikotinski
receptori za acetilholin), ligand-zavisni jonski kanali. Ipak, mnogi receptori za neurotransmitere
su G protein-zavisni receptori, za koje je efektorni protein jonski kanal. Neurotransmiter se vezuje
za receptore to izaziva otvaranje ili zatvaranje jonskih kanala povezanih sa receptorom i dovodi
do promene potencijala na membrani. Drugi receptori za neurotransmitere kao i receptori za miris
i fotoreceptori u oku, su G protein-zavisni receptori koji indirektno moduliu aktivnost jonskih
kanala preko aktivacije sekundarnih glasnika. U daljem tekstu e biti opisani G protein-zavisni
receptori koji direktno ili indirektno moduliu jonske kanale: muskarinski i Gt-zavisni receptori.

3.2.1. Muskarinski receptor u srcu aktivira G protein koji otvara kanal za K+

Vezivanje acetilholina za nikotinski receptor u skeletnoj muskulaturi, generie akcioni potencijal
koji dovodi do mii ne kontrakcije. Nasuprot ovom, muskarinski receptori za acetilholin u srcu
dovode do inhibitorne reakcije. Vezivanje acetilholina za ove receptore usporava rad srca tj. izaziva
dugotrajnu hiperpolarizaciju (traje nekoliko sekundi) membrane sr ano mii nih elija. Aktivacija
muskarinskih receptora, zavisnih od Gi proteina, dovodi do otvaranja kanala za K+, a izlazna
struja K+ hiperpolarie elijsku membranu. Kao to je prikazano na slici 3. 16. signal se od
aktiviranog receptora, disocijacijom G subjedinice, prenosi na efektorni protein. Ova direktna
aktivacija kanala za K+, preko G subjedinice,
se moe demonstrirati patch clamp ogledima
(merenjem jonske struje kroz jedan kanal) u
kojima se u citoplazmu elija miokarda dodaje
purifikovani G
protein. Neposredno po
dodavanju G proteina, K+ kanali se otvaraju,
iako elije nisu stimulisane acetilholinom ili
nekim drugim neurotransmiterom.
Slika 3.16. Model muskarinskog receptora na membrani elija
miokarda. Receptori su preko trimernog G proteina povezani sa
kanalom za K+. Vezivanje acetilholina za receptor aktivira Gi
subjedinicu i njenu disocijaciju od G proteina. Disocirana G
subjedinica se vezuje za K+ kanal i otvara ga. Izlazna struja K+,
hiperpolarie membranu, to dovodi do usporavanja ritma sr anih
kontrakcija.

87

3.2.2. Gt-zavisni receptori koje aktivira svetlost

Retina oka sadri dva tipa fotoreceptora tzv. tapi i i epi i. epi i su uklju eni u prepoznavanje
boja, dok tapi e moe stimulisati svetlost malog intenziteta (kao to je svetlost meseca).
Rodopsin je receptor zavisan od G proteina, koga aktivira svetlost, a lokalizovan je na
membranskim diskovima spoljanjeg segmenta tapi a (Slika 3.17.). Za rodopsin je vezan trimerni
G protein tzv. transducin (Gt), koji se ekspresuje samo u tapi ima. tapi i sadre oko 4 x 107
molekula rodopsina. Molekul rodopsina se sastoji od proteina opsina koji ima sedam
transmembranskih regiona, i koji je kovalentno vezan sa pigmentom 11-cis-retinalom. Nakon
absorpcije fotona svetlosti dolazi do konverzije pigmenta u all-trans izomer i konformacione
promene opsina koja ga aktivra. Forma u kojoj je opsin vezan za all-trans-retinal se naziva
metarodopsin II ili aktivirani opsin. Ovakva, svetlom aktivirana forma rodopsina, reaguje sa Gt.
Aktivni opsin je nestabilan i lako disocira na opsin i all-trans-retinal, to dovodi do zavravanja
vizuelnog signala. U mraku se slobodni
all-trans-retinal konvertuje u 11-cisretinal, koji moe ponovo sa opsinom da
formira rodopsin.
U mraku, membranski potencijal tapi a
je zna ajno manji od MPM karakteristi nog za neurone (-60 mV do -90 mV) i
iznosi oko -30 mV. Posledica ove depolarizacije membrane tapi a, je konstantna sekrecija neurotransmitera i konstantna stimulacija bipolarnih interneurona, sa kojima su tapi i u sinapti kom kontaktu. Membrana tapi a u
mraku, poseduje veliki broj otvorenih,
neselektivnih kanala koji proputaju Na+ i
Ca++ kao i K+. Absorpcija svetlosti dovodi
do zatvaranja ovih kanala i porasta membranskog potencijala tj. membranski
potencijal postaje negativniji.
Slika 3.17. tapi .

88

to je ve i broj fotona koji se absorbuje rodopsinom, vie je zatvorenih kanala tj. manja je ulazna
struja Na+, ve i je membranski potencijal koji dovodi do manje sekrecije neurotransmitera. Ova
promena tj. informacija se prenosi u vizuelni korteks gde se obradjuje i predstavlja informaciju o
svetlosti.
3.2.2.1. Aktivacija rodopsina izaziva zatvaranje cGMP-zavisnog kanala za katjone
Molekul koji ima klju nu funkciju u povezivanju aktiviranog opsina i kanala za katjone u
membrani spoljanjeg segmenta tapi a, je sekundarni glasnik, cGMP. Spoljanji segment tapi a
sadri neobi no visoku koncentraciju cGMP-a ( 0.07 mM), nastalog od GTP-a u reakciji koja je
katalisana guanilat ciklazom. Apsorpcija svetlosti indukuje aktivaciju fosfodiesteraza za cGMP,
koje vre hidrolizu cGMP do 5-GMP-a. Drugim re ima, visoka koncentracija cGMP-a u mraku,
odrava otvorene cGMP-zavisne katjonske kanale, a svetlost dovodi do razlaganja cGMP tj. pada
njegove koncentracije, zatvaranja kanala, hiperpolarizacije membrane i smanjenog oslobadjanja
neurotransmitera.

Slika 3. 18. Rodopsinom-indukovano zatvaranje katjonskih kanala u tapi ima.

U mraku visoka koncentracija cGMP-a odrava katjonske kanale otvorenim. Absorpcija
svetlosti generie aktivirani opsonin (O*; 1) koji se vezuje za neaktivni Gt protein
razmenjuje se GDP sa GTP-om (2). Slobodni Gt GTP aktivira fosfodiesteraze za cGMP
(PDE) tako to se vee za inhibitornu subjedinicu (3) to dovodi do oslobadjanja
kataliti ke i subjedinice (4). Aktivirane kataliti ke subjedinice konvertuju cGMP u
GMP (5) a smanjenje koncentracije cGMP-a izaziva odvajanje cGMP-a od cGMPzavisnih kanala, njihovo zatvaranje (6) i hiperpolarizaciju membrane.

89

Kao to je prikazano na slici 3.18. fosfodiesteraze koje razlau cGMP su efektorni proteini za Gt.
inhibitorne
Slobodni Gt GTP kompleks, nastao nakon absorpcije svetlosti, se vezuje za dve
subjedinice fosfodiesteraze, to dovodi do njihovog odvajanja od
i
kataliti kih subjedinica i
konverzije cGMP-a u GMP. Jedan molekul aktivnog opsina, u membrani diska spoljanjeg
segmenta tapi a, moe da aktivira 500 Gt molekula, a svaki od njih aktivira fosfodiesterazu. Ovo
je primarna faza amplifikacije signalne transdukcije u vizuelnom sistemu.
Konverzija aktivnog kompleksa Gt GTP u neaktivni Gt GDP je ubrzana aktiviraju im proteinom
GTP-ase (GAP; engl. GTP-ase activating protein) koji je specifi an za Gt GTP kompleks. Kod
sisara je Gt aktivan (tj. u GTP vezanom stanju) samo nekoliko deli a sekunde, to ograni ava
aktivnost fosfodiesteraza tj. i one se brzo inhibiu, to u uslovima ukidanja svetlosti, dovodi do
porasta koncentracije cGMP-a i vra anja potencijala membrane na po etne vrednosti. Ovakva
brza inaktivacija Gt GTP kompleksa omogu ava brz odgovor oka na promenu objekta npr.
prilikom kretanja.
Patch-clamp analize na izolovanim deli ima membrane spoljanjeg segmenta tapi a, su
obezbedile direktne dokaze o ulozi cGMP-a u regulaciji katjonskih kanala. Naime, kada se cGMP
doda na citosolnu povrinu membrane dolazi do brzog otvaranja katjonskih kanala, to se deava
u odsustvu protein kinaza ili fosfataza i ukazuje da cGMP direktno deluje na jonske kanale i
odrava ih otvorenim. Kao i potencijal-zavisni jonski kanali, cGMP-zavisni jonski kanali sadre 4
subjedinice od kojih svaka vezuje po jedan molekul cGMP-a. Da bi kanal bio otvoren, potrebno je
da se za njega veu bar 3 molekula cGMP-a. Ovakva alosterna interakcija, ini otvaranje kanala
vrlo osetljivim na malo variranje koncentracije cGMP-a.
3.2.2.2. Adaptacija tapi a na razli ite nivoe osvetljenja
epi i su neosetljivi na nizak nivo svetlosti, dok su tapi i inhibisani u uslovima velikog
intenziteta svetla. Funkcionalne karakteristike epi a i tapi a ilustruje primer zaslepljenosti,
koja nastaje ukoliko neko vreme boravimo na dnevnoj svetlosti, a zatim udjemo u slabo osvetljenu
sobu. Posle nekog vremena, kada se tapi i adaptiraju na uslove slabe svetlosti (polako postaju
senzitivni na slabu svetlost), postajemo sposobni da razlikujemo objekte. Ovakav proces vizuelne
adaptacije omogu ava tapi ima da razlikuju kontraste irokog dijapazona (preko 100 000 x) koji
nastaju kao rezultat razli itih nivoa svetlosti.

90

Proces koji doprinosi vizuelnoj adaptaciji uklju uje fosforilaciju aktiviranog opsina (O*),
aktivacijom rodopsin kinaze (enzim sli an kinazi
adrenergi nih receptora, BARK, opisanoj
ranije). Svaki molekul opsina poseduje 3 serinska ostatka, koja mogu biti fosforilisana. Broj
fosforilisanih serina je u obrnutom odnosu sa sposobnosti ove molekule da interaguje sa Gt.
Drugim re ima, to je ve i broj fosforilisanih serina, manja je sposobnost akivnog opsina da
aktivira Gt i dovede do zatvaranja cGMP-zavisnih katjonskih kanala. Zna aj fosforilacije aktivnog
opsina, je ilustrovana ogledom na tapi ima koji ekspresuju mutirane molekule rodopsina, u
kome su serini zamenjeni nekim drugim aminokiselinama (npr. alaninom). Ovakvi rodopsini
pokazuju mnogo sporiju deaktivaciju prilikom delovanja svetlosti ve eg intenziteta. U tim
uslovima, aktivni opsin je fosforilisan a aktivacija Gt je redukovana, tako da je neophodan ve i
porast intenziteta svetlosti za generisanje vizuelnog signala. U uslovima smanjenog intenziteta
svetlosti, opsin je defosforilisan i njegova sposobnost za aktivaciju Gt raste. Drugim re ima samo
nekoliko dodatnih fotona je potrebno za nastajanje vizuelnog signala.

Slika 3. 19. Uloga fosforilacije opsina u adaptaciji tapi a na promene nivoa svetlosti.

U uslovima visokog nivoa svetlosti (kakva je npr. dnevna svetlost u podne), fosforilacija opsina je
velika (sva 3 mesta su fosforilisana), tako da C-terminalni region molekule postaje vezno mesto za
-arestin. Vezivanje -arestina spre ava interakciju aktiviranog opsina sa Gt i potpuno blokira
nastajanje Gt GTP kompleksa, to dovodi do inaktivacije tapi a. Mehanizam kontrole aktivnosti
tapi a preko uklju ivanja rodopsin kinaze je sli an adaptaciji ili desenzitizaciji drugih G-protein
zavisnih receptora u uslovima visoke koncentracije liganda tj. predstavlja opti mehanizam
adaptacije.
Drugi mehanizam vizuelne adaptacije tapi a je jedinstven za ove elijske forme. U mraku, elije
se adaptiraju tako to se skoro sve Gt i G subjedinice nalaze u spoljanjem segmentu.

91

Medjutim, izlaganje tapi a svetlosti umerenog intenziteta u trajanju npr. od 10 minuta, dovodi
do translokacije Gt i G subjedinica iz spoljanjeg segmenta u elijske kompartmane. Iako
mehanizam translokacije Gt i G subjedinaica jo uvek nije poznat, jasno je da uklanjanje Gt
proteina iz spoljanjeg segmenta onemogu ava njegovu interakciju sa aktivnim opsinom tj.
predstavlja jedan vid adaptacije. Kao i u slu aju drugih signalnih puteva, i tokom vizuelne
adaptacije, koriste se multipli mehanizmi inaktivacije prenosa signala to omogu ava bolju
regulaciju aktivacije signalnog puta u razli itim uslovima osvetljavanja.

92

3.3. GPCR-zavisni RECEPTORI KOJI AKTIVIRAJU FOSFOLIPAZU C

U tekstu koji sledi e biti opisani signalni putevi aktivirani GPCR-om, koji angauju neke druge
sekundarne glasnike, kao i mehanizmi preko kojih oni reguliu razli ite funkcije elija.
Sekundarni glasnici koji e biti opisani, mogu nastati od membranskog fosfolipidnog molekula
tzv. fosfatidilinozitola (PI). Inozitolna grupa ovog fosfolipidnog molekula, koja se projektuje u
citosol, moe biti fosforilisana i defosforilisana na nekoliko pozicija, kombinovanim delovanjem
razli itih kinaza i fosfataza. Drugim re ima, razli ita fosforilacija omogu ava nastajanje razli itih
fosfoinozitida vezanih za membranu.

Slika 3. 20. Sinteza DAG i IP3 od PI vezanog za membranu. Forme PI kinaza vezanih za membranu (PI-4 i PI-5 kinaza) fosforiliu specifi nu
hidroksilnu grupu u inozitolnom prstenu, produkuju i fosfoinozitide PIP i PIP2. Razlaganje PIP2 delovanjem PLC generie nastajanje dva
sekundarna glasnika DAG i IP3.

Nivo mnogih fosfoinozitida u eliji je dinami ki regulisan ekstracelularnim signalima, naro ito
onim koji se vezuju za receptor tirozin kinazu ili citokinski receptor. Fosfoinozitid PIP2 (PI 4,5bifosfat) moe da vee mnoge citosolne proteine za plazma membranu. Neki od tih proteina su
neophodni za formiranje i remodelovanje aktinskog citoskeleta, drugi su neophodni za vezivanje
proteina zna ajnih u procesu endocitoze i formiranju vezikula.

93

Fosfolipaza C je enzim koji je povezan sa elijskom membranom, i koji je odgovoran za razlaganje

PIP2 i nastajanje dva sekundarana glasnika: 1,2-diacilglicerol (DAG), lipofilne molekule koja
ostaje povezana sa elijskom membranom, i inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3), molekule koja
difunduje u citosol. Signalni putevi koji uklju uju angaovanje ova dva sekundarna glasnika se
jednim imenom nazivaju IP3/DAG signalni put. Vezivanje hormona za receptore koji su povezani
sa Go ili Gq proteinom (Tabela 3.1.) dovodi do aktivacije izoforme fosfolipaze C (PLC ).

3.3.1. Inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3) izaziva oslobadjanje Ca++ iz endoplazmatskog retikuluma

Ca++ se u eliji uglavnom nalazi uskladiten u tzv. intracelularnim depoima kao to su
mitohondrije, endoplazmatski retikulum (ER), ili se nalazi u sastavu nekih vezikula. elije koriste
razli ite mehanizme za regulaciju koncentracije citosolnog Ca++, tako da se njegova koncentracija
u citosolu odrava ispod 0.2 M1. Vrlo je vana kontrola koncentacije citosolnog Ca++, zato to
mali porast nivoa Ca++ izaziva razli ite elijske odgovore.
Vezivanje mnogih hormona za svoje membranske receptore (npr. u jetri, masnim ili nekim drugim
elijama) dovodi do porasta citosolnog Ca++, koji se oslobadja aktivacijom IP3-zavisnih Ca++
kanala u membrani ER. Kanal se sastoji od etiri identi ne subjedinice, od kojih svaka, na Nterminalnom citosolnom domenu poseduje vezno mesto za IP3. Kanal se otvara kada se za njega
vee IP3, a kroz otvoreni kanal u citosol difunduje Ca++. Ova tvrdnja tj. specifi nost IP3 efekta na
Ca++ kanale, se moe ilustrovati jednostavnim ogledom u kome se preparatu ER vezikula dodaju
razli iti fosforilisani inozitoli od kojih samo IP3 izaziva oslobadjanje Ca++ u citosol.
Porast nivoa Ca++ u citoplazmi je kratkotrajan tj. prolazan, zbog toga to se aktiviraju pumpe za
Ca++, locirane u elijskoj membrani ili membrani ER, a koje aktivno transportuju Ca++ u
ekstracelularni fluid ili nazad u lumen ER. Takodje, u toku jedne sekunde od nastajanja IP3
molekula, dolazi do hidrolize jednog fosfata i nastajanja inozitol 1,4-bifosfata, koji ne moe da
aktivira kanale za Ca++ u membrani ER.

1 Na primer, razli ite ATP-azne pumpe transportuju Ca++ kroz plazma membranu ili kroz memembranu elijskih organela koja skladite
intracelularni Ca++.

94

Slika 3. 21. Porast nivoa citosolnog Ca++ regulisanog

aktivacijom IP3/DAG signalnog puta. Ovaj put moe biti stimulisan
aktivacijom nekog G protein-zavisnog receptora, kao i nekoliko
drugih receptora koji dovode do aktivacije PLC. Razlaganje PIP2
dovodi do nastajanja DAG i IP3 (1). IP3 difunduje u citosol, vezuje se
za kanale za Ca++ i otvara ih (2), dozvoljavajuci difuziju Ca++ u
citosol (3). Jedan od razli itih odgovora elije izazvanih porastom
citosolnog Ca++ je i regrutovanje protein kinaze C (PKC) koja u
plazma membrani (4) biva aktivirana DAG-om (5). Aktivirana PKC
moe da fosforilie razli ite elijske enzime i receptore menjaju i
njihovu aktivnost (6). Kada se intracelularni depo isprazni, IP3
zavisni kanali se vezuju sa TRP kanalima za Ca++ u plazma
membrani tj. otvaranjem TRP kanala dolazi do influksa
ekstracelularnog Ca++ (7).

Bez na ina za ponovno punjenje intracelularnih depoa, elija bi brzo bila nesposobna da na
ponovljenu IP3 stimulaciju odgovori pove anjem citosolnog Ca++. Utvrdjeno je da se nakon
pranjenja depoa za Ca++ u ER, otvaraju plazma-membranski kanali za Ca++ tzv. TRP kanali. Na
jo neobjanjen na in, smanjenje Ca++ u lumenu ER, dovodi do konformacione promene IP3
zavisnih kanala za Ca++, koja omogu ava njegovo vezivanje za TRP kanale u elijskoj membrani.
Ovakva interakcija dva kanala za Ca++, dovodi do otvaranja TRP kanala i influksa ekstracelularnog
Ca++ u eliju.
Otvaranje IP3zavisnih kanala za Ca++ je regulisano citosolnim jonima Ca++. Na primer, poviena
koncentacija Ca++ u citosolu smanjuje afinitet kanala za IP3, ime se smanjuje oslobadjanje Ca++ iz
lumena ER. Kompleksna regulacija IP3zavisnih kanala za Ca++ vodi ka brzim oscilacijama nivoa
citosolnog Ca++, u slu aju stimulacije IP3 signalnog puta. Tako na primer, stimulacija
gonadotropnih elija adenohipofize sa LHRH, izaziva brze ponovljene oscilacije nivoa citosolnog
Ca++ (engl. spikes in cytosolic Ca++ level) koji je povezan sa epizodi nom sekrecijom LH. Zna aj
ovakve fluktuacije citosolnog Ca++ jo uvek nije objanjen. Jedno od mogu ih objanjena je da
spori porast nivoa Ca++ moe biti toksi an za eliju.

95

3.3.2. Diacilglicerol (DAG) aktivira protein kinazu C (PKC) koja regulie mnoge druge
proteine
Nakon formiranja DAG ostaje povezan sa elijskom membranom. Njegova osnovna funkcija je da
aktivira familiju protein kinaza tzv. protein kinaza C (PKC). U uslovima kada elija nije
stimulisana hormonima, PKC je kataliti ki neaktivan solubilni citosolni protein. Porast citosolnog
Ca++ dovodi do regrutovanja PKC, i njenog pribliavanja plazma membrani, gde moe da bude
aktivirana u reakciji sa DAG-om (koji je vezan za elijsku membranu). Moe se re i da, aktivacija
PKC zavisi od porasta koncentracije Ca++ u citosolu, kao i od interakcije sa DAG-om, to
predstavlja primer interakcije dve grane IP3/DAG signalnog puta.
Aktivacija PKC u razli itim elijama aktivira razli ite odgovore i ima vanu ulogu u mnogim
aspektima rasta i metabolizma elija. Na primer, u elijama jetre, PKC pomae u regulaciji
metabolizma glikogena tako to fosforilacijom odredjenih proteina inhibie sintezu glikogena.
Takodje, PKC u zavisnosti od tipa elije, moe da fosforilie razli ite transkripcione faktore i tako
indukuje sintezu mRNA koja e npr. dovesti do proliferacije elija.

3.3.3. Ca++/kalmodulin kompleks posreduje u odgovoru elija na spoljanje signale

Pored vezivanja za GPCR, i vezivanje liganda za nekoliko drugih tipova receptora, moe da aktivira
PLC, to dovodi do IP3-posredovanog pove anja nivoa slobodnog Ca++ u citosolu. Ovakvo
lokalizovano pove anje koncentracije slobodnog Ca++ je kriti no za njegovu funkciju sekundarnog
glasnika2. Na primer stimulacija GPCR-a, acetilholinom u sekretornim elijama pankreasa i
parotidne lezde indukuje IP3-posredovan porast nivoa citosolnog Ca++, koji izaziva fuziju
sekretorne vezikule sa elijskom membranom i oslobadjanje njenog sadraja u ekstracelularni
prostor. U trombocitima, porast citosolnog Ca++, nakon stimulacije trombinom, izaziva
konformacionu promenu koja vodi ka agregaciji trombocita, vrlo zna ajnoj fazi u procesu
hemostaze. Sekrecija insulina iz
elija pankreasa, je takodje, izazvana porastom Ca++ u citosolu,
ali je mehanizam njegovog oslobadjanja druga iji.
2 Koncentracija Ca++ u citosolu je kod elija u miru niska ( 10-7M) dok je u ekstracelularnom fluidu ( 10-3M) i ER visoka. Kada signal otvori kanale
za Ca++ on difunduje, pove avaju i njegovu koncentraciju u citosolu 10-20x. Glavni tipovi Ca++ kanala preko kojih se ostvaruje ovaj efekat su:
voltano zavisni Ca++kanali u plazma membrani, IP3-zavisni Ca++ kanali u membrane ER, i rijanodinski receptori. Detaljnije o funkciji ovih kanala I
mehanizmima pumpanja Ca++ u ER i/ili mitohondrije, kao i u ekstracelularni fluid pro itati u skripti Opta fiziologija ivotinja, Kova evi R i sar.

96

3.3.3.1. Frekvenca oscilacija Ca++ uti e na odgovor elije

Ca++-senzitivni fluorescentni indikatori, npr. fura-2, se esto koriste u merenju promene nivoa
citosolnog Ca++ u individualnim elijama, nakon aktivacije inozitol fosfolipidnog signalnog puta.
Ovako posmatran signal kalcijuma, je mali i lokalizovan na diskretne regione u eliji. Ovi signali,
koji se esto nazivaju iljci, predstavljaju osnovne jedinice Ca++ signalinga. Smatra se, da oni
nastaju usled otvaranja individualnog (ili male grupe) kanala za Ca++ u membrani ER. Obi no je
Ca++ signal (iljak), pra en serijom signala, koja obi no traje nekoliko sekundi. Oscilacije Ca++
traju toliko dugo, koliko traje aktivacija receptora na povrini elije. Takodje, oscilacije bar
delimi no zavise i od kombinacije pozitivne i negativne povratne sprege na IP3-zavisan kanal za
Ca++ (oslobodjeni Ca++ inicijalno stimulie dalje oslobadjanje Ca++ iz intracelularnog depoa, a kad
njegova koncentracija dovoljno poraste, Ca++ inhibie dalje oslobadjanje).
Frekvenca oscilacija Ca++ signala, izraava intenzitet ekstracelularnog stimulusa. Fizioloki
odgovor elije zavisi od frekvence tih oscilacija, i esto i sam odgovor elije predstavlja oscilatornu
funkciju. Na primer, u slu aju hormonske stimulacije
elija adenohipofize, ekstracelularni signal izaziva
oscilatorni odgovor Ca++ (ponavljanje iljaka Ca++), u
kome je svaki iljak povezan sa sekrecijom hormona.
Takodje, elijski odgovor koji zavisi od frekvence
oscilacija Ca++, ne mora da bude oscilatoran. Kod nekih
tipova
elija, odredjena frekvenca Ca++ oscilacija,
aktivira transkripciju jednog seta gena, dok druga, via
frekvenca, aktivira transkripciju drugih gena u eliji.
Mehanizam preko koga elija dobija informacije o
promeni nivoa Ca++, uklju uje angaovanje Ca++ senzitivnih proteina, koji menjaju svoju aktivnost u
zavisnosti od frekvence oscilacija Ca++ u citosolu.
Slika 3. 22. Vazopresinom indukovane oscilacije Ca++ u elijama jetre.

97

3.3.3.2. Ca++/kalmodulin-zavisna protein kinaza (CaM-kinaza) posreduje u mnogim

efektima Ca++ u eliji
Mali citosolni protein, kalmodulin, koji je karakteristi an za sve eukariotske elije, funkcionie
kao protein koji je uklju en u mnoge efekte jona Ca++ u eliji. Vezivanje jona Ca++ za etiri vezna
mesta na molekulu kalmodulina, dovodi do formiranja kompleksa koji interaguje i modulie
aktivnost mnogih enzima i proteina u eliji. Ca++ se vezuje za kalmodulin u kooperativnom
maniru, to zna i da male promene nivoa citosolnog Ca++ vode ka velikim promenama nivoa
aktivnog kalmodulina.
Mnogi efekti Ca++/kalmodulin kompleksa su posredovani fosforilacijom proteina, koja je
katalisana kinazama iz familije Ca++/kalmodulin-zavisnih protein kinaza (CaM-kinaze).
Pripadnici ove familije, fosforiliu ostatke serina i/ili treonina u sastavu proteina, iju aktivnost
reguliu. Prva otkrivena CaM-kinaza, je kinaza lakog lanca miozina, koja regulie aktivnost
miozina u elijama glatke muskulature. Kinaza lakog lanca miozina ispoljava visoku specifi nost
za odredjeni supstrat tj. fosforilie lake lance miozina. Brojne druge CaM-kinaze imaju mnogo iru
specifi nost, i odgovorne su za mnoge efekte Ca++ u ivotinjskim elijama. Neke od CaM-kinaza,
mogu da fosforiliu regulatorne proteine gena, kao sto je CREB protein, i na taj na in da inhibiu
ili aktiviraju transkripciju specifi nih
gena.
Slika 3. 23. Aktivacija CaM-kinaze II. CaM-kinaza II je
veliki proteinski kompleks koji se sastoji od 12
subjedinica, a na slici je zbog jednostavnosti, prikazana
samo jedna subjedinica. Razli iti tipovi subjedinica ( , ,
, i ) su zastupljeni u razli itim elijama. U odsustvu
Ca++/kalmodulin kompleksa, enzim je neaktivan, to je
rezultat interakcije izmedju inhibitornog i kataliti kog
domena. Vezivanje Ca++/kalmodulin kompleksa menja
konformaciju proteina, to omogu ava da kataliti ki
domen fosforilie inhibitorni domen susedne subjedinice
u kompleksu (kao i druge proteine u eliji).
Autofosforilacija enzimskog kompleksa (uzajamnom
fosforilacijom subjedinica) produava aktivnost enzima
na dva na ina. Prvo, zadrava vezani Ca++/kalmodulin,
tako da ne dozvoljava njegovu disocijaciju od enzimskog
kompleksa i nakon povratka nivoa citosolnog Ca++ na
bazalne vrednosti, za bar 10 sekundi. Konvertuje enzim
u formu koja postaje nezavisna od Ca++, tako da enzim
ostaje aktivan i kada dodje do disocijacije od
Ca++/kalmodulin kompleksa. Enzim ostaje aktivan sve dok protein fosfataze (koje defosforiliu enzim), ne prevladaju proces autofosforilacije.

98

Najbolje izu en primer, je primer multifunkcionalne CaM-kinaze, CaM-kinaze II, koja je prisutna
u svim ivotinjskim elijama, a posebno je dobro zastupljena u nervnim elijama. U nekim
regionima mozga, zastupljenost ove kinaze iznosi ak 2% od ukupnih proteina, a podru je sinapsi
je naro ito bogato CaM-kinazom II. CaM-kinaza II poseduje dve vane karakteristike koje su
medjusobno povezane. Prva je da funkcionie kao molekularna memorijska sprava tj. aktivira se
Ca++/kalmodulinskim kompleksom, i ostaje aktivna ak i kad signal Ca++ prestane da postoji. Ovo
se objanjava njenom sposobnos u autofosforilacije, tj. ona pored fosforilacije ciljnih proteina
ima sposobnost da sama sebe fosforilie, i da na taj na in ostane aktivna i kada signal koji je
aktivirao vie ne postoji. Aktivnost CaM-kinaze II se odrava, sve dok fosfataze ne prevladaju
autofosforilaciju ovog enzima. Druga, zna ajna karakteristika ovog enzima je da moe da koristi
svoj mehanizam memorije i funkcionie kao dekoder frekvence oscilacija Ca++. Smatra se da je
ova osobina naro ito vana u sinapsama, gde promene u nivou intracelularnog Ca++ vode ka
dugotrajnim promenama. Kada je u in vitro ogledu CaM-kinaza II imobilisana na vrstoj povrini i
izloena delovanju protein fosfataze, kao i ponavljanim pulsevima Ca++/kalmodulin kompleksa,
razli ite frekvence (kombinaciji onih faktora koji imitiraju situaciju u stimulisanim elijama),
enzimska aktivnost graduisano raste, u funkciji frekvence Ca++/kalmodulin kompleksa.
3.3.3.3. Ca++/kalmodulin-zavisna aktivacija drugih efektornih proteina
Ca++/kalmodulin kompleks moe da aktivira cAMP fosfodiesterazu, enzim koji degradira cAMP u
5`-AMP i time se uklju uje u inhibicuju signalnog puta cAMP-a. Ovakva interakcija dva signalna
puta, je jedan od mnogih primera interakcije dva sekudarna glasnika, koja su uklju ena u finu
regulaciju odredjenih aspekata funkcije elija.
U nekim elijama aktivacija receptora i signalnog puta preko PLC i IP3 dovodi do aktivacije
specifi nih transkripcionih faktora. U nekim slu ajevima Ca++/kalmodulin aktivira protein kinazu
koja fosforilie transkripcione faktore, a modifikacijom njihove aktivnosti regulie ekspresiju gena.
U drugim slu ajevima, Ca++/kalmodulin aktivira fosfatazu, koja defosforilie transkripcione
faktore. Zna ajan primer uklju ivanja ovakvog mehanizma u regulaciju funkcije elije je aktivacija
T limfocita, u kojima joni Ca++ stimuliu aktivnost transkripcionog faktora NFAT (engl. nuclear
factor of activated T cells). U nestimulisanim elijama NFAT je fosforilisan i lociran u citosolu.
Nakon stimulacije receptora i pove avanja nivoa citosolnog Ca++, Ca++/kalmodulin kompleks se
vee i aktivira kalcineurin. Kalcineurin je serin-fosfataza, koja u aktivnoj formi uklanja klju nu
fosfatnu reziduu (defosforilie) na citosolnom NFAT-u, i time omogu ava njegovu translokaciju u
nukleus i stimulaciju ekspresije gena vanih za aktivaciju T limfocita.

99

Ca++/kalmodulin kompleks, takodje ima vanu ulogu u kontroli dijametra krvnih sudova. Ovaj
signalni put angauje NO, kao signalnu molekulu, i ilustruje primer funkcije cGMP-a kao
sekundarnog glasnika.
3.3.3.4. cGMP aktivira protein kinazu G i izaziva relaksaciju elija glatke muskulature
Nitroglicerin, se due od jednog veka, koristi u le enju intenzivnog bola u grudima kod angine
pektoris. Poznato je da nitroglicerin u telu polako otputa azot oksid (NO), koji dovodi do
relaksacije glatke muskulature krvnih sudova, ime se pove ava dijametar krvnih sudova i protok
krvi koja snabdeva organ (u ovom slu aju miokard) sa O2. Jedno od intrigantnih otkri a moderne
medicine, je funkcija NO, toksi nog gasa, kao signalne molekule.
Definitivni dokazi za funkciju NO u relaksaciji glatke muskulature su dobijeni iz seta ogleda u
kojima je preparatima elija glatke muskulature, dodavan acetilholin. Direktno dodavanje
acetilholina na ove elije je dovelo, do o ekivanog rezultata tj. do njihove kontrakcije (dobro je
poznato da Ach izaziva kontrakciju glatke muskulature). Medjutim, dodavanje acetilholina u
lumen malih izolovanih krvnih sudova, je dovelo do relaksacije zida krvnog suda. Analize su
pokazale, da acetilholin deluje na endotel krvnih sudova, izazivaju i oslobadjanje supstance koja
stimulie relaksaciju glatko-miicnih elija. Ispostavilo se da je ova supstanca NO.
Danas se zna da endotelne elije
poseduju receptore za acetilholin,
koji su Go protein-zavisni receptori.
Vezivanje acetilholina za ove
receptore aktivira fosfolipazu C,
koja preko IP3 dovodi do porasta
nivoa citosolnog Ca++. Ca++/kalmodulin kompleks stimulie aktivnost NO sintaza, enzima koji kataliu formiranje NO, od O2 i
aminokiseline arginina.
Slika 3. 24. Regulacija kontraktilnosti glatke
muskulature krvnih sudova preko NO i cGMP.

100

NO ima kratak poluivot (svega nekoliko sekundi) to ograni ava njegovu difuziju, tako da NO
moe da difunduje samo lokalno tj. do susednih elija. U slu aju regulacije funkcije glatke
muskulature krvnih sudova, on difunduje iz endotelnih elija do susednih elija glatke
muskulature, i izaziva njihovu relaksaciju.
Efekat NO na elije glatke muskulature se ispoljava aktivacijom sekundarnog glasnika, cGMP-a.
Naime, NO se u eliji vezuje za svoj intracelularni receptor tj. citosolni enzim tzv. solubilnu
gualinat ciklazu. Vezivanje NO za hem, koji se nalazi u sastavu ovog enzima, dovodi do
konformacione promene koja stimulie guanilat-ciklaznu aktivnost enzima tj. produkciju cGMP-a.
Ve ina intacelularnih efekata cGMP-a je posredovana protein kinazom G (PKG). U glatkoj
muskulaturi krvnih sudova, PKG aktivira signalni put koji dovodi do inhibicije formiranja aktinmiozin kompleksa, relaksacije elija tj. do vazodilatacije. U ovom slu aju cGMP deluje indirektno
preko aktivacije PKG, dok u ranije spomenutom primeru regulacije funkcije tapi a, cGMP reaguje
direktno sa katjonskim kanalima u plazma membrani.
Relaksacija glatke muskulature, takodje, moe biti izazvana, vezivanjem atrijalnog natrureti nog
peptida (ANP) i nekih drugih peptdida za svoje receptore na membrani glatko-mii nih elija.
Citoplazmati ni domen ovih membranskih receptora, poseduje enzimsku aktivnost, sposobnost
produkuje cGMP. Kada pove an volimen krvi, istegne elije miokarda pretkomore, one sekretuju
ANP. ANP, cirkulacijom dospeva do receptora za ANP tzv. membranske guanil ciklaze, koja se
nalazi na membrani glatke muskulature susednih krvnih sudova, vee se za nju i stimulie
produkciju cGMP-a. Aktivacija PKG izaziva dilataciju krvnih sudova, koja smanjuje krvni pritisak
i tako smanjuje pokreta ki stimulus koji je doveo do sekrecije ANP.

101

3.4. GPCR-zavisna AKTIVACIJA TRANSKRIPCIJE GENA

Kao to je ranije napomenuto, intracelularni putevi transdukcije signala mogu da imaju
kratkotrajni ili dugotrjni efekat na eliju. Kratkotrajni efekti koji se mere sekundama ili minutima
su rezultat modulacije enzima ili drugih proteina koji ve postoje u eliji, prouzrokuju i time
promene u elijskom metabolizmu i/ili funkcijama. Ve ina puteva stimulisanih aktivacijom
GPCRs prouzrokuje kratkotrajne efekte. Pored toga, GPCRs-signalni putevi mogu imati i
dugotrajne efekte koji traju satima ili danima zahvaljuju i aktivaciji ili represiji transkripcije gena,
to vodi, u nekim slu ajevima ka proliferaciji elija, ili diferencijaciji u razli ite tipove elija. Ranije
je diskutovano (videti sekciju) kako signal koji indukuje pove anje nivoa citosolnog Ca2+ vodi ka
aktivaciji transkripcionih faktora. U ovoj sekciji e biti razmatrani drugi mehanizmi kojima neki
GPCRs reguliu transkripciju i/ili ekspresiju gena.

3.4.1. Membranski-lokalizovan tubby transkripcioni faktor se otputa aktivacijom PKC

S obzirom na veliku ekspanziju bolesti vezanih za ishranu interesovanje za tzv. tubby gen je
zna ajno poraslo kada je identifikovano da se ovaj gen ekspresuje prvenstveno u odredjenim
regionima mozga uklju enim u kontrolu ponaanja u ishrani. Jo ve a panja nau ne javnosti je
usmerena na ovaj gen kada je otkriveno da je tubby gen uklju en u kontrolu i/ili regulaciju
gojaznosti. Mievi koji nose mutacije na tubby genu razvijaju gojaznost i odredjeni aspekti
njihovog metabolizma pode aju na one kod gojaznih ljudi. Sekvencioniranje kloniranog tubby
gena pokazalo je da kodirani protein ima i DNK-vezuju i domen, kao i transkripcioni-aktivacioni
domen. Medjutim, detektovan Tubby protein je lokalizovan
blizu plazma membrane, to ga ne ini mogu im kandidaton
za transkripcioni faktor. Pokazano je da Tubby protein vrsto
vee PIP2 koji usidrava protein u plazma memebranu (Slika
3.25.).
Slika 3.25. Vezivanje liganda za receptore koji transdukuju signal preko Go ili Gq
proteina prati aktivacija Tubby transkripcionog faktora.
U stanju mirovanja tj. kada GPCR nije okupiran ligandom, Tubby je vrsto vezan sa PIP2 u plazma
mebrani. Stimulacija receptora aktivira PLC, to vodi hidrolizi PIP2 i oslobadja Tubby u citosol (1).
Vodjen sa dve funkcionalne NLS na svom N-terminalnom domenu, Tubby se translocira u nukleus (2) i
aktivira transkripciju ciljnih gena (3). Nije poznato da li IP3 ostaje zaka en za Tubby nakon odvajanja
PIP2. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company;
adaptirano od Santagata i sar. (2001), Science 292:2041.).

102

Hormoni koji se vezuju za receptore koji transdukuju signal preko Go ili Gq proteina, indukuju
aktivaciju fosfolipaze C (engl. PhosphoLipase C PLC) to prouzrokuje hirolizu PIP2 i oslobadja
Tubby u citosol3. Nakon toga se Tubby translocira u nukleus vodjen sa dve funkcionalne sekvence
za nuklearnu lokalizaciju (engl. Nuclear Localisation Sequences - NLS) koje se nalaze na
njegovnom N-terminalnom domenu. U nukleusu, Tubby aktivira transkripciju, jo uvek,
nepoznatih/nedefinisanih gena. Identifikacija i karakterizacija ovih gena bi trebala da omogu i
bolje razumevanje uloge proteina koje oni kodiraju u gojaznosti.

3.4.2. CREB vezuje cAMP signale za transkripciju

Pove anje nivoa citosolnog cAMP-a u elijama sisara stimulie eksrpesiju mnogih gena. Na
primer, pove anje niova cAMP-a u odredjenim endokrinim elijama indukuje produkciju
somatosterina, peptida koji inhibie oslobadjanje razli itih hormona. Takodje, u elijama jetre,
cAMP indukuje sintezu nekoliko enzima koji su uklju eni u konverziju tro-ugljeni nih
komponeneti u glukozu.
Svi geni koji su regulisani sa cAMP sadre cis-aktivnu DNK sekvencu koja ima funkciju elementa
koji odgovara na cAMP (engl. Cyclic AMP-Response Element CRE). CRE vezuje fosforilisani
transkripcioni faktor koji se zove CRE-vezuju i protein (engl. CRE-Binding CREB protein), a
koji je detektovan jedino u nukleusu. Kao to je ranije diskutovano, vezivanje ligada za receptore
koji transdukuju signal preko Gs proteina, aktivira AC, to pove ava nivo intracelularnog cAMP-a
koji aktivira PKA i inicira oslobadjanje kataliti kih subjedinica PKA. Neke kataliti ke
subjedinice PKA se translociraju u nukleus i tamo fosforiliu serin-133 na CREB proteinu.
Fosforilisani CREB protein se vezuje za gene koji u svom promotoru imaju CRE, a istovremeno i
interaguje sa koaktivatorom CBP/P300 koji vezuje CREB protein za bazalnu transkripcionu
maineriju, te time omogu ava CREB proteinu da stimulie transkripciju gena za iji CRE region
se vezao (Slika 3.26.). Ranije studije su sugerisale da fosforilacija prozrokuje konformacione
promene CREB proteina, ali se danas zna da se CBP/P300 vezuje specifi no za fosforilisani serin133 (fosfoserin-133) aktiviranog CREB proteina. Drugi transkripcioni faktori se takodje oslanjaju
i prevode signale preko CBP/P300 kako bi aktivirali transkripciju gena. Prema tome, ovaj
koaktivator ima veoma vanu ulogu u integraciji signala koji poti u od brojnih intracelularnih
puteva transdukcije signala, a koji kuliminiraju regulacijom transkripcije gena.
3

Nije poznato da li IP3 ostaje vezan za Tubby

103

Slika 3.26. Vezivanje liganda za receptore koji

transdukuju signal preko Gs proteina prati aktivacija
ekspresije gena.
Stimulacija receptora (1) vodi aktivaciji PKA (2). Kataliti ke
subjedinice PKA se translociraju u nukleus (3) I tamo fosforiliu i
atkiviraju transkripcioni faktor CREB (4). Fosforilisani CREB se
asocira sa koaktivatorom CBP/P300 (5) da bi stimulisao razli ite
ciljne gene ija je ekspresija kontrolisana preko CRE
regulatornog elementa.
(Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology.
WH Freeman and Company; videti Parker i sar. (1996),
Mol Cell biol 16 (2):694.).

3.4.3. GPCR-vezani arestin aktivira nekoliko kinaznih kaskada koje

kontroliu ekspresiju gena
Kao to je prikazano ranije (videti slike 3.13. i 3.14), vezivanje arestina za fosforilisane serine u
citosolnom domenu receptora koji transdukuju signal preko G proteina, blokira aktivaciju G
subjedinice i posreduje endocitozu GPCR-arestin kompleksa. Pored toga, verovatno
iznenadjuju e, ali GPCR-arestin kompleks deluje i kao postolje/skela (engl. scaffold protein) za
vezivanje nekoliko kinaza (videti slike 3.13. i 3.14.). Ova aktivacija uklju uje c-Src4, koja aktivira
4c-Src kinaza je lan familije Src kinaza, tirozin kinaza koje se ne aktiviraju direktno receptorom, a pripadaju velikoj familiji blisko povezanih tirozinspecifi nih protein kinaza koje su uklju ene u regulaciju elijske deobe, elijske diferencijacije i elijske agregacije. Bar devet identifikovanih protein
kinaza je u okviru familije Src kinaza. Prva identifikovana tirozin kinaza je zapravo viralni onkogeni produkt v-Src kinaza. U poredjenju sa svojom
elijskom kopijom, c-Src kinazom, v-Src nema inhibitorne elemente koji kontroliu aktivnost protein kinaze. Posledica gubitka inhibitornih
elemenata je da je v-Src kinaza konsititutivno aktivna, te je stoga veoma potentan faktor/protein koji indukuje transformaciju.

104

MAP kinazni signalni put, ali i druge puteve transdukcije signala koji vode aktivaciji transkripcije
gena neophodnih za deobu elije. Kompleks od tri proteina vezana za arestin, uklju uju i JNK1
(Jun N-terminal Kinase), inicira kaskadnu aktivaciju kinaza koja na kraju aktivira c-Jun
transkripcioni faktor. Aktivirani c-Jun favorizuje ekpresiju gena za odredjene enzime koji
stimuliu rast, kao i gena za neke proteine koji pomau elijama da odgovre na stresne situacije.
Kao to je napomenuto, vezivanje epinefrina za -adrenergi ni receptor u elijama sr anog mii a
stimulie glikogenolizu, te time ubrzava rad srca i poja ava snagu kontrakcije sr anog mii a.
Medjutim, produeni tretman sa epinefrinom indukuje proliferaciju ovih sr ano-mii nih elija,
to u ekstremnim slu ajevima prouzrokuje kardia nu hipertrofiju koja ote uje sr ani mii i
onemogu ava mu normalan rad. Ova epinefrinom-indukovana proliferacija elija je delom
posledica aktivacije kaskade MAP kinaza koja moe biti indukovana GPCR-arestin
kompleksom. Drugi, verovatno vaniji put, preko koga aktivacija -adrenegi nog receptora
favorizuje kardia nu hipertrofiju uklju uje drugi tip receptora. Gs protein koji je aktiviran adrenergi nim receptorom moe nekako da prouzrokuje aktivaciju specifi nih ekstracelularnih
proteaza koje sadre metal u aktivnom centru, a koje tako aktivirane cepaju transmembranski
prekursor epidermalnog faktora rasta (engl. Epidermal Growth Factor EGF). Solubilni EGF se
otputa u ekstracelularni prostor i vezuje se za receptore na membrani iste elije koja ga je
otpustila, aktivira receptore i deluje na tu eliju u autorkinom maniru. Kako e biti pokazano u
slede em poglavlju, EGF receptor pripada receptorima sa aktivno u tirozin kinaze (engl. Receptor
Tyrosine Kinase - RTK), a to je klasa receptora za koju je uobi ajeno da uklju uje kaskadu MAP
kinaza koja na kraju rezultira proliferacijom elija. Sli na unakrsna-komunikacija (engl. crosstalk) izmedju dva tipa receptora se deava u mnogim drugim putevima signalne transdukcije. Kao
to ne postoji elija koja ivi u izolaciji, takodje nema receptora niti puta transdukcije signala koji
funkcionie samostalno.

105

106

SIGNALNI PUTEVI OD RECEPTOR-ENZIMA I OD

RECEPTORA VEZANIH ZA ENZIM

04

Razvoj svih organizama zahteva izvravanje kompleksnih programa u kojima se specifi ni geni
aktiviraju i ekspresuju u specifi nim setovima elija i u precizno odredjeno vreme. Veliki broj
razvojnih promena je generisan kao rezultat delovanja ekstracelularnih signalnih molekula na
njihove receptore koji se nalaze na povrini ciljne elije. Ve ina ovih signala su solubilni,
sekretovani fakori koji deluju u autokrinom i/ili parakrinom maniru. Neki od signalnih molekula
vezivanjem za receptore na povrini elije aktiviraju puteve transdukcije signala koji na kraju
prouzrokuju promenu obrazca ekspresije gena.
ak i zrele elije koje su deo diferenciranog tkiva konstatno menjaju njihove obrazce genske
ekspresije. U najve em broju slu ajeva ovo se deava zbog toga to brojni receptori na povrni
elije kontinuirano primaju informacije od ekstracelularnih signala i transdukuju ove informacije,
preko elemenata signalne transdukcije, u aktivaciju specifi nih transkripcionih faktora koji
stimuliu ili spre avaju ekspresiju specifi nih ciljnih gena. Mnogi ovakvi signalni putevi vode ka
promeni metaboli ke aktivnosti elije, dok drugi uti u na nivo proteina koji remete sposobnost
elije da napreduje u elijskom ciklusu i da se deli.
Tipi na elija sisara obi no ekspresuje elijske-povrinske receptore za vie od 100 razli itih
tipova ekstracelulanih signalnih molekula koje funkcioniu prvenstveno u smislu regulacije
aktivnosti transkripcionih faktora (videti sliku 3.1., na po etku poglavlja 3.). Signalomindukovana aktivacija transkripcionih faktora se deava na nekoliko na ina, odnosno aktivacijom
nekoliko razli tiih tipova receptora, to za posledicu ima aktivaciju razli ih tipova intracelularne
transdukcije signala. U prethodnom poglavlju, u zadnjoj sekciji (3.5.) je opisano kako stimulacija

107

nekih GPCRs preko cAMP-PKA-signalnog puta aktivira CREB transkripcioni faktor i regulie
ekspresiju gena. U ovom poglavlju e biti opisane druge klase elijskih, povrinskih, receptora
koje ilustruju dodatne signalnom-indukovane mehanizme aktivacije transkripcionih faktora.
Pored GPCRs, druga velika grupa ili drugi veliki tip receptora na povrini elije su tzv. receptori
vezani za enzim (engl. enzyme-linked receptors). Ovaj tip receptora je karakteristi an po svojoj
ulozi da prepozna i odgovori na specifi ne ekstracelularne signalne proteine u smislu
favorizovanja rasta, proliferacije ili preivljavanja elija u animalnom tkivu. Ovi signalni proteini
se veoma esto zajedni ki zovu faktori rasta (engl. Growth Factors - GFs) i oni obi no deluju kao
lokalni medijatori u veoma maloj koncentraciji (10-9 do 10-11 M). Odgovor na ovakve
ekstracelularne signalne molekule je obi no spor (meri se satima ili ak danima) i obi no zahteva
veliki broj intracelularnih signalnih koraka/faza koje e eventualno voditi ka promeni u obrazcu
ekspresije gena (Tabela 4.1.). Pored toga, neki receptori vezani za enzim posreduju i direktne i
brze efekte na citoskelet, kontroliu i na taj na in vrstu kretanja elije i promenu njenog oblika.
Ekstracelularni signali koji indukuju ove rapidne odgovore vrlo esto nisu difuzibilni, nego se
vezuju za povrinu elije. Poreme aji u elijskoj proliferaciji, diferencijaciji, preivljavanju i
migraciji su fundamentalni dogadjaji koji mogu prouzrokovati kancer, a abnormalnosti u
signalingu preko receptora vezanih za enzim i/ili receptora koji sami imaju unutranju enzimsku
aktivnost imaju veliku ulogu u nastanku i razvoju malignih transformacija i kancera.
Kao i GPCRs, receptori vezani za enzim su transmembranski proteini sa svojim ligand-vezuju im
domenom na spoljanjoj povrini plazma membrane. Umesto da, kao GPCRs, imaju citosolni
domen koji je asociran sa heterotrimernim G proteinima, ovaj tip povrinskih receptora ima
citosolni domen koji ili sam po sebi ima unutranju enzimsku aktivnost ili je direktno asociran sa
enzimom. Dok GPCRs imaju sedam transmembranskih domena, svaka subjedinica receptora
vezanog za enzima obi no ima samo jedan. Do sada je identifikovana est klasa receptora vezanih
za enzim:
(1) Receptori sa aktivno u tirozin kinaza (engl. Receptor Tyrosine Kinases RTKs) koji
fosforiliu specifi ne tirozine na malom setu intracelularnih signalnih proteina.
(2) Receptori asocirani sa tirozin kinazom (engl. Tyrosine-Kinase-Associated-Receptors
TKARs) koji su asocirani sa intracelularnim proteinom koji ima aktivnost tirozin kinaze.
(3) Receptorima-sli ne tirozin fosfataze (engl. Receptor-Like Tyrosine Phosphatases - RLTPs)
koje uklanjaju fosfatne grupe sa tirozina na specifi nim intracelularnim signalnim

108

proteinima. Zovu se receptorima-sli ne zbog toga to njihov verovatni ligand jo uvek nije
identifikovan, te njihova receptorna funkcija nije direktno i precizno demonstrirana.
(4) Receptori serin/treonin kinaze fosforiliu specifi ne serine ili treonine na asociranim
latentnim/pritajenim genskim regulatornim proteinima.
(5) Receptori guanilil ciklaze (engl. Guanylyl Cyclases GCs) direktno katalizuju produkciju
cGMP-a od prekursora GTP-a u citosolu.
(6) Receptori asocirani sa histidin kinazom (engl. Histidin-Kinase-Associated Receptors HKARs) aktiviraju tzv. dvo-komponentni signalni put u kome kinaza autofosforilacijom
fosforilie samu-sebe a onda odmah prenosi fosfat na drugi intracelularni signalni protein.
Stimulacija receptora za faktor transformiu eg rasta ili transformiu i faktor rasta beta (engl.
Transforming Growth Factor
- TGF ), kao i citokinskih receptora vodi direktno aktivaciji
citosolnih transkripcionih faktora, a kao rezultat fosforilacije kinazom koja je deo citosolnog
domena receptora ili je asocirana sa receptorom sa citosolne strane. Fosforilisani i aktivirani
citosolni transkripcioni faktori se potom translociraju u nukleus i deluju na specifi ne ciljne gene
u smislu regulacije njihove transkripcije. U slu aju receptora sa aktivno u tirozin kinaza,
RTKs, vezivanje liganda za receptor inicira seriju pokretnih kaskadnih dogadjaja koji vode
aktivaciji citosolne kinaze koja se translocira u nukleus, gde fosforilacijom aktivira jedan ili vie
transkripcionih faktora. Signaling od receptora za faktor nekroze tumora
(engl. Tumor
Necrosis Factor TNF- ) generie aktivni NF-kappaB, NF- B, transkripcioni faktor proteoliti kim
cepanjem proteina citosolnog inhibotora. Proteoliti ko cepanja Notch receptora oslobadja
citosolni domen receptora koji funkcionie kao koaktivator za transkripcione faktore u nukleusu.
Proteoliza takodje ima klju nu ulogu u signalnim putevima aktiviranim vezivanjem proteinskih
liganda koji se zovu Wnt i Hedgehog (Hh) za njihove receptore, a signalni putevi aktivirani ovim
ligandima imaju vode u ulogu tokom razvoja i diferencijacije.
Zbog jednostavnosti, vrlo esto se opisuju razli ite receptorne klase nezavisno sa fokusom na
glavni put signalne transdukcije iniciran svakom klasom receptora. Medjutim, nekoliko klasa
receptora moe da transdukuje signal preko vie od jednog puta (Tabela 4.1.). Pored toga, mnogi
geni su regulisani sa brojnim transkripcionim faktorima, od kojih svaki moe biti aktiviran sa
jednim ekstracelularnim signalom ili sa vie ekstracelularnih signala. Ovakva unakrsnakomunikacija (engl. cross-talk) izmedju signalnih puteva i njima aktivirana promena u obrazcu
genske ekspresije evantualno moe biti toliko produena da elija moe predpostaviti razli itu
razvojnu sudbinu, to je posebno izraeno tokom ranih faza razvoja.

109

Tabela 4.1. Pregled glavnih klasa receptora i signalnih puteva

KLASA RECEPTORA / SIGNALNI PUT *

KARAKTERISTIKE PO KOJIMA SE RAZLIKUJU

RECEPTORI VEZANI ZA HETERO-TRIMERNE G PROTEINE

Ligandi: Epinefrin, glukagon, serotonin, vazopresin, ACTH, adenozin i mnogi drugi (kod
sisara); mirisni molekuli, svetlost; faktori parenja/sparivanja kod kvasaca
GPCR
Receptori: sedam transmembranskih heliksa; citosolni domen udruen sa membranskim
lancem trimernog G proteina
Signalna transdukcija: (1) putevi sekundarnih glasnika koji uklju uju cAMP ili IP3/DAG; (2)
jonski kanali; (3) put MAP kinaza
RECEPTORI SA UNUTRANJOM ILI UDRUENOM ENZIMSKOM AKTIVNO U
Ligandi: Transformiu i faktor rasta superfamilija (TGF , BMPs), aktivin, inhibini (kod
sisara); Dpp (Drosophila)
TGF receptori
Receptori: unutranji protein sa serin/treonin kinaznom aktivno u u citosolnom domenu
(tip I i II)
Signalna transdukcija: direktna aktivacija citosolnih Smad transkripcionih faktora
Ligandi: Interferoni, eritropoetin, hormon rasta, neki interleukini (IL-2, IL-4) i drugi citokini
Receptori: jedinstveni transmembranski heliks; konzervirani multi- lanac nabran u
Citokinski receptori
ekstracelularnom domenu; JAK kinaza udruena sa intracelularnim domenom
Signalna transdukcija: (1) direktna aktivacija citosolnih STAT transkripcionih faktora; (2)
put PI-3 kinaza; (3) IP3/ DAG put; (4) put Ras-MAP kinaza
Ligandi: insulin, epidermalni faktor rasta (EGF), fibroblastni faktor rasta (FGF),
neurotrofini, drugi faktori rasta
Tirozin kinazni receptori
Receptori: jedinstveni transmembranski heliks; unutranji protein sa tirozin-kinaznom
aktivno u u citosolnom domenu
Signalna transdukcija: (1) put Ras-MAP kinaza; (2) IP3/ DAG put; (3) put PI-3 kinaza
Ligandi: Atrijalni natriureti ki faktor i srodni peptidni hormoni
Receptori: jedinstveni transmembranski heliks; unutranja guanil ciklazna aktivnost u
Receptori guanilil ciklaza
citosolnom domenu
Signalna transdukcija: stvaranje cGMP-a
Ligandi: Plejotriofini i drugi proteinski hormoni
Receptori: unutranja fosfotirozin fosfatazna aktivnost u citosolnom domenu, inhibisana
vezivanjem liganda
Receptori fosfotirozin fosfataza
Signalna transdukcija: hidroliza aktiviranog fosfotirozinskog ostatka citosolnog proteina
tirozin kinaze
Ligandi: mali peptidi udrueni sa glavnim histokompatibilnim (MHC) proteinima u plazma
membrani makrofaga i drugih antigen prezentuju ih elija
T- elijski receptori - TCR
Receptori: jedinstveni transmembranski heliks; nekoliko protein kinaza udruenih sa
citosolnim domenom; prona eni jedino u T limfocitima
Signalna transdukcija: (1) aktivacija citosolnih protein tirozin kinaza; (2) put PI-3 kinaza; (3)
IP3/ DAG put; (4) put Ras-MAP kinaza
RECEPTORI KOJI SU JONSKI KANALI
Jonski kanali za koje se vezuju
ligandi

Ligandi: neurotransmiteri (acetilholin, glutamat), cGMP, fizi ki stimulusi ( dodir, istezanje),

IP3 (receptori u membrani ER)
Receptori: etiri od pet subjedinica sa homologim segmentom u svakoj subjedinici, koje
oblau jonski kanal
Signalna transdukcija: (1) lokalne promene membrabnskog potencijala usled influksa jona;
(2) porast koncentracije Ca2+ u citosolu

* Ukoliko nije druga ije nazna eno, svi receptori su locirani na plazma membrani

110

Tabela 4.1. Pregled glavnih klasa receptora i signalnih puteva (nastavak)

KLASA RECEPTORA / SIGNALNI PUT *

KARAKTERISTIKE PO KOJIMA SE RAZLIKUJU

PUTEVI KOJI UKLJU UJU PROTEOLIZU

Ligandi: sekretovani Wnt (kod sisara); Wg (kod Drozofile)
Receptori: Frizzled (Fz) sa sedam transmembranskih heliksa; udrueni-membranski
Wnt put
vezani-LDL-receptoru-sli ni protein (Lrp) neophodan za receptorsku aktivnost
Signalna transdukcija: skup multiproteinskih kompleksa na membrani koji inhibiu
proteazomom-posredovanu proteolizu citosolnog -katenin transkripcionog faktora,
rezultiraju i njegovom akumulacijom
Ligandi: elijski vezani Hedgehog
Receptori: Vezivanje Hh za Patched (Ptc), koji ima 12 transmembranskih heliksa;
Hedgehog (Hh) put
aktivacija signalinga od Smoothened (Smo), sa 7 transmembranskih heliksa
Signalna transdukcija: Proteoliti ko osloba anje transkripcionog aktivatora od
multiproteinskog kompleksa u citosolu
Ligandi: membranski vezani Delta ili Serrate protein
Receptori: Ekstracelularna subjedinica Notch receptora nekovalentno udruena sa
transmembranskom citosolnom subjedinicom
Notch/Delta put
Signalna transdukcija: Intramembransko proteoliti ko cepanje transmembranskog domena
receptora, sa osloba anjem citosolnog segmenta koji funkcionie kao koaktivator jedarnih
transkripcionih faktora
Ligandi: faktor nekroze tumora (TNF- ), interleukin 1 (kod sisara); Sptzle (Drozophila
NF- B put
Receptori: razli iti su kod sisara; Toll i Toll- sli ni receptori kod Drosophile
Signalna transdukcija: Fosforilacijom- zavisna degradacija inhibitornog proteina sa
osloba anjem aktivnog NF- B transkripcionog faktora u citosolu
PUTEVI INTRACELULARNIH RECEPTORA
Ligandi: Azot oksid (NO)
Azot oksid put
Receptori: solubilna guanil ciklaza
Signalna transdukcija: stvaranje cgMP-a
Ligandi: Lipofilni molekuli, uklju uju i steroidne hormone, tiroksin, retinoide i masne
kiseline kod sisara i ekdizon kod Drosophile
Receptori: visoko konzervirani DNK-vezuju i domen, konzervirani hormon vezuju i domen
Putevi nukearnih receptora
i varijabilni domen; lociran unutar jedra ili citosola
Signalna transdukcija: Aktivacija receptornih transkripcionih faktora vezivanjem liganda
* Ukoliko nije druga ije nazna eno, svi receptori su locirani na plazma membrani
(Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; adaptirano od Brivanlou &
Darnel. (2002), Science 295:813.)

Nau nici primenjuju razli ite vrste eksperimentalnih pristupa i model-sistema da bi

identifikovali i prou avali funkciju ekstracelularnih signalnih molekula, receptora, kao i
intracelularnih puteva transdukcije signalna preko signal-transdukcionih proteina. Na primer,
sekretovani signalni protein Hedgehog (Hh) i njegov receptor su prvo identifikovani kod mutanta
Drosophile melanogaster koji ima poreme aj u razvoju. Nakon toga su klonirani humani i
miiji homologi ovog proteina, a potom je pokazano da oni participiraju u brojnim i veoma
vanim signalnim dogadjajima tokom diferencijacije. Neki proteini signalne transdukcije su prvo
identifikovani prilikom fukcionalnih mutacija u genu koji ga kodira ili overekspresije normalnog
proteina, to je prouzrokovalo abnormalnu proliferaciju elija koja je vodila ka malignitetu. Na

111

ovaj na in je identifikovan mutantni Ras protein koji ispoljava aktivnost koja nije podlona
regulaciji tj. tzv. neregulisanu ili konstitutivnu aktivnost. Normalan, tzv. divlji tip (engl. wild
type), Ras je kasnije identifikovan kao klju ni u esnik u mnogim signalnim putevima. Veliki broj
ekstracelularnih signalnih molekula inicijalno je bio izdvojen i pre i en (purifikovan) iz elijskih
ekstrakata, a na osnovu njihove sposobnosti da stimuliu rast i proliferaciju specifi nih tipove
elija. Ovih nekoliko primera ilustruje neophodnost multidisciplinarnog pristupa izu avanju
signalnih puteva to podrazumeva i uklju uje biohemijske, geneti ke (kvasci, crvi, muice, mievi
i drugi organizmi) i fizioloke eksperimentalne pristupe, kao i multidisciplinarni pristup
analiziranju rezultata.

4.1. SIGNALING PREKO TGF

RECEPTORA I DIREKTNA AKTIVACIJA Smad PROTEINA

Veliku broj faktora koji reguliu promene u razvoja ini superfamiliju faktora transformacije rasta
ili superfamiliju transformiu eg faktora rasta beta beta (engl. Transforming Growth Factor TGF ). Ovu superfamiliju zapravo ini veliki broj sli nih ekstracelularnih signalnih molekula koji
imaju iroki spektar funkcija u regulciji razvoja i kod beski menjaka i kod ki menjaka. Jedan
lan ove superfamilije, morfogeni protein kosti (engl. Bone Morphogenic Protein - BMP) je
prvobitno bio identifikovan zbog svoje sposobnosti da indukuje formiranje kosti u kulturi elija.
Danas se jedan tip ovog proteina, BMP7, koristi u klinici za oja avanje kosti nakon ozbiljnih
preloma. Otkriveni su i drugi BMP proteini sa brojnim funkcijama u indukovanju klju nih faza
razvoja, uklju uju i formiranje mezoderma i najranijih fromi elija hematopoeze.
Drugi lan superfamilije TGF , TGF -1, je identifikovan na osnovu svoje sposobnosti da indukuje
transformaciju fenotipa odredjenih elija u kulturi. Pored toga, sve tri humane isoforme TGF -1
koje su do sada poznate imaju antiproliferativni efekat na mnoge tipove sisarskih elija.
Gubitak receptora za TGF -1 ili nekih intracelularnih signalnih proteina koji u estvuju u
transdukciji signala od TGF -1 receptora oslobadja elije antiproliferativnog delovanja TGF -1, to
se esto deava kod humanih tumora. Takodje, TGF -1 proteini favorizuju ekspresiju elijskih
adhezionih molekula i molekula ekstracelularnog matriksa. TGF -1 stimulie neke elije da
sintetiu i sekretuju faktore rasta koji mogu da balansiraju, ili nekada ak i prevazidju,
normalnu TGF -1-indukovanu inhibiciju rasta. Homolog TGF -1 proteina kod Drosophile
melanogaster se zove Dpp proteini i kontrolie dorzoventralni obrazac razvoja embriona muice.

112

Drugi lanovi sisarske TGF -1 superfamilije, aktini i inhibini, deluju na rani razvoj genitalnog
trakta.
Pored veoma brojnih i kompleksnih elijskih efekata indukovanih raznovrsnim lanovima TGF -1
superfamilije, signal-transdukcioni put je u osnovi jednostavan. Jednom aktivirani, receptori za
ove ligande direktno fosforiliu i aktiviraju odredjeni tip transkripcionog faktora. Odgovor
date elije na taj aktivirani transkripcioni faktor zavisi i od konstelacije i stanja ostalih
transkripcionih faktora koje elija ve sadri.

4.1.1. TGF se formira cepanjem skeretovanog inaktivnog prekursora

Kod ljudi se TGF sre u u tri izofrome ovog proteina TGF
TGF
i TGF
, od kojih je svaki
kodiran unikatnim genom i ekspresovan u tkivnospecifi nom i razvojno-regulatornom maniru. Svaka
izoforma TGF je sintetisana kao deo ve eg prekursora koji
sadri pro-domen. Ovaj domen se cepa, ali ostaje
nekovalentno asociran sa zrelim/kona nim proteinom
nakon njegove sekrecije. Ve ina sekretovanih TGF
proteina se magacionira u ekstracelularnom matriksu kao
latentan, inaktivni kompleks koji sadri pocepani
prekursor TGF i kovalentno vezani TGF -vezuju i protein
koji se zove Latentni TGF vezuju i protein (Latent TGF
Binding Protein - LTBP). Vezivanje LTBP za matriksni
protein trombospondin ili za odredjene tipove elijskihpovrinskih integrina indukuje konformacione promene
LTBP i prouzrokuje otputanje zrelog, dimernog TGF .
Alternativno, digestija vezanog proteina kataliti kim
delovanjem matriksnih metaloproteaza moe rezultirati
aktivacijom TGF (Slika 4.1A.). Monomerna forma TGF
faktora rasta sadri 110-140 aminokiselina i ima
kompaktnu strukturu sa etiri
antiparalelna lanca i tri
konzervisana intracelularna disulfidna mosta (Slika 4.1B.).
Slika 4.1. Formiranje i struktura TGF superfamilije signalnih molekula.

113

Ovo formira strukturu poznatu kao cisteinski motiv/mustra i koja je relativno rezistentna
prema denaturaciji. Ve ina varijacija u sekvenci izmedju razli itih TGF proteina vezana je za Nterminalni region, petlju koja je priklju ena
lancima i -heliks. Razli ite heterodimerne
kombinacije ovih proteina mogu da pove avaju funkcionalnu raznolikost ovih proteina mnogo
vie nego to je generisano razlikama u primarnoj sekvenci monomera.

4.1.2. Receptori za TGF signaling imaju aktivnost serin/treonin kinazna

Da bi identifikovali receptore za TGF na povrini elije istraiva i su prvo pomeali i obeleili
purifikovani TGF protein sa radioizotopom-I125 (125I) u uslovima u kojima se ovaj radioizotop
konvalentno vezuje za tirozinske ostatke koji su izloeni na molekulu proteina. Ovakav, 125Iobeleeni, TGF je inkubiran sa elijama u kulturi, a potom je inkubaciona smea tretirana sa
hemijskim agensima koji se cross-reaguju (unakrsno se vezuju) sa obeleenim TGF , odnosno,
kompetituju za TGF receptorna mesta na povrini elija u kulturi. Purifikacija obeleenih
receptora pokazala je postojanje tri razli ita polipeptida sa molekulskom teinom od oko 55, 85 i
280 kDa, a koji se obeleavaju kao RI, RII i RIII receptori za TGF .
Najizraeniji TGF receptor, RIII, je proteoglikan na povrini elije, te se RIII receptor za TGF jo
naziva i -glikan. Ovaj tip receptora vezuje i koncentrie TGF veoma blizu povrine elije. Tip I i
tip II receptori su dimerni transmembranski proteini sa serin/treonin kinazom kao delom
njihovog citosolnog domena. RII je konstitutivno aktivna kinaza koja, u odsustvu TGF , fosforilie
samu sebe procesom autofosforilacije. Vezivanje TGF indukuje formiranje kompleksa koji sadre
po dve kopije od svakog RI i RII. Nakon toga, RII fosforilie serinske i treoninske ostatke na
visoko-konzervisanoj sekvenci RI subjedinice pridodate citosolu-okrenutoj strani plazma
membrane, te na taj na in aktivira kinaznu aktivnost RI.

4.1.3. Aktivirani Tip I TGF receptori fosforiliu Smad transkripcione faktore

Geneti kim studijama, sli nim onima koje su kori ene za disekciju i analizu signalnih puteva od
receptora sa aktivno u tirozin kinaze (videti sekciju 4.3. u ovom poglavlju), nau nici su otkrili
transkripcione faktore koji se aktiviraju vezivanjem signalnih molekula za TGF receptore
Drosophile melanogaster. Ovi transkripcioni faktori kod Drosophile, ali i sli ni proteini ki menjaka

114

se nazivaju Smad proteini (engl. Smads). Familija Smad proteina su proteini ki menjaka
homologi i sa specifi nim proteinom Drosophile melanogaster koji se zove MAD (engl. Mothers
Against Decapentaplegic - MAD), kao i sa specifi nim proteinom Caenorhabditis elegans koji se
zove SMA. Ime Smad je kombinacija ova dva. Istraivanja na larvama Drosophile melanogaster
pokazala su da mutacija MAD gena kod majki, represuje dekapentaplegi ni gen u embironu.
Fraza majke protiv dekapentaplegije engl. Mothers Against Decapentaplegic - MAD) je pridodata
zbog toga to majke esto formiraju organizacije koje se protive i suprotstavljaju razli itim
problemima (npr. majke protiv pijanih voza a; engl. Mothers Against Drunk Drivers - MADD)
(engl. mothers against decapentaplegic). Tri tipa receptora za Smad proteine funkcioniu u TGF
signalinom putu: (1) receptorom-regulisani Smad proteini (R-Smads) koji uklju uju Smad1,
Smad2, Smad3, Smad5 i Smad9; (2) co-Smad proteini (co-Smads) koji uklju uje Smad4; (3)
inhibitorni ili antagonisti ki Smad proteini (I-Smads) koji uklju uju Smad6 i Smad7. Vezivanje
TGF
za svoje receptore aktivira signalne puteve transdukcije signala koji prozrokuju
oligomerizaciju i fosforilaciju Smad1 proteina . Smad1 je receptorom-regulisani Smad protein i
aktivira se preko BMP tip I receptora-kinaze.
R-Smads imaju dva domena, MH1 i MH2, koji su odvojeni fleksibilnim vezivnim regionom (Slika
4.2.). N-terminalni MH1 domen sadri specifi an DNK-vezuju i segment, kao i sekvencu koja se
zove signal za nuklearnu lokalizaciju (engl. Nuclear Localization Signal - NLS) i koja je
neophodna za transport proteina u nukleus. Kada je R-Smad u nefosforilisanom stanju, NLS je
maskirana, a MH1 i MH2 domeni su asocirani u takvom maniru da ne mogu da se veu za DNK
niti za co-Smad. Fosforilacija tri serinska ostatka blizu C-treminusa R-Smada (Smad2 i Smad3)
aktiviranim TGF receptorom tipa I razdvaja domene i dozvoljava vezivanje importina za NLS.
Nakon toga se u citosolu simultano formira kompleks od dve Smad3 molekule (ili Smad2
molekule) i jedne co-Smad (Smad4) molekule. Kompleks se stabilizuje vezivanjem fosforilisanih
serina na svakom Smad3 za fosfoserin-vezuju a mesta na MH2 domenima i Smad3 i Smad4
molekula. Vezani importin
onda posreduje translokaciju heteromernih R-Smad/co-Smad
kompleksa u nukleus. Nakon to se importin
disocira unutar nukleusa, Smad2/Smad4 ili
Smad3/Smad4 kompleksi kooperiu sa drugim transkripcionim faktorima u cilju aktivacije
transkriptcije specifi nih gena.
U nukleusu se R-Smads kontinuirano defosforilie, to rezultira disocijacijom R-Smad/co-Smad
kompleksa i eksportovanjem ovih Smad proteina iz nukleusa. Zbog kontinuiranog

115

nukleocitoplazmati nog kretanja tamo-ovamo, koncentracija aktivnih Smad proteina u nukleusu

blisko reflektuje nivo aktiviranog TGF receptora na povrini elije.
Skoro sve elije sisara sekretuju makar jedan
izoformu TGF i ve ina elija ima TGF receptor
na svojoj povrini. Medjutim, s obzirom da razli iti
tipovi elija imaju razli ite setove transkripcionih
faktora sa kojima aktivirani Smad proteini mogu
da se veu, intracelularni odgovori indukovani
vezivanjem TGF se razlikuju izmedju tipova
elija. Na primer, u epitelijalnim elijama i
fibroblastima TGF ne indukuje samo ekspresiju
proteina ekstracelularnog matriksa (kolagena)
nego i proteina koji inhibiu serumske proteaze
koje bi u protivnom degradirale ekstracelularni
matriks. Jedna od serumskih proteaza je i
inhibitor aktivatora plazminogena 1, PAI-1 (engl.
Plazminogena Activator Inhibitor 1 PAI-1).
Transkripcija PAI-1 gena zahteva formiranje
kompleksa transkripcionoog faktora TFE3 sa
Smad3/Smad4 kompleksom i vezivanje svih ovih
proteina za specifi nu sekvencu u okviru
regulatornog regiona PAI-1 gena (Slika 4.2.).
Slika 4.2. TGF -Smad singalni put.
1A U nekim elijama se TGF vee za tip III TGF recpetora (RIII) koji ga
prezentuje receptoru tipa II (RII). 1B U drugim elijama se TGF vee direktno za
RII koji je konstitutivno fosforilisana i aktivna kinaza. 2 Ligand-RII regrutuje i
fosforilie jukstamembranske segmente receptora tipa I (RI), koji ne vee direktno
TGF . Ovo oslobadja inhibicije RI kinaznu aktivnost koja je ina e zatvorena izmedju
RI segmenata izmedju membrane i kinaznog domena. 3 Aktivirani RI potom
fosforilie Smad3 (prikazano na slici) ili neki druigi R-Smad protein, prouzrokuju i
konformacione promene koje omogu avaju dostupnost skevence za nuklearnu
lokalizaciju (NLS). 4 Dve fosforilisane Smad3 molekule interaguju sa co-Smad
(Smad4) proteinom koji nije fosforilisan i sa importinom (Imp- ) i formiraju veliki
citoslolni kompleks. 5 i 6 nakon translociranja celokupnog citosolnog kompleksa u
nukleus Ran-GTP prouzrokuje disocijaciju Imp- . 7 Nuklearni transkripcioni faktor
(npr. TFE3) se asocira sa Smad3/Smad4 kompleksom formiraju i aktivacioni
kompleks koji se kooperativno vee sa preciznom geometrijom za regulatornu
sekvencu ciljnog gena. U donjem delu slike je prikazan aktivacioni kompleks za gen
koji kodira inhibitor aktivatora plazminogena 1 (PAI-1).

116

Pridruivanjem sa ostalim transkripcionim faktorima, kompleksi Smad2/Smad4 i Smad3/Smad4

indukuju ekspresiju proteina kao to je p15 koji zarobljava/zaustavlja elijski ciklus u G1 fazi i
time blokira proliferaciju. Ovi Smad kompleksi takodje vre represiju transkripcije myc gena, te
time redukuju ekspresiju mnogih gena koji favorizuju rast, a ija je transkripcija normalno
aktivirana Myc proteinom. Razli iti faktori rasta u TGF superfamiliji se vezuju za svoje sopstvene
receptore i aktiviraju razli ite setove Smad proteina, te time aktiviraju razli ite elijske odgovore.
Specifi nost koja se ispoljava medju ovim sli nim receptorima je uobi ajeni fenomen u
intracelularnoj signalnoj transdukciji, a TGF je izvanredan primer jedne strategije u ostvarivanju
takve specifi nosti odgovora. Na primer, vezivanje bilo koje izoforme TGF za specifi ni receptor
vodi fosforilaciji Smad2 ili Smad3 proteina, formiranju Smad2/Smad4 ili Smad3/Smad4
kompleksa i eventualno aktivaciji transkripcije specifi nih ciljnih gena (npr. PAI-1). Sa druge
strane, BMP protein, koji takodje pripada TGF superfamiliji, se vezuje i aktivira razli ite setove
receptora, to prouzrokuje fosforilaciju Smad1 proteina, njegovu dimerizaciju sa Smad4 i
aktivaciju specifi nih transkripcionih odgovora preko Smad1/Smad4 kompleksa. Ovi mehanizmi
aktivacije transkripcije se razlikuju
od
mehanizama
preko
kojih
Smad2/Smad4 i Smad3/Smad4
aktiviraju transkripciju.

Slika 4.3. Model Smad-zavisnog signalnog puta

aktiviranog preko TGF .
Uo iti da je TGF dimer i da se Smad otvara da bi
ispoljio povrinu za dimerizaciju kada su fosforilisane.
Nekoliko karakteristika puta nije prikazano radi
jednostavnosti: (1) RI i RII su dimeri. (2) RI je
normalno asociran sa inhibitornim proteinom koji se
disocira od RI kada je on fosforilisan od strane RII. (3)
Individualni Smad proteini su trimeri. (4) Protein za
usidravanje koji se naziva SARA (engl. Smad Anchor
for Receptor Activation) pomae pri regrutovanju
Smad2 ili Smad3 za aktivaciju RI, i to tako to se vee
za RI, za Smad proteine i za inozitol fosfolipidne
molekule u plazma membrani. (5) funkcija odredjenih
Smad proteina je regulisana enzimima koji poja avaju
ubikvinaciju, a time i njihovu degradaciju.

117

4.1.4. Onkoproteini i I-Smad proteini reguliu Smad-signaling preko negative povatne

sprege
TGF -4 je negativni regulator proliferacije epitelijalnih elija mle nih lezda. Regulie normalan
razvoj duktusa i alveoa u mle noj lezdi i uklju en je u postlaktacionu involuciju. Visok nivo
ekspresije TFG in vivo spre ava formiranje tumora mle nih lezda, sugeriu i time veoma
zna ajnu ulogu ovog faktora rasta u formiranju, razvoju i funkciji mle nih lezda. Kao to je
navedeno, TGF signali se transdukuju preko RI i RII tipa receptora do intracelularnih signalnih
medijatora Smad2 i Smad3 proteina. Pored navedenih puteva regulacije, Smad signaling je
dodatno regulisan intracelularnim proteinima, uklju uju i citosolne proteine koji se zovu SnoN i
Ski (Ski ozna ava Sloan-Kettering Cancer Institute) i koji su negativni regulatori TGF
signalinga. Ovi proteini su originalno identifikovani kao onkoproteini zbog toga to prouzrokuju
abnormalnu proliferaciju elija kada su overekspresovani u kulturi fibroblasta. Ski je prvobitno
otkriven kao onkogen prisutan u Sloan-Kettering virusu. Potom su otkriveni Sno i njegove
izoforme SnoN, SnoA i SnoI. SnoN i Ski su strukturalno i funkcionalno visoko homologi proteini.
Oni su sposobni da indukuju transformaciju fibroblasta i diferencijaciju mii a pile eg embriona.
Pored toga, snoN+/- ili ski+/- heterozigotni mievi ispoljavaju pove anu osetljivost ka
tumorogenezi, to ukazuje da ovi proteini imaju tumor-supresorsku funkciju. Razli iti efekti SnoN
i/ili Ski mogu biti povezani sa njihovom sposobno u da reguliu transkripciju. Oni se vezuju
direktno za korepresor nuklearnih hormonskih receptora (engl. nuclear hormone receptor
corepressor), ili korepresor SMRT (engl. Silencing Mediator of Retinoid and Thyroid receptors),
kao i mSin3A korepresor, te na taj na in formiraju komplekse sa histon deacetilazom (engl.
Histone DeACetylase - HDAC) to im omogu ava da deluju kao represori transkripcije. Prema
tome, overekspresija ili alternativno odsustvo SnoN i/ili Ski moe poremetiti brojne transkripcione
regulacione puteve u eliji.
SnoN i Ski se vezuju za Smad2/Smad4 ili Smad3/Smad4 signalne komplekse formirane
nakog TGF stimulacije. SnoN i Ski ne remete sposobnost vezivanja Smad kompleksa za
regulatorni region DNK, nego blokiraju Smad kompleksima indukovanu aktivaciju transkripcije,
te na taj na in ine elije rezistentnim na delovanje TGF , odnosno TGF -indukovanu inhibiciju
rasta (Slika 4.4.). Prema tome, SnoN/Ski fukcioniu kao izmenjiva i/prekida i u TGF
signalnoj transdukciji zbog toga to u odsustvu TGF interaguje sa Smad2/Smad4 ili
Smad3/Smad4 signalnim kompleksima i regrutuje kompleks korepresor nuklearnih
receptora/mSin3A/HDAC prema Smad proteinima, te tako inhibie njihovu transaktivacionu

118

sposobnost i represuje TGF signalnu transdukciju. Nakon TGF stimulacije, SnoN se veoma brzo
degradira u ubikvitin-proteazomnom putu posredovanom kompleksom koji favorizuje anafazu u
elijskom ciklusu (engl. Anaphase-Promoting Complex - APC) ili Smurf2 E3 ligazama. Ovo vodi
ka disocijaciji SnoN od Smads proteina i dozvoljava TFG signalu da bude transdukovan sa
povrine elije u njenu unutranjost. Intersantno je da, iako TGF stimulacija prouzrokuje veoma
brzu degradaciju Sno i/ili Ski proteina, nakon nekoliko asova ekspresija oba proteina postaje
veoma snano indukuje, te se smatra da je ovaj fenomen odgovoran za indukcije mRNK SnoN/Ski
nakod produenog tretmana sa TGF . Ovo moe formirati negativnu povratnu spregu i limitirati
TGF efekte. Vano je napomenuti da overekspresija SnoN i/ili Ski rezultira gubitkom TGF indukovanih efekata, to vodi poreme aju u rastu elija i sugerie o potencijalnim mehanizmima
SnoN/Ski-posredovane onkogeneze. Prema tome, regulacija SnoN/Ski proteina ima veoma vanu
ulogu u kontroli TGF aktivnosti u odnosu na
zahteve okruenja elija.

Slika 4.4. ematski model Ski-posredovane down-regulacije odgovora

na TGF sitmulaciju.
Ski se vezuje za Smad4 u Smad2/Smad4 ili Smad3/Smad4 signalnim kompleksima
(nije prikazano) i moe parcijalno da poremeti interakciju izmedju Smad proteina. Ski
takodje regrutuje protein koji se zove N-CoR i koji se vee direktno za mSin3A, koji
potom interaguje sa histon deacetilazom (engl. Histone DeACetilase - HDAC),
enzimom koji favorizuje deacetilaciju histona. Kao rezutat ovoga, isklju uje se
aktivacija transkripcije indukovana preko TGF , a posredovana Smad signalnim
kompleksima. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH
Freeman and Company;videti Stroschein i sar. (1999), Science 286:771.).

Pored aktivacije navedenih Smad proteina, TGF stimulie i indukcju I-Smad proteina, a posebno
Smad7 proteina. Smad7 blokira sposobnost aktiviranog RI receptora da fosforilie R-Smad
proteine. Na ovaj na in se Smad7, kao i Ski i SnoN, uklju uje u negativnu povratnu spregu, pri
emu njegova indukcija, prilikom produene stimulacije sa TGF inhibie intracelularni TGF signaling, a time i elijske odgovore/efekte koje on pokre e.

4.1.5.

Gubitak TGF signalinga u estvuje u indukciji abnormalne proliferacije

malignim transformacijama elija

elija i

Mnogi humani tumori imaju inaktivne mutacije ili TGF receptora ili Smad proteina , te su prema
tome rezistentni na inhibiciju rasta prouzrokovanu sa aktivacijom TGF signalinga (Slika 4.5.).

119

Na primer, ve ina pankreasnih kancera ima deleciju gena koji kodira Smad45, tj. tzv. DPC gen, te
prema tome nije sposobno da inhibie p15 ili
druge inhibitore elijskog ciklusa kao odgovor
na TGF . Mutacije koje prouzrokuju gubitak
funkcija ili TGF receptora ili Smad proteina
favorizuju
proliferaciju
i
u estvuju
u
invazijama i metastazama tumorskih elija
(Slika 4.5.). Retionoblastomi, gastri ni kanceri,
kanceri kolona, kao i neke malignacije T i B
elija takodje nemaju sposobnost da odgovore
na TGF signale. Ovaj gubitak sposobnosti
odgovora korelie sa gubitkom ekspresije TGF
receptora tipa I i II, a ponekada se moe
nadomestiti overekspresijom proteina koji
nedostaje, tj. nije ekspresovan. Pored toga,
mutacija Smad2 proteina se esto deava u
humanim kancerima. Nije samo TGF
signaling neophodan za kontrolu proliferacije
elija,
nego
njegova
koordinisana
komunikacija sa drugim signalnim putevima,
to prouzrokuje da se neke elije usmeravaju
ka diferencijaciji na specifi an na in. Prema
tome,
aktivacija
TGF
signalnog
puta
generalno inhibie proliferaciju
elija, a
gubitak/nedostatak razli itih komponenti ovog
puta u estvuje u indukciji abnormalne
proliferacije
elija
i
malignim
transformacijama.
Slika 4.5. Efekat gubitka TGF signalinga.
Vezivanje TGF , fakora koji inhibie rast, prouzokuje aktivaciju Smad
transkripcionih faktora. U odsustvu TGF signalinga ili zbog mutacije receptora
ili mutacija Smad proteina, pove ava se elijska proliferativnost i invazivnost.

Gen koji nosi deleciju za Smad4 i definie mutaciju je nazvan DPC gen, tj. gen izbrisan/ise en u pankreasnom kanceru (engl. Deleted in
Pancreatic Cancer DPC).

120

Tabela 4.2. Faktori rasta i inhibitori faktora rasta kod ki menjaka

HORMON

EGF familija: Jedan peptidni lanac

EGF
TGF
NDF
Epiregulin
ARIA

IZVOR

DEJSTVO

Pljuva ne lezde
Vie izvora
Vie izvora
Vie izvora
vanove elije

Proliferacija epitela; nezavisno usidrenje; neovaskularizacija

Kao prethodno
Epitelijalna proliferacija kod sisara
Proliferacija fibroblasta
Indukcija Ach receptora

TGF familija: Identi ni ili homologi dimeri

TGF s
Mller-ova inhibitorna supstanca
Inhibin / aktivin

Svuda prisutan
Testisi sisara
Gonade i hipotalamus

Kotani morfogenetski protein

Vie izvora

Inhibie proliferaciju epitelijalnih i imunih elija; indukuje

mezoderm
Regresija Mller-ovih kanala kod mukog pola
Inhibicija FSH sekrecije; spermatogeneza
Osteogeneza; kotana reparacija; formiranje embrionalne ose;
gradijenti nervnog sistema

Trombociti
Nervna tkiva i vaskularna
glatka muskulatura

Proliferacija vezivnog tkiva; tkivna reparacija

Vaskularni endotelijalni mitogen;
pove ava vaskularnu permeabilnost

Vie izvora
Vie izvora
Ovarijum
Testis

GH-zavisni rast hrskavice; parakrini faktor rasta

Rast fetusa
Inhibicija uterusnih kontrakcija; izduivanje interpubi nog
ligamenta i smekavanje cerviksa
Sputanje testisa u skrotum

Vie izvora
Stroma epitela

Razvoj nervnog, skeletno-mii nog, integumentnog,

kardiovaskularnog i respiratornog sistema
Mitogen epitelijalnih elija

Mozak, srce, slezina

Mozak, srce
Mozak, srce, bubrezi, jetra i timus

Opstanak, uve anje i diferencijacija nervnog sistema;

prvenstveno dorzalnog korena i paravertebralnih ganglija
Kao prethodno; prvenstveno dorzalnog korena i nodalnih ganglija
Kao prethodno; uklju uju i sve tri ganglije

PDGF familija: Identi ni ili homologi dimeri

PDGF
VEGF
Insulinska familija: Intaktni ili prese eni
peptidni lanci
IGF-I
IGF-II
Relaksin
INSL3
FGF familija: Jedan peptidni lanac
FGF
KGF(FGF-7)
NGF familija: Peptidi
NGF
BDNF
NT-3
Hematopoetski faktori rasta: Glikoproteini
eritropoetin
CSFs
IL-3
SCF
Trombopoetin
Meoviti faktor
Retinoi na kiselina

bubrezi
Endotel, T elije, fibroblasti i
makrofagi
T elije pomo nice
Vie izvora
U jetri

Proliferacija progenitorne elije eritrocita

Proliferacija progenitorne elije leukocita
Proliferacija multilinijskih kolonija
Proliferacija hematopoetskih elija(prvenstveno mastocita),
germinativnih elija i melanoblasta
Proliferacija progenitorne elije etrombocita
Epitelijalna diferencijacija

(Preuzeto iz Bolander F.F. (2005): Molecular Endocrinology. Elsevier Academic Press.)

121

4.2. CITOKINSKI RECEPTORI I JAK/STAT SIGNALNI PUTEVI

Pord GPCR klase receptora, druga velika klasa receptora na povrini elije su citokinski
receptori iji je citosolni domen veoma blisko asociran sa jednim lanom familije citosolnih
tirosin kinaza, JAK kinazom (engl. JAnus Kinase). Tre a klasa receptora su receptori tirozin
kinaze (engl. Receptor Tyrosine Kinases - RTKs) iji citosolni domen ima aktivnost tirozin kinaza,
te se stoga ovi receptori zovu tzv. receptori sa unutranjom enzimskom aktivnosti. Mehanizmi
kojima se ligandom aktiviraju citokinski receptori i receptori tirozin kinaze su veoma sli ni i
postoji zna ajno preklapanje u intracelularnim putevima transdukcije signala koji se uklju uju
aktivacijom receptor obe klase. U narednoj sekciji e biti opisane neke sli nosti u signalnim
putevima koji se aktiviraju ukoliko su ligandi vezani za receptore ove dve klase.

4.2.1. Citokinski receptori i receptori tirozin kinaze imaju mnoge zajedni ke

karakteristike signalinga
Vezivanje liganda za citokinske receptore, kao i RTKs inicira formiranje fukcionalnog dimernog
receptora. U nekim slu ajevima, ligand indukuje
asocijaciju dve monomerne subjedinice receptora koje
difunduju jedna prema drugoj u ravni plazma
membrane (Slika 4.6.).

Slika 4.6. Dimerizacija receptora za EGF, receptora sa

tirozin kinaznom aktivnosti.
A ematski prikaz poloaja ekstracelularnih i transmembranskih domena EGF
receptora. Vezivanje jedne EGF molekule za monomerni receptor prouzrokuje
izmenu strukture petlje loicirane izmedju dva EGF-vezuju a domena
monomernog receptora. Dimerizacija dva identi na monomerna receptora koja
su prethodno vezala ligand se odvija u ravni membrane i to interakcijom
prvenstveno dva aktivirana segmenta sa petljama. B Struktura
ekstracelularnih domena dimernog EGF receptora koji su vezali TGF , homolog
EGF . Uo iti interakciju izmedju dva aktivirana segmenta sa petljama.

122

U nekim drugim slu ajevima, receptor je dimer i u odsustvu liganda, a vezivanje liganda menja
konformaciju ekstracelularnih domena obe subjedinice. Bez obzira da li je monomer ili dimer, u
svakom slu aju, formacija funkcionalnog dimernog receptora prouzrokuje da jedna slabo aktivna
citosolna kinaza fosforilie ta no odredjene tirozinske ostatke na delu molekule druge kinaze koji
se zove aktivaciona usna. Fosforilacija tirozina u aktivacionoj usni, aktivira kinaznu aktivnost
pomenute kinaze i vodi aktivaciji druge kinaze u dimeru, kao i nekoliko tirozin kinaznih ostataka
u citosolnom domenu receptora (Slika 4.7.). Kao to e biti opisano i kasnije, fosforilacija ostataka
u aktivacionoj petlji je generalni mehanizam kojim se aktiviraju mnoge kinaze.

Slika 4.7. Generalna struktura

ligandom-indukovane aktivacije RTKs i citokinskih receptora.
1 Citosolni domen RTKs ima
kataliti ko mesto proteina tirozin
kinaze, dok je citosolni domen
citokinskih receptora asociran sa
odvojenom JAK kinazom. 2 U
oba tipa receptora, vezivanje
liganda prouzrokuje konformacione promene koje favorizuju
formiranje funkcionalnog dimernog receptora, pribliavaju i ili
dva domena koja imaju
kataliti ku atkivnost tirozin kinaze (RTKs) ili dva citosolna
domena koja su asocirana sa
JAK kinazama (citokinski receptori). Ovi priblieni domeni potom fosforiliu jedan drugi na
mestima tirozinskih ostataka na
aktivacionoj usni. 3 Fosforilacija prouzrokuje da se usna pomera iz kataliti kog mesta kinaze, te to dozvoljava da se ATP ili
proteinski supstrat veu. Aktivirana kinaza potom fosforilie
druge tirozinske ostake u citosolnom domenu receptora. Dobijeni fosforilisani tirozini funkcioniu
kao mesta za pristajanje (engl.
docking sites) razli itih proteina
koji u estuvuju u transdukciji
signala.

123

Odredjeni fosfo-tirozinski ostaci formirani u aktiviranim citokinskim receptorima ili RTKs imaju
funkciju mesta za vezivanje, ili za pristajanje (engl. docking sites), SH2 domena (engl. Src
Homology 2 domains) ili PTB domena (engl. PhosphoTyrosine Binding domains), koji su prisutni
u irokom spektru intracelularnih signal-transdukcionih proteina. Vezivanje ovih domena za
fosfotirozine specifi ne sekvence aktiviranih receptora prouzrokuje fosforilaciju nekih proteina koji
estvuju u transdukciji signala. Ova fosforilacije se ostvaruje ili citosolnim delom molekule
receptora koji ima tirozin kinaznu kataliti ku aktivnost (RTKs) ili citosolnim delom molekule
receptora koji je asociran sa kinazom (citokinski receptori). Fosforilacija signal-transdukcionih
proteina prouzrokuje njihovu aktivaciju i vezivanje drugih signal-transdukcionih proteina koji su
prisutni u citosolu nestimulisane elije, te ih tako pozicionira blizu njihovih supstrata koji su
lokalizovani u plazma membrani ili aktivira dalje puteve transdukcije signala.
Neki citokinski receptori (npr. IL-4 receptor), kao i neki RTKs (npr. insulinski receptor) vezuju
IRS-16 ili neki drugi protein koji ima vie mesta za pristajanje (engl. multidocking protein)
preko PTB domena docking proteina. Aktivirani receptor potom fosforilie vezani docking
protein formiraju i na taj na in puno fosforilisanih tirozinskih ostataka na docking proteinu, te
ovi fosforilisani tirozini sada sami po sebi funkcioniu kao docking mesta za SH2, tj. signaltransdukcione proteine koji imaju SH2
domene (Slika 4.8.).

Slika 4.8. Regrutovanje signal-transdukcionih proteina

prema elijskoj membrani preko vezivanja za fosfotirozinske ostatke aktviranog receptora.
Citosolni proteini sa SH2 ili PTB domenima se mogu vezivati za
specifi ne fosfotirozinske ostatke aktiviranog RTKs (prikazano na slici) ili
citokinskog receptora. U nekim slu ajevima su signal-transdukcioni
proteini fosforilisani ili sa receptorskom-unutranjom ili sa receptoromasociranom tirozin kinazom, te se time poja ava njihova aktivnost. Neki
RTKs i citokinski receptori koriste multidocking proteine kao to je IRS1 da bi pove ali broj signal-transdukcionih proteina koji se regrutuju i
aktiviraju. Posledi na receptor- kinazna fosforilacija IRS-1 kreira fosfotirozinske ostatke koji funkcioniu kao dodatna docking mesta za SH2
domene signal-trandukcionih proteina.

6 IRS (engl. Insulin Receptor Substrate - IRS) molekul ima funkciju docking proteina izmedju insulinskog receptora i kompleksne mree
intracelulanih molekula za transdukciju signala koji sadre SH2 domene (engl. Src Homology 2 domains).

124

4.2.2. Citokini uti u na razvoj mnogih tipova elija

Citokini su familija relativno malih, sekretornih proteina (generalno sadre oko 160
aminokiselina) koji kontroliu mnoge aspekte rasta i diferencijacije u specifi nim tipovima elija
(Tabela 4.3.). Na primer, prolaktin tokom trudno e stimulie epitelijale elije koje oblau nezrele
duktuse mle nih lezda da se diferenciraju u acinarne elije koje e produkovati proteine mleka i
sekretovati ih u kanale mle ne lezde. Drugi citokin, interleukin 2 (IL-2) je esencijalan za
proliferaciju i funkcionisanje T elija (T limofocita) imunog sistema, dok je njemu blizak i srodni
citokin, IL-4, esencijalan za formiranje i funkcionisanje efektornih B elija (B limfocita) koje
produkuju antitela. Neki citokini, kao to je interferon , se produkuju i sekretuju od strane
velikog broja razli itih tipova elija, a kao odgovor na virusnu infekciju. Sekretovani interferoni
deluju na susedne elije u parakrinom maniru i indukuju enzime koji ine ove elije rezistentnijim
na virusnu infekciju. Veliki broj citokina u estvuje u aktivaciji, kao i efektornim
mehanizmima imunog sistema (detaljniji opis je mogu e na i u skripti Molekularna i elijska
imunologija, Kosti i Andri , 2007). Pored toga, veliki
broj citokina u estvuje i u hematopoezi, procesu
stvaranja uobli enih elemenata krvi (detaljniji opis je
mogu e na i u skripti Uporedna fiziologija ivotinja,
Andri i saradnici, 2005). Eritropoetin (Epo) je
citokin (moe delovati i u endokrinom maniru, pa se
esto naziva i hormonom) koji indukuje produkciju
eritrocita stimulacijom indukcije proliferacije i
diferencijacije eritroidne progenitorne
elije u
kotanoj sri (Slika 4.9.).

Slika 4.9. Uloga eritropetina u formiranju eritrocita.

Eritroidne progenitorne elije koje se nazivaju eritroidne kolonija-formiraju e jedinice
(engl. Colony Forming Units Erythroid CFU-E) su derivati hematopoetskih pluripotentnih
stem elija koje takodje daju progenitorne elije i za druge tipove elija krvi. U odsustvu
eritropoetina CFU-E elije ulaze u apoptozu tj. proces programirane elijske smrti.
Vezivanje eritropetina za njegov receptor na CFU-E indukuje transkripciju nekoliko gena
koji kodiraju proteine koji spre avaju apoptozu, dozvoljavaju i CFU-E elijama da preive
i da prolaze kroz program od tri do pet zavrnih deoba elije. Eritropoetin takodje
indukuje ekspresiju proteina specifi nih za eritrocite kao to je globin koji potom formira
hemoglobin, kao i membranski protein glikoforin i jono-izmenjiva ki protein. Receptori za
eritropoetin, kao i drugi membranski proteini se gube sa povrine CFU-E elija kada one
ulaze u proces diferencijacije. Ukoliko se CFU-E elije gaje u kulturi sa eritropoetinom u
polu vrstom medijumu (npr. sadri metilcelulozu), elije koje su potomci ne mogu da se
udaljavaju, te svaka CFU-E elija produkuje koloniju od 30-100 eritroidnih elija.)

125

Eritropoetin se sintetie u elijama bubrega koje su monitori, tj. prate koncentraciju kiseonika u
krvi. Hipoksija ili pad koncentracije kiseonika u krvi ispod normalnog nivoa, moe da bude
rezultat smanjenja broja eritrocita ispod optimalnog nivoa, imaju i u vidu da je njihova osnovna
funkcija transport gasova, a prvenstveno kiseonika vezanog za hemoglobin. elije bubrega koje
preko tzv. kiseoni nog senzora (hem protein) registruju pad kiseonika u krvi odgovaraju tako to
indukuju aktivaciju kiseonik-senzitivnog transkripcionog faktora ili hipoksijom-indukovanog
faktora, HIF-1 (engl. Hypoxia Induced Factor 1). Nedostatak kiseonika na senzoru aktivira
intermedijere (X) koji potom stimuliu pove anu produkciju obe subjedinice HIF-1
transkripcionog faktora. HIF-1 aktivira transkripciju gena koji kodiraju proteine koji posreduju
kratkotrajne i dugotrajne odgovore na deficit kiseonika. HIF-1 aktivira razli ite ciljne gene u
razli itim elijama ukazuju i time da verovatno deluje u kombinaciji sa drugim proteinima koji
reguliu transkripciju gena (Slika 4.10).
Slika 4.10. Model signalnih puteva
koji se uklju uju kao odgovor na
hipoksiju, a posredovani su HIF-1.
Lokalna koncentracija kiseonika se
registruje verovatno kiseoni nim senzorom
koji zahteva hem-asocirane proteine (Sheme). Nedostatak kiseonika na senzoru
aktivira intermedijere (X) koji potom
stimuliu pove anu produkciju obe
subjedinice HIF-1 (engl. Hypoxia Induced
Factor 1). HIF-1 aktivira transkripciju gena
koji kodiraju proteine koji posreduju
kratkotrajne i dugotrajne odgovore na deficit
kiseonika. HIF-1 aktivira razli ite ciljne gene
u razli itim elijama ukazuju i time da
verovatno deluje u kombinaciji sa drugim
proteinima koji reguliu transkripciju gena.
VEGF (engl. Vascular Endothelial Growth
Factor) vaskularni endotelijalni faktor
rasta; iNOS (engl. inducible Nitric Oxide
Synthase) inducibilna azot oksid sintaza;
HO-1 (engl. Heme Oxygenase 1) hem
oksigenaza ; EPO (engl. ErythroPOietin) eritropoetin. (Preuzeto iz Lodish i sar.
(2004): Molecular Cell Biology. WH
Freeman and Company; adaptiorano
od Zhu i Bunn (2001), Science
292:449.).

Kako nivo eritropoetina raste, tako je sve vie i vie CFU-E progenitornih elija spaeno smrti, to
im dozvoljava da produkuju oko 50 ili vie eritrocita u periodu od samo dva dana. Na ovaj na in
organizam moe da odgovara na gubitak krvi ubrzanom produkcijom eritrocita.

126

4.2.3. Svi citokini i njihovi receptori imaju sli nu strukturu i aktiviraju sli ne puteve
signalne transdukcije
Svi citokini imaju sli nu tercijarnu strukturu koju grade etiri duga konzervisana
heliksa ( helikoidna struktura) grupisana zajedno u specifi noj orjentaciji. Sli no, struktura svih
citokinskih receptora je ista. Svi citokinski receptori se sastoje od jednog ili vie
transmembranskih proteina iji je ekstracelularni deo odgovoran za vezivanje citokina, a
citoplazmatski deo je odgovoran za iniciranje signalnih puteva. Ekstracelularni domen je gradjen
od dva subdomena, od kojih svaki ima sedam konzervisanih
lanaca grupisanih zajedno u
specifi nom maniru. Tipi ni putevi signalne transdukcije se aktiviraju ligand-indukovanom
aktivacijom receptora, pribliavaju i citoplazmatske delove jedne ili vie receptornih molekula u
procesu analognom signalingu preko T i B receptora (detaljniji opis je mogu e na i u skripti
Molekularna i elijska imunologija, Kosti i Andri , 2007).
Citokini svoj efekat ispoljavaju vezuju i se sa velikim afinitetom za svoje receptore koji pripadaju
odredjenim strukturnim familijama (Slika 4.11.). Aktivacija receptora stimulie specijalizovane
signalne puteve kao to je npr. JAK-STAT signalni put (Janus tirozin Kinaze u citoplazmi koje
fosforiliu STAT-engl. Signal Transducer and Activator of Transcription). Svi citokinski receptori
su vezani sa jednom ili vie JAKs. Postoje etiri identifikovane JAKs sa definisanom strukturom:
JAK1, JAK2, JAK3 i Tyr2). Na primer, receptori za -interferon su socirani sa JAK1 i Tyr2, dok
su receptori za -interferon asocirani za JAK1 i JAK2 (Tabela 4.3.).
Tabela 4.3. Neki signalni proteini koji deluju preko citokinskih receptora i JAK-STAT signalnog puta
LIGANDI

JAKs UDRuENE sa RECEPTOROM

AKTIVIRANI STATS

NEKI ODGOVORI

-interferon

Jak1 i Jak2

STAT1

Aktivira makrofage; pove ava ekspresiju MHC proteina

-interferon

Tyr2 i Jak2

STAT1 i STAT2

Pove ava otpornost elije na viralne infekcije

Eritropoetin

Jak2

STAT5

Stimulie produkciju eritrocita

Prolaktin

Jak1 i Jak2

STAT5

Stimulie produkciju mleka

Hormon rasta

Jak2

STAT1 i STAT5

Stimulie rast indukuju i produkciju IGF-1

GM-CSF

Jak2

STAT5

Stimulie produkciju granulocita i makrofaga

Jak2

STAT5

Stimulie ranu produkciju uobli enih elemenata krvi

IL-3

(Preuzeto iz Alberts i sar. (2005): Molecular Biology of The Cell. Garland Science.

Mievi kojima nedostaje JAK1 ne mogu da odgovaraju na stimulaciju sa interferonima. Receptor

za eritropoetin (stimulie progenitorne elije eritrocita da preive, proliferiu i diferenciraju se) je

127

asociran jedino sa JAK2. Kod mieva kojima nedostaje JAK2 (JAK2-deficitarni mievi) ili je
njegova funkcija poreme ena, nema razvoja eritrocita i oni veoma rano umiru (Slika 4.15.).
Najrasprostranjenija klasifikacija citokinskih receptora zasniva se na strukturalnoj homologiji
ekstracelularnih citokin-vezuju ih domena. Prema ovoj klasifikaciji citokinski receptori su
podeljeni u pet familija (Slika 4.11.).
Tip I citokinski receptori (hemopoetinski receptori), sadre jednu ili vie kopija
domena sa dve konzervisane cisteinske rezdue i membransku proksimalnu sekvencu triptofanserin-X-triptofan-serin (WSXWS), gde X predstavlja bilo koju amino kiselinu. Ovi receptori vezuju
citokine koji nose 4 lanca heliksa. Konzervirana struktura receptora je deo koji vee citokine sa
4 lanca heliksa, dok se specifi nost prema svakom tipu citokina determinie amino kiselinskim
ostacima koji se razlikuju od jednog do drugog receptora. Ovi receptori sadre unikatni lanac
ligand-vezuju eg domena i jedan ili vie tzv. signal-tansducing lanaca (deo molekule receptora
odgovoran za transdukciju/prenos signala) koji je esto isti kod receptora za razli ite citokine
(Slika 4.11A.).
Tip II citokinski receptori su sli ni tip I receptorima u organizaciji ekstracelularnih
domena sa konzervisanim cisteinima,
ali ne sadre WSXWS.
Ovi receptori imaju
jedan ligand vezuju i
polipeptidni lanac i
jedan
lanac
za
signalnu
transdukciju.
Slika 4.11. Strukture citokinskih receptora.
A Receptori za razli ite citokine
klasifikovani su u familije na osnovu
konzervisane strukture ekstracelularnog domena (WSXWS: triptofanserin-X-triptofan-serin); B - Razli iti
citokinski receptori izgra eni su od
specifi nog ligand-vezuju eg lanca
koji se nekovalentno asocira sa
signalnom subjedinicom koja je
zajedni ka za receptore razli itih
citokina.

128

Citokinski receptori koji pripadaju Ig superfamiliji imaju ekstracelularni

imunoglobulinski (Ig) domen. Ovi receptori vezuju raznolike tipove citokina ime se aktiviraju
razli iti mehanizmi signalne transdukcije.
TNF receptori pripadaju familiji receptora (u kojoj neki lanovi nisu citokini) sa
ekstracelularnim domenima bogatim cisteinima. Vezivanje liganda uslovljava da receptor aktivira
intracelularne proteine sa kojima je asociran, a koji indukuju apoptozu i/ili stimuliu ekspresiju.
GPCR (engl. G-Protein Coupled Receptors) ili receptori koji -heliksom sedam puta
prolaze/presecaju (engl. seven-transmembrane -helical receptors) elijsku membranu se jo
nazivaju i serpentinski receptori izbog toga to njihov transmembranski domen ima oblik zmije i
sedam puta prolazi napred, nazad od spoljanje do unutranje strane membrane i obratno. Naziv
GPCR poti e od toga to njihov signalni put uklju uje vezivanje GTP-vezuju ih proteina tzv. Gproteina. Genom sisara kodira veliki broj ovakvih receptora koji su uklju eni u prenoenju signala
iz elijskog okruenja. U imunom sistemu pripadnici ove klase receptora posreduju brze i prolazne
(tranzijentne) odgovore na citokine iz familije hemokina.
Citokinski receptori takodje mogu biti grupisani prema putevima signalne transdukcije koje
aktiviraju (Tabela 4.4.). Ovakvo grupisanje esto korelira sa strukturnom homologijim u
citoplazmatskom domenu signalnog lanca receptora. Drugim re ima, lanovi familije definisani
prema ekstracelularnom domenu, aktiviraju sli ne puteve transdukcije signala u eliji.
Tabela 4.4. Mehanizmi signalne transdukcije citokinskih receptora
PUTEVI SIGNALNE
TRANSDUKCIJE
JAK/STAT put

CITOKINSKI RECEPTOR KOJI

KORISTI DATI SIGNALNI PUT

SIGNALNI MEHANIZAM

Tip I i tip II citokinskih receptora

JAK-posredovana fosforilacija i aktivacija STAT transkripcionih faktora

Signaling TNF receptora

preko TRAF

TNF familija receptora:

TNR-RII, CD40

Vezivanje adapterskih proteina, aktivacija transkripcionih faktora

Signaling TNF receptora

preko tzv. death domena

TNF familija receptora:

TNR-RI, Fas

Vezivanje adapterskih proteina, aktvacija kaspaze

Tirozin kinaze povezane sa

receptorima

M-CSF receptor
Receptor faktora stem elija (SCF)

G protein signaling

Hemokinski receptori

Unutranja aktivnost tirozin kinaze u receptoru

GTP zamena i disocijacija G :GTP od G , G :GTP aktivira razli ite
elijske enzime, ali i neke druge proteine

(preuzeto iz Abbas AK & Lichtman AH (2005): Cellular and Molecular Immunology)

Strukurna homologija izmedju razli itih citokinskih receptora ukazuje da su svi evoluirali od
istog preda kog proteina. Da li elija odgovara ili ne na odredjeni citokin zavisi jednostavno od
toga da li ona ekspresuje ili ne ekspresuje odgovaraju i receptor (engl. cognate receptor). Iako svi
citokinski receptori aktiviraju sli ne signalne puteve, odgovor odredjene elije na citokinski signal

129

zavisi od celokupne konstelacije transkripcionih faktora elije, strukture hromatina, kao i drugih
proteina vezanih za razvojnu istoriju elije. Interakcija eritropetina sa njegovim dimernim
eritropoetinskim receptorom (engl. Erythropoietin Receptor EpoR) je primer vezivanja citokina za njihove receptore (Slika
4.12.).
Slika 4.12. Struktura eritropoetina vezanog za ekstracelularne domene dimernog
eritropoetinskog receptora.
Eritropoetin sadri etiri konzervisana duga
heliksa koja su grupisana u odredjeni aranman.
Ekstracelularni domen eritropoetinskog monomera je gradjen od dva subdomena, od kojih svaki sadri
sedam konzervisanih lanaca grupisanih u karakteristi nom maniru. Ostaci bo nih lanaca dva heliksa
eritropoetina stupaju u kontakt sa petljom na jednom monomeru eritropoetinskog receptora, dok se ostaci
na druga dva
heliksa eritropoetina vezuju u istom maniru za petlju na drugom monomeru
eritropoetinskog receptora, te na taj na in stabilizuju dimernu strukturu receptora. Struktura interakcije
drugih citokina i njihovih receptora je sli na strukturi eritropoetina i njegovog receptora. (Preuzeto iz
Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company; adaptiorano od
Syed i sar. (1998), Nature 39:511.).

Vezivanje citokina ili indukuje receptorne lance da se oligomerizuju ili da se reorijentiu i

formiraju oligomer. I jedno i drugo dovodi do pribliavanja asociranih JAKs dovoljno blizu da bi
mogle da se unakrsno/medjusobno fosforiliu, te time pove avaju aktivnost tirozin-kinaznih
odmena. JAK potom fosforilie tirozine na citokinskom receptoru formiraju i tako fosfo-tirozinske
ostatke koji imaju funkciju docking mesta za STATs i druge signal-transdukcione proteine.
Postoji sedam poznatih STATs (STAT1,STAT2, STAT3, STAT4, STAT5, STAT6 i STAT7), a
svaki od njih ima SH2 domen koji ima dve funkcije. (1) Posreduje vezivanje STAT proteina za
fosfo-tirozinska docking mesta na atkiviranom citokinskom receptoru (ili RTKs). Kada se STAT
vee biva fosforilisan od strane JAK na tirozinskim ostacima, to prouzrokuje njegovu disocijaciju
od receptora. (2) SH2 domeni na oslobodjenom STAT molekulu sada posreduju vezivanje STAT
molkula za fosfo-tirozine drugih STAT molekula, formiraju i tako ili STAT homodimer ili
heterodimer. Potom se STAT dimer translocira u nukleus u kome se, u kombinaciji sa drugim
genskim regulatornim proteinima, vezuje za specifi an region na DNK molekuli, tzv. DNK element
koji odgovara (engl. DNA Response Element - DRE), razli itih gena i stimulie njihovu transkripciju (Slika 4.13.). Na primer, kao odgovor na hormon prolaktin koji stimulie elije mle ne lezde
da produkuju mleko, STAT5 stimulie transkripciju gena koji kodira proteine mleka.
Citokinski receptori aktiviraju odgovaraju e STAT proteine zbog toga to SH2 domeni ovih STAT
proteina prepoznaju jedino specifi ne sekvence fosfotirozinskih docking mesta. Na primer,
aktivirani receptor za -interferon regrutuje i STAT1 i STAT2, dok aktivirani receptor za -

130

interferon regrutuje jedino STAT1. Ukoliko bi se SH2 domen -interferonskog receptora zamenio
SH2 domenom -interferonskog receptora, aktivirani hibridni receptor bi regrutovao i STAT1 i
STAT2, kao i -interferonski receptor sam po sebi.

Slika 4.13.
JAK-STAT
signalni
put
aktiviran
vezivanjem
-interferona
za svoje receptore.
Vezivanje interferona prouzrokuje ili dimerizaciju dva odvojena
polipeptidna lanca (kao to je
prikazano) ili reorjentie receptorne lance da formiraju dimer. U
svakom slu aju, asocirani JAK
molekuli se pribliavaju jedan
drugom tako da mogu da se
medjusobno unakrsno fosforiliu
na mestima gde su tirozinski
ostaci, to pokre e proces
transdukcije signala, odnosno
aktivira signalni(e) put(eve). Dva
razli ita receptorna lanca su
asocirana sa razli itim JAKs
(Tyr2 i JAK1) te tako regrutuju
razli ite STAT molekule (STAT1 i
STAT2). Aktivirani fosforilacijom
STATs se disociraju od receptora
i formiraju heterodimere koji se
translociraju u nukleus gde se
veu za specifi na mesta na
DNK sekvenci (engl. DNA response elements) i zajedno sa drugim genskim regulatornim proteinima indukuju transkripciju gena.

Odgovori posredovani STAT proteinima su esto regulisani negativnom povratnom spregom.

Pored aktivacije gena koji kodiraju proteine koji posreduju citokinima-indukovani odgovor elije,
STAT dimeri mogu takdoje da aktiviraju gene koji kodiraju inhibitorne proteine. U nekim
slu ajevima, inhibitorni protein se vezuje i za aktivirani citokinski receptor i za STAT
proteine, to blokira dalju aktivaciju STAT proteina, i pomae gaenju/prekidu odgovora. Pored
toga, u nekim drugim slu ajevima inhibitorni protein postie isti rezultat blokiranjem funkcije
JAK. Ovi negativni mehanizmi nisu dovoljni sami po sebi da ugase odgovor. Aktivirani JAKs i
STATa se takodje inaktiviu defosforilacijom njihovih fosfo-tirozinskih ostataka. Kao i u svim
drugim putevima signalne transdukcije u kojima se za transdukciju signala koristi fosforilacija
tirozina tirozin kinazama, defosforilacija se ostavuje kataliti kim delovanjem proteina tirozin

131

fosfataza (engl. Protein Tyrosine Phosphatases - PTPs), koje su veoma vane u signalnim
procesima kao i proteini tirozin kinaze koje vre fosforilaciju tirozina.
Kao to je napomenuto, stimulacija citokinskih receptora njihovim specifi nim ligandima aktivira
brojne intracelularne puteve transdukcije signala i svi oni vode ka aktivaciji specifi nih
transkripcionih faktora, prouzrokuju i stimulaciju ili inhibiciju ekspresije odredjenih ciljnih gena.
Na primer, vezivanje eritropoetina za njegov receptor, osnosno aktivacije eritropoetinskog
receptora aktivira brojne intracelularne puteve transdukcije signala koji su sli ni za sve citokine
(Slika 4.14.).

Slika 4.14. Pregled intracelularnih puteva transdukcije signala koji se aktiviraju vezivanjem liganda za eritropetinski receptor (EpoR),
tipi ni citokinski receptor.
etiri velika signalna puta mogu da transdukuju signal od aktiviranog EpoR-JAK (videti donji deo slike 4.7.). Svaki signal-transdukcioni put regulie transkripciju
razli itih setova gena. A U najdirektnijem putu, transkripcioni faktor STAT5 se fosforilie i aktivira direktno u citosolu. B Vezivanje tzv. linker proteina, Grb2 7 ili
Shc8 za aktivirani EpoR prouzrokuje aktivaciju Ras-MAP kinaznog puta. C i D Aktivaciju EpoR prati idukcija dva fosfoinozitidna puta koja se aktviraju regrutovanjem
fosfolipaze C i PI3 kinaze na membranu. Pove an nivo Ca2+ i aktivirana protein kinaza B (PKB) takodje moduliu aktivnost citosolnih proteina koji nisu uklju eni u
regulaciju transkripcije, nego imaju druge funkcije u procesima transdukcije signala ili drugim procesima u eliji.

4.2.4. JAK kinaze asocirane za receptor aktiviraju STAT transkripcione faktore

Ubrzo nakon otkri a i kloniranja citokina, izlovana je i ve ina njihovih receptora razli itim
eksperimentalnim tehnikama. Geneti kim analizama je potvrdjeno da se vezivanjem liganda za
Grb2 protein (engl. Growth factor receptor-bound protein 2) je adapterni protein uklju en u signalnu transdukciju i elijsku komunikaciju. iroko je
ekspresovan i neophodan je za brojne elijske funkcije. Najpoznatiji je po sposobnosti da vezuje epidermalnog faktora rasta tirozin kinazu da bi bila
aktivirana Ras proteinom. Grb2 se sastoji od SH2 domena koji su sa svake strane vezani saSH3 domenima. Grb2 SH2 domeni se vezuju fosfotirozine peptida receptora ili scaffold proteina, i to najpre za pY-X-N-X (X je hidrofobni ostatak kao to je valin). Grb2 N-terminalni SH3 domen se
vezuje za prolinom-bogate peptide i moe da vee Ras-guanin izmenjiva ki faktor SOS (engl. Son Of Sevenless). Grb2 C-terminalni SH3 domen se
vezuje za peptide sa konformacijom motiva P-X-I/L/V-D/N-R-X-X-K-P motiva koja im omogu ava da se specifi no veu sa docking proteine kao
to je Gab-1 (engl. Grb2-associated binder - 1).
8 Shc protein (engl. Src homology and collagen protein) je docking protein koji se fosforilie aktivacijom insulinskog ili sli nih receptora, a potom
vezuje proteine koji imaju SH2 domene, uklju uju i i adapterni protein Grb2.
7

132

citokinske receptore aktiviraju dva klju na signal-transdukciona proteina: JAK kinaza i STAT
transkripcioni faktor. Pokazano je da su jedan (ponekada i dva) od etiri humana JAK proteina i
makar jedan od nekoliko STAT proteina uklju eni u signaling u donjem toku signalnog puta svih
citokinskih receptora. Za razumevanje fukcionisanja JAK i STAT proteina uvek se kao primer
prezentuje, najbolje prou en i razjanjen citokinski signalni put, a to je signalni put koji se
uklju uje nakon aktivacije eritropoetinskog receptora (engl. Erythropoietin Receptor EpoR). Ovaj
signalni put je veoma vaan za formiranje zrelih, funkcionalnih eritrocita, a time i za transport
gasova, odnosno opitmalno snabdevanje svih elija i tkiva kiseonikom. Svi po etni elementi EpoRsignalnog puta (eritropoetin, EpoR, kao i JAK2) su neophodni za formiranje adultnog-tipa
eritrocita koje normalno po inje dvanaestog dana embrionalnog razvi a kod mia. Embrioni mia
kojima nedostaju funkcionalni geni koji kodiraju ili EpoR ili JAK2 (Slika 4.15) ne mogu formirati
adultni-tip eritrocita i esto umiru zbog nesposobnosti da obezbedjuju potrebne i dovoljne koli ine
kiseonika fetalnim organima.
Slika 4.15. Studije sa mutantnim mievima su pokazale da su i eritropoetinski receptor (EpoR) i JAK2 esencijani za razvoj eritrocita.
Mievi kod kojih su oba alela za EpoR i JAK2 gene uklonjena (engl. knocked out) razvijaju se normalno do trinaestog embrionalnog dana, a potom po inju da
umiru zbog anemije uzrokovane nedostakom
eritrocitima-posredovanog
transporta
kiseonika do fetalnih organa. Zatamnjeni deo
kod normalnog tipa embriona (+/+) je fetalna
jetra koja je glavno mesto produkcije eritrocita
u
ovoj
razvojnoj
fazi.
Nedostatak
boje/zatamnjenja kod mutantnih embirona (-/-)
ukazuje na odsustvo eritrocita koji sadre
hemoglobin. Sem toga, mutantni embrioni
izgledaju normalno, to ukazuje da je glavna
funkcija EpoR i JAK2 u ranom razvoju kod
mia da stimuliu produkciju eritrocita.
(Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular
Cell Biology. WH Freeman and
Company; EpoR slike su od Wu i sar.
(1995), Cell 83:59. JAK2 slike su od
Neubauer i sar. (1998), Cell 93:307.).

Kao to je ranije napomenuto, eritropoetin se vezuje simultano za ekstracelularne domene dva

EpoR mononomera (videti sliku 4.12.). Aktivacija EpoR rezultira pribliavanjem JAKs molekula
dovoljno blizu da bi mogle medjusobno da se fosforiliu unakrsnom fosforilacijom na kriti nim
tirozinima aktivacione usne (videti sliku 4.7). Kao i kod drugih kinaza, fosforilacija aktivacionih
usana prouzrokuje konformacione promene koje smanjuju Km za ATP ili supstrat koji treba
da bude fosforlisan, te time pove avaju kinaznu aktivnost. Jedan deo informacija za ovaj
mehanizam aktivacije dobijen je u studijama sa JAK2 mutantima kod kojih su kriti ni tirozini na
aktivacionim usnama mutirani u fenilalanin. JAK2 mutant se normalno vezuje za RpoR, ali ne

133

moe da bude fosforilisan. Ekspresija ovog JAK2 mutanta u eritroidnim elijama u koli inama
ve im nego to je uobi ajeno potpuno blokira EpoR signaling, zbog toga to JAK2 mutant blokira
funkciju normalnog/divljeg-tipa (engl. wild-type) proteina. Ovakav tip mutacije se naziva
dominantna negativna mutacija i prouzrokuje gubitak funkcije ak i u elijama koje nose kopije
normalnog gena (engl. wild-type gene).
Kao to je napomenuto, aktivirane JAK kinaze fosforiliu nekoliko tirozinskih ostataka na
citosolnom domenu receptora. Neki od ovih fosfo-tirozina potom imaju funkciju veznih mesta za
grupu STAT transkripcionh faktora. Svi STAT proteini imaju: (1) N-terminalni SH2 domen kojim
se vezuju za fosfo-tirozine receptornog citosolnog domena; (2) centralni DNK-vezuju i domen; (3)
C-terminalni domen sa kriti nim tirozinskim ostacima. Kada se STAT protein vee za aktivirani
receptor, C-terminalni tirozini se fosforiliu sa asociranom
JAK kinazom. Ovakav aranman osigurava da se u
odredjenim elijama aktiviraju samo oni STAT proteini sa
SH2 domenima koji mogu da se veu za odredjeni
receptorni protein. Fosforilisani STAT disocira spontano od
receptora, a dva fosforilisana STAT proteina medjusobno
formiraju dimere tako to se SH2 domeni svakog od njih
vezuju za fosfo-tirozine drugog
STAT proteina. Zbog
dimerizacije se izlae signal za nuklearnu lokalizaciju ili
nuklearni lokalizacioni signal (engl. Nuclear Localisation
Signal - NLS) (Slika 14.16.), te se STAT dimer translocira u
nukleus, gde se vezuje za specifi ne poja iva ke sekvence
(engl. enhancer sequences) koje kontroliu ciljne gene.

Slika 4.16. JAK-STAT singalni put.

Prate i vezivanje liganda za citokinski receptor i aktivaciju asocirane JAK kinaze, JAK fosforilie
nekoliko tirozinskih ostataka na receptornom citosolnom domenu (videti sliku 4.7.). Nakon to se
inaktivni monomerni STAT protein vee za receptor, fosforilie se aktivnom JAK kinazom.
Fosforilisani STATs spontano disociraju od receptora i spontano se dimeriu. S obzirom da STAT
homodimer ostvaruje dve interakcje izmedju fosfo-tirozina i SH2 domena, iako je za stabilizaciju
receptor-STAT kompleksa dovoljna samo jedna ovakva interakcija, fosforilisani STAT nema
tendenciju da ponovo vee za receptor. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell
Biology. WH Freeman and Company.).

Razli iti STAT proteini aktirivaraju razli ite gene u razli itim elijama. Na primer, u eritroidnim
progenitornim elijama stimulacija eritropetinom dovodi do aktivacije STAT5, a ovaj aktivirani
transkripcioni faktor indukuje pove anu eskpresiju proteina Bcl-x L, koji spre ava programiranu

134

elijsku smrt tj. apoptozu ovih progenitornih elija, te im time dozvoljava da proliferiu i
diferenciraju se u eritroidne elije (videti sliku 4.9.). I ne samo to, mievi kojima nedostaje STAT5
su veoma anemi ni zbog toga to veliki broj progenitornih elija ulazi u apoptozu, ak i u
prisustvu velikih koncentracija eritropoetina. Ovakvi mutantni mievi ipak produkuju malo
eritrocita i preivljavaju jer je eritropoetinski receptor vezan i za druge anti-apoptoti ke puteve koji
ne uklju uju STAT5 (videti sliku 4.14.).

4.2.5. SH2 i PTB domeni se vezuju za specifi nu sekvencu koja okruuje fosfoserinske
ostatke
Kao to je ranije napomenuto, mnogi intracelularni signal-transdukcioni proteini imaju SH2 ili
PTB domene kojima se veu za aktivirani receptor ili neku drugu komponenetu signalinga
(adapterni protein, linker protein, scaffold protein, docking protein itd) koja ima fosforilisane
tirozinske ostatke (videti sliku 4.8.). SH2 domen je dobio svoje puno ime, Src homology 2
doman, zbog svoje homologije sa regionom u prototipu citosolne tirozin kinaze kodirane src
genom. Trodimenzionalne strukture SH2 domena razli itih proteina su vrlo sli ne, ali se svaki
vezuje za odredjenu i preciznu sekvencu aminokiselina koje okruuju fosfo-tirozinske ostatke.
Unikatna sekvenca svakog SH2 domena determinie specifi ne fosfo-tirozinske rezidue koje vee.
Na primer, SH2 domen Src tirozin kinaze se snano vezuje za bilo koji peptid koji sadri etiri
kriti na ostatka osnovne sekvence: pTyr-Glu-GluIle. Ove etiri aminokiseline ostvaruju intimni
kontakt sa peptid-vezuju im mestom u Src SH2 domenu.
Vezivanje li i na umetanje dvokrakog zatvara a (pTyr i Ile
bo ni lanci peptida) u dvokraku duplju u SH2 domenu. Dva Glu
ostatka se veoma tesno fituju i priljubljuju se u i na povrinu
SH2 domena izmedju fosfo-tirozinske duplje i hidrofobnog depa
koji prihvata ostatak Ile (Slika 4.16.).

Slika 4.16. Povrinski model SH2 domena Src kinaze vezanog za peptid koji ima fosfotirozine.
Fosfo-tirozin (Tyr0 i OPO3-) i izoleucin (Ile3) ostaci se uklapaju u dvokraku duplju na povrini SH2 domena. Dva
glutamatna ostatka (Glu1 i Glu2) su vezani za mesta na povrini SH2 domena koja su izmedju dve duplje.
(Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company;videti
Waksman i sar. (1993), Cell 72:779.).

135

Variranje u hidrofobnoj duplji u SH2 domenima razli itih STAT proteina, kao i drugih signaltransdukcionih proteina, dozvoljava im da se veu za fosfo-tirozine vezane za razli ite sekvence,
ra unaju i na razliku u njihovim vezuju im parametrima. Vezuju a specifi nost razli itih SH2
domena je u velikoj meri determinisana C-terminalnim aminokiselinskim ostacima u odnosu na
fosfo-tirozine ciljnog peptida. Suprotno tome, vezuju a specifi nost razli ith PTB domena je
derminisana specifi nim N-terminalnim aminokiselinskim reziduama, i to pet do osam
aminokiselinskih ostataka, u odnosu na fosfo-tirozine ciljnog peptida. Ponekada se PTB domeni
vezuju za ciljni peptid ak iako tirozin nije fosforilisan.

4.2.6. Signaling od citokinskih receptora je modulsan negativnim signalima

Signalom-indukovana aktivacija transkripcije ciljnih gena na neki dui period moe biti jednako
opasna za eliju kao i jako mala indukcija. Prema tome, elije moraju biti sposobne i osposobljene
da prekinu signal-transdukcioni put veoma brzo ukoliko i iako ekstracelularni signal ostaje
konstantno prisutan. Intracelularnu transdukciju signala od razli itih citokinskih receptora preko
JAK/STAT signal-transdukcionog puta negativno reguliu tri familije proteina: (1) Fosfataze koje
sadre SH2 domene (engl. SH2-containing Phosphatases SHP) (2) Supresori citokinskog
signalinga (engl. Suppressors Of Cytokine Signaling - SOCS) (3) Proteini inhibitori aktiviranih
STAT proteina (engl. Protein Inhibitors of Activated STATs PIAS). U razli itim progenitornim
elijama odredjene klase proteina imaju ulogu da prekinu signalnu transdukciju citokinskih
receptora, jedni u kratkom periodu (meri se minutama), a drugi u duim periodima i trajno.
4.2.6.1. Kratkotrajna regulacija je indukovana SHP1 fosfatazama
SHP1 protein, lan SHP familije proteina, je citoplazmati ni protein tirozin fosfataza (engl. Protein
Tyrosine Phosphatase PTP). SH1 protein ima 2 tandema SH2 domena, kataliti ki domen
fosfataze, kao i C-terminalni rep od oko 100 aminokiselinskih ostataka. Suprotno strukturalno
sli nom SHP2 genu koji je eskpresovan u svim elijama, SHP19 gen je primarno i uglavnom
ekspresovan u hematopeti nim elijama i smatra se da je potencijalni tumor-supresorski gen u
limfomima i leukemijama, zbog toga to antagonizira favorizovanje rasta i onkogeni potencijal
proteina tirozin kinaze. Mutantni mievi kojima nedostaje SHP1 fosfataza umiru zbog preterane

9 Humani SHP1 gen se sastoji od 17 egzona, a DNK je duine oko 17 kb. Ima dva tandema SH2 domena, kataliti ki domen i C-terminalni rep sa
oko 100 aminokiselinskih ostataka.

136

produkcije eritrocita i nekih drugih tipova elija krvi. Analizom ovih mutantnih mieva su prvi put
ponudjene sugestije da SHP1, protein fosfo-tirozin fosfataza, negativo regulie intracelularnu
transdukciju signala od nekoliko tipova citokinskih receptora u nekoliko razi itih tipova
progenitornih elija.
U elijama koje nisu stimulisane citokinima tj. koje se nalaze u stanju mirovanja, SHP1
protein tirozin fosfataza je prisutna u neaktivnoj formi (jedan njen SH2 domen je fizi ki vezan i
maskira, a time i onemogu ava aktivaciju kataliti kog mesta SHP1 fosfataze). Prilikom stimulacije
citokinima, ovaj SH2 domen, koji blokira fosfataznu aktivnost SHP1 proteina, se vezuje za
odredjene i specifi ne fosfo-tirozinske rezidue aktiviranog receptora. Na ovaj na in se iniciraju
konformacione promene koje prouzrokuju da SH2
domen, koji je ranije blokirao i maskirao fosfatazno
mesto SHP1, razmaskirava tj. otkriva fosftazno
kataliti ko mesto SHP1 i pozicionira ga dovoljno
blizu fosforilisanog tirozina u regionu atkivacione
usne JAK koja je asocirana sa receptorom. Ovo
omogu ava da SHP1 defosforilie tirozin na
aktivacionoj usni JAK kinaze, a uklanjanje fosfata
sa ovog tirozina inaktivie JAK kinaznu aktivnost.
Na ovaj na in JAK kinaza ne moe vie da
fosforilie receptor ili druge signal-transdukcione
supstrate (npr. STAT proteine), sve dok se dodatni
citokinski molekuli ne veu za receptor na povrini
elije i iniciraju novu rundu transdukcije signala
(Slika 4.17A.).

Slika 4.17. Dva mehanizma za prekidanje transdukcije signala od

receptora za eritropoetin (EpoR).
A SHP1, protein tirozin fosfataza, je prisutna u neaktivnoj formi u nestimulisanim
elijama. Vezivanje SH2 domena SHP1 proteina za odredjeni fosfo-tirozin aktiviranog
receptora razmaskirava tj. otkriva fosfatazno kataliti ko mesto SHP1 i pozicionira ga
dovoljno blizu fosforilisanog tirozina u regionu atkivacione usne JAK2, to omogu ava
SHP1 da defosforilie tirozin na aktivacionoj usni. Uklanjanje fosfata sa ovog tirozina
inaktivie JAK kinaznu aktivnost. B SOCS proteini, ija je ekspresija indukovana u
ertropoetinom-stimulisanim eritroidnim elijama, inhibiu ili trajno prekidaju sinaling na
dui period. Vezivanje SOCS za fosfo-tirozinske ostatke na EpoR ili JAK2 blokira
vezivanje drugih signal-transdukcionih proteina (levo). SOCS boksevi mogu takodje
naciljati i delovati na proteine kao to je JAK2 preko ubiquitin-proteazomnog puta
(desno). Sli ni mehanizmi reguliu intracelularnu transdukciju signala i od drugih
citokinskih receptora. (Preuzeto iz Lodish i sar. (2004): Molecular Cell Biology.
WH Freeman and Company.).

137

4.2.6.2. Dugotrajna regulacija je indukovana SOCS proteinima

Familiju SOCS proteina ini bar 8 lanova koje karakterie prisustvo centralnog SH2
domena i konzervisane C-terminalne strukture koja je nazvana SOCS kutija ili SOCS boks
(engl. SOCS box). lanovi SOCS familje deluju kao citokinima-indukovani negativni regulatori
citokinskog signalinga. Ovi negativni regulatori se jo nazivaju i CIS proteini (engl. CytokineInduced Suppressors proteins). Pored drugih gena ija transkripcija je indukovana STAT
proteinima, ovi transkirpcioni faktori mogu da indukuju i eksprsiju SOCS/CIS gena. SOCS/CIS
proteini su tzv. immediate-early gene products koji mogu biti indukovani razli itim
citokinima, a preko STAT transkripcionih faktora koji indukuju aktivaciju transkripcije.
Pojedina ne SOCS/CIS mRNK ispoljavaju unikatne tkivno-specifi ne i vremenski-zavisne
odgovore na iroki spektar citokina. Veoma vaan lan SOCS/CIS familije proteina je SOCS-1
protein, jer njegov gen, SOCS-1 gen10, moe biti indukovan razli itim citokinima uklju uju i:
eritropetin, GM-CSF, IL-1, IL-3, IL-6 i IFN- . Ekspresija SOCS1 remeti elijski odgovor na IL-6
preko direktne interakcije i blokiranja JH1 domena aktivirane JAK2 kinaze. Sa druge strane,
CIS protein, lan iste familije inhibitora citokina, je STAT5-indukovani negativni regulator jer
uspostavlja negativnu povratnu spregu vezuju i se za fosfo-tirozine na receptorima za eritropoetin
i IL-3. Na taj na in je onemogu ena i blokirana fosforilacija STAT5, a time i njegova aktivacija, pa
tako i dalji signal-transdukcioni mehanizmi i odgovori koji su indukovani i zavisni od STAT5
transkripcionog faktora.
Generalno, negativni regulatori citokina deluju na dva na ina:. (1) SH2 domeni
nekoliko SOCS proteina se vezuju za fosfo-tirozine aktiviranog receptora spre avaju i tako
vezivanje drugih signal-transdukcionih proteina (npr. STAT transkripcionih faktora) i dalju
transdukciju signala. SOCS1 protein, ija je ekspresija indukovana u eritropoetinom-stimulisanim
eritroidnim elijama, inhibiu ili trajno prekidaju signaling na dugi period. SOCS1 se vezuje za
kriti ne fosfo-tirozine na aktivacionoj usni aktivirane JAK2 kinaze, te tako inhibie njenu kinaznu
aktivnost. Vezivanje SOCS za fosfo-tirozinske ostatke na EpoR ili JAK2 blokira vezivanje drugih
signal-transdukcionih proteina (vidti sliku 4.17B. levo) (2) Svi SOCS proteini imaju domen koji se
zove SOCS boks mogu takodje naciljati i delovati na proteine kao to je JAK2 preko
ubiquitin-proteazomnog puta (videti sliku 4.17B. desno). SOCS boks domeni SOCS proteina
regrutuje kompnenete E3 ubiquitin ligaze (Slika 4.18). Kao rezultat vezivanja SOCS1, JAK2
postaje poliubiquitiran, a potom se degradira u proteazomima (engl. proteasomes), te se na taj

10 Humani SOCS-1 gen je gen od jednog egzona (engl. signle-exon gene) koji kodira 211 aminokiselina i nalazi se izmedju CpG ostrvaca veli ine
2.5 kb (engl. kilobase).

138

na in trajno gase svi signal-transdukcioni putevi posredovani JAK2 kinazom. Ovaj mehanizam je
potvrdjen i eksperimentima u kojima su primenjeni inhibitori proteazoma, a koji su produili
JAK2-posredovanu transdukciju signala.
Istraivanja u kojima su kori ene elijske kuture sisarskih elija pokazala su da je
receptor za hormon rasta (engl. Growth Hormone GH), koji pripada superfamiliji citokinskih
receptora inhibisan tj. down-regulisan SOCS-2
proteinom. Mievi kojima nedostaje SOCS-2 protein
rastu zna ajno vie nego njihovi normalni, wildtype
srodnici,
i
imaju
duga ke
kosti
i
proporcionalno uve anje skoro svih unutranjih
organa, kao i ekstremiteta. Prema tome, SOCS
proteini imaju esencijalnu ulogu negativnog
modulatora u regulaciji intracelularne transdukcije
signala od receptora za eritropetin, receptora za
hormon rasta, kao i receptora za druge citokine.

Slika 4.18. Ubikvitinom-posredovani proteoliti ki put.

A 1 Enzim E1 se aktivira ka enjem molekula ubiquitina (Ub). 2 Aktivirani E1 za
koga je zaka ena molekula Ub prenosi vezani Ub molekul do E2. 3 Ubiquitin ligaza (E3)
vri transfer Ub molekule vezane za E2 na bo ni lanac sa ostakom koji ima amino grupu
(-NH2). Dodatne molekule se dodaju na ciljni protein ponavljanjem koraka 1,2 i 3., te se
tako formira poliubiquitirani lanac koji usmerava ciljni protein prema proteozomu (4). 5 U
okviru ovog velikog kompleksa, ciljni protein se cepa na veliki broj malih peptidnih
fragmenata. B Kompjuterom-generisana slika otkriva da proteazom ima cilindri nu
strukturu sa poklopcima na svakom kraju sredinjeg dela ili jezgra. Poroteoliza
ubiquitinima-etiketiranim proteinima se odvija du unutranjeg zida jezgra.

4.2.7. Mutant receptora za eritropoetin koji ne moe biti down-regulisan, prouzrokuje

pove anje hematokrita
Kod normalnih ena i mukaraca procentualni udeo uobli enih elemenata krvi, od kojih je najvie
eritrocita (hematokrit) se odrava veoma blizu 45-47 procenata. Pad hematokrita rezultira
pove anom produkcijom eritropetina u bubrezima. Pove ani nivo cirkuliu eg eritropetina
prouzrokuje da vie eritroidnih progenitornih elija prolaze kroz terminalnu proliferaciju i
diferencijaciju do zrelih eritrocita, te se veoma brzo uspostavlja normalan nivo hematokrita. U
uslovima napornog vebanja (kao to su sportovi izdrljivosti; npr. maratoni, cross-country

139

skijanje, itd.) kada transport kiseonika do mii a i opskrbljenost mii a dovoljnim koli inama
kiseonika mogu biti limitirani, pove anje u broju eritrocita moe biti dobro reenje, jer omogu ava
bolje snabdevanje kiseonikom. Zbog ovog razloga, kori enje suplemenata eritropoetina za
pove anje hematokrita iznad normalnog nivoa je zabranjeno na mnogim atletskim takmi enjima i
atleti ari se obavezno i regularno testiraju na prisustvo komercijalnog rekombinantog
eritropetina (npr. epoetin ) u njihovim telesnim te nostima (naj e e krvi i urinu). Suplement
eritropoetina ne nudi samo mogu e kompetitivne pogodnosti, nego moe biti veoma opasan.
Previe eritrocita moe prouzrokovati da krv postane troma i inertna i da se zgruava u malim
krvnim sudovima, posebno u mozgu. Nekoliko atleti ara koji su se dopingovali rekombinantnim
eritropoetinom su umrli od modanog udara tokom vebanja.
Otkri e mutanta eritropoetinskog receptora (EpoR) tj. neregulisanog EpoR razjasnilo je sumnjivu
situaciju kada je registrovano da osvaja tri zlatne medalje na Olimpijadi u cross-country skijanju
ima hematokrit preko 60 procenata, iako je testiranje nivoa eritropoetina u njegovoj krvi i urinu
pokazalo manje vrednosti nivoa eritropetina nego to je uobi ajeno. Posledi na analiza DNK
pokazala je da je taj atleti ar heterozigotan za mutaciju na genu koji kodira eritropoetinski
receptor. Mutantni alel kodira receptor koji tzv. okrnjeni receptor (engl. truncated receptor) kome
nedostaje nekoliko tirozina koji se u normalnim uslovima fosforiliu nakon stimulacije sa
eritropoetinom. Kao posledica toga, mutantni receptor je sposoban da aktivira STAT5, kao i
druge signal-transdukcione proteine, ali nije sposoban da vee SHP1 fosfatazu, koja obi no
prekida transdukciju signala (videti sliku 4.17A.). Prema tome, veoma mali nivo eritropoetina, koji
je produkovao pomenuti atleti ar, je indukovao produenu intracelularnu transdukciju signala u
njegovim eritroidnim progenitornim elijama, to je rezultiralo pove anom produkcijom eritrocita
u broju ve em od normalnog. Ovaj in vivo primer zaista uivo ilustruje fino podeavanje nivoa
kontrole i regulacije signalne transdukcije od eritropoetinskog receptora u humanom telu.

140

4.3. RECEPTORI KOJI IMAJU FUNKCIJU TIROZIN KINAZA (RTKs) I AKTIVACIJA Ras PROTEINA
Receptor-tirozin kinaza (RTK) je protein koji ima ekstracelularni domen, za koji se vezuje ligand i
citoplazmati ni domen koji ima aktivnost tirozin kinaze. Ligand za RTK je peptid ili protein u
solubilnoj ili u formi vezanoj za membranu. Ligandi za RTK su npr. faktori rasta (nervni faktor
rasta, NGF; faktor rasta poreklom iz trombocita, PDGF, faktor rasta fibroblasta, FGF, epidermalni
faktor rasta, EGF) kao i insulin. Vezivanje liganda za receptor stimulie tirozin kinaznu aktivnost
molekule, koja dovodi do aktivacije signalnog puta Ras-MAP kinaze, kao i nekoliko drugih
signalnih puteva. Signalni putevi koji se aktiviraju vezivanjem liganda za RTK su uklju eni u
regulaciju irokog spektra razli itih funkcija, uklju uju i regulaciju elijske proliferacije i
diferencijacije, kao i promovisanje preivljavanja elija, i modulaciju elijskog metabolizma11.
U ovom delu teksta e biti opisano kako vezivanje liganda dovodi do aktivacije RTKs, i kako
aktivirani receptor prenosi signale do Ras proteina.
4.3.1. Vezivanje liganda dovodi do transfosforilacije RTK
Svi RTKs se sastoje iz ekstracelularnog domena, koji sadri ligand-vezuju i domen, hidrofobnog
transmembranskog heliksa, i citoplazmati nog domena u okviru koga se nalazi region koji ima
aktivnost tirozin kinaze. Vezivanje liganda za monomerne RTKs, indukuje dimerizaciju receptora.
Neki monomerni ligandi, npr. FGF, se vezuju za heparin-sulfat, negativno naelektrisanu
polisaharidnu komponentu ekstracelularnog matriksa, to stimulie vezivanje za monomerni
receptor i formiranje dimernog ligand-receptor kompleksa. Ligandi za neke RTKs su dimeri, koji
vezivanjem za receptor, dovode u vezu dve monomerne molekule RTK. Nasuprot ovim primerima,
neki RTKs, kao to je receptor za insulin, su u nestimulisanom stanju dimeri povezani
disulfidnom vezom. Vezivanje liganda za ove RTKs, izaziva konformacionu promenu koja aktivira
receptor.
Kinazna aktivnost nestimulisanog receptora je vrlo mala. Aktivacija receptora i formiranje dimera
omogu ava, da jedna subjedinica fosforilie jedan ili vie tirozinskih ostataka, u blizini
kataliti kog mesta susedne subjedinice. Ova transfosforilacija dovodi do konformacione promene

11 Neki RTKs su identifikovani u ogledima na elijama kancera koje su imale mutiranu formu receptora za faktore rasta. Ovakve elije su
proliferisale i u odsustvu faktora rasta. Na primer konstitutivno aktivni mutant Her2, receptor za EGF-sli ne proteine omogu ava nekontrolisanu
proliferaciju elija kancera i u odsustvu EGF-a (koji je neophodan za proliferaciju normalnih elija).

141

koja stimulie vezivanje ATP-a (npr. u slu aju insulinskog receptora) ili vezivanje proteinskih
substrata (kao kod FGF receptora), a uve ana kinazna aktivnost dovodi do fosforilacije i drugih
mesta u citosolnom kataliti kom domenu RTK. Vezivanje liganda za RTK aktivira kinaznu
aktivnost receptora, u maniru, sli nom aktivaciji JAK kinaza povezanih sa receptorima za citokine
(razlika je u lokaciji kataliti kog mesta koje je u slu aju RTK citosolni domen iste molecule, a JAK
kinaze su molekuli odvojeni od citokinskog receptora).
Fosforilisani ostatak tirozina u aktiviranom RTK, postaje vezno mesto za proteine uklju ene u
downstream prenos signala. Mnogi fosfotirozinski ostaci aktiviranog RTK interaguju sa
adapternim proteinima. To su mali proteini koji poseduju SH2, PTB ili SH3 domene, ali nemaju
enzimatsku ili signalnu aktivnost. Ovi proteini povezuju aktivirani RTK sa drugim komponentama
u signalnom putu, npr. sa Ras proteinom.
4.3.2. Aktivacija/inaktivacija Ras proteina
Ras je monomerni protein koji vee GTP, i koji kao i G subjedinica trimernog G proteina, moe
biti u aktivnoj formi, kada vezuje GTP, i neaktivnoj formi vezanoj za GDP.
Aktivacija Ras-a je ubrzana vezivanjem sa GEF (engl. guanine nucleotide exchange factor), koji
se vezuje za Ras GDP kompleks, i izaziva disocijaciju Ras-a od GDP. GTP, koji je u eliji prisutan
u mnogo ve oj koncentraciji nego GDP, se spontano vee za upranjeno mesto, to dovodi do
odvajanja GEF molekule i formiranja aktivnog Ras GTP kompleksa. Hidroliza GTP-a u GDP
deaktivira Ras. Kao i u slu aju G GTP kompleksa, deaktivacija Ras GTP kompleksa zahteva
prisustvo drugog proteina tzv. GAP (engl. GTP-ase-activating protein). GAP se vezuje za Ras GTP
kompleks i vie od 100x ubrzava GTP-aznu aktivnost Ras-a12. U elijama se GAP vezuje za
specifi ne fosfotirozinske ostatke u aktiviranom RTK, dovode i ga blizu Ras GTP kompleksa
povezanog sa membranom. Hidroliza GTP-a je katalisana aminokiselinama iz Ras-a i GAP-a.
Ras, kao i trimerni G proteini, pripadaju familiji intracelularnih proteina koji vezuju GTP tzv.
superfamiliji GTP-aza. Mnoge sli nosti u strukturi i funkciji G i Ras-a, kao i njihovo prisustvo u
svim eukariotskim elijama, ukazuje na pojavu jedne GTP-aze ukju ene u signalnu transdukciju,
vrlo rano u toku evolucije. Takodje, struktura G i Ras-a, je vrlo sli na GTP-vezuju im faktorima,
uklju enim u sintezu proteina, koji se ekspresuju u svim prokariotskim i eukariotskim elijama.
12

Prose an ivotni vek Ras GTP kompleksa je oko 1 minut, to je mnogo due nego trajanje G GTP kompleksa

142

Gen koji je kodirao ovog predka GTP-aza, se u toku evolucije umnoio i evuluirao, tako da humani
genom kodira superfamiliju GTP-aza, koja se sastoji od
stotine razli itih intracelularnih proteina, uklju enih u
regulaciju mnogih aspekata rasta i metabolizma elija.
Funkcija Ras proteina koji se ekspresuje u sisarskim
elijama je vrlo dobro izu ena. Mutirani Ras proteini su
povezani sa mnogim tipovima humanih kancera. Smatra
se da mutirani Ras, koji moe da vee GTP, ali ne moe
da izazove njegovu hidrolizu tj. protein koji je stalno
aktivan, doprinosi neoplasti noj transformaciji. Analiza
trodimenzionalne strukture Ras-GAP kompleksa, je
dovela do otkri a da onkogeni, konstitutivno aktivni Ras
proteini (RasD), sadre mutaciju13 koja onemogu ava
njegovu interakciju sa GAP-om. Nemogu nost vezivanja
GAP-a, odrava Ras u aktivnom stanju vezanom za GTP.
4.3.3. RTK se povezuje sa Ras-om preko adapternog
proteina i faktora razmene guaninskih
nukleotida
Prvi eksperimentalni rezultati koji su ukazali da Ras
funkcionie iza RTK, u zajedni kom signalnom putu, su
dobijeni u ogledima na kulturi fibroblasta, koji su
stimulisani na proliferaciju tretmanom sa PDGF i EGF.
Iniciranje anti-Ras antitela u fibroblaste je blokiralo
proliferaciju, a iniciranje konstitutivno aktivnog Ras
mutanta, RasD mutanta, je izazvalo proliferaciju elija i u
odsustvu stimulacije sa faktorima rasta. Takodje,
stimulacija fibroblasta sa FGF, je dovela do formiranja
aktivnog Ras GTP kompleksa.
Slika 4.19. Aktivacija Ras-a nakon vezivanja liganda za RTKs.

RasD sadri mutaciju u poziciji 12. Zamena glicina, koji se normalno nalazi na ovoj poziciji, sa bilo kojom drugom aminokiselinom (izuzev prolina)
blokira vezivanje sa GAP-om, to ini Ras konstitutivno aktivnim tj. vezanim za GTP.
13

143

Kako stimulacija elija sa faktorima rasta, dovodi do aktivacije Ras-a? Dva citosolna proteina,
GRB2 (engl. growth factor receptor-bound protein 2) i Sos (engl. son sevenless) su klju ni
proteini uklju eni u aktivaciju Ras-a. GRB2 se preko SH2 domena vezuje za specifi ne
fosfotirozinske ostatke na aktiviranom receptoru. GRB2, takodje, poseduje dva SH3 domena,
preko kojih se vezuje za Sos protein, i aktivira ga. Drugim re ima, GRB2 funkcionie kao
adapterni protein za EGF receptore. Sos je protein koji vri zamenu guanin nukleotida (GDP-a sa
GTP-om), tzv. GEF (engl. guanine nucleotide-exchange factor).
4.3.4. Vezivanje Sos proteina za neaktivni Ras izaziva promenu konformacije koja ga
aktivira
Kao to je ve spomenuto, adapterni protein, GRB2, sadri dva SH3 domena preko kojih se vezuje
za Sos (faktor koji ima funkciju izmenjiva a guanin nukleotida), kao i SH2 domen preko koga
ostvaruje vezu sa fosfotirozinskim ostacima RTK molekula. SH3 domeni GRB2 proteina,
selektivno vezuju sekvencu aminokiselina u Sos proteinu, koja sadri veliki broj prolina.
Prolinski ostaci imaju vanu ulogu u interakciji sa SH3 domenom adapternog proteina. Sekvenca
aminokiselina koja je bogata u prolinskim ostacima, omogu ava nastajanje takve konformacije
koja dozvoljava kontakt sa SH3 domenom. Ostaci prolina se
idealno poklapaju (fituju) sa vezuju im depovima na
povrini SH3 domena, i na taj na in stimuliu interakciju.
Nekoliko neprolinskih ostataka, takodje, reaguje sa SH3
domenom. Ostaci ovih aminokiselina su odgovorni za
specifi nost vezivanja. Drugim re ima strategija vezivanja za
SH3 domene je takva da odredjeni ostaci aminokiselina
obezbedjuju strukturni motiv neophodan za vezivanje, a
rezidue susednih aminokiselina odredjuju specifi nost
vezivanja.

Slika 4.20. Model SH3 domena vezanog za peptid koji je bogat prolinom.

144

Nakon aktivacije RTK, formira se kompleks proteina, koji sadri aktivirani receptor, GRB2 i Sos
protein. Aktivacija receptora dovodi do angaovanja Sos-a iz citosola dovode i ga do membrane, tj.
u neposrenu blizinu supstrata (Ras GDP-a vezanog za membranu). Smatra se da C-terminalni
region Sos molekule, inhibie nukleotid-izmenjiva ku aktivnost, i da interakcija sa GRB2
proteinom uklanja tu inhibiciju.
Vezivanje Sos proteina za Ras GDP kompleks, dovodi do konformacione promene na
odgovaraju im segmentima Ras proteina (Switch I i Switch II), koja otvara dep za GDP, i
dozvoljava njegovu difuziju iz depa. S obzirom da je intracelularna koncentracija GTP-a, 10X
ve a od koncentracije GDP-a, GTP e zameniti GDP, i tako aktivirati Ras protein. Vezivanje GTP-a
za Ras, indukuje specifi nu konformaciju Switch I i Switch II segmenata, koja aktivira
downstream efektorne molekule u signalnom putu.

Slika 4.21. Struktura Ras proteina vezanog za GDP, Sos protein i GTP. (a) Switch I i Switch II ne reaguju direktno sa GTP-om u Ras GDP
kompleksu. (b) Jedan heliks Sos proteina se vezuje za oba Switch regiona, izazivaju i masovnu konformacionu promenu Ras proteina. Ova
interakcija pomera Switch I region, to dozvoljava GDP-u da difunduje iz depa. (c) GTP se vezuje za Ras-Sos kompleks i dovodi do promene
konformacije Switch I i Switch II regiona Ras proteina, koja omogu ava vezivanje fosfata GTP-a i pomera Sos, to stimulie interakciju Ras GTP
kompleksa sa efektornim molekulama.

145

4.4. SIGNALNI PUT MAP KINAZE

U sisarskim elijama svi receptori koji imaju funkciju tirozin kinaze (RTKs), kao i ve ina receptora
za citokine koriste visoko konzervisani signalni put, u kome se signal indukovan vezivanjem
liganda, prenosi preko GRB2 i Sos do Ras proteina. Aktivirani Ras, stimulie formiranje signalnog
kompleksa u membrani, koji se sastoji od tri protein kinaze koje su povezane scaffold proteinom.
Ova kaskada kinaza, kulminira aktivacijom MAP kinaze (engl. mitogen activated protein
kinase), serin/treonin kinaze, esto nazivane i ERK (engl. extracellar regulated kinase). Nakon
translokacije u nukleus, MAP kinaza, moe da fosforilie mnoge proteine, uklju uju i i
transkripcione faktore koji reguliu ekspresiju proteina zna ajnih u elijskom ciklusu i u procesu
diferencijacije. Aktivacija MAP kinaze u dve razli ite elije moe da izazove sli ne ili razli ite
elijske odgovore. Takodje, njena aktivacija razli itim hormonima, koji deluju na istu eliju, moe
da dovede do stimulacije istih ili razli itih odgovora.
U ovom delu e prvo biti opisani elementi kaskade kinaza downstream od Ras-a, u RTK-Ras
signalnom putu koji funkcionie u sisarskim elijama, kao i povezivanje drugih signalnih puteva
za sli ne kinazne kaskade.
4.4.1. Signal se prenosi od aktiviranog Ras-a do kaskade protein kinaza
Mnoge analize izvedene na kvascima, kod C. elegans, Drosophila, kao i na elijama sisara su
pokazale postojanje visoko konzervisane kaskade protein kinaza koje se aktiviraju, aktivacijom
Ras-a (slika 4.22.). Aktivni Ras GTP kompleks se vezuje za N-terminalni regulatorni region Raf-a
(serin/treonin kinaza), koju aktivira. Hidroliza Ras GTP-a u Ras GDP, oslobadja aktivni Raf, koji
fosforilie i aktivira MEK (engl. MAP kinase kinase). Aktivni MEK, fosforilie i aktivira MAP
kinazu, takodje serin/treonin kinazu. MEK je kinaza za koju je karakteristi na dvojna
specifi nost tj. ona moe da fosforilie tirozinski ostatak, kao i serinski ili treoninski ostatak
ciljnog proteina tj. MAP kinaze. Aktivirana MAP kinaza fosforilie razli ite proteine, uklju uju i i
transkripcione faktore koji posreduju u razli itim elijskim odgovorima.
Nekoliko tipova eksperimenata je ukazalo da se Raf, MEK i MAP kinaza nalaze iza (downstream)
Ras-a, u signalnom putu. Na primer, mutirani Raf proteini koji nemaju N-terminalni regulatorni
domen, su konstitutivno aktivni, i izazivaju proliferaciju kulture elija u odsustvu stimulacije sa
faktorima rasta. Ovakvi mutanti Raf proteina, su nadjeni u tumorskim elijama, i smatra se da su

146

kodirani onkogenima. Nasuprot ovom, elije koje ekspresuju nefunkcionalan mutant Raf
proteina, ne mogu biti stimulisane na proliferaciju. Takodje, in vitro analize vezivanja su
pokazale da se Ras GTP kompleks vee direktno za N-terminalni regulatorni domen Raf proteina,
aktiviraju i njegovu kataliti ku aktivnost.
Aktivacija MAP kinaze u zavisnosti od aktivacije Ras proteina je pokazana u kulturi elija koje
ekspresuju konstitutivno aktivan RasD protein. Kod ovih elija, MAP kinaza je aktivna, u odsustvu
bilo kakve stimulacije sa faktorima rasta. Biohemijske studije su pokazale da Ras ne moe
direktno da fosforilie, ili da na neki drugi na in aktivira, MAP kinazu. U potrazi za kinazom koja
bi mogla da aktivira MAP kinazu, samo u uslovima stimulacije faktorima rasta, a ne dok su elije
u miru, vreno je frakcionisanje ekstrakta kulture elija. Ovi ogledi su doveli do otkri a MEK
a14, kinaze koja specifi no fosforilie jedan treoninski i jedan tirozinski ostatak MAP kinaze, koja
dovodi do njene aktivacije. Kasnije studije su pokazale da Raf fosforilie serin/treoninski ostatak
MEK-a (na C-terminalnom kataliti kom domenu), izazivaju i njenu aktivaciju. Tako, aktivni
Ras GTP kompleks indukuje kaskadu kinaza, koja uklju uje Raf, MEK i MAP kinazu: aktivacija
RTK
Ras
Raf
MEK
MAP kinaza.

Slika 4.22.
Kinazna kaskada koja prenosi
signale downstream od aktiviranog Ras
proteina do MAP kinaze.

14

Akronim MEK poti e od MAP i ERK kinaze.

147

4.4.1.1.
Aktivacija Raf kinaze
Mehanizam aktivacije Raf proteina se razlikuje od mehanizma aktivacije MEK i MAP kinaza. U
nestimulisanim elijama, Raf se nalazi u citosolu, u konformaciji u kojoj je N-terminalni
regulatorni domen vezan za kinazni domen. Interakcija izmedju regulatornog i kinaznog domena
inhibie kinaznu aktivnost molekule. Ova inaktivna konformacija je stabilisana dimerom 14-3-3
proteina, koji vezuje fosfoserinske ostatke mnogih signalnih molekula. Dimerni 14-3-3 protein se
vezuje za fosfoserine u Raf proteinu, i to tako to je jedan monomer vezan za fosfoserin Nterminalnog domena (fosfoserin 259), a drugi se vezuje u kataliti kom domenu (fosfoserin 621).
Smatra se da je interakcija sa 14-3-3 proteinom klju na za dostizanje konformacionog stanja za
koje moe da se vee aktivni Ras.
Vezivanje Ras GTP kompleksa (vezanog za membranu), za N-terminalni domen Raf-a, uklanja
inhibitornu subjedinicu i izaziva konformacionu promenu, koja dovodi do disocijacije 14-3-3
proteina.
4.4.1.2.
Aktivacija MAP kinaze
Kao i u slu aju aktivacije JAK kinaza, i RTK,
kataliti ko mesto inaktivne, nefosforilisane MAP
kinaze je blokirano nizom aminokiselina (tzv.
aktivacione usne; engl. activation lip), koje se
proteu tako da ine nepristupa nim tirozin (tyr185), koji bi trebalo da bude fosforilisan.
Vezivanje MEK kinaze za MAP kinazu, destabilie
ovakvu konformaciju, to dovodi do promene koja
ini tirozin 185 pristupa an delovanju MEK
kinaze (u inaktivnom stanju ovaj tirozin je
zaklonjen u molekulu MAP kinaze).

Slika 4.23. Molekularna struktura MAP kinaze u neaktivoj (nefosforilisanoj) formi (a) i aktivnoj (fosforilisanoj) formi (b).

Dakle, MEK fosforilie tirozin 185, a zatim i susedni treonin 183. Fosforilisani tirozinski i
fosforilisani treoninski ostaci MAP kinaze, dodatno interaguju sa susednim aminokiselinama
menjaju i konformaciju regiona, koja omogu ava vezivanje ATP-a za kataliti ko mesto kinaze.

148

Fosforilacija ostatka tirozina ima klju nu ulogu ne samo u vezivanju za specifi an proteinski
substrat, nego i za dimerizaciju molekula MAP kinaze, koja je zna ajna za njenu translokaciju u
nukleus. Naime, smatra se da samo dimeri MAP kinaze mogu da se translociraju u nukleus, gde
reguliu aktivnost transkripcionih faktora.
4.4.2. MAP kinaze reguliu aktivnost mnogih transkripcionih faktora koji kontroliu gene
rane faze
Dodavanje faktora rasta (EGF ili PDGF) u kulturu elija
koje se nalaze u Go fazi, izaziva brzo pove anje ekspresije
velikog broja gena (oko 100 razli itih gena). Ovi geni se
nazivaju geni rane faze (primarni geni), zato to se
indukuju pre nego to elije udju u S fazu elijskog
ciklusa, i replikuju svoju DNA. Jedan od zna ajnih gena
rane faze, kodira transkripcioni factor c-Fos. c-Fos
zajedno sa drugim transkripcionim faktorima kao to je
c-Jun, indukuje ekspresiju mnogih gena koji kodiraju
proteine neophodne za razvoj elije u toku elijskog
ciklusa. Ve ina RTKs koji vezuju faktore rasta, koriste
signalni put MAP kinaze za aktivaciju gena, koji kodiraju
proteine kao to su c-Fos.
Regulacija c-Fos gena uklju uje aktivaciju poja iva a
tzv. SRE (engl. serum response element15). Kompleks
poja iva a sadri DNA sekvencu, koja moe da vee
multiple transkripcione faktore.
Slika 4.24. Indukcija transkripcije gena aktivirane MAP kinazom.

Neki od njih su aktivirani MAP kinzom, a drugi drugim protein kinazama koje funkcioniu u
drugim signalnim putevima (npr. PKA u signalnom putu cAMP-a ili PKC u PIP2 signalnom putu).

15

Naziv SRF (serum response element) poti e od injenice da se aktivira mnogim faktorima rasta iz seruma.

149

Kao to je prikazano na slici 4.24. aktivirana (fosforilisana) dimerna MAP kinaza indukuje
transkripciju c-Fos gena, tako to modifikuje dva transkripciona faktora, TCF (engl. ternary
complex factor) i SRF (engl. serum response factor). U citosolu MAP kinaza fosforilie i aktivira
kinazu tzv. p90RSK, koja se translocira u nukleus, gde fosforilie specifi ne serine u SRF proteinu.
Sama MAP kinaza se ,takodje, translocira u nukleus, gde fosforilie specifi ne serine u sastavu
TCF proteina. Fosforilisani TCF, se povezuje sa dva molekula fosforilisanog SRF, i nastaje
trimerna forma, koja se vezuje za SRE segment na DNA. Eksperimentalne dokaze za ovaj model
su obezbedili ogledi na elijama koje ekspresuju negativni dominantni TCF protein (mutirani
molekul kome nedostaje serin koji bi trebalo da bude fosforilisan MAP kinazom). Nedostatak
klju nog ostatka serina, blokira aktivnost MAP kinaze i spre ava ekspresiju gena. Takodje,
biohemijske analize su pokazale da fosforilacija SRF angaovanjem p90RSK, stimulie vezivanje i
pove ava afinitet vezivanja za SRE sekvencu na DNA. Dakle, oba transkripciona faktora su
neophodna za maksimalnu stimulaciju ekspresije gena, nastalu usled delovanja faktora rasta,
preko signalnog puta MAP kinaze.
4.4.3. G protein-zavisni receptori prenose signale do MAP kinaze
Iako se ve ina signalnih puteva MAP kinaze aktivrira preko RTKs ili citokinskog receptora,
signalni putevi koji poti u od drugih receptora, takodje, mogu aktivirati MAP kinazu. Kvasci ili
jedno elijski eukarioti, koji nemaju RTKs ili receptore za citokine, poseduju nekoliko signalnih
puteva MAP kinaze. U daljem tekstu e biti opisan signalni put sparivanja (engl. mating pathway)
zastupljen kod kvasca (S. cerevisiae), koji predstavlja dobro prou en primer povezivanja G proteinzavisnih receptora (GPCR za sekretovane feromone, a i
faktore) sa signalnom kaskadom MAP
kinaze. Feromoni kontroliu sparivanje izmedju haploidnih elija kvasca razli itih tipova (a i ). A
haploidne elije, sekretuju, a faktor parenja, dok na svojoj membrani imaju receptore za factor.
elije sekretuju faktor, a na svojoj membrani ekspresuju receptore za a faktor. Na taj na in
svaki tip elija, prepoznaje faktor parenja produkovan iz elija suprotnog tipa. Aktivacija MAP
kinaza preko a ili
receptora indukuje transkripciju gena, koji inhibiu elijski ciklus, to
onemogu ava sparivanje sa suprotnim elijskim tipom, i formiranje diploidne elije.
Vezivanje liganda za neki od ovih receptora za feromone, dovodi do stimulacije GPCR-a tj.
stimulie reazmenu GDP-a za GTP na G subjedinici, i disocijaciju G GTP od G kompleksa.
Disocirani G kompleks je nosilac fiziolokog odgovora, nastalog usled delovanja feromona na
GPCR-a kvasaca. Ovo je potvrdjeno ogledima na elijama kvasca koje nemaju G subjedinicu, i

150

imaju uvek slobodan G kompleks. Ovakve elije mogu da se pare i u odsustvu faktora za
parenje, tj. proces sparivanja je konstitutivno aktivan. elije koje imaju defektnu, ili uopte
nemaju G ili G subjedinicu, ne mogu da aktivraju signalni put sparivanja.
Disociran
G
kompleks
aktivira kaskadu kinaza,
sli nu onoj kod eukariotskih
elija, downstream od Ras
proteina. G
kompleks je
vezan za membranu preko
subjedinice, a vezuje i
aktivira
Ste20,
protein
kinazu koja fosforilie i
aktivira Ste11, serin/treonin kinazu koja je analogna
Raf i drugim sisa-rskim
MEKK proteinima. Aktivirana Ste11, fosforilie Ste7,
kinazu dvojne specifi nosti
(sli nu MEK) koja fosforilie i
aktivira Fus3, serin/treonin
kinazu koja je ekvivalent
MAP kinazi. Nakon translokacije u nukleus Fus3,
fosforilie transkripcione faktore, koji kontroliu ekspresiju proteina uklju enih u
specifi ne funkcije elija vezane za sparivanje.
Slika 4.25. Kinazna kaskada koja prenosi signale od receptora za faktore sparivanja kod S. cerevisiae.

151

4.4.4. Scaffold proteini izoluju multiple puteve Map kinaza u elijama eukariota
Pored opisanih MAP kinaza, kvasci kao i elije sisara, sadre i druge predstavnike superfamilije
MAP kinaza. To su na primer, sisarska JNKs (engl. Jun N-terminal kinases) i p38 kinaza, koje
postaju aktivne u uslovima stresa, kao i est kinaza koje se ekspresuju u kvascima. Svi ovi enzimi
su serin/treonin kinaze, koje se aktiviraju u citosolu, kao odgovor na specifi an ekstracelularni
signal, a zatim se translociraju u nucleus. Imaju kolektivan naziv MAP kinaze. Aktivacija svih
poznatih MAP kinaza zahteva fosforilaciju tirozinskog i treoninskog ostatka u regionu aktivacione
usne. Takodje, sve eukariotske elije sadre nekoliko pripadnika superfamilije MEK kinaza, koje
fosforiliu razli ite pripadnike superfamilije MAP kinaza. Vezivanje razli itih ekstracelularnih
signalnih molekula stimulie, visoko konzervisan sistem kaskade kinaza, koji kulminira
aktivacijom odredjene MAP kinaze. Drugim re ima razli ite MAP kinaze reguliu razli ite odgovore
elije, uklju uju i morfogenezu, smrt elije i odgovore na stres.
Ipak, razli ite kaskade MAP kinaza imaju i neke zajedni ke komponente. Na primer, kod kvasaca,
Ste11 je zajedni ki signalni molekul, u putevima koji reguliu sparivanje, rast filamenata i
osmoregulaciju, a svaki od ovih puteva aktivira samo jednu efektornu MAP kinazu (na primer,
Fus3 funkcionie kao MAP kinaza u signalnom putu parenja; Kss1 u putu koji regulie rast
filamenata; Hog1 u regulaciji
osmoregulacije.
Sli no,
u
sisarskim elijama, zajedni ki
upstream proteini u estvuju
u aktivaciji multiplih JNK
kinaza.

Slika 4.26. Razli iti signalni putevi MAP

kinaza u S. cerevisiae.

Otkri e zajedni kih elemenata u razli itim signalnim putevima MAP kinaza, je postavilo pitanje
kako se ostvaruje specifi nost elijskog odgovora na odredjene ekstracelularne signale. Ogledi na
kvascima su obezbedili inicijalne dokaze o postojanju proteina koji su specifi ni za odredjeni put
tzv. scaffold proteini (u vrlo slobodnom prevodu proteini skele). Ovi proteini spre avaju
interakciju kinaza odredjenog signalnog puta sa kinazama drugog signalnog puta. Na primer,

152

scaffold protein Ste5 stabilizuje veliki kompleks koji uklju uje Ste11 i druge kinaze u signalnom
putu sparivanja koji na kraju aktivira Fus3 kinazu. Drugi scaffold proteini, koji su vezani za
zajedni ku komponentu, Ste11, stabiliu kompleks proteina uklju enih u signalni put regulacije
filamentacije, ili osmoregulacije. Drugim re ima, u zavisnosti od specifi nog ekstracelularnog
signala formira se veliki kompleks proteina, u kome je prenos signala iza Ste11 proteina,
ograni en na kompleks, koji ograni ava odredjeni scaffold protein.
Iako su scaffold proteini signalnih puteva MAP kinaza, kvasaca i muva, dobro dokumentovani,
postoje poteko e u identifikaciji ovih proteina u sisarskim elijama. Najbolje izu en scaffold
protein je Ksr (engl. kinase suppressor of Ras), koji vezuje MEK i MAP kinaze u Ras-MAP
signalnom putu. Nadjeni su i drugi proteini koji se vezuju za specifi ne sisarske MAP kinaze, tako
da se smatra, da se i u sisarskim elijama specifi nost prenosa signala do odredjenih MAP kinaza,
ostvaruje interakcijom sa razli itim scaffold proteinima.

153

4.5. FOSFOINOZITIDI KAO TRANSDUKTORI SIGNALA - SIGNALNI PUT PI3 KINAZE

U prethodnom tekstu je objanjena signalna transdukcija koja poti e od receptora za citokine i
RTKs, a koja zapo inje formiranjem multiproteinskog kompleksa povezanog sa plazma
membranom. U ovom delu e biti opisano kako ovi recpetori iniciraju signalne puteve koji
uklju uju fosforilisane inozitol lipide vezane za membranu, kolektivno nazvane fosfoinozitidi.
4.5.1. Neki RTKs i receptori za citokine aktiviraju fosfolipazu C
Kao to je ve opisano ranije, stimulacija nekih G protein-zavisnih receptora, aktivira izoformu
fosfolipaze C (PLC ). To je enzim povezan sa membranom koji vri hidrolizu fosfatidilinozitol 4,5bifosfata (PIP2), i tako generie dva zna ajna sekundarna glasnika, 1,2-diacilglicerol (DAG) i
inozitol 1,4,5-trifosfat (IP3). Prenos signala preko IP3/DAG signalnog puta vodi ka pove anju
citosolnog Ca++ i aktivacije protein kinaze C.
Mnogi RTKs i receptori za citokine, takodje, mogu da iniciraju IP3/DAG signalni put, aktivacijom
izoforme PLC. SH2 domeni PLC , se vezuju za specifi ne fosfotirozine aktiviranog receptora,
dovode i enzim u neposrednu blizinu PIP2, substrata vezanog za membranu. Sa druge strane,
kinazna aktivnost receptora, fosforilie tirozinske ostatke na vezanoj PLC to pove ava hidrolaznu
aktivnost. Drugim re ima, RTKs i citokinski receptori stimuliu aktivnost PLC na dva na ina:
lokalizacijom enzima tj. dovode i ga u vezu sa membranom, i fosforilacijom enzima.
4.5.2. Regrutovanje PI-3 kinaze dovodi do aktivacije protein kinaze B
Pored aktivacije IP3/DAG signalnog puta, neki RTKs i receptori za citokine, mogu da iniciraju jo
jedan fosfoinozitidni signalni put, tj. put PI-3 kinaze, regrutovanjem enzima, fosfatidilinozitol-3
kinaze (PI-3) na membranu. PI-3 kinaza je prvi put identifikovana, tako to je purifikovana
zajedno sa nekoliko viralnih onkoproteina. Kada se neaktivna, dominantno negativna, verzija PI-3
kinaze, ekspresuje u elijama zaraenim virusom (virus-transformisanim elijama), inhibie se
nekontrolisana proliferacija elija, karakteristi na za virus-transformisane elije. Ovaj, kao i drugi
nalazi, sugeriu da je normalna kinaza u odredjenim signalnim putevima zna ajna za proliferaciju
elija i za spre avanje apoptoze. Kasniji eksperimentalni rezultati su potvrdili u e e PI-3 kinaze u
signalnim putevima koji reguliu proliferaciju i apoptozu elija. Humani genom kodira 9

154

homologih PI-3 kinaza, od kojih najbolje izu ena sadri p110 subjedinicu, koja ima kataliti ku
aktivnost i p85 subjedinicu sa SH2 domenom.
SH2 domen PI-3 kinaze, se vezuje za
fosfotirozinske ostatke u citosolnom domenu
mnogih aktiviranih RTKs, i receptora za
citokine. Aktivirani receptor angauje PI-3
kinazu, postavljaju i njen kataliti ki domen u
blizinu fosfoinozitidnog supstrata (na citosolnoj
strani
elijske membrane), to dovodi do
nastajanja PI 3,4-bifosfata ili PI 3,4,5-trifosfata.
Ovi PI-3 fosfati, vezani za plazma membranu,
predstavljaju vezno mesto za razli ite signalne
proteine, koji prenose signale u okviru nekoliko
zna ajnih signalnih puteva.
Protein kinaza B (PKB, ili Akt) je
serin/treonin kinaza, koja se vezuje za PI-3
fosfate. Pored kinaznog domena, PKB poseduje
PH domen, preko koga se ostvaruje veza sa 3fosfatom (moe da se vee i za PI 3,4-bifosfat,
kao i za PI 3,4,5-trifosfat). U nestimulisanim
elijama, nivo PI-3 fosfata je mali, i PKB se
nalazi u citosolu u neaktivnoj formi. Nakon
stimulacije receptora, raste koli ina PI-3 fosfata
u
eliji, PKB se translocira na
elijsku
membranu i vezuje za fosfate.
Interakcija sa PI-3 fosfatosfatima se odvija
preko PH domena, to dovodi do konformacione
promene molekula, koja oslobadja kataliti ko
mesto neaktivne PKB, od inhibitornog uticaja
PH domena. Maksimalna aktivacija PKB, zavisi
od angaovanja jo jedne kinaze, koja se
Slika 4.27. Nastajanje fosfatidilinozitol 3-fosfata

155

takodje, preko PH domena vezuje za PI-3 fosfate. To je PDK1 kinaza (engl. phosphoinositidedependent protein kinase 1)16. Obe kinaze (PKB i PDK1), povezane sa membranom preko
interakcije sa PI-3 fosfatima, se difuzijom u ravni membrane, pribliavaju jedna drugoj, to omogu ava njihovu interakciju, tj. PDK1 fosforilie PKB. PDK1 prvo fosforilie ostatak serina u okviru
aktivacione usne PKB.
Za maksimalnu aktivaciju PKB, je potrebna i fosforilacija drugog serina, koji se ne nalazi u
segmentu aktivacione usne. Drugim re ima, aktivnost PKB je regulisana, inhibitornim PH
domenom, kao i delovanjem druge kinaze tj. fosforilacijom. Jednom aktivirana, PKB, se disocira
od plazma membrane i difunduje u citosol gde moe da fosforilie razli ite ciljne proteine.

Slika 4.28. Regrutovanje i aktivacija PKB u signalnom putu PI-3 kinaze.

4.5.3. Receptor za insulin deluje preko signalnog puta PI-3 kinaze

Insulinski receptor je dimerni RTK, koji aktivira Ras-MAP signalni put, koji dovodi do promene u
ekspresiji gena. Aktivacija receptora za insulin, moe, da stimulie i signalni put PI-3 kinaze. U

16 PDK1 kinaza (engl. phosphoinositide-dependent protein kinase 1) uprkos svom imenu ne zahteva fosfoinozitide za efikasnu in vitro fosforilaciju
ve ine supstrata.

156

elijama jetre, mii ima i masnim elijama, aktivacija insulinskog receptora, preko aktivacije PKB,
dovodi do smanjenja nivoa glukoze u krvi i stimulacije sinteze glikogena.
Osnovni mehanizam preko koga insulin smanjuje nivo glukoze u krvi, je stimulacija transporta
glukoze u masne elije i mii ne elije. Ovaj efekat se ostvaruje aktivacijom PKB, koja preko
nepotpuno objanjenog mehanizma, dovodi do premetanja transportera za glukozu tzv. GLUT4,
sa intracelularne membrane na povrinu elije. Intenzivniji transport glukoze u eliju, dovodi do
smanjenja njene koncentracije u krvi.
U jetri i mii ima, insulin stimulie aktivnost glikogen sintaze (GS), koja je odgovorna za sintezu
glikogena od UDP-glukoze. Kada su elije u miru (u odsustvu stimulacije sa insulinom), kinaza
glikogen sintaze 3 (GSK3) je aktivna tj. fosforilie glikogen sintazu, blokiraju i njenu aktivnost.
Aktivacijom insulinskog receptora, aktivira se PKB koja fosforilie i time inhibise GSK3. Inhibicija
GSK3, aktivira sintezu glikogena.
4.5.4. Aktivirana protein kinaza B omogu ava preivljavanje elija aktivacijom nekoliko
puteva
U mnogim elijama aktivirana protein kinaza B, direktno fosforilie proapoptoti ke proteine, kao
to je, na primer BAD (engl. Bcl-2-associated death promoter), i na taj na in spre ava aktivaciju
apoptoti kog signalnog puta, koji dovodi do elijske smrti. Aktivirana PKB je, u elijama mnogih
kultura, uklju ena u spre avanje apoptoze, fosforilacijom tri serinska ili treoninska ostatka
transkripcionog faktora forkhead-1. Ovaj transkripcioni faktor se u nestimulisanim elijama
(bez faktora rasta) nalazi u nefosforilisanom stanju u nukleusu i aktivira transkripciju nekoliko
gena koji kodiraju proapoptoti ke proteine. Kada se u kulturu elija dodaju faktori rasta, PKB
postaje aktivna i fosforilie forkhead-1. Za fosforilisani forkhead-1 se vee fosfoserin-vezuju i
protein 14-3-3, i odvaja ga u citosol17. Nestanak faktora rasta iz kulture, dovodi do inaktivacije
PKB, i do defosforilacije forkhead-1 tj. do favorizovanja apoptoze. Konstitutivno aktivni mutant18
forkhead-1 inicira apoptozu ak i u prisustvu faktora rasta tj. aktivirane PKB.

14-3-3 je isti onaj protein koji zadrava fosforilisani Raf u citosolu. 14-3-3 proteini su familija konzervisanih regulatornih molekula koji se
ekspresuju u svim elijama eukariota. 14-3-3 proteini imaju sposobnost da vezuju razli ite signalne proteine, uklju uju i kinaze, fosfataze, i
transmembranske receptore. Poznato je da vie od 100 signalnih proteina moe da reaguje sa 14-3-3 proteinima.
18 U konstitutivno aktivnom mutantu forkhead-1 proteina su 3 serinska ostatka, koja su mesta fosforilacije sa PKB, zamenjena nekim drugim
aminokiselinama.
17

157

4.5.5. PTEN fosfataza je uklju ena u prekid PI-3 signalnog puta

Kao i druga intracelularna deavanja u procesu prenosa signala, i fosforilacija PI-3 kinazom je
reverzibilna. Fosfataza odgovorna za ovaj proces tzv. PTEN fosfataza (engl. phosphatase and
tensin homolog (mutated in multiple advanced cancers 1)), ima neobi no iroku specifi nost.
Iako je PTEN fosfataza uklju ena u defosforilaciju fosfoserinskih, fosfotreoninskih i
fosfotirozinskih ostataka mnogih proteina, smatra se da je njena glavna funkcija u eliji
uklanjanje 3-fosfata iz PI 3,4,5-trifosfata. Overekspresija PTEN fosfataze u eliji promovie
apoptozu, tako to smanjuje nivo PI 3,4,5-trifosfata, a time i antiapoptoti ki efekat aktivirane
PKB.
elije mnogih agresivnih kancera nemaju gen koji kodira PTEN. Delecija ovog gena vodi ka
nekontrolisanom rastu elija, karakteristi nom za ove kancere. Ove elije imaju povien nivo PI
3,4,5-trifosfata i povienu aktivnost PKB. S`obzirom da aktivirana PKB ima antiapoptoti ki efekat,
gubitak PTEN indirekno smanjuje programiranu elijsku smrt. U nekim elijama, kao to su stem
elije nervne kreste, nedostatak PTEN-a ne samo to spre ava apoptozu, nego stimulie elijski
ciklus i dovodi do ubrzane proliferacije. Zna aj PTEN-a u kontroli razvoja nervnog sistema,
ilustuje primer, knockout mieva, koji ne ekspresuju PTEN, i imaju velike mozgove sa velikim
brojem nervnih elija.
4.5.6. Receptor za odredjeni faktor rasta je povezan sa multiplim signalnim putevima.
Interakcija razli itih signalnih puteva omogu ava finu regulaciju elijskih aktivnosti neophodnih
za odravanje kompleksnih fiziolokih procesa. Kao to je opisano ranije, RTK i receptori za
citokine mogu da iniciraju Ras-MAP signalni put, DAG/IP3 put, kao i signalni put PI-3 kinaze.
Takodje, citokinski receptori mogu da preko JAK kinaze, povezane sa receptorom, direktno
aktiviraju STAT transkripcione faktore.
Aktivacija multiplih signalnih puteva preko mnogih receptora, omogu ava nezavisnu kontrolu
razli itih setova gena, aktivacijom istih ili razli itih receptora. Ponekad ovi signalni putevi mogu
da indukuju suprotne efekte. Na primer, genetska manipulacija Ras-MAP signalnog puta, i puta
PI-3 kinaze, u toku diferencijacije mii a je ukazala da ova dva puta imaju suprotne efekte:
aktivacija Ras-MAP kinaznog puta inhibie diferencijaciju miocita u miotubule, dok aktivacija
puta PI-3 kinaze stimulie diferencijaciju.

158

4.6. RECEPTORI POVEZANI SA CITOPLAZMATI NIM TIROZIN KINAZAMA

Aktivnost mnogih plazma membranskih receptora, koji nemaju domen tirozin kinaze, ipak, zavisi
od fosforilacije tirozinskog ostatka. Ovi receptori funkcioniu preko citoplazmati nih tirozin
kinaza, koje su povezane sa receptorom, a mogu da fosforiliu razli ite proteine u eliji,
uklju uju i i same receptore kada se za njih vee ligand. Funkcionisanje ovih receptora je sli no
funkcionisanju RTKs. Razlika je u tome to su receptor i njegov kinazni domen kodirani
razli itim genima, i to je tirozin kinaza nekovalentno povezana sa polipeptidom receptora. Kao i
RTKs, i ovi receptori za ispoljavanje svoje funkcije zahtevaju oligomerizaciju.
Mnogi od ovih receptora zavise od aktivnosti pripadnika najve e familije citoplazmati nih tirozin
kinaza, tzv. Src familije tirozin kinaza. Src familiji pripadaju i Src, Yes, Fgr, Fyn, Lck, Lyn, Hck i
Blk. Sve ove protein kinaze sadre SH2 i SH3 domene, i nalaze se na citoplazmati noj strani
plazma membrane, dre i se za nju delimi no, preko interakcije sa transmembranskim
receptorima a delimi no preko kovalentne veze sa lipidnim lancima. Razli iti pripadnici Src
familije su povezani sa razli im receptorima i fosforiliu razli ite setove ciljnih proteina. Na
primer, Lyn, Fyn i Lck su povezani sa razli im receptorima za antigene na limfocitima (Fyn i Lyn
sa BCR-om, a Lck sa TCR-om). U oba slu aja kinaza se aktivira kada se ekstracelularni ligand
vee za odgovaraju i receptorni protein. Src, kao i neki drugi pripadnici Src familije, se takodje,
mogu vezati i aktivirati RTK. U ovom slu aju receptor i citoplazmati na tirozin kinaza, uzajamno,
stimuliu kataliti ku aktivnost jedna drugoj, i na taj na in poja avaju i produavaju trajanje
signala.

Slika 4.29. Interakcija receptora za antigene

na B limfocitima sa Fyn, Blk i Lyn i aktivacija
signalnog puta.

159

Drugi tip citoplazmati nih tirozin kinaza, je povezan sa integrinima, familijom receptora preko
kojih se elija vezuje za ekstracelularni matriks. Vezivanje integrina za komponente matriksa,
aktivira intracelularne signalne puteve koji uti u na ponaanje elije. Grupisanje integrina (engl.
cluster) na mestima kontakta sa matriksom, pomae nastajanje fokalno adhezivnih veza, koje
regrutuju mnoge proteine. Citoplazmati na tirozin kinaza tzv. FAK (engl. focal adhesion kinase)
se, uz asistenciju drugih citoskeletnih proteina, vee za citoplazmati ni rep jedne subjedinice
integrina. FAK molekuli u formiranim klasterima, se uzajamno fosforiliu, formiraju i
fosfotirozinsko vezno mesto na koje e se vezati Src kinaza. Src i FAK, fosforiliu jedan drugog,
kao i druge proteine koji grade adhezivnu vezu, uklju uju i i signalne proteine RTK signalnog
puta. Na ovaj na in je omogu ena adhezija elija za
odgovaraju i substrat (podlogu), na kome je mogu e njihovo
preivljavanje, rast, deoba elije, kao i migracija. Mievi koji
ne ekspresuju FAK, umiru u ranim fazama razvoja, a
njihove elije ne migriraju normalno u posudama za gajenje
(engl. culture dish).
Slika 4.30. Formiranje fokalno adhezivnih veza sa substratum
uz angaovanje FAK i Src kinaza. Objanjenje u tekstu.

Receptori za citokine su subfamilija receptora povezanih sa citoplazmati nim tirozin kinazama. O

njima moete pro itati u predhodnim delovima teksta.

160

4.7. SIGNALING PREKO GUANILIL CIKLAZA I cGMP-a

Guanilil ciklaze (engl. Guanylyl Cyclase GC) su familija enzima koja katalie konverziju GTP u
cGMP. Familiju ine i membranski-vezani/partikularni izotipovi guanilil ciklaze (engl.
membrane-bound GCs mGCs or particulate GCs - pGC) i solubilne izoforme guanilil ciklaze
(engl. soluble GCs sGCs)koje su ekspresovane u skoro svim elijskim tipovima. Ovi receptorenzimi su regulisani veoma raznovrsnim i raznolikim ekstracelularnim signalnim molekulima koji
uklju uju peptidne hormone (npr. natriureti ne peptide), bakterijske toksine (npr.
lipopolisaharide), slobodne radikale (npr. azot oksid), kao i intracelularne molekule kao to su
Ca2+ i adeninski nukleotidi. Stimulacija guanilil ciklaze prouzrokuje akumulaciju cGMP, a cGMP,
kao sekundarni glasnik u maniru sli nom cAMP, aktivira i/ili regulie kompleksni signaltransdukcioni kaskadni signaling preko intermedijalnih efektora u donjem toku signalnog puta.
Ovi cGMP-indukovani efektori ukju uju cGMP-zavisnu protein kinazu (engl. Protein Kinase G PKG); cGMP-regulisane fosfodiesteraze (engl. PhosphoDiEsterases - PDEs): cikli nim
nukleotidima-regulisne jonske kanale (engl. Cyclyc Nucleotide Gated ion channels - CNG) i
transportere-pumpe cikli nih nukleotida, ali i nekih drugih molekula (engl. Multi-drug Resistance
Proteins - MRPs). Guanilil ciklaze i cGMP-posredovane signalne kaskade imaju centralnu ulogu u
regulaciji razli itih fiziolokih (ali i patofiziolokih) procesa uklju uju i motilitet glatke
muskulature, homeostazu intestinalnog fluida i elektrolita, regulaciju prometa vode i elektrolita,
fototransdukciju u retini, kao i modulatornu, autokrinu i/ili parakrinu funkciju u regulaciji
medju elijske i intra elijske komunikacije. U ovoj sekciji e ukratko biti opisana opte
karakteristike guanilil ciklaza, struktura i funkcija lanova familije guanilil ciklaza i ukratko
molekularni mehanizmi koji reguliu aktivnost enzima. Pored toga bi e dat kratak pregled
dogadjaja u donjem delu signal-transdukcionih puteva koji su kontrolisani GC-cGMPsignalingom, uklju uju i efektore koji transdukuju signal (PKG i CNG kanali), kao i signalne
proteine koji prekidaju signaling (PDEs i MRPs).
Veliki broj receptora sa aktivno u guanilil ciklaze je otkriven, ali u najve em broju slu ajeva oni
su orfanski receptori, za koje nije poznat ligand koji ih aktivira u normalnim/fiziolokim uslovima.
Genom nematode Caenohrabditis elegans kodira ak 26 razli itih receptora sa atkivno u guanilil
ciklaze. Ve ina onih ispitivanih su ekspresovani u specifi nim podgrupama senzornih neurona,
sugeriu i da su moda ovi receptori uklju eni u detektovanju odredjenih i specifi nih molekula u
okruenju ovih crva. Pored toga, neki sisarski orfanski receptori sa aktivno u guanilil ciklaze su
pronadjeni u senzorni neuronima, u delu nosa koji je odgovoran za detekciju feromona.

161

4.7.1. Receptori guanilil ciklaze generiu cGMP direktno

Receptori guanilil ciklaze su proteini koji imaju na jednom domenu ligand-vezuju e mesto
(ekstracelularno ili intracelularno) za signalni molekul, a na drugom domenu (uvek intracelularno)
guanilil-ciklaze-kataliti ki domen. Vezivanje signalnog molekula aktivira ciklazni domen koji
katalie transformaciju GTP u cGMP. Produkovani cGMP se potom vezuje i aktivira cGMPzavisnu protein kinazu G (engl. Protein Kinase dependent on cGMP - PKG) koja fosforilie
specifi ne serine ili treonine, sli no kao i PKA. Prema tome, receptor GC koristi cGMP kao
intracelularni medijator, sekundarni glasnik, u istom maniru kao to neki GPCRs preko adenilil
ciklaze koriste cAMP. Razlika je u tome to je, kod receptora guanilil ciklaze, veza izmedju ligandvezuju eg domena i ciklazne aktivnosti direktna, dok se kod GPCRs signalinga veza izmedju
receptora i kataliti ke kinazne aktivnosti ostvaruje preko adenilil ciklaze, te je singalni put
receptor G protein adenilil ciklaza cAMP neto dui od receptor-GC cGMP.
4.7.1.1. Molekularna biologija guanilil ciklaza
Razvoj molekularno biolokih metoda, a u prvom redu lan ane reakcije polimeraze (engl.
Polymerase Chain Reaction - PCR) olakale su pretraivanje i otkrivanje novih lanova familije
guanilil ciklaza. Kori eni su tzv. degenerativni PCR prajmeri bazirani na konzervisanim
aminokiselinskim sekvencama kataliti kih domena i sGC i mGCs da bi se amplifikovalo guanilil
kataliti ko mesto, kao suprotno od adenilil kataliti kog mesta.
Identifikacija lanova familije guanilil ciklaza. Sredinom 70-tih je otkrivena guanilil
ciklazna aktivnost i u solubilnoj i partikularnoj/membranskoj frakciji ve ine elija, ali je tek
razvoj tehnika molekularnog kloniranja doprineo potpunom istraivanju lanova familije guanilil
ciklaza. Purifikacija guanilil ciklaze iz citosolnog kompartmenta plu a pokazala je da je sGC
heterodimer gradjen od i subjedinica i da postoji velika homologija izmedju sGC izolovanih iz
plu a goveda i pacova. Degenerativni prajmeri zasnovani na strukturi purifikovanih subjedinica
su kori eni za pregled cDNK biblioteke i kloniranje 1 i 1subjedinica, a potom i 2 i 2
subjedinica. sGC je receptor za azot oksid, ali se moe aktivirati i na drugi na in. Istraivanja
mGC sugerisala su novu paradigmu za transdukciju signala, odnosno mogu nost aktiviranja
mGC peptidnim ligandima, natriureti nim peptidima (engl. Natiuretic Peptides NPs). Postoji
nekoliko tipova natriureti nih peptida: atrialni natriureti ni peptid (engl. Atrial NP - ANP);
natriureti ni peptid mozga (engl. Brain NP BNP) i C natriureti ni peptid (CNP). U po etnim
eksprimentima je pokazano da ANP aktivira guanilil ciklaznu aktivnost u membranskoj frakciji, te
je na osnovu toga i izolovana prva, gruba forma mGC iz membranske frakcije testisa morskog

162

jea, a mGC je prvi put klonirana kori enjem cDNK biblioteke testisa morskog jea. Ovaj prvi
klon je obezbedio neophodne probe za izolovanje sisarske cDNK koja kodira mGC, i to prvobitno
mGC izoformi A (mGC-A) i B (mGC-B), a potom i C (mGC-C), D (mGC-D), E (mGC-E), F (mGC-F) i
G (mGC-G). mGC-A i mGC-B su receptori za natriureti ne peptide, i to u najve oj meri za ANP i
BNP, ali mogu da veu i CNP. mGC-C je receptor za termostabilne bakterijske enterotoksine
(engl. heat-STable enterotoxins - STs ), kao i za endogene peptide guanilil i uroguanilil. Ostale
klonirane mGC su orfanski receptori bez poznatog ekstracelularnog liganda. Sekvence na Cterminalnom kataliti kom domenu mGCs su veoma homologe sa
i
subjedinicama sGC, a
imaju limitirani identitet sa dva kataliti ka domena adenilil ciklasa.
Struktura i lokacija gena koji kodiraju guanilil ciklaze. Hromozomski lokusi gena koji
kodiraju izoforme guanili ciklaza, njihovi ligandi su mapirani i u humanom i u miijem genomu i
oni nisu povezani, nego su rasuti po genomu. Na primer, geni koji kodiraju natriureti ne peptide
koji su ligandi za mGC-A (ANP i BNP) su organizovani kao tandem. Sli no, guanili i uroguanilil,
endogeni aktivatori mGC-C su kodirani sa blisko vezanim genima. Dok je mGC-A ekspresovana u
razli itim tipovima elijua, ekspresija mGC-C je ograni ena na intestinalini epitel i primarni i
metastazni kolorektalni kancer.

4.7.2. Membranski vezani receptori guanilil ciklaze

Signalni molekuli koji koriste membranski vezane guanilil ciklaze su natriureti ni peptidi (engl.
Natiuretic Peptides NPs), familija strukturno sli nih sekretornih signalnih peptida koji reguliu
promet vode i elektrolita i dilatiraju krvne sudove. Postoji nekoliko tipova natriureti nih peptida:
atrialni natriureti ni peptid (engl. Atrial NP - ANP); natriureti ni peptid mozga (engl. Brain NP
BNP) i C-tip natriureti nog peptida (CNP). Mii ne elije atriuma (komore) srca sekretuju ANP
kada se pove ava krvni pritisak. Sekretovani ANP cirkulacijom dospeva do bubrega i stimulie
ekskretovanje Na+ i vode. Pored toga stimulie relaksaciju glatkih mii a zidova krvnih sudova.
Oba ova efekta smanjuju krvni pritisak. Pored toga, u raznim tkivima natriureti ni peptidi
estvuju u autokrinoj i/ili parakrinoj regulaciji i/ili modualciji razli itih fiziolokih funkcija
razli itih tipova elija.
Do danas je kod sisara opisano sedam izoformi mGC koji su ozna eni mGC-A, B, C, D, E, F i G.
Ovi proteini formiraju familiju elijskih-povrinskih receptora i karakteriu se prisustvom
ekstracelularnog ligand-vezuju eg domena; jednog transmembranskog domena koji jedanput

163

preseca membranu; i citosolnog regiona koji sadri unikatnu karakteristiku guanilil ciklaza tj. Cterminalni ciklaza karakteristi ni domen i protein-kinazi sli an domen. Kao to je napomenuto,
mGC-A i mGC-B funkcioniu kao receptori za natriureti ne peptide, mGC-C je receptor za
bakterijski termostabilni enterotoksin i za dva endogena peptida (guanilil i uroguanilil), dok su
ostale etiri izoforme mGC orfanski receptori. Dok su receptori za natriureti ne peptide koji imaju
aktivnost guanilil ciklaze (mGC-A i mGC-B), kao i mGC-G veoma rasprostranjeni u tkivima,
mGC-C i guanilil ciklaze senzornih organa (mGC-D, mGC-E i mGC-F) su ekspresovane u tkivno
specifi nom maniru.
4.7.2.1. Izotipovi membranske/partikularne guanilil ciklaze
Na osnovu specifi nosti prema ligandu mGC su klasifikovane u tri osnovne klase:
(1) Receptori natriureti nih peptida sa aktivno u guanilil ciklaze uklju uju mGC-A i
mGC-B koje se ekspresuju u bubrezima, adrenalnoj lezdi, glatkim mii ima krvnih sudova i
drugim tkivima, a vezuju natriureti ne peptide ANP, BNP i CNP. Osnovni mehanizam kojim
natriureti ni peptidi ispoljavaju svoj fizioloki efekat uklju uje aktiviranje receptora koji imaju
gunilil ciklaznu aktivnost i intracelularna akumulacija cGMP-a. Receptor mGC-A ima najve i
afinitet za ANP, a oko 10 puta manji za BNP, dok je afinitet za CNP veoma mali. Suprotno, mGC-B
ima 50 do 500 puta ve i afinitet za CNP nego za druge natriureti ne peptide.
(2) Intestinalnog peptida-vezuju i receptori sa aktivno u guanilil ciklaze uklju uju
mGC-C koja je originalno identifikovana i klonirana od mRNK izolovane iz intestinalne mukoze. Za
razliku od receptora za natriureti ne peptide, zna ajna ekspresija mGC-C je limitirana na elije
intestinalne mukoze na putu od duodenuma do rektuma. Iako mGC-C ima konzervisanu
domensku strukturu karakteristi nu za familiju guanilil ciklaza, nema ulogu receptora za
natriureti ne peptide. Prvi otkriveni ligand za mGC-C je termolabilni bakterijski endotoksin ST.
Kasnije je potvrdjeno da i peptidi koji ispoljavaju veliki stepen homologije sa ST enterotoksinom,
kao to su guanilin i uroguanilin (izolovani iz intestinalne mukoze), kao i limfoguanilin
(izolovan iz slezine i limfoidnih tkiva), mogu da se veu za ovaj receptor i da preko njega
pove avaju koncentraciju intracelularnog cGMP-a.
(3) Orfanski receptori sa aktivno u guanilil ciklaze uklju uju mGC-D, mGC-E, mGC-F i
mGC-G, izoforme za koje nisu precizno definisani ligandi, ali se zna da ih ne aktiviraju ligandi koji
aktiviraju ostale klase mGCs. Primarna struktura ekstracelularnih domena mGC-D, mGC-E i
mGC-F ispoljava veliki stepen homologije, a njihova ekspresija je limitirana na senzorna tkiva.
Ekstracelularni domen mGC-G veoma podse a na ekstracelularni domen receptora za
natriureti ne peptide, te se sumnja da i ligand za mGC-G moda li i na natriureti ne peptide.

164

4.7.2.2. Struktura membranske/partikularne guanilil ciklaze

Sve membranski-vezane guanilil ciklaze ispoljavaju veliku konzervisanost strukturnih domena.
Noviji rezultati istraivanja u ovoj oblasti su doprineli definisanju i identifikaciji est odvojenih
domena (Slika 4.31.): (1) Ekstracelularni ligand-vezuju i domena na N-terminalnom kraju koji
ponekad, u zavisnosti od strukture ne konzervisanog dela molekule, vezuje razli ite ligande (npr.
u slu aju mGC-A, mGC-B i mGC-C). (2) Jedan transmembranski domen koji samo jedan put
preseca elijsku membranu. (3) Citoplazmati ni jukstamembranski domen. (4) Regulatorni domen
koji ima zna ajnu homologiju sa protein kinazama. (5) Region sli an zglobu koji moe da se
pomera i okre e. (6) C-terminalni kataliti ki domen.

Slika 4.31. Struktura domena gunanilil ciklaza.

Prikazani su modeli ANPCRs (engl. ANP Clearance Receptors; tzv. okrnjena forma mGC-A kome nedostaje citoplazmati ni domen ispod jukstaglomerularnog
domena), mGCs i sGCs.

165

4.7.2.3. Receptor-efektor povezanost i funkcija membranske/partikularne guanilil ciklaze

Mehanizmi kojima se interakcija ligand-receptor prevodi/transducira u kataliti ku aktivaciju i
elijski signal, kao i prekidanje tog signala nije precizno definisano kod mGC-signalinga. Receptori
guanilil ciklaze ispoljavaju strukturu sli nu receptorima familije tirozin kinaza. Prihva eni
model aktivacije ovih receptora uklju uje obaveznu ligandom-indukovanu dimerizaciju
receptornih monomera. Smatra se da mGC ve postoje u obliku oligomera i da ligand-receptor
aktivacija ne menja oligomerno stanje. Adeninski nukleotidi, kao to je ATP, indukuju alosteri ku
aktivaciju guanilil ciklaze. Pored efekta na interakciju izmedju receptora i efektora, adeninski
nukleotidi takodje alosterno reguliu afinitet receptora za natiureti ne peptide, za ligand.
Suprotno ovome, supstituenti adeninskih nukleotida, kao to su 2-hloroATP i 2-metiltioATP
inhibiu i bazalnu i indukovanu aktivnost guanilil ciklaza.

Slika 4.32. Regulacija membranske guanilil ciklaze (mGC) i solubilne guanilil ciklaze (sGC) njihovim ligandima.

166

4.7.3. Solubilna guanilil ciklaza

Solubilna guanilil ciklaza, sGC, je ekspresovana u citoplazmi skoro svih sisarskih elija i
funkcionie kao receptor za azot oksid, a posreduje u ostvarivanju irokog spektra raznovrsnih
fiziolokih funkcija, kao to je inhibicija agregacije trombocita, relaksacija glatke muskulature,
transmisija signala u procesima vidjenja, transdukciji signala u nervnom sistemu,
imunomodulaciji itd. Ovaj enzim je heterodimerni protein koga ine i subjedinice, a ekspresija
obe subjedinice je neophodana za kataliti ku aktivnost. Svaka subjedinica se sastoji od Nterminalnog regulatornog domena i C-terminalnog kataliti kog domena i oni imaju veliki stepen
homologije sa domenima membranske guanilil ciklaze, kao i adenilil ciklazama.
4.7.3.1. Struktura subjedinica i izotipovi/izoforme solubilne guanilil ciklaze
Analiza sGC iz razli itih tkiva pokazala je da ovaj enzima ima heterodimernu strukturu koju ini
kombinacija dve od mogu e etiri subjedinice ( 1, 2, 1,
2). Najzastupljeniji heterodimer je
kombinacija
1 i
1 subjedinica i ovaj heterodimer se ekspresuje u mnogim tkivima.
Eksperimentalni podaci pokazuju da ekspresija 1 ili 1 subjedinica ponaosob nema udela u
formiranju aktivnog enzima, ve je ekspresija obe subjedinice neophodna za kataliti ku aktivnost
enzima. Pored toga, pokazano je da i 2 subjedinica moe da formira heterodimer 1/ 2 koji je
znatno manje aktivnosti od 1/ 1 homodimera. Smatra se da
2 regulie aktivnost 1/ 1
heterodimera kompeticijom sa 1. Pored 1, i 2 subjedinica moe da formira heterodimere i sa
1 i sa 2 s tim to ima manji afinitet za vezivanje sa 1. Ovaj 2/ 1 heterodimer je takodje
manje aktivan od 1/ 1, to ukazuje da verovatno i 2 subjedinica ima regulatornu ulogu. Uprkos
zahtevu za heterodimernom konformacijom za ekspresiju kataliti ke aktivnosti, dokazano je i
postojanje homodimera 1/ 1 i 1/ 1, ali njihova fizioloka uloga jo nije definisana. Izoforma
sGC koja je skoro otkrivena i izolovana iz nervnog sistema duvanskog rogatog moljca (Manduca
sexta) ne zahteva heterodimernu formaciju za ekspresovanje kataliti ke aktivnosti. Ova novija
forma sGC je ozna ena kao MsGC- 3 i po strukturi je veoma sli na 1 subjedinici, ali na Cterminalnom zavretku ima dodatni peptidni lanac od 315 aminokiselina koji nije homolog ni sa
jednim poznatim proteinom.
4.7.3.2. Struktura domena solubilne guanilil ciklaze
Svaka pojedina na subjedinica solubilne guanilil ciklaze se sastoji od tri funkcionalna domena:
hem vezuju eg, dimerizacionog i kataliti kog (Slika 4.31). Hem-vezuju i domen je lociran na Nkraju svake subjedinice, a hem prosteti na grupa je neophodna za aktivaciju enzima sa NO. Hem

167

je prsten od pet atoma azota, od kojih su etiri atoma azota koordinisana centralnim atomom
gvo a, dok je peti atom azota vezan za His105 1 subjedinice imidazolnom vezom. Centralni atom
gvodja moe biti ili u fero/redukovanoj (Fe2+) ili u feri/oksidovanoj (Fe3+) formi. Peti lan prstena
je imidazolski aksijalni ligand koordinisan sa 1 subjedinicom na His105. Mutacija na ovom
histidinu lociranom blizu N-terminalnog dela 1 subjedinice rezultira nesposobno u sGC da
vezuje hem, te se produkuje enzim koji nije sposoban da odgovara na NO. Mutacije na drugim
konzervisanim histidinima nemaju efekta na sposobnost enzima da vezuje hem. C-kraj
i
subjedinica je kataliti ki domen enzima i prisustvo C-kraja obe subjedinice je neophodno za
vezivanje supstrata. Dimerizacioni domen je mesto povezivanja 1 i 1 subjedinica i ispoljava
veliki stepen homologije sa dimerizacionim domenom mGC.
4.7.3.3. Regulacija solubilne guanilil ciklaze ligandima
Regulaciju aktivnosti sGC mogu da vre NO, protoporfirin IX, dvovalentni katjoni, a postoji i
kataliti ki mehanizam regulacije sGC.
Azot oksid (NO) regulie solubilnu guanilil ciklazu. NO je slobodni, reaktivni radikal koji
aktivira sGC vezivanjem direktno za hem formiranjem fero-nitrozil-hem kompleks (Slika 4.32.).
Poluivot ovog fero-nitrosil hema je izmedju 4 minuta i 3 sata na 20oC. NO se vee za estu
poziciju prstena hema, raskida vezu izme u aksijalnog histidina i gvo a, i formira vezu sa
gvodjem koje je tada pomereno iz ravni prstena. Na ovaj na in se frormira peto-koordinidani
prsten u kojem je NO tada na petoj poziciji. Enzim se inaktivira disocijacijom NO i vra anjem
gvodja u ravan prstena. Pored toga, ugljen monoksid (CO), tako e ima sposobnost vezivanja za
estu poziciju prstena hema, ali u tom slu aju ne e do i do disocijacije histidina, i Fe ostaje u
ravni prstena. Stoga je CO daleko manje efikasan aktivator sGC nego NO i u slu aju
purifikovanog enzima sGC, aktivacija sa NO je 100 do 200 puta, dok je aktivacija sa CO svega
4 puta.
Protoporfirin IX regulie solubilnu guanilil ciklazu. Protoporfirin IX (engl.
ProtoPorphyrin IX PPIX), prekursor hema, je komponenta koja postoji prirodno i koja se
sintetie od glicina. PPIX ima sposobnost aktivacije raznih formi sGC (sGC koja je deficitarna u
hemu (engl. heme-deficient sGC); koja nema hem (engl. heme-free sGC) ili koja ima hem(hemcontaining sGC) u aktivnom centru i to i u hem-nezavisnom i u NO-nezavisnom maniru. PPIX se
vezuje za sGC pri malim koncentracijama (Kd=1.4 nM) i formira stabilan kompleks koji ne disocira
tokom gel filtracije ili dijalize. Dva dela porfirinskog prstena su veoma vana za vezivanje za hem
sGC, a to su dve vinil grupe na pozicijama 2 i 4 (esencijalne su za kreiranje hidrofobne
interakcije izmedju porfirinskog ringa i enzima; supstitucija ovih grupa sa manje hidrofobnim ili

168

polarnim grupama prouzrokuje slabiju interakciju izmedju porfirinskog prstena i sGC i smanjuje
aktivnost enzima) i negativno naelektrisane COOH grupe vicinalne propionske kiseline na
poziciji 6 i 7 (formiraju elektrostati ke veze sa baznim ostacima (npr. argininskim) u apoproteinu
sGC).
Kataliti ki mehanizam regulacije solubilne guanilil ciklaze. Kataliti ki domen prisutan
na C-terminusu i i subjedinica sGC ispoljava veliki stepen homologije sa C1 i C2 kataliti kim
domenima adenilil ciklaze, kao i kataliti kim domenima mGCs. Kao to je napomenuto ranije, za
ispoljavanje enzimske aktivnosti sGC, neophodna je koekspresija i subjeinica koje formiraju
heterodimer koji poseduje dva kataliti ka domena. Iako su prisutna dva kataliti ka domena, svaki
od njih doprinosi, sa specifi nim ostacima, formiranju jedinstvenog kataliti kog mesta i vezivanju
jedinstvenog supstrata. Dimerizacija se ostvaruje specifi nim regionom koji je homolog
dimerizacionom domenu mGCs i lociran je proksimalno u odnosu na kataliti ke domene
i
subjedinica (Slika 4.31.)
Dvovalentni katjoni reguliu i solubilnu i membranski vezanu guanilil ciklazu. Za
ekspresiju maksimalne kataliti ke aktivnosti mGCs i sGC neophodni su dvovalentni katjoni, i to
kao kofaktori za supstrate i alosterni modulatori. Za aktivaciju svih nukleotidnih ciklaza je
neophodno da njihovi purinski nukleotidi formiraju helate sa dvovalentnim katjonima, te se, tek
kao tako formirani helati, vezuju za kataliti ki domen i pokre e se enzimska ciklizacija. Mn2+ i
Mg2+ su optimalni dvovalentni katjoni koji funkcioniu kao kofaktori supstrata. Kori enjem Mg2+
kao katjonskog kofaktora supstrata, guanilil ciklaze (mGCs i sGCs) ispoljavaju bazalnu kataliti ku
aktivnost koja je potpuno senzitivna na aktivaciju ATP i lignadima. I ne samo to, izgleda da je
Mg2+ fizioloki dvovalentni katjon koji podrava guanil ciklaznu aktivnost in vivo. Suprotno ovome,
kori enjem Mn2+ kao katjonskog kofaktora supstrata guanilil ciklaze ispoljavaju maksimalnu
kataliti ku aktivnost, ali nisu senzitivne na aktivaciju nukleotidima i ligandima. Ovo je generalna
karakteristika ciklaza. Adenilil ciklaze se takodje aktiviraju u ligand-nezavisnom maniru ukoliko
koriste Mn2+ kao katjonski kofaktor supstrata. Ca2+ katjoni takodje podravaju kataliti ku
aktivnost guanilil ciklaza kao katjonski kofaktori supstrata, ali izgleda da su oni negativni
alosterni modulatori sGC. I ne samo to, Ca2+ i cGMP ispoljavaju antagonisti ke funkcije u
nekoliko fiziolokih sistema (u vaskularnim glatkim mii ima Ca2+ indukuje kontrakcju, a cGMP
relaksaciju).

169

4.7.4. cGMP i elijski signaling

Veliki broj endogenih i egzogenih signalnih molekula, uklju uju i lokalno produkovane hemijske
medijatore (citokine i mnoge druge), hormone, neurotransmitere i toksine, indukuju i produkuju
elijske odgovore preko cGMP molekula, kao sekundarnog signalnog glasnika.
4.7.4.1. Elementi cGMP signalnog puta
Biohemijski mehanizmi i procesi koji omogu avaju bioloke odgovore posredovane preko cGMP
uklju uju sistem koji sintetie cGMP (mGC i sGC), sistem efektornih molekula preko kojih se
trandukuje signal (cGMP-zavisne protein kinaze ili protein kinaze G (engl. Protein Kinases G PKG), kanali ije je otvaranje regulisano cikli nim nukleotidima (engl. Cyclyc Nucleotide-Gated
channels - CNG kanali) i sistem koji uklanja cGMP iz elije i to razgradnjom u citosolu
(fosfodiesteraze, engl. PhosphoDiEstreases - PDEs) ili pumpanjem/transportom u
ekstracelularni prostor (tzv. ABC transporteri, transporteri cikli nih nukleotida, engl. Multidrug
Resistance Proteins - MRPs). Specifi nost elijskog odgovora je diktirana prisustvom cGMPvezuju eg motiva na ciljnim proteinima. Dva evolutino daleka alosterna mesta za vezivanje cGMP
su prisutna u eukariotskim elijama. Jedno alosterno vezivanje cGMP, sa velikim stepenom
homologije, se odvija na cGMP-zavisnim i cAMP-zavisnim protein kinazama (PKGs i PKAs) i CNG
kanalima, a drugo se deava na cGMP-zavisnim PDEs. Pored toga, finalni izlazni odgovor
pove ane koncentracije intracelularnog cGMP je determinisan tipom i kombinacijom targetnih
proteina i supstrata, enzima koji metaboliu cGMP, a ekspresovani su u eliji, kao i njihove
intracelularne kolokalizacije i organizacije u selektivne kompartmente i organele. Na primer,
fosfolamban i IP3 receptor su supstrati i za PKA i za PKG, ali obrazac kolokalizacije ovih kinaza i
njihovih supstrata je razli iti u razli itim tipovima elija. PKG je kolokalizovana sa ova dva
supstrata u elijama glatke muskulature, dok je PKA kolokalizovana sa istim supstratima u
mii nim elijama srca. Prema tome, cGMP-PKG-zavisna fosforilacija fosfolambana i IP3 receptora
u elijama glatke muskulature ima udela u relaksaciji mii a, dok se, suprotno tome, fosforilacija
istih supstrata u sr ano-mii nim elijama deava preko cAMP-PKA signalnog puta i favorizuje
odvajanje Ca2+, i rezultira skra enjem sistole srca. Na kraju, cGMP moe imati razli ite efekte u
razli itim fiziolokim ili patofiziolokim uslovima. Na primer, u neutrofilima koji su u stanju
mirovanja tj. nisu aktivirani, cGMP analog ne indukuje fosforilaciju intermedijarnog filamenta
vimetina, dok u aktiviranim neutrofilima, cGMP-PKG fosforilie vimetin nakon prolazne
kolokalizacije enzima na filamentima.

170

U daljem tekstu e biti dat kratak i opti pregled na ina integracije guanilil ciklaza i cGMP-a u
transmembransku signalnu kaskadu, cross-talk sa drugim signalnim putevima, i neki od
irokog spektra brojnih dogadjaja u delu signalnog puta nakon guanilil ciklaza i cGMP-a.
4.7.4.2. cGMP i elijski signaling preko protein kinaza
cGMP i cGMP-zavisne protein kinaze (Protein kinaze G PKGs)
PKGs predstavljaju osnovni intracelularni medijator cGMP-signala. Ligandom-indukovano
pove enje koncentracije intracelularnog cGMP-a omogu ava da se cGMP vee i aktivira PKG, to
aktivira kataliti ku kinaznu aktivnost i vodi kataliti kom transferu -fosfata sa ATP na serinski ili
treoninski ostatak ciljnog proteina. Ovaj fosforilisani protein potom posreduje translaciju
ekstracelularnog sitmulusa u specifi nu bioloku funkciju.
Identifikovana su dva razli ita gena za sisarsku PKG. Jedan gen je lociran na humanom
hromozomu 10 i kodira dve izoforme, I i I izoforme, PKG I koje nastaju u procesu alternative
splicing N-terminalnog regiona. Drugi gen za PKG je lociran na humanom hromozomu 4 i kodira
PKG II. PKG I je citosolni homodimerni protein (76 kDa) iroko ekspresovan u cerebellumu,
trombocitima i glatkoj muskulaturi. Razlike u N-terminalnom domenu dve izoforme PKG I
uslovljava razli ite afinitete za vezivanje cGMP-a. PKG I ima vezna mesta velikog i malog afiniteta
koja ispoljavaju pozitivnu medjusobnu kooperaciju. PKG I ima dva cGMP-vezuju a mesta sa
manjim afinitetom i kooperativno u. Pored toga, iako je ekspresija ove dve izoforme detektovana
u istim humanim tkivima, PKGI je najvie detektovana u vaskularnom sistemu, bubregu i
adrenalnoj lezdi, dok je jedino PKGI detektovana u uterusu. PKG II je membranski-vezan
heterodimerni protein (86 kDa) ije prisustvo nije detektovano u kardiovaskularnom sistemu, ali
je ekspresovan u plu ima, bubregu i kostima, a posebno je dominanatan u mozgu i intestinumu.
PKG II se razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od PKG I na N-terminalnom kraju, u unikatnom i
specifi nom mestu ovog regiona koje usmerava intracelularnu lokalizaciju ovog enzima. Takodje,
PKG II ima miristoilatna mesta koja su neophodna za asocijaciju sa membranom, dok PKG I ima
acetilovana mesta. Osnovna razlika izmedju dve PKGs je to cGMP-vezuju a mesta na PKG II
ispoljavaju minimalni afinitet i kooperativnost. Pored toga, druga razlika je zna ajna divergencija
u specifi nosti za supstrate koja se mnogo vie ispoljava u in vivo uslovima.
Sve poznate PKGs su gradjene od N-terminalnog, regulatornog i kataliti kog domena. Nterminalni domen sadri pet regulatornih mesta: (1) mesto za dimerizaciju subjedinica koje se
sastoji od -heliksa sa konzervisanim leucin/izoleucin ponovicma; (2) autoinhibirotno mesto
uklju eno u inhibiciju kataliti kog domena u odsustvu cGMP-a; (3) autofosforilacijsko mesto
koje u prisustvu cGMP-a moe da pove a bazalnu kataliti ku aktivnost i afinitet PKGs za cAMP;

171

(4) mesto za regulaciju afiniteta i kooperativnog ponaanja mesta koja vezuju cGMP; (5) mesto
za intracelularnu lokalizaciju koje determinie interakciju enzima sa specifi nim subcelularnim
strukturama. Regulatorni domen sadri vezna mesta za cikli ne nukleotide (konvencionalno
ozna en kao A i B) koja dozvoljavaju potpunu aktivaciju enzima nakon specifi nog vezivanja
dve molekule cGMP-a. I na kraju, kataliti ki domen, lociran na C-terminalnom kraju PKGs,
sadri vezna mesta za Mg2+-ATP i ciljni protein.
PKGs fosforiliu veliki broj raznovrsnih proteina u in vitro uslovima, ali u in vivo uslovima
je demonstrirano svega nekoliko. Ovo veliko odstupanje moe biti objanjeno injenicom, da pored
sekvence za prepoznavanje na supstratu, u fiziolokim uslovima specifi nost supstrata prema
PKG je diktirana i intracelularnom kompartmanskom organizacijom i lokalizacijom. Ovo rezultira
formiranjem unikatnih makomolekulskih agregata koji sadre enzim-ciljni protein kompleks.
Trenutna radna hipoteza sugerie da PKG I deluje kao solubilni intracelularni modulator
koncentracije intraceluranog Ca2+, dok PKG II regulie fluidnu homeostazu na elijskoj
membrani. Bioloki supstrati za PKG I mogu biti konceptualno podeljeni na tri glavne grupe:
klasi ni, novi i hipoteti ki ciljni proteini. Klasi ni ciljni proteini se jasno prepoznaju kao
supstrati i u in vitro i/ili u in vivo uslovima su fosforilisani sa PKG I i imaju dobro poznate i
prou ene funkcije. Ova grupa uklju uje: IP3 receptor i fosfolamban koji su uklju eni u regulaciju
funkcije glatke muskulature; vimentin koji je uklju en u aktivaciju neutrofila; G supstrati koji su
snano ekspresovani u Purkinje-ovim elijama gde deluju kao fosfatazni inhibitori; tromboksan
A2 receptor ija je aktivacija inhibisana preko PKG-posredovane fosforilacije u trombocitima.
Novi ciljni proteini su PKG I supstrati koji su ili skoro opisani ili su podaci vezani za
njjihovu fosforiaciju sa PKG I konfliktni i opre ni. U ovu grupu spadaju L-tip Ca2+ kanala i
Ca2+-aktivirani K+ kanal koji nakon fosforilacije imaju u e a u regulaciji tonusa glatkih mii a
vaskularnih sudova, kao i kontraktilnosti srca; Ca2+-zavisna citosolna fosforilacija fosfolipaze A2
uklju ene u relaksaciju tonusa vaskularne glatke muskulature; tirozin hidroksilaza ija se
aktivnost pove ava nakon fosforilaicje; miozin-vezuju a subjedinica fosfataze lakih lanaca miozina
koja posreduje u relaksaciji elija glatke muskulature i vazodilataciji. Ve ina, ako ne i svi
pomenuti supstrati se fosforiliu subtipom I PKG I. Hipopteti ki ciljni proteini su mogu i
kandidati za fosforilaciju sa PKG I , ali njihova fosforilacije nije demonstrirana. U ovu grupu
spadaju mogu i supstrati predloeni na osnovu eksperimentalne demonstracije cGMP-PKG
posredovanih procesa, kao to su na primer, proteini citoskeleta i kontraktilni proteini (npr. Laki
lanac miozina, kalponin, dezmin, koneksini itd.). Pored navedenog, cGMP-PKG singnali put je
uklju en u kontrolu ekspresije gena razli itih promotor-odgovornih elementata (npr. engl.
serum-response element, AP-1 binding site and cAMP-response element). Suprotno od PKG I,

172

jedini klasi ni supstrat koji se prepoznaje sa PKG II je CFTR (engl. Cystic Fibrosis
Transmembrane conductance Regulator) u elijama intestinalne mukoze.
cGMP i cAMP-zavisne protein kinaze (Protein kinaze A PKAs)
Zbog toga to PKAs sadre specifi an nukleotid-vezuju i motiv sa zna ajnom homologijom sa
PKGs, one takodje mogu biti aktivirane sa cGMP-om, iako sa 50 puta manjom selektivno u nego
u slu aju kada su aktivirane cAMP-om. Iako su nukleotid-vezuju a mesta PKAs i PKGs homologa,
ipak postoji razlika izumedju ovih mesta, posebno u supstituciji klju nih aminokiselina. Bez
obzira to postoje mnogi kontraverzni podaci vezani za corss-talk izmedju cGMP-PKGs i cAMPPKAs signalnih puteva, interesantno je da su mnogi supstrati za PKGs i supstrati za PKAs. Pored
toga, pokazano je da cGMP deluje sli no kao i cAMP u posredovanju mnogih fiziolokih odgovora
(npr. PKG and PKA inhibiu IP3-zavisno otputanje Ca2+ i indukuju relaksaciju elija gastri ne
mukoze). Kod ki menjaka, cGMP i cAMP indukuju relaksaciju vaskularne muskulature, inhibiu
aktivaciju trombocita i reguliu sekreciju hlorida i vode u intestinumu. Pored toga, cAMP
unakrsno aktivira PKG u razli itim tkivima, a i cGMP unakrsno aktivira PKA. Funkcionalna
konvergencija izmedju cGMP-a i cAMP-a takodje moe da se deava na down-stream nivoima
signalnih puteva, kao to je nivo proteina koji su ciljni za kinaze (PKAs i PKGs). Pored identi nosti
supstrata koji se fosforiliu sa PKA i PKG, postoji zna ajno preklapanje izmedju dva cikli na
nukleotida u njihovoj sposobnosti da reguliu vazodilataciju cerebralnih arterija. PKA i PKG mogu
da deluju u kooperatvinom maniru u smislu da je fosforilacijska aktivnost jedne kinaze
neophodna za potpuni efekat druge kinaze. Na primer, overekspresija NOS prouzrokuje pove anje
nivoa NO koji preko cGMP-PKG unakrsno fosforilie PKA. Iako in vitro istraivanja sugeriu da
cGMP moe da transdukuje signal preko PKA i in vivo, neki drugi podaci to ne podravaju, zbog
toga to ne stimulisane elije ispoljavaju visoki stepen subcelularne lokalizacije koji primorava
sekundarne glasnike, enzime i njihove supstrate da formiraju radne jedinice i predstavljaju
prepreku za kross-aktivaciju. Pored toga, i PKA i PKG molekuli moraju biti usidreni (engl.
anchor) za specifi ne intracelularne proteine kako bi ove kinaze ispoljavale svoju funkciju. Sve
zajedno, istraivanja sugeriu da, u in vivo uslovima, cGMP i cAMP signalne kaskade aktiviraju
razli ite i veoma vane fizioloke funkcije i to uglavnom nezavisno, a da ni cGMP-zavisna
aktivacija PKA, niti cAMP-zavisna aktivacija PKG ne moe kompletno kompenzovati gubitak
drugog nukleotida.

173

Slika 4.33. Neke protein kinaze.

Veli ina i lokacija kataliti kih domena (tamno obojeni) protein kinaza nije prikazana. U svakom slu aju, kataliti ki domen svake protein kinaze je dug oko 250
aminokiselina, a ovi domeni medjusobno imaju veoma sli nu aminokiselinsku sekvencu, to ukazuje da su evoluirali od istog preda kog proteina tj. primordijalne
kinaze. Uo titi da su sve prikazane tirozin kinaze vezane za plazma membranu (JAKs su vezane preko svoje asocijacije za citokinske receptore) dok je ve ina
serin/treonik kinaza u citosolu. (Preuzeto iz Alberts i sar. (2005): Molecular Biology of The Cell. Garland Science.

4.7.4.3. cGMP i jonski kanali regulisani cikli nim nukleotidima

CNG kanali su familija voltano-zavisnih katjonskih kanala ekspresovanih u razli itim elijama.
Karakteristike CNG kanala su: (1) prisustvo transmembranskog segmenta (S1-S6); (2) jonprovodna pora izmedju S5 i S6 segmenta; (3) dva interaktivna regulatorna domena na

174

citoplazmati noj strani membrane, predstavljena i sa N-terminusom i sa C-terminusom kanala.

Pored toga, CNG kanali koji odgovaraju na specifi ne nukleotide imaju i nukleotid-vezuju i domen
na C-terminalnom kraju koji je homolog sa nukleotid-vezuju im domenom nukleotid-zavisnih
protein kinaza. Selektivna senzitivnost CNG kanala prema cikli nim nukleotidima je vezana za
specifi nost u gradji C-terminusa, kao i kod PKAs i PKGs, te prema tome, iako je aktivacija svih
CNG kanala regulisana i sa cGMP i sa cAMP, odredjeni izotipovi su vie senzitivni na cGMP nego
na cAMP, i obrnuto. Pored toga, jedna specifi na subfamilija CNG kanala, koji se zovu
hiperpolarizacijom-aktivirani cikli nim nukleotidima-regulisani kanali (engl. Hyperpolarizationactivated Cyclc Nucleotide-gated HCN channels) je senzitivna na cikli ne nukleotide. Ovi kanali
su ekspresovani u mozgu i srcu, a aktivnost im je modulisana i direktnim vezivanjem
nukleotida i hiperpolarizacijom plazma membrane. HCN kanali poseduju unikatne
strukturalne karakteristike u regionu njihove pore, kao i u regionu S4 transmembranskog
segmenta koji ispoljava selektivnu jonsku propustljivost i unikatnu voltanu senzitivnost.
Glavne familije CNG kanala reguliu influks Na+ i Ca2+ u elijama i gradjeni su od
tetramernih proteina koji se direktno otvaraju vezivanjem cikli nih nukleotida. Suprotno HCN
kanalima, CNG proteini ispoljavaju veoma slabu senzitivnost prema voltai i gradjeni su od
heterotetramernog sklopa i subjedinica. Jedino subjedinica formira funkcionalni monomerni
kanal ukoliko je ekspresovana u heterologom sistemu. Klonirane su tri
subjedinice (CNG1,
CNG2, CNG3) koje ispoljavaju visoku homologiju. Ovi CNG kanali su inicijalno klonirani iz tri
razli ita tipa neurona (engl. rode, cone and olfactory), pa se nekada tako i zovu, ali se ekspresuju i
u pankreasu, slezini, testisu, ovarijumu, bubregu, plu ima, mozgu, srcu, adrenalnim elezdama i
intestinumu.
4.7.4.4. cGMP-regulie fosfodiesteraze, a fosfodiesteraze razgradjuju cGMP
Karakterizacijom biohemijskih, farmakolokih i strukturalnih profila, identifikovano je bar 10
razli itih genskih familija za PDEs kod sisara. Svaki lan ima konzervisani kataliti ki domen
od oko 270 aminokiselina na C-terminusu. Ovaj domen cepa fosfodiestarsku vezu, te tako
hidrolizuje 3', 5' cikli ne nukleotide do njihovih odgovoraju ih nukleotida, 5' monofosfata. Sve
PDEs imaju heterologni regulatorni domen i funkcioniu kao dimeri, iako je funkcionalna
zna ajnost ove dimerizacije jo uvek nedefinisana.
Familije PDEs koje su ozna ene kao 1, 2, 3 i 10 hidrolizuju i cAMP i cGMP; familje PDEs
4, 7 i 8 cepaju prvenstveno cAMP; familije PDEs 5, 6 i 9 specifi no hidrolizuju cGMP.
Aktivnost PDEs je neophodna za elijski signaling jer metabolizam cikli nih nukleotida modulie
njihove intracelularne koncentracije i uti e na posledi ni fizioloki odgovor i ponaanje elije.

175

PDEs reguliu funkcije srca, adrenalnu steroidogenezu, erektilni odgovor mujaka,

fototransduciju, itd. Specifi na ciljna mesta za usidravanje mogu da lokalizuju enzim u blizinu
izabranog proteina, te se tako modulie nivo cikli nih nukleotida u specifi nim sub elijskim
kompartmentima.
cGMP regulie PDEs preko tri razli ita mehanizma: (1) pove anjem aktivnosti preko
grupnog delovanja na PDE5, PDE6 i PDE9; (2) menja brzinu hidrolize cAMP-a preko kompeticije
za kataliti ko mesto (PDE1, PDE2 i PDE3); (3) regulie aktivnost enzima direktnim vezivanjem za
specifi na alosterna mesta (PDE2, PDE5 PDE6 i PDE10). Pored toga, smatra se da preko cGMPPKG-posredovane fosforilacije neke PDEs mogu biti aktivirane, dok neke mogu biti inhibisane.
PDE5 je homodimer koji specifi no hidrolizuje i degradira cGMP. Direktno vezivanje cGMPa za alosterno vezno mesto favorizuje fosforilaciju PDE5 ili sa PKG ili sa PKA, te na taj na in
indirektno stimulie enzimsku aktivnost. Sugerisano je da vezivanje cGMP direktno aktivira PDE5
ali ovaj efekat nije demonstriran u in vivo sistemu. Pokazano je da je PDE6 u specifi nim
fotoreceptorima (rod PDE6-A i PDE6-B, i cone PDE6-C) gradjena od dve velike kataliti ki
aktivne subjedinice ( , u rods i u cones) koje su asocirane sa razli itim manjih inhibitornim
subjedinicama i subjedinicama. Veruje se da vezivanje cGMP za alsoterno mesto PDE6 regulie
interakciju izmedju kataliti kih subjedinica, inhibitornih subjedinica i transducin, veoma vaan
korak u fototransdukciji.
4.7.4.5. cGMP i elijska fiziologija
Kao to je napomenuto, veoma veliki broj fiziolokih odgovora elije je posredovan preko cGMP. U
daljem tekstu e biti veoma kratko prikazani samo najmarkantniji fizioloki odgovori koji se
aktiviraju cGMP-signalnim putem, uklju uju i regulaciju motiliteta elija glatkih mii a krvnih
sudova i intestinuma, regulaciju homeostaze intestinalnog fluida i elektrolita, kao i
fototransdukciju.
cGMP u estvuje u regulaciji motiliteta elija glatkih mii a zidova krvnih sudova i
intestinuma. Mehanizam koji karakterie kontrakciju glatke muskulature je baziran na
sinegisti kim i antagonisti kim silama/snagama koje reguliu intracelularnu koncentraciju Ca2+
[Ca2+]i. Kontraktilne snage prouzrokuju pove anje koncentracije intracelularnog Ca2+ i/ili
pove avaju senzitivnost intracelularne sredine za Ca2+. Sprotno tome, dilatiraju e snage redukuju
intracelularnu koncentraciju Ca2+ i/ili desenzitiziraju intracelularnu sredinu za Ca2+. Efekat ova
dva suprotna procesa je fosforilacija lakog lanaca miozina od 20 kDa (engl. Miosine Light Chain
20 kDa MLC20) na serinu 19 preko kinaze lakog lanca miozina, to dovodi do vazokonstrikcije.

176

Suprotno, defosforilacije MLC20 od strane fosfataze lakog lanca miozina produkuje

vazorelaksaciju.
Egzogeni i endogeni signalni molekuli (npr. nitro-vazodilatatori, endotelijalijumomobezbedjeni faktor relaksacije i nateiureti ni peptidi) prouzrokuju vazodilataciju preko pove anja
koncentracije intracelularnog cGMP-a.

Slika 4.34. Molekularni mehanizmi koji omogu avaju relaksaciju vaskularne glatke muskulature posredovanu preko cGMP.
cGMP prouzrokuje relaksaciju glatke muskulature kontrolom intracelularne koncentracije Ca2+ [Ca2+]i, i to redukcijom [Ca2+]i i desenzitivizacijom kontraktilnog aparata
prema Ca2+. cGMP redukuje [Ca2+]i preko nekoliko mehanizama: Inhibicijom influksa Ca2+ preko L-tipa Ca2+ kanala (1), ili pove anjem efluksa Ca2+ (2) preko aktivacije
ATPaze koja pumpa Ca2+ (2d) ili preko Na+/Ca2+ izmenjiva a (2b). Pored toga, cGMP moe da pove ava efluks Ca2+ stimulacijom hiperpolarizacije membrane preko
aktivacije Na+/K+ ATPase (2c) i K+ kanala (2a), te na taj na in pove ava izlazak Ca2+ preko Na+/Ca2+ izmenjiva a. Takodje, cGMP pove ava odvajanje Ca2+ preko
aktivacije ATPaze sarkoplazmati nog retikuluma koja pumpa Ca2+ (3; Ph-fosfolamban). cGMP smanjuje mobilizaciju Ca2+ preko inhibicije agonistima-indukovanog
formiranja IP3 ili preko inhibicije IP3 receptora na sarkoplazmati nom retikulumu(4; R-receptor, G-G protein, PLC fosfolipaza C, IP3R IP3 receptor). cGMP
desenzitivie kontraktilni aparat za Ca2+ (5) verovatno aktivacijom fosfataze lakog lanca miozina, to rezultira defosforilacijom lakog lanca miozina od 20 kDa .

177

cGMP, kao sekundarni glasnik aktivira dalje signal-transdukcione proteine, to kulminira

relaksacijom elija glatke muskulature i to na dva na ina:
i preko desenzitizacije
2+
kontraktilnog aparata prema Ca i smanjenjem intracelularne koncentracije Ca2+. Ove efekte
cGMP ostvaruje preko nekoliko molekularnih mehanizama (Slika 4.34.). cGMP-indukovana
redukcija [Ca2+]i se ostvaruje inhibicijom influksa Ca2+ preko L-tipa Ca2+ kanala (1), ili pove anjem
efluksa Ca2+ (2) preko aktivacije ATPaze koja pumpa Ca2+ (2d) ili preko Na+/Ca2+ izmenjiva a (2b).
Pored toga, cGMP moe da pove ava efluks Ca2+ stimulacijom hiperpolarizaciju membrane preko
aktivacije Na+/K+ ATPase (2c) i K+ kanala (2a), te na taj na in pove ava izlazak Ca2+ preko
Na+/Ca2+ izmenjiva a. Takodje, cGMP pove ava odvajanje Ca2+ preko aktivacije ATPaze
sarkoplazmati nog retikuluma koja pumpa Ca2+ (3; Ph-fosfolamban). cGMP smanjuje mobilizaciju
Ca2+ preko inhibicije agonistima-indukovanog formiranja IP3 ili preko inhibicije IP3 receptora na
sarkoplazmati nom retikulumu(4; R-receptor, G-G protein, PLC fosfolipaza C, IP3R IP3
receptor). cGMP desenzitivie kontraktilni aparat za Ca2+ (5) verovatno aktivacijom fosfataze lakog
lanca miozina, to rezultira defosforilacijom lakog lanca miozina od 20 kDa (MLC20). Prema tome,
cGMP ima veoma vanu, ali i kompleksnu ulogu u relaksaciji glatke muskulature koju ispoljava
preko kontrole intracelularne koncentracije Ca2+ (Slika 4.34.). Pored toga, smatra se da u in vivo
uslovima razli iti mehanizmi deluju sinergisti ki u smislu smanjenja [Ca2+]i i indukcije vaskularne
relaksacije kori enjem cGMP-a kao sekundarnog glasnika.
cGMP u estvuje u regulaciji homeostaze intestinalnog fluida i elektrolita.
Termostabilni bakterijski endotoksin, ST, indukuje skretornu diareju preko aktivacije guanilil
ciklaze i pove avanja intracelularne koncentracije cGMP-a (Slika 4.35.). Ciljni proteini u eliji za
ovaj patofizioloki efekat su epitelijalne elije koje oblau i ograni avaju intestinum jer je jedino u
njima detektovan receptor za ST a to je mGC-C. Poreme ajem ekspresije gena koji kodira ovaj
receptor rezultira rezistencijom prema ST-indukovanoj diareji, to demonstrira da je mGC-C
apsolutno neophodna za ST-indukovanu intestinalnu sekreciju. Pokazano je da, vezivanje ST za
mGC-C simulie intestinalnu sekreciju preko pove anja intracelularne koncentracije cGMP-a.
cGMP aktivira CFTR (engl. Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) i favorizuje
efluks hlorida to prvenstveno tera i transport vode u lumen intestinuma. Smatra se da je PKG
glavni molekularni target cGMP-a u nizu transdukcije signala i aktivacije CFTR. Pored PKG II, i
drugi mehanizmi posrduju cGMP-zavisnu aktivaciju CFTR. cGMP moe direktno da aktivira PKA i
da stimulie CFTR-posredovani hloridni efluks u humanim elijama kolona koje ne ekspresuju
PKG II (Slika 4.35.). Bakterije, kao to je E.coli imaju plazmide koji kodiraju familiju homologih
peptida tj. termostabilnih endotoksina, STs, i mogu da naseljavaju intestinum nakon
konzumiranja hrane i/ili vode koja je kontaminirana ovom bakterijom. Naseljene bakterije

178

produkuju ST u lumen intestinuma, a ST specifi no prepoznaje i vezuje se za mGC-C

ekspresovanoj na membrani epitelijalnih elija koje grade ivice etkastog pokrova elija
intestinalne mukoze. ST-indukovana aktivacija mGC-C rezultira pove anjem intracelularne
koncentracije cGMP-a i posledi nom
aktivacijom PKG II koja je takodje
lokalizovana
na
membrani
ivi nih
epitelijalnih
elija
etkastog pokrova
mukoznih intestinalnih elija (Slika 4.35.).
Slika 4.35. Regulacija intestinalne sekrecije posredstvom
ST-indukovane
aktivacije
mGC-C
i
pove anja
intracelularnog nivoa cGMP-a.
Bakterije, kao to je E.coli imaju plazmide koji kodiraju familiju
homologih peptida tj. termostabilnih endotoksina, STs, i mogu da
naseljavaju intestinum nakon konzumiranja hrane i/ili vode koja je
kontaminirana ovom bakterijom. Naseljene bakterije produkuju ST u
lumen intestinuma, a ST specifi no prepoznaje i vezuje se za mGC-C
ekspresovane na membrani epitelijalnih elija koje grade ivice
etkastog pokrova elija intestinalne mukoze. ST-indukovana aktivacija
mGC-C rezultira pove anjem intracelularne koncentracije cGMP-a i
posledi nom aktivacijom PKG II koja je takodje lokalizovana na
membrani ivi nih epitelijalnih elija etkastog pokrova mukoznih
intestinalnih elija. Pored toga, cGMP moe da aktivira i PKA, ili
direktno, ili inhibicijom cAMP-specifi nih PDEs i indukuju i akumulaciju
cAMP. CFTR protein (hloridni kanal) koji je takodje kolokalizovan sa
mGC-C i PKGII moe biti fosforilisan i sa PKG i sa PKA. Fosforilacija
CFTR kanala sa jednom od ove dve protein kinaze prouzrokuje
perzistentno stanje otvorenog kanala, to dozvoljava hloridima da se
kre u u smeru njihovog koncentracijskog gradijenta iz intracelularnog u
ekstracelularni kompartment, tj. da izlaze u lumen intestinuma. Drugi
jonski kanali i transporteri odravaju elektroneutralnost u eliji tokom
ST-indukovanog efluksa hlorida. Vektoralni protok vode od
bazolatelarne do apikalne povrine je navodjen ovom jonskom
provodljivo u, to rezultira akumulacijom fluida i elektrolita u
intestinalnom lumenu i prouzrokuje sekretornu diareju.

Pored toga, cGMP moe da aktivira i PKA, ili direktno, ili inhibicijom cAMP-specifi nih PDEs i
indukuju i akumulaciju cAMP. CFTR protein (hloridni kanal) koji je takodje kolokalizovan sa
mGC-C i PKGII moe biti fosforilisan i sa PKG i sa PKA. Fosforilacija CFTR kanala sa jednom od
ove dve protein kinaze prouzrokuje perzistentno stanje otvorenog kanala, to dozvoljava
hloridima da se kre u u smeru njihovog koncentracijskog gradijenta iz intracelularnog u
ekstracelularni kompartment, tj. da izlaze u lumen intestinuma. Drugi jonski kanali i transporteri
odravaju elektroneutralnost u eliji tokom ST-indukovanog efluksa hlorida (Slika 4.35.).
Vektoralni protok vode od bazolatelarne do apikalne povrine je navodjen ovom jonskom
provodljivo u, to rezultira akumulacijom fluida i elektrolita u intestinalnom lumenu i

179

prouzrokuje sekretornu diareju. Iako postoje dokazi o uklju enosti cGMP u regulaciji intestinalnih
fluida i homeostaze elektrolita, fizioloka zna ajnost ovih mehanizama nije sasvim jasna, ali
prisustvo mGC-C u intestinumu reptila i ptica sugerie jasnu evolutivnu konzerviranost ove
izoforme guanilil ciklaze. Pored toga, mievi kod kojih je poreme ena ekspresija gena ili za mGC-C
ili za njen down-stream ciljni protein, PKG II, ne ispoljavaju abnormalnosti u razvoju
intestinalnog trakta, izuzev izostanka odgovora na guanilin/uroguanilil/ST.
cGMP u estvuje u fototransdukciji. Fototransdukcija na spoljanjem segmentu retine
predstavlja ivi primer vanosti i neophodnosti cGMP u fiziolokim procesima. I ne samo to, cGMP
regulie i fazu obnavljanja vizuelne ekscitacije, kao i adaptaciju na svetlost podloge. Oba tipa
fotoreceptora (rod i cone) sadre unikatne proteine koji deluju kooperativno u kontroli
intracelularnih koncentracija klju nih sekundarnih glasnika cGMP i Ca2+ ([cGMP]i i[Ca2+]i). Ovo
potom regulie sve mehanizme kojima se omogu uje i obezbedjuje fototransdukcije i determinie
fizioloki odgovor na svetlo.

Slika 4.36. Uloga cGMP-a u fototransdukciji kod ki menjaka.

180

Molekularne komponenete sisarske fototransdukcione mainerije se kombinuju da bi kreirale

kompleksnu kaskadu u kojoj cGMP i Ca2+ veoma striktno interaguju da bi konvertovali
eksternalnu energiju (svetlost u formi fotona) u internalni signal (elektri ne impulse). Prema tome,
tokom mraka, visoki nivo cGMP osigurava [Ca2+]i od oko 500 nM i odrava spoljani segment
rod-receptora u depolarizovanom stanju. U ovakvim uslovima kompleks PDE6 je veoma slabo
aktivan, CNG1 kanal je otvoren, a aktivnost plazma membranskog Na+/Ca2+K+-izmenjiva a
limitira pove anje [Ca2+]i. Svetlo pokre e sekvencijalnu aktivaciju rodopsina, transducina i
kompleksa PDE6, to dovodi do hidrolize cGMP-a. Posledi no smanjenje intracelularne
koncentracije cGMP-a prouzrokuje zatvaranje CNG1 kanala i remeti struju Ca2+. Na taj na in se
smanjuje [Ca2+]i na oko 50 nM (to je 10 puta manje nego u mraku) i prouzrokuje
hiperpolarizacija membrane fotoreceptora. Svetlom-indukovano smanjenje [Ca2+]i se registruje i
ose a preko Ca2+-vezuju ih proteina koji nakon vezivanja Ca2+ inhibiu aktivaciju rodopsina i
stimuliu guanilil ciklze, pa prema tome pove avaju koncentraciju intracelularnog cGMP-a
posreduju i oporavak od fotoekscitacije.
Tokom zadnje dekade, sa ekspanzijom molekularnnih tehnika kloniranja, znanje o familiji guanilil
ciklaza i njihovim ulogama u fiziolokim i patofiziolokim procesima se dramati no proirilo. Ipak,
postoji veliki broj zna ajnih pitanja i zanimljivih izazova za budu a istraivanja, kao to su
precizni molekularni mehanizmi koji reguliu protok informacija izmedju razli itih domena
guanilil ciklaze u posredovanju receptor-efektor komunikacije. Pored toga, veoma je vano
definisati elijske komponente, signal-transdukcione proteine koji reguliu aktivnost guanilil
ciklaze, kao to su kinaze i fosfataze. Takodje, posebnu panju zasluuje odnos izmedju aktivnosti
guanilil ciklaze i elijskog metabolizma, posebno zbog toga to su mGCs tesno regulisne sa ATP, te
poreme aj intracelularne koncentracije ove molekule moe imati snane posledice na mGCposredovani signaling. Pored toga, neophodno je ispitati integraciju guanilil ciklaza u generalni
mehanizam elijske transdukcije signala, kao i cross-talk izmedju izmedju elementa GC-cGMPsignalinga i drugih signalnih kaskada, kao to je na primer cAMP-PKA signalni put (Slika 4.37.).
Na kraju, identifikacija i karakterizacija novih down-stream receptora za cGMP e dalje
definisati ulogu ovih vanih signal-transdukcionih mehanizama u elijskoj fiziologiji.

181

Slika 4.37. ematski prikaz signalnih

puteva aktiviranih cikli nim nukleotidima.
CNG (cyclic nucleotide-gated channels); GEF
(guanine nucleotide exchange factors); GPCR
(G
protein-coupled
receptors);
HCN
(hyperpolarization-activated
nonselective
cation channels); LPS+IFN (lipopolysacharide
+interferon); NOS (nitric oxide synthase); PDE
(phosphodiesterase); PKA (protein kinase A;
C and R, catalytic and regulatory units); PKG
(protein kinase G); Xn (PKA phosphorylated
proteins, including L-type voltage-gated Ca2+
channels, ryanodine and InsP3 receptors,
troponin, and CREB proteins); Yn (PKG
phosphorylated proteins, including InsP3
receptors, Ca2+-activated K+ channels and
CREB proteins).

182

4.8. SIGNALNA TRANSDUKCIJA PREKO RECEPTORA TIROZIN FOSFATAZA

Kao to je ve spomenuto, samo mali broj serin/treonin fosfataza je odgovoran za uklanjanje
fosfatne grupe sa fosforilisanih serinskih i treoninskih ostataka na proteinu. Nasuprot njima,
humani genom kodira oko 30 razli itih tirozin fosfataza (PTPs, engl. protein tyrosine
phosphatases). Kao i tirozin kinaze, tirozin fosfataze su u eliji zastupljene kao citoplazmati ne i
transmembranske forme. Za protein fosfataze je karakteristi no da imaju veliku specifi nost za
svoje substrate, tj. da uklanjaju fosfatne grupe samo sa odredjenih fosfotirozinskih ostataka iz
fosforilisanog proteina. Takodje, ove fosfataze omogu avaju kratak ivot fosforilacije tirozina, tako
da je nivo fosforilisanih tirozinskih ostataka u sastavu proteina elije nizak. Funkcija tirozin
fosfataza je regulisana, tako da se one aktiviraju samo u odgovaraju im fazama aktivacije
signalnog puta.
Dve citoplazmati ne tirozin fosfataze ki menjaka imaju SH2 domene, pa se zato zovu SHP-1 i
SHP-2. SHP-1 je uklju ena u prekidanje odgovora
na citokine, tako to defosforilie aktivirane Jak
proteine19. Kod mieva koji nemaju gen za SHP-1,
postoji nepravilnost u razvoju skoro svih krvnih
elija, to ukazuje na zna aj SHP-1 u hematopoezi.
Obe kinaze, SHP-1 i SHP-2, su uklju ene i u
prekidanje odgovora nekih RTKs.

Slika 4.38. Neki predstavnici protein tirozin fosfataza.

Citoplazmati ne tirozin fosfataze SHP-1 i SHP-2 imaju sli ne strukture sa dva
SH2 domena. Tri transmembranske tirozin fosfataze imaju dva intracelularna
fosfatazna domena (domen blii membrani obezbedjuje ve u / svu kataliti ku
aktivnost). DPTP je protein Drosophile; ostali su proteini sisara.

elije sisara poseduju veliki broj transmembranskih

protein fosfataza, uglavnom nepoznate funkcije. Za neke se pretpostavlja da imaju funkciju
receptora, pa se prema tome ozna avaju kao receptoru-sli ne tirozin fosfataze. Svi ovi molekuli
imaju jedan transmembranski segment i obi no poseduju dva tirozin fosfatazna domena na
citosolnoj strani plazma membrane. Primer ovakvog molekula je CD45 protein, koji se ekspresuje
19

Mutirani receptor za eritropoetin ne moe da regrutuje SHP-1, tako da JAK2 ostaje due aktivna.

183

na povrini svih leukocita. Iako ligand za ovaj receptor jo uvek nije identifikovan, smatra se da
CD45 protein ima ulogu u regulaciji aktivacije T i B limfocita, stranim antigenima. Uloga CD45
proteina u signalnoj transdukciji, je analizirana na transfekovanim elijama, koje su ekspresovale
rekombinantni hibridni protein, koji se sastojao od ekstracelularnog EGF-vezuju eg domena i
intracelularnog CD45 tirozin fosfataznog domena. Rezultati su, neo ekivano, pokazali da vezivanje
EGF za hibridni receptor inaktivie tirozin fosfataznu aktivnost molekula. Ovakvi rezultati su
ukazali na mogu nost medjusobne saradnje, receptor tirozin kinaze i receptor tirozin fosfataze,
prilikom vezivanja svojih ekstracelularnih liganada. U svakom slu aju, aktivnost CD45 proteina
neophodna je za aktivaciju limfocita, a zna aj ligandom izazvane inhibicije aktivnosti CD45
proteina jo uvek nije jasan.
Neke receptoru-sli ne tirozin fosfataze, pokazuju osobine adhezivnih proteina i mogu imati ulogu
formiranju medju elijskih kontakata. Na primer, mogu imati zna ajnu ulogu u navodjenju
aksona nervnih elija u toku razvoja nervnog sistema. Geni koji kodiraju neke receptoru-sli ne
tirozin fosfataze su dobro ekspresovani u nervnom sistemu Drosophile. Ukoliko dodje do ote enja
ili mutacije nekog od ovih gena, aksoni neurona u razvoju ne e uspeti da pronadju ciljnu eliju sa
kojom bi trebalo da grade sinapsu.
Transmembranske tirozin kinaze mogu da funkcioniu i kao ligandi koji e aktivirati receptore na
susednim elijama. Primer za to je protein tirozin fosfataza / , koja se ekspresuje na povrini
glijalnih elija u nervnom sistemu sisara. Protein tirozin fosfataza / , se vezuje za receptorne
proteine tzv. kontaktine na membrani neurona u razvoju, i stimulie eliju da formira duga ke
produetke. Postoji mogu nost da protein fosfataze, interakcijom sa neuronima, prenose i signale
na glijalne elije, medjutim, ovakav bidirekcioni prenos signala jo nije definitivno potvrdjen. Na
kraju, u nekim slu ajevima, protein fosfataze su potrebne da bi ponitile delovanje tirozin
fosfataza, to je neophodno za normalan rast i navodjenje aksona ka ciljnoj eliji.

184

4.9. SIGNALNA TRANSDUKCIJA PREKO TCR KOMPLEKSA

Za limfocite, jedine elije sposobne da specifi no prepoznaju antigen (nosioci imunog odgovora), je
karakteristi no da na svojoj membrani ekspresuju receptore visoke specifi nosti za odredjeni
antigen. To su tzv. receptori za antigen na T elijama tzv. TCR (engl. T cell antigen receptor) i na
B limfocitima tzv. BCR (engl. B cell antigen receptor), koji je u stvari antitelo vezano za
membranu B limfocita. Preko receptora za antigene se prepoznaju strani antigeni koji su prodrli u
organizam, a njihova aktivacija obezbedjuje specifi nost imunog odgovora. Sa druge strane,
vezivanje antigena za ove receptore, zajedno sa signalima koji poti u od mikroorganizama ili
produkata aktivacije mehanizama nespecifi ne imunosti, dovode do aktivacije imunog odgovora tj.
pokre u proliferaciju i diferencijaciju specifi nih limfocita. U daljem tekstu e biti opisan prenos
signala nastao vezivanjem antigena za TCR i aktivacija signalnih molekula koje pomau, receptoru
za antigen u aktivaciji T limfocita. Signalna transdukcija koja poti e od BCR-a je vrlo sli na onoj
koja se aktivira vezivanjem antigena za TCR.
TCR, moe da prepozna samo proteinske antigene koji su iskazani na povrini drugih elija, tako
da je za ispoljavanje njihove funkcije nuno da direktno reaguju sa drugim elijama npr. sa
inficiranim elijama doma ina, antigen-prezentuju im elijama, makrofagama i B limfocitima.
Specijalizovani proteini, koji imaju ulogu u iskazivanju antigena T limfocitima, su produkti gena
glavnog histokompatibilnog kompleksa (MHC, engl.
major histocompatibility complex). TCR prepoznaje
strukturu antigeni nog peptida kao i odredjene ostatke
MHC molekula, na povrini antigen-prezentuju ih ili
drugih elija doma ina.
Slika 4.39. TCR prepoznaje MHC+antigeni ni peptid

Biohemijski signal, koji se ostvaruje nakon prepoznavanja antigena od strane T limfocita, se ne

prenosi samim TCR nego su u taj proces uklju eni proteini koji su nekovalentno vezani za
antigenski receptor (CD i lanci) i predstavljaju TCR kompleks.
Za prepoznavanje antigena i prenos signala (signaling) su odgovorna dva seta molekula:
visoko varjabilni TCR na T limfocitima
signalni proteini (CD i lanci)

185

T elije ekspresuju i druge membranske receptore koji ne prepoznaju antigene ali doprinose
odgovoru T elija na antigene (adhezione molekule koje stabilizuju vezivanje T elija, za elije koje
prezentuju antigen na svojoj membrani). To su pomo ne molekule.

4.9.1. Struktura

TCR

TCR koji se ekspresuje na T limfocitima je heterodimer, uglavnom,

sastavljen od dva transmembranska, polipeptidna lanca ( i ),
kovalentno povezana disulfidnim vezama. i lanci se sastoje od Nterminalnog varijabilnog domena (V), konstantnog domena (C),
hidrofobnog
transmembranskog
domena
i
kratkog
citoplazmati nog domena. V domeni
i
lanaca sadre regione
visoke varijabilnosti (hipervarijabilne domene
ili CDRs; engl.
complementarity-determining regions).
Slika 4.40. TCR i pomo ne molekule.

Tri CDRs na lancu su rasporedjena pored tri sli na regiona na lancu tako da formiraju region
TCR-a koji specifi no prepoznaje antigen iskazan u kompleksu sa MHC molekulama. U
i
lanacu, CDR3 ima najve u varjabilnost i najvie doprinosi ukupnoj varjabilnosti TCR-a.
C domeni
i lanaca sadre regione koji imaju rezidue
cisteina koje doprinose medjusobnom disulfidnom
povezivanju dva lanca. Transmembranski (hidrofobni)
domen
sadri
rezidue
pozitivno
naelektrisanih
aminokiselina, kao to je lizin u lancu, i lizin i arginin
u
lancu. Ove rezidue interaguju sa negativnim
reziduama u transmembranskim regionima drugih
polipeptida koji formiraju TCR kompleks (CD i ). Oba
lanca, imaju kratke citoplazmati ne repove (5-12
ostataka aminokiselina).

Slika 4.41. Struktura

TCR

186

Citoplazmati ni regioni TCR-a su previe kratki da bi imali funkciju u transdukciji signala. Ovu
funkciju vre molekule koje su fizi ki povezane sa TCR-om i grade TCR kompleks.
4.9.2. CD3 i

proteini

CD3 i
proteini su nekovalentno povezani sa
TCR heterodimerom. Kada TCR prepozna
antigen, ovi proteini prenose signal (ogovorni su za signalnu transdukciju) koji vodi ka aktivaciji T
elija. CD3 molekula se sastoji iz 3 proteina: , i . TCR kompleks, takodje sadri i disulfidno
povezan homodimer
lanaca. CD3 i
proteini su identi ni na svim T elijama, nezavisno od
njihove specifi nosti, to je vezano za njihovu funkciju prenosa signala, a ne prepoznavanja
antigena.
4.9.2.1. Struktura CD3 i

proteina

Kao to je ve spomenuto CD3 proteini se sastoje od tri CD3 proteina to su , i lanci. N-terminalni ekstracelularni regioni ovih lanaca sadre Ig-sli an domen pripadaju Ig superfamiliji.
Transmembranski domeni, sva tri CD3 lanca, sadre negativno naelektrisani aspartat koji se vee
za pozitivno naelektrisane rezidue transmembranskog domena
i
lanaca TCR-a odrava
kompleks intaktnim. Citoplazmati ni domeni , i lanaca (od 44-81 ostataka aminokiselina) sadre po jednu kopiju konzervisane sekvence vane za transmisiju signala
immunoreceptor
tyrosine-based activation motif (ITAM). ITAM ima centralnu ulogu u signalingu preko TCR
kompleksa. On je takodje, nadjen, na citoplazmati nim regionima drugih membranskih proteina
limfocita koji su uklju eni u proces transdukcije signala ( lanci TCR kompleksa, lanci Ig i
Ig membranskih Ig na B limfocitima, kao i
kod nekoliko Fc receptora).
lanci su
izgradjeni od: kratkog ekstracelularnog regiona (9 aminokiselinskih ostataka), transmembranskog regiona koji sadri negativan
aspartat i duga kog citoplazmati nog repa
(113 ostataka aminokiselina koje imaju 3
ITAMa).

Slika 4.42. Komponente TCR kompleksa

187

Za ekspresiju TCR kompleksa potrebana je sinteza sve tri komponente.

Slika 4.43. Ekspresija TCR kompleksa.

U nedostaku CD3
(u stvari bilo koje
komponente) ne e do i do formiranja TCR
kompleksa, a svi proteini koji ga grade e biti
degradirani u eliji. Transfekovanje elija sa
genom koji nedostaje (u ovom slu aju gen za
CD3 ) e dovesti do formiranja i ekspresije TCR
kompleksa na elijskoj membrani.

4.9.2.2. Funkcije CD3 i proteina

CD3 i
proteini povezuju prepoznavanje antigena i biohemijske dogadjaje koji dovode do
funkcionalne aktivacije T limfocita.
Posle prepoznavanja antigena dolazi do fosforilacije tirozinske rezidue ITAMs u citoplazmati nom
repu CD3 i proteina. Fosfotirozin postaje vezno mesto za adapterne proteine i za tirozin kinazu
sa Src homologim 2 domenom (SH2), uklju uju i i ZAP-70 kinazu, koja se vee za lanac, kao i
Fyn kinazu koja se vee za CD3. Aktivacija ovih kinaza aktivira put signalne transdukcije koji
vodi ka promenama ekspresije gena u T elijama.
4.9.3. CD4 i CD8 koreceptori uklju eni u aktivaciju T limfocita
CD4 i CD8 su proteini koji se vezuju za nepolimorfni region MHC molekule i uklju eni su u
prenos signala tj. zajedno sa signalom TCR kompleksa iniciraju aktivaciju T elija.
4.9.3.1. Struktura CD4 i CD8 koreceptora
CD4/CD8 su transmembranski glikoproteini, lanovi Ig superfamilije.
CD4 se ekspresuje kao monomer, na povrini perifernih T limfocita, kao i nekih drugih elija. Ima
4 ekstracelularna Ig-sli na domena, hidrofobni transmembranski domen, i citoplazmati ni rep (38
ostatka aminokiselina). Preko svoja dva N-terminalna Ig-sli na domena, vee se za MHC molekul
klase II.

188

CD8 su disulfidno povezani heterodimeri, sastavljeni od CD8 i CD8 lanca. Oba lanca imaju
jedan ekstracelularan Ig-sli an domen, hidrofobni transmembranski region, i citoplazmati ni rep
(25 aminokiselinskih ostataka). Ig domen CD8, se vezuje za nepolimorfni domen MHC molekula
klase I.
4.9.3.2. Funkcija CD4 i CD8 koreceptora
CD8 koreceptori se selektivno vezuju za MHC molekule klase I. Ova klasa molekula se ekspresuje
na svim elijama koje imaju nukleus i uglavnom je vezana za iskazivanje intracelularnih antigena.
CD4 koreceptori se selektivno vezuju za MHC molekule klase II.
CD4/CD8 doprinose transdukciji signala nakon prepoznavanja antigena. Signalni put koji se
aktivira vezivanjem za CD4/CD8 koreceptore uklju uje aktivaciju specifi ne familije Src kinaza
tzv. Lck (engl. leukocyte-specific protein tyrosine kinase) koja je nekovalentno vezana za
citoplazmati ni rep CD4 i CD8 koreceptora. Prenos signala je posredovan Lck kinazom. Veza
CD4/CD8 i Lck je neophodna za maturaciju i aktivaciju T limfocita. Kada TCR prepozna antigen,
CD4/CD8 koreceptori se veu za odgovaraju e MHC
molekule. Ovo vezivanje pribliava koreceptor i njegovu
Lck, do TCR kompleksa, a Lck fosforilie tirozinske ostatke
ITAM-a u CD3 i lancima i tako inicira aktivaciju T elija.
Osim uloge u signalnoj transdukciji, CD4/CD8 koreceptori,
pove avaju adheziju T limfocita za ciljnu eliju ( eliju koja
prezentuje antigen+MHC I/II).
Slika 4.44. Lck signalni put u T limfocitima.
Lck je tirozin kinaza (Src familija) povezana sa
citoplazmaticnim repom CD4 i CD8. CD4/CD8 asocirana
Lck je neophodna za maturaciju i aktivaciju T elija.

4.9.4. Aktivacija TCR kompleksa

Cilj aktivacije kaskada signalnih reakcija u T elijama, je koordinisana aktivacija transkripcije
gena u T limfocitima, a od ijih produkata zavisi odgovor i funkcije aktiviranih T elija. Signalni
put koji se aktivira stimulacijom TCR kompleksa je najve im delom definisan in vitro analizama na

189

razli itim populacijama T elija. Dobijeni rezultati su definisali osnovne karakteristike signalne
transdukcije u T elijama.
Multiplim vezivanjem za TCR i koreceptore, aktivira se signalni put TCR-a.
Kao odgovor na prepoznavanje antigena dolazi do grupisanja membranskih receptora
(engl. clustering), fosforilacije tirozinskih ostataka nekoliko proteina, i aktivacije
adapternih proteina.
Signali TCR kompleksa, koordinativno aktiviraju nekoliko biohemijskih puteva:
signalni put Ras-MAP kinasa, put protein kinaze C, i kalcijum-kalcineurin signalni put.
Aktivacija ovih enzima se deava vrlo brzo nakon stimulacije TCR-a (nekoliko minuta), a
aktivacija svakog od ovih puteva indukuje transkripcione faktore koji stimu-liu ekspresiju
razli itih gena T elija.
U narednom tekstu e biti opisani
glavne etape u TCR signalnoj kaskadi.

Slika 4.45. Signalni putevi koji se aktiviraju

aktivacijom TCR kompleksa

4.9.4.1.

Rani dogadjaji na membrani: formiranje imunoloke sinapse i aktivacija

protein kinaza i adapternih proteina

Odmah nakon prepoznavanja antigena, na membrani T limfocita se pokre u procesi koji grupiu
molekule koji u estvuju u signalnoj transdukciji.

190

Formiranje imunoloke sinapse

Kada TCR kompleks prepozna kompleks antigen-MHC na membrani elija koje ga prezentuju,
dolazi do brze mobilizacije membranskih proteina, i intracelularnih signalnih molekula, na mesto
kontakta antigen-prezentuju ih elija i T limfocita.
Region fizi kog kontakta izmedju T elija i
antigen-prezentuju e elije se naziva imunoloka sinapsa. Molekuli na membrani T
elija se brzo mobiliu oko centra sinapse
koja uklju uje: TCR kompleks (TCR, CD3,
lance), CD4 ili CD8 koreceptore, receptore za kostimulatore (kao to su CD28),
kao i enzime i adapterne proteine koji su
povezani sa citoplazmati nim repom
transmembranskih receptora. Integrini se
nalaze na periferiji sinapse, gde doprinose
stabilizaciji kontakta izmedju T elije i
APC.
Slika 4.46. Fosforilacija tirozina u toku aktivacije T elija.
Nakon prepoznavanja antigena, CD4-povezana Lck postaje
aktivna i fosforilie ITAM-e CD3 i lanaca. ZAP-70 se vee za
fosfotirozine lanca i fosforilie ih i aktivira. Aktivni ZAP-70
fosforilie tirozine u razli itim adaptornim molekulama kao to je
LAT (B). Adapterni protein postaje vezno mesto za elijske
enzime kao to je PLC 1 i proteine koji aktiviraju Ras i MAP
kinaze (C), a ovi enzimi aktiviraju razli ite elijske odgovore

Mnoge sinapse se nalaze u regionima elijske membrane koji se razlikuju u lipidnom sastavu od
ostalih regiona membrane mikrodomeni oboga eni glikolipidima. Prepoznavanje antigena
stimulie organizaciju membranskih molekula u sinapsu i angaovanje signalnih puteva koji
aktiviraju proteine citoskeleta.

191

Aktivacija tirozin kinaza.

Odmah nakon organizacije membranskih molekula i formiranja sinapse dolazi do aktivacije tirozin
kinaza20 povezanih sa citoplazmati nim domenima molekula CD3 i koreceptornih proteina, kao i
fosforilacija tirozna u CD3 i lancima. Citoplazmati ni regioni CD3 i lanaca sadre peptidnu
sekvencu tzv. ITAM (engl. immunoreceptor tyrosine-based activation motifs) koja e biti
fosforilisana Lck-om, kinazom koja pripada Src familiji tirozin kinaza, i koja je povezana sa Cterminalnim repom CD4/CD8 koreceptora21. Lck moe biti aktivirana autofosforilacijom, a aktivna
Lck fosforilie tirozinske ostatke ITAM-a u CD3 i lancima.
Jo jedna kinaza je fizi ki povezana sa TCR kompleksom. To je Fyn, kinaza koja je povezana sa
CD3 proteinom i ima sli nu ulogu kao Lck.
Fosforilisani tirozin u okviru ITAM sekvence postaje vezno mesto (docking site) za tirozin kinazu
ZAP-70 (engl. -associated protein of 70-kD). ZAP-70 sadri dva konzervisana regiona koja se veu
za fosfotirozine ITAM sekvenci lanaca. Vezani ZAP-70 postaje substrat za susednu Lck, koja
fosforilie tirozine ZAP-70. Jednom aktivirani ZAP-70, moe da se autofosforilie kao i da
fosforilie brojne signalne molekule. Kriti no mesto za aktivaciju downstream signalnih
molekula je aktivacija ZAP-70. Da bi se dostigao kriti an nivo angaovanja ZAP-70 molekula
potrebna je njegova multipla aktivacija i multipla fosforilacija ITAMs-a lanaca22.
Jo jedna kinaza koja ima ulogu u aktivaciji T elija je PI-3 kinaza (engl. phosphatidylinositol-3),
koja fosforilie inozitol-lipide povezane sa membranom. Ovaj enzim se regrutuje aktivacijom TCRa i adapternih proteina, a on generie nastajanje nastajanje fosfatidilinozitol trifosfata (PIP3) od
membranskih bifosfata. PIP3 je vezno mesto za fosfolipazu C i Itk kinazu (engl. IL2-inducible Tcell kinase), kao i Btk u B limfocitima. PI-3 kinaza je uklju ena i u signaling koji poti e od CD28
molekula.
Aktivnost kinaza u T elijama je kontrolisana delovanjem tirozin fosfataza. Tirozin fosfataze
mogu da defosforiliu tirozinske ostatke, i na taj na in inhibiu ili stimuliu enzimsku aktivnost

Tirozin kinaze su enzimi koji kataliu fosforilaciju ostatka tirozina u razli itim proteinskim supstratima.
Kada se TCR vee za peptid-MHC kompleks, veza e se i CD4 ili CD8 koreceptori za nepolimorfne regione molekula klase II ili I vezivanje e
pribliiti citoplazmati ne repove CD4/CD8 koreceptora, ITAM regionima, CD3 i lanaca.
22 Potreba da se jedna T elija vee za antigen vie puta
svaki in vezivanja dovodi do ponovne fosforilacije ITAM-a lanaca, to vodi ka
multiplom angaovanju ZAP-70 molekula.
20

21

192

kinaza. TCR kompleks angauje dva tipa fosfataza. To su SHP-1 i SHP-2, koje funkcioniu tako
to inhibiu signalnu transdukciju uklanjanjem fosfatne grupe iz klju nih signalnih molekula.
Regrutovanje i aktivacija adapternih proteina
Aktivirani ZAP-70 fosforilie nekoliko adapternih proteina koji aktiviraju/veu signalne molekule.
Adapterni proteini23 veu signalne molekule i organizuju ih u specifi ne elijske kompartmane
(regione) i tako promoviu aktivaciju odredjenog signalnog puta. Za aktivaciju TCR signalne
kaskade, neophodna je aktivacija ZAP-70 i fosforilacija LAT adapternog proteina (engl. linker
activation of T cells). Fosforilisani tirozini LAT molekule su vezno mesto za SH2 domene drugih
adapternih molekula i enzima uklju enih u nekoliko signalnih kaskada. Aktivirani LAT direktno
vezuje fosfolipazu C 1 (klju ni enzim aktivacije T elija), i koordinie regrutovanje nekoliko drugih
adapternih proteina (SLP-76 kao i Grb-2) u imunoloku sinapsu.

4.9.5. Signalni put Ras-MAP kinaze u T limfocitima

Kao to je re eno, Ras je pripadnik familije guanozin nukleotid-vezuju ih proteina (mali G
proteini) koji su uklju eni u aktivaciju razli itih procesa u mnogim elijama. On je povezan sa
elijskom membranom preko kovalentno vezanih lipida. U neaktivnoj formi, vezno mesto Ras-a za
guanin nukleotide je okupirano guanozin-difosfatom (GDP). Kada se vezani GDP zameni
guanozin-trifosfatom (GTP), Ras se konformaciono izmeni i moe da regrutuje/aktivira razli ite
enzime.
Kada ZAP-70 fosforilie LAT, za LAT se vezuje Grb-2 (preko svog SH2 domena). Grb-2 angauje
Ras GTP/GDP faktor razmene, nazvan Sos, koji katalie zamenu GDP sa GTP molekulom i tako
nastaje forma Ras-a vezana sa GTP-om (Ras GTP). Ras GTP funkcionie kao alosterni aktivator
enzima zvanih MAP kinaze (engl. mitogen activated protein). U T elijama postoje tri glavne MAP
kinaze: ERK, JNK i p38.
Ras GTP stimulie aktivaciju, MAP kinazne kaskade, koja uklju uje najmanje tri razli ite kinaze,
a svaka od njih fosforilie/aktivira slede u u kaskadi. Aktivacija, MAP kinazne kaskade dovodi do

23 Adapterni proteini sadre strukturne motive/domene kojim se vezuju za druge proteine. Ovi motivi uklju uju motive koji veu Src 2 i 3 domene

(SH2 i SH3), fosfotirozin-vezuju e domene (PTB) i PH domene.

193

aktivacije ERK-a24 (engl. extracellular receptor-activated kinase) koji fosforilie protein Elk, koji
stimulie Fos, komponentu neophodnu za aktivaciju transkripcionog faktora AP-1 (activation
protein-1).
Paralelno sa aktivaciom Ras-a, TCR-povezane kinaze takodje mogu da aktiviraju i drugi GTP/GDP
izmenjiva ki protein, tzv. Vav, koji deluje na drugi mali G protein Rac. Rac GTP inicira
aktivaciju enzimske kaskade, koja rezultuje aktivacijom MAP kinaze, zvane JNK (engl. c-Jun Nterminal kinase). Aktivirana JNK fosforilie c-Jun, drugu komponentu neophodnu za aktivaciju
AP-1 transkripcionog faktora.

Slika 4.47. Ras-MAP signalni put u aktivaciji T limfocita.

ZAP-70 se aktivira prepoznavanjem antigena (videti sliku 4.8.) fosforie adapterne
proteine vezane za membranu, to onda dovodo do vezivanje drugog adaptera Grb-2.
ZAP-70 fosforilie Grb-2 prave i mesto za privla enje Sos faktora za GTP/GDP
razmenu. Sos konvertuje Ras GDP u Ras GTP (nije prikazan) koji aktivira kaskadu
enzima, to kulminira aktivacijom MAP kinaze koja se zove ERK kinaza. Paralelan
Rac-zavistan put koji se naziva stresom-aktiviranog proteina (engl. Stress-Activated
Protein - SAP), ili SAP-zavisni kinazni put generie drugu aktivnu MAP kinazu koja se
zove JNK kinaza (nije prikazano na slici).

Tre i pripadnik familije MAP kinaza, je p38. Ova

kinaza se takodje aktivira Rac GTP sistemom, a
rezultat njenog angaovanja je aktivacija razli itih
transkripcionih faktora.

4.9.6. Kalcijum- i protein kinaze C-posredovan signalni put u T limfocitima

TCR signalni put uklju uje i aktivaciju 1 izoforme fosfolipaze C (PLC 1), a produkti nastali
hidroliti kim razlaganjem membranskih lipida aktiviraju transkripcione faktore u T elijama.
PLC 1 je citosolni enzim specifi an za inozitol fosfolipide. Fosforilisani LAT, aktivira PLC 1, koja
katalie hidrolizu membranskih fosfolipida tj. PIP2. Nastali IP3 i DAG aktiviraju dva odvojena
signalna puta u T elijama.

24 ERK je sinonim za MAP kinazu. ERK (ili MAP kinaza), JNK, i p38 su kinaze, koje se ekspresuju u elijama eukariota, a pripadaju istoj
superfamiliji, superfamiliji MAP kinaza.

194

IP3 difunduje kroz citoplazmu do

endoplazmatskog retikuluma, gde se
vezuje za receptor i stimulie oslobadjanje Ca++ iz endoplazmatskog
retikuluma, pove avaju i nivo slobodnog Ca++ u citoplazmi sa 100 nM do
600 ili ak 1000 nM. Ca++ se vezuje za
kalmodulin, a kompleks Ca++ - kalmodulin aktivira nekoliko enzima, ukljuuju i i serin/treonin fosfatazu
kalcineurin.

Slika 4.48.
Signaling u T limfocitima preko
metabolizma membranskih inozitol fosfolipida.

DAG je hidrofobna molekula koja ostaje u elijskoj membrani, na mestu gde je formirana.
Kombinacija povienog nivoa intracelularnog Ca++ i DAG-a, aktivra PKC koja je povezana sa
elijskom membranom. Aktivirana PKC se konformaciono menja, tako da njeno katiliti ko mesto
postaje dostupno supstratu.
4.9.7. Aktivacija transkripcionih faktora koji reguliu ekspresiju gena u T limfocitima
Enzimi angaovani TCR signalnom kaskadom, aktiviraju transkripcione faktore, koji se
vezuju za regulatorne domene brojnih gena u T elijama, i aktiviraju njihovu transkripciju.
Citoplazmati ni putevi signalne transdukcije vode ka aktivaciji efektornih enzima, kao to su
kinaze ERK, JNK i PKC, kao i fosfataza kalcineurin. Ovi enzimi doprinose aktivaciji
transkripcionih faktora kao to su NFAT, AP-1 i NF- B koji funkcioniu kao stimulatori ekspresije
gena u antigen-stimulisanim T elijama.
NFAT (engl. nuclear factor of activated T cells) je transkripcioni faktor neophodan za ekspresiju
IL-2, IL-4, TNF i drugih citokinskih gena. On je prisutan u inaktivnoj, serin-fosforilisanoj formi u
citoplazmi nestimulisanih T limfocita. NFAT se aktivira kalcijum-kalmodulin zavisnom fosfatazom,

195

kalcineurinom. Kalcineurin defosforilie citoplazmatski NFAT, i na taj na in izaziva njegovu

translokaciju u nukleus.
AP-1 je transkripcioni faktor nadjen u mnogim tipovima elija. AP-1 je ime za familiju DNAvezuju ih faktora izgradjenih od dimera dva proteina koja se medjusobno veu preko zajedni kih
strukturnih motiva tzv. leucine zipper. AP-1 faktor, koji je najbolje opisan, se sastoji iz Fos i Jun
proteina.
NF- B su homodimerni ili heterodimerni proteini koji su homologi sa proto-onkogenima
zna ajnim za transkripciju mnogih gena u razli itim tipovima elija. NF- B je prisutan u
citoplazmi u kompleksu sa proteinima inhibitorima B (I B) koji spere avaju njegovu
translokaciju u nukleus. Signalne kaskade PKC, MAP kinaze, kao i porast intracelularnog
kalcijuma stimuliu fosforilaciju I B kinaze koja fosforilie I B. Za fosforilisanu formu I B se
vezuju peptidi ubikvitina, koji je obeleavaju za proteoliti ku degradaciju u proteazomima. Nastali
NF- B se translocira u nukleus, gde doprinosi aktivaciji citokinskih gena i gena za receptore
citokina.

Slika 4.49. Aktivacija

faktora u T elijama.

transkripcionih

Veliki broj signalnih puteva konvergira u antigenimastumulisanim T elijama, u cilju aktivacije i

generisanja transkripcionih faktora koji stimuliu
ekpresiju razli itih gena (u ovom slu aju IL-2 gena).
Kalcijum kalmodulinom aktivirani NFAT, kao i Ras
i Rac signalni putevi generiu dve komponenete AP1. Manje se zna o vezi izmedju TCR signala i
aktivacije NF-kB (NF-kB je prikazan kao kompleks
od dve subjedinice koje su tipi no p50 i p65 proteini
nazvani prema njihovoj molekulskoj veli ini u
kilodaltonima). PKC je vana u aktivaciji T elija, a
PKC je posebno vana u aktivaciji NF-kB. Svi ovi
transkripcioni faktori funkcioniu koordinativno u
regulaciji genske ekspresije. Obratiti panju na
injenicu da je prikazano da razli iti signalni putevi
aktiviraju jedinstvene trankripcione faktore, ali
postoji i razumljivo preklapanje pojedinih signalnih
puteva, pa svaki signalni put moe da igra ulogu u
aktivaciji velikog broja transkripcionih faktora.

196

SIGNALING KOJI UKLJU UJE SIGNALOM

REGULISANU PROTEOLIZU

05

Potreba za sinhronizovano koordinisanom intracelularnom transdukcijom signala nije

nikada ve a nego tokom razvoja organizma. Svaka elija u embrionu treba da bude vodjena
kroz razvojni put ili neki drugi put u zavisnosti od njenihovog porekla, pozicije i karkatera
njihovih suseda. Na svakom koraku razvojnog puta, elije moraju da razmenjuju signalne sa
svojim susedima da bi koordinisale svoje ponaanje prema njihovom. Ve ina signalnih puteva koji
su do sada opisani se iroko koriste tokom razvojnog puta i svi oni su tzv. reverzibilni signalni
putevi kod kojih je inaktivacija jednako vana kao i inicijalna aktivacija. Pored ovih, postoje i
drugi signalni putevi koji razvode signale u unutranjosti elije i u estvuju u razvoju organizma i
koji su esencijalni signalni putevi, ali ireverzibilni jer se komponente signalnog puta
proteoliti ki cepaju. Svi ovi signalni putevi su zavisni bar delom od regulisane proteolize.
Iako su mnogi od njih otkriveni kroz geneti ke studije na Drosophili melanogaster, oni su visoko
evolutivno konzervisani i koriste se opet i ponovo tokom animalnog razvoja.
U ovom poglavlju e biti opisana etiri signalna puta: (1) Signalni put koji zavisi od aktivacije NF, regulatornog proteina latentnih gena i ija aktivacija dozvoljava elijama da odgovaraju odmah
i odlu no na veliki broj stresom-indukovanih uslova. (2) Notch25/Delta signalni put koji tokom
razvoja determinie sudbinu mnogih tipova elija. Proteoliti ku aktivaciju elijskog-povrinskog
Notch receptora facilitira presenilin 1, membranski protein koji ima implikacija u Alzheimer-ovoj
bolesti. (3) Signalni put aktiviran sekretovanim Wnt26 proteinima, signalnim molekulima koji
Notch (sr. urez, leb) receptori su receptorni proteini koji imaju takvu strukturu koj li i na eleb ili urez u koji se ume u Delta ligandi.
Wnt je kovanica kombinacije Wg (engl. wingless) i Int. Wg gen je originalno identifikovan kao gen za polarnost segmenta kod Drosophile
melanogaster, a koji funkcionie tokom embriogeneze, ali i metamorfoze tj. formiranju adulta. INT geni su orginalno identifikovani kao geni
ki menjaka u blizini nekoliko mesta za integraciju MMTV (engl. Mouse Mammary Tumor Virus). Int-1 gen i Wg gen su homologi i smatra se da su
evolutivno nastali od istog preda kog gena.
25

26

197

posreduju u kontroli mnogih razvojnih procesa. (4) Signalni put aktiviran sekretovanim
Hedgehog27 (Hh) proteinima, signalnim molekulima koji posreduju u kontroli mnogih razvojnih
procesa i beski menjaka i ki menjaka. Sva etiri signalna puta imaju klju nu ulogu u animalnom
razvoju. Ukoliko je bilo koji od njih inaktivisan, razvoj organizma je ozbiljno poreme en i ivotinja
umire kao embrion ili tokom rodjenja.

5.1. NF-kB SIGNALNI PUT

Kao to je napomenuto ranije, signalom-indukovana fosforilacija je od neobi ne vanosti za
modulaciju aktivnosti mnogih transkripcionih faktora. Drugi mehanizam signalnom-indukovane
regulacije aktivnosti transkripcionih faktora je proizaao iz studija i na sisarskim elijama i na
elijama Drosophile melanogaster i uklju uje fosforilaciju, a potom i posledi nu ubiquitinomposredovanu degradaciju inhibitornog proteina. Najizrazitiji primer ovakvog mehanizma aktivacije
transkripcionih faktora je aktivacija NFtranskripcionog faktora.

5.1.1. Signalom-indukovana degradacija citosolnog inhibitornog proteina aktivira NFtranskripcioni faktor

NF-

(engl. Nuclear Factor appa ) proteini su regulatorni proteini latentnih gena koji
predstavljaju sr u regulaciji inflamatorni procesa. NFsingnalni put je prvobitno otkriven na
osnovu njegove transkripcione aktivnosti u ekspresiji gena koji kodira
laki-lanac antitela
(imunoglobulina) u B elijama, a danas se zna da je NFglavni transkripcioni regulator u
imunom sistemu sisara. Iako muice ne prave antitela, otkriven je intracelularni i ekstracelularni
protein, Dorsal, koji je NFhomolog, i kod Drosphila posreduje imuni odgovor uperen prema
bakterijskim i viralnim infekcijama, i to preko indukcije sinteze velikog broja antimikorobijalnih
peptida koji se sekretuju iz elija. Ovo sugerie da je NFregulatorni sistem star vie od pola
biliona godina. NFse veoma brzo aktivira u odgovoru elija imunog sistema sisara na

27 Hedgehog (sr. je) signalni put je klju ni regulator animalnog razvoja konzervisan od muice do oveka. Ovaj signalni put je dobio ime od
njegovog polipeptdinog liganda, intracelularne molekule koja se zove Hedgehog i koji je pronadjen kod Drosophile melanogaster. Hh je jedan od
produkata gena za segmentarnu polarnost Drosophile uklju en u ustanovljavanju baze za plan tela ove muice. Mutacija u samo jednom genu
Hedgehog proteina produkuje larvu sa iljatim procesima (zubi ima), te ona podse a na jea (engl. hedgehog).Ovaj molekul je veoma vaan tokom
kasnijih faza embriogeneze i metamorfoze. Sisari imaju tri Hedgehog homologa od kojih je tzv. SHh (engl. Sonic Hedgehog) najvie istraen, a
postoje jo i DHh (engl. Desert Hedgehog) i Ihh (engl. Indian Hedgehog). Sva tri puta su jednako vana tokom embrionalnog razvoja.

198

infekciju, inflamaciju, kao i brojne stresogene situacije, kao to je jonizuju a radijacija. Pored
toga, NFse takodje aktivira sa tzv. inflamatornim citokinima kao to su TNF- i IL-1, koji
se sekretuju iz okolnih elija (najvie makrofaga), a kao odgovor na infekciju. Iako su receptori za
ova dva proinflamatorna citokina strukturno razli iti, operiu na sli an na in.
lanovi familije NFproteina dele strukturnu homologiju sa retroviralnim onkoproteinom v-Rel,
pa se nekada klasifikuju i kao NF- /v-Rel familija proteina. Postoji pet definisanih lanova
familije NFproteina u sisarskim elijama: RelA (jo se zove p65), RelB, c-Rel, NF( jo se
zove p50), NF( jo se zove p52). lanovi familije NFproteina mogu da formiraju
homodimere i heterodimere, a svaki od ovih dimera aktivira karakteristi an set gena. Inhibitorni
protein Ise tesno vezuje za ove dimere i dri ih u inaktivnosm stanju, u sklopu velikog
proteinskog kompleksa u citosolu. Sve subjedinice heterodimernog NFimaju homologe
regione, na njihovim N-terminusima, koji su neophodni za dimerizaciju i vezivanje za DNK. U
stanju mirovanja, NFje odvojen u citosolu u inaktivnom stanju preko direktnog vezivanja za
inhibitoni protein I- . Jedan molekul I-kB se vezuje za N-terminalne domene svake subjedinice
p50/p65 , te na taj na in
maskira
signal
za
nuklearnu
lokalizaciju
(engl.Nuclear Localization
Signals - NLS). Vezivanje
signala, kao to su TNFili IL-1 aktiviraju signalni
put vezivanjem za svoje
receptore na povrini
elije.
Protein ki-nazni
kompleks koji je nazvan
Ikinaza, je ta ka
konvergencije
svih
ekstracelularnih signala
koji
aktiviraju
NF(Slika 5.1. i Slika 5.2.)

Slika 5.1. NF-

signalni put.

199

U toku nekoliko minuta od stimulacije receptora aktivira se TAK1 (engl. Transcriptional factor
Activated Kinase 1, act like mitogen-activated protein kinase kinase kinase) koja inicira aktivaciju
Ikinaze, a ona aktivirana fosforilie dva N-terminalna serinska ostatka na I- . Potom se za
ove fosfo-serine vezuje E3 ubiquitin ligaza i vri poliubikvitinaciju I- , zapo inju i njegovu
momentalnu degradaciju proteazomom (videti sliku 4.18. u prethodnom poglavlju 4). U elijama
koje ekspresuju mutantnu formu Ikod koje su ova dva klju na serina zamenjena alaninima, te
prema tome ne mogu biti fosforilisana, NFje permanentno represovan, to jasno demonstrira
da je fosforilacija Iesencijalna za aktivaciju NFsignalnog puta.
Slika

5.2.

Aktivacija

NF-

signalnog puta sa TNF- .

I TNF- i njegov receptor su trimerni
proteini. Vezivanje TNF- prouzrokuje
rearaniranje
grupisanih
(engl.
clustered) citoplazmatskih repova
receptora koji potom regrutuju veliki
broj intracelularnih signalnih proteina,
uklju uju i RIP kinazu (engl. ReceptorInteracting Protein kinase) i dva
adapterna proteina, TRADD (engl.
DeathTNF-Receptor-Associated
Domain protein ) i TRAF2 (engl. TNFReceptor-Associated Factor 2). Ovo
potom regrutuje i
aktivira jo
nedefinisanu kinazu koja je nazvana
IKKK (engl. IKinase Kinase
Kinase) koja fosforilie i aktivira IKK
Kinase Kinase). IKK je
(engl. Iheterodimer gradjen od dve kinazne
subjedinice (IKK- i IKK- ) i jedne
regularne adapterne subjedinice koja je
nazvana IKK- . IKK- fosforilie Ina dva serina, te time markira I-KB
protein za ubikvitinaciju i degradaciju u
proteazomima. Signal za nuklearnu
lokalizaciju izloen na slobodnom NFsada usmerava transport ovog
proteina u nukleus, gde on, u
kooridinisanoj kolaboraciji sa drugim
koaktivatorima, stimulie transkripciju
ciljnih gena. Pored gena koji su
uklju eni u imuni odgovor, NF-kB
aktivira Igen (nije prikazano)..
Uloga RIP nije jasna: iako je njegovo
prisustvo neophodno za TNFsignaling, njegov kinazni domen nije.

200

Odvajanje Iod NFotkriva i izlae region signala za nuklearnu lokalizaciju, te se NFtranslocira u nukleus i aktivira transkripciju velikog broja ciljnih gena. Bez obzira na njegovu
ativaciju proteolizom, NFsignaling eventualno moe biti ugaen negativnom povratnom
spregom, ukoliko jedan od gena, ija je transkripcija momentalno indukovana sa NF- , kodira I. Ovo moe dovesti do pove anja niova Iproteina koji u nukleusu vezuje aktivni NFi
vra a ga u citosol.
NFstimulie transkripciju vie od 150 gena uklju uju i i gene koji kodiraju citokine i
hemokine koji privla e elije imunog sistema i fibroblaste do mesta infekcije. Pored toga, NFfavorizuje ekspresiju receptornih proteina koji omogu avaju neutrofilima da migriraju iz krvi u
okolna tkiva. Takodje, NFstimulie ekspresiju inducibilne forme enzima koji produkuje azot
oksid (engl. inducible Nitric Oxide Synthase - iNOS), koji je toksi an za bakterijske elije, kao i
transkripciju nekoliko anti-apoptoti kih faktora koji preveniraju programiranu elijsku smrt.
Prema tome, ovaj jedan jedini transkripcioni faktor koordinira i aktivira odbranu organizma ili
direktnim odgovorom na patogene i stresogne stimuluse, ili indirektnim odogovorom na signalne
molekule oslobodjene iz drugih inficiranih ili ozledjenih elija i tkiva.
Pored uloge u infalamaciji i imunitetu, NFigra zna ajnu ulogu u procesima razvoja. Na primer,
embrioni mia koji ne ekspresuju jednu od subjedinica I-kB kinaze umiru zbog degeneracije jetre
uzrokovane preteranom apoptozom elija koje bi normalno preivele. Smatra se da je degradacija
proteina zavisna od fosforilacije uobi ajeni regulatorni mehanizam u mnogim razli itim elijskim
procesima.

201

5.2. NOTCH/DELTA SIGNALNI PUT

Signaling od Notch receptornog
ivotinja. Osnovna uloga mu je
amplifikacijom i konsolidacijom
ograni avaju. I Notch protein i
velikim brojem ponovaka koji li

proteina je moda najvie kori eni signalni put u razvoju

da kotrolie izbor elijske sudbine tokom razvoja, uglavnom
molekularnih razli itosti izmedju elija koje se medjusobno
njegov ligand Delta protein su transmembranski proteini sa
e na epidermalni faktor rasta, EGF (engl. Epidermal Growth

Factor, EGF -like repeats) u svojim ekstracelularnim domenima. Iako je Notch singalning uklju en
u razvoj mnogih tkiva, najpoznatiji je po svojoj ulozi u produkciji nervnih elija kod Drosophile.
Nervne elije obi no rastu kao izolovane pojedina ne elije medju epitelijalnim slojem
prekurskorskih elija. Tokom ovog procesa, svaka budu a nervna elija, ili opredeljena
progenitorna elija nervne- elije, alje signale ka svom najbliem susedu da se ne razvija u istom
pravcu u isto vreme. Ovaj proces se naziva lateralna inhbicija i u njemu se podrazmeva da
okolne-grani ne i razvojno ekvivalentne elije koje su u kontaktu imaju razli ite sudbine. Proces
lateralne inhibicije u kome u estuvu i Notch protein i njegov Delata ligand je visoko konzervisan i
veoma van tip elijske diferencijacije i kod beski menjaka i ki menjaka. Ovaj proces je posebno
vaan spre avanju formiranja previe prekursora nervnih elija od nediferenciranog sloja
epitelijalnih elija. Na primer, u embrionu muice, inhibisane elije oko budu eg prekursora
nervne elije e se razvijati u epidermalne elije. Lateralna inhbicija zavisi od kontakt-zavisnih
signalnih mehanizama koji su posredovani preko signalnog proteina Delta izloenog na povrini
budu ih nervnih elija. Vezivanjem za Notch na susednim elijama, Delta ligand daje signal
susednim elijama da ne postanu nervne elije (Slika 5.3.).

Slika 5.3. Lateralna inhibicija posredovana sa Notch i Delta tokom

razvoja nervnih elija kod Drosophila.
Kada pojedina ne elije epitela otpo nu svoj razvoj u nervne elije,
istovremeno alju signale susednim elijama i time spre avaju njihov
razvoj u nervne elije.Ovaj inhibitorni kontakt-zavistan signaling
posredovan je ligandom Delta, koji se pojavljuje na povrini budu ih
nervnih elija i vezuje se za Notch proteine susednih elija. U mnogim
tkivima, sve elije jedne grupacije inicijalno ekspresuju i Delta i Notch,
pri emu postoji kompeticija me u njima. elija koja pobedi u ovoj
kompeticiji ima e snano izraenu ekspresiju Delta liganda, te e usled
toga imati sposobnost i da inhibie susedne elije. U nekim slu ajevima
dopunski faktori interaguju sa Delta ili Notch, kako bi pojedine elije
inili osetljivim na kasnije inhibitorne i druge priguuju e signale.

202

Kada postoje poreme aji u procesu transdukcije signala ovog tipa kod muica, elije-susedi
nervnih elija e se takodje razviti u nervne elije i produkovati mnogo vie neurona na ra un
epidermalnih elija, to je smrtonosno. Signaling izmedju elija koje su bliski susedi preko Notch i
Delata (ili Delta-sli nog proteina Serrate) regulie izbor sudbine elije u velikom broju razli itih
tkiva, pomau i da se kreira fino graduisani obrazac raznovrsnih tipova elija. Pored lateralne
inhibicije, Notchom-posredovan signling moe imati i druge efekte u nekim tkivima, i to na primer,
da radi u obrnutom smeru, tj. da prouzrokuje da se susedne elije ponaaju sli no.

5.2.1. Regulisana intramembranska proteoliza katalisana preselinom 1 aktivira Notch

receptor
I Notch receptorni protein i Delta ligand su transmembranski proteini koji jednom presecaju
elijsku membrani i oba ova proteina zahtevaju proteoliti ko procesovanje da bi bili funkcionalni.
Iako jo uvek nije jasno zato Delta ligand treba da bude razloen, proteoliza Notch proteina je
glavi mehanizam kojim Notch aktivacija menja ekspresiju gena u nukleusu. Kada se Notch
aktivira vezivanjem Delta, intracelularne proteaze odvajaju citoplazmati ni rep od Notch
proteina. Oslobodjeni rep se premeta u nukleus da aktivira transkripciju seta gena koji
odgovaraju na Notch-aktivaciju (engl. Notch-responsive genes). Notch rep deluje preko vezivanja
za genski regulatorni protein CSL (tako se zove kao kombinacija tri naziva proteina: engl. CBF1 in
mammals, Suppressor of hairless in flies and Lag-1 in worms). Vezivanje Notch repa aktivira CSL
i konvertuje ga iz transkripcionog represora u transkripcionog aktivatora. Produkti glavnih gena
koji su aktivirani Notch signalingom su i sami proteini regulatori gena (genski regulatorni
proteini), ali sa inhibitornim delovanjem jer oni blokiraju ekspresiju gena neophodnih za neuralnu
diferencijaciju, u nervnom sistemu, kao i razli itih drugih gena u ostalim tkivima.
Notch receptor prolazi kroz tri proteoliti ke razgradnje, ali samo su dve zadnje zavisne od Delta
liganda. Kao deo svoje normalne biosinteze, proteaza koja se zove furin deluje u Goldi aparatu i
se e novo-sintetisani Notch protein u njegovom budu em ekstracelularnom domenu. Ovo
proteoliti ko cepanja konvertuje Notch protein u heterodimer, koji se potom transportuje na
povrinu elija kao zrela, matrurirana, forma receptora. Vezivanje Delta liganda za Notch receptor
indukuje drugo proteoliti ko cepanje u transmembranskom domenu, posredovano memranski
vezanom metaloproteazom koja se zove TACE (engl. Tumor necrosis factor Alpha Converting
Enzyme). Finalno proteoliti ko cepanje, koje sledi veoma brzo nakon drugog, je katalisano

203

preselinom 1, koji cepa, i na taj na in i odvaja citoplazmati ni rep aktiviranog Notch receptora
(Slika 5.5). Oslobodjeni rep se translocira u nukleus, vezuje za CSL genski regulatorni protein,
aktivira ga i konvertuje iz transkripcionog represora u transkripcionog aktivatora (Slika 5.4.).

Slika 5.4. Procesovanje i

aktivacija Notch proteina
proteoliti kim cepanjem.
Strelice ozna ene brojevima
prikazuju mesta proteoliti kog
cepanja. U trans mrei Goldi
aparata deava se prvi korak
proteoliti ke obrade, tokom
kojeg se generie zrela forma
heterodimernog
Notch
receptora, koji se zatim izlae
na povrini elije. Vezivanje
Delta liganda, prisutnog na
susednim elijama, aktivira
dva naredna proteoliti ka
koraka. Notch i Delta
interaguju direktno preko
svojih ponovljivih EGF-u
sli nih
(engl.
EGF-like)
domena. Neki podaci ukazuju
na to da tenzija koja se
ispoljava na Notch protein
preko endociti ke mainerije
elija koje interaguju, aktivira
cepanje na poziciji 2.

Kao to je napomenuto, prvo proteoliti ko cepanje Notch proteina se odvija u Goldi kompleksu
delovanjem furin proteaze. Ali, pre nego to stigne u Goldi aparat, Notch protein se sintetie kao
monomerni membranski protein u endoplazmatskom retikulumu, gde se vezuje za preselin 1,
protein koji osam puta preseca membranu. Kompleks putuje prvo u Goldi aparat gde se odvija
prvo, furinom-posredovano, proteoliti ko cepanje Notch proteina koje generie ekstracelularnu
subjedinicu i transmembransko-citosolnu subjedinicu. Ove dve subjedinice ostaju nekovalentno

204

asocirane jedna sa drugom u odsustvu interakcije sa Delta ligandom koji je na membrani druge
elije. Vezivanje Delta liganda za Notch receptor aktivira dva naredna proteoliti ka cepanja Notch
proteina (Slika 5.5.).

Slika 5.5.
Regulisana intramembranska
proteoliza katalisana preselinom 1 aktivira
Notch/Delta signalni put.
Ekstracelularna subjedinica Notch proteina je
nekovalentno vezana za sa njegovom
transmembransko-citosolnom subjedinicom. 1 Vezivanje Delta liganda sa susedne elije prvo
zapo inje proteoliti ko cepanje Notch proteina
membranski-vezanom metaloproteinazom TACE
(engl. Tumor necrosis factor Alpha Converting
Enzyme). 2 - Na taj na in se oslobadja
ekstracelularni segment. 3 Preselin 1, integralni
membranski
protein
potom
katalizuje
intramembransko cepanje koje oslobadja
citosolni Notch segment ili rep. 4 - Notch citosolni
segment se odmah translocira u nukleus gde
deluje na regulaciju ekspresije gena koji imaju
uticaja na determinaciju sudbine elije tokom
razvoja.

Kao to je napomenuto, drugo proteoliti ko cepanje u okviru hidrofobnog transmembranskog

domena Notch proteina katalisano je membranski vezanom metaloproteazom TACE i odvaja
ekstracelularni deo, dok poslednje proteoliti ko cepanje katalisano preselinom 1, rezultira
oslobadjanjem Notch citosolnog segmenta, koji se odmah translocira u nukleus. Ovakva signalomindukovana regulisana intramembranska proteoliza, ili RIP, (engl. Regulated Intramembrane
Proteolisis) se deava kao odgovor elija na visoki nivo holesterola, kao i na prisustvo
nesavijenih proteina (engl. unfolded) u endoplazmatskom retikulumu.
S obzirom da se cepanje Notch citosolnog segmenta (repa) odvija u okviru transmembranskog
segmenta, veoma podse a na cepanje drugog transmembranskog proteina, APP (engl. -Amyloid
Precursor Protein), koji je ekspresovan u neuronima i nije definisana njegova fizioloka funkcija,
ali se zna da je uklju en u Alzheimer-ovu bolest. APP se cepa u okviru transmembranskog
segmenta oslobadjaju i jedan peptidni fragment u ekstracelularni prostor mozga, a drugi u citosol
neurona. U Alzheimer-ovoj bolesti, ekstracelularni fragmenti se akumuliraju u preteranoj koli ini,

205

te se stoga agregiraju u filamente koji formiraju amiloidne plo e/plakove (engl. amyloid
plaques), za koje se veruje da ote uju i nervne elije, u estvuju u njihovom gubitku. Naj e i
genetski uzrok Alzheimer-ove bolesti je mutacija na genu za preselin 1 (PS1), koji pored
proteoliti kog cepanja Notch proteina, participira i u cepanju APP. Mutacija na PS1 genu
prouzrokuje cepanje APP u fragmente koji pove anom brzinom formiraju amiloidne plakove.
Preselin 1 je prvi put i identifikovan kao produkt gena koji je uobi ajeno mutiran kod pacijenata
sa autozomalno-dominantnom formom Alzheimer-ove bolesti. Kao to je napomenuto, glavna
patoloka promena asocrana sa Alzheimer-ovom bolesti je akumulacija amiloidnih plakova koji
sadre agregate malih peptida gradjenih od 42 ostatka i nazvanih A 42. Ovi peptidi su derivati
proteoliti kog cepanja APP, koji zapravo prolazi kroz proteoliti ko cepanje preko dva signalna puta
(Slika 5.6.). U oba puta, inicijalno cepanje se odvija u okviru ekstracelularnog domena i
katalisano je -sekretazom ili -sekretazom, a tip enzima koji katalie reakciju proteolize e
odrediti dalju sudbinu signalnog puta. Nakon incijalnog cepanja u okviru ekstracelularnog
domena, na istom intramembranskom mestu, kod oba puta, odvija se drugo proteoliti ko cepanje
katalisano -sekretazom. Signalni put iniciran -sekretazom, koji uklju uje i istu membranskivezanu metaloproteinazu TACE koja cepa Notch, generie peptid (26 aminokiselinskih ostataka)
koji nije tetan. Sa druge strane, signalni put iniciran -sekretazom generie formiranje
patolokih A 42 (Slika 5.6.). Missense mutacija na genu za preselin 1, uklju enom u Alzheimerovu bolest, poja ava formiranje A 42 peptida, to prouzrokuje ubrzano formiranje amiloidnih
plakova i eventualno moe dovesti do smrti neurona.
Slika 5.6.
Proteoliti ko
cepanje APP, plazmamembranskog proteina.
Levo:
Sekvencijalno
proteoliti ko
cepanje
katalisano -sekretazom (1) i
-sekretazom (2) produkuje
nekodljivi
membranskiusadjen
peptid (engl.
innocuous
membraneembedded peptide) od 26
aminokiselina. -sekretaza je
kompleks
od
nekoliko
proteina, ali proteoliti ko
mesto
koje
katalizuje
intramembransko cepanje je verovatno na preselinu 1. Desno: Cepanje ekstracelularnog domena katalisano -sekretazom (1), pra eno cepanjem
u okviru membrane -sekretazom, generie A 42 peptid (42 aminokiselinska ostatka) koji je uklju en u formiranju amiloidnih plakova u Alzheimerovoj bolesti. Uo iti da se u oba signalna puta citosolni segment APP oslobadja u citosol, ali mu funkcija nije poznata.

206

Geneti ki pokazatelji kod C.elegans, Drosophile i mieva uklazuju da je, i kod ovih organizama,
preselin 1 protein neophodna komponeneta Notch signalnog puta, koja pomae da se izvede
finalno proteoliti ko cepanje koje aktivira Notch protein. Notch signalni put je regulisan
glikozilacijom. Jedna familija glikoziltransferaza, tzv. Fringe familija (engl. Fringe family), dodaje
ekstra e ere na O-vezane oligosaharide na Notch protein, to remeti specifi nost Notch proteina
za njegove ligande. Ovo je prvi primer modulacije ligand-receptor signalinga diferencijalnom
receptornom glikozilacijom.

207

5.3. WNT SIGNALNI PUT

Wnt28 proteini su sekretovani molekuli koji deluju kao lokalni medijatori u kontroli mnogih
aspekata razvoja kod svih ivotinja u kojima su istraivani. Wnt proteini su otkriveni nezavisno
kod muica i mieva: kod Drosophila je wg (engl. wingless) gen otkriven zbog svoje uloge u
razvoju krila, dok je kod mieva Int-1 gen pronadjen zbog toga to favorizuje razvoj tumora dojke
kada je aktiviran integracijom virusa koji je do njega. Receptor na povrini elije za Wnt pripada
tzv. Frizzled familiji proteina koji sedam puta presecaju elijsku membranu (engl. seven-pass
transmembrane proteins). Ovi receptori po strukturi li e na GPCRs, a neki od njih mogu i da vre
transdukciju signala, kao i GPCRs, preko G proteina i inozitol fosfolipidnog puta koji su opisani
ranije (videti poglavlje 3). Ipak, Frizzled receptori uklju uju signalnu transdukciju preko signalnih
puteva koji nisu zavisni i ne uklju uju G proteine. Osnovni signalni put Frizzled receptora
uklju uje citoplazmati ni singalni protein nazvan Dishevelled protein. Najbolje okarakterisan
Dishevelled-zavistan put deluje preko regulacije proteolize multifunkcionalnog proteina koji se
zove -katenin (ili Armadilo kod muica).

5.3.1. Wnt proteini se vezuju za Fizzled receptore i inhbiu degradaciju -katenina

-katenin i Armadilo protein su multifunkcionalni proteini koji su uklju eni i proces adhezije
elija- elija, a i kao regulatorni proteini latentnih gena (engl. latent gene regulatory proteins). Wnt
proteini aktiviraju ove puteve vezuju i se i za Fizzled receptor-protein i za ko-receptorni protein.
Ko-receptorni protein je sli an receptornom proteinu za LDL (engl. Low Density Lipoprotein), te se
stoga zove LDL-receptorima sli an protein, ili, LRP (engl. LDL-Receptor-Related-Protein). Nije
jasno definisano kako Fizzled receptor i LRP aktiviraju Dishevelled protein, koji potom prevodi i
razvodi signal dalje.
U odsustvu Wnt signalinga, najvie elijskog -kateinina je locirano u elija- elija adherentnim
vezama, gde je asociran sa katherinima koji su transmembranski adhezioni proteini. U ovim
adherentnim vezama, -katenin pomae vezivanje katherina za aktinski citoskelet. Bilo koji
28 Wnt je kovanica kombinacije Wg (engl. wingless) i Int. Wg gen je originalno identifikovan kao gen za polarnost segmenta kod Drosophile
melanogaster, a koji funkcionie tokom embriogeneze krila, ali i metamorfoze tj. formiranju adulta. INT geni su orginalno identifikovani kao geni
ki menjaka u blizini nekoliko mesta za integraciju sa MMTV (engl. Mouse Mammary Tumor Virus). Wg gen i Int-1 gen su homologi i smatra se da
su evolutivno nastali od istog preda kog gena.

208

molekul -katenina koji nije asociran sa katherinima se veoma brzo degradira u citoplazmi.
Ova degradacija zavisi od velikog degradacionog kompleksa koji regrutuje -katenin i sadri bar
tri druga proteina (Slika 5.7A): (1) Serin/treonin kinazu koja se zove GSK-3 (engl. Glycogen
Synthase Kinase-3 ) i koja fosforilie -katenin, te ga na taj na in markira za ubikvitinaciju i
rapidnu degradaciju u preoteazomima. (2) Tumorski-supresorni protein APC (engl. Adenomatous
-katenina pove avaju i afinitet
Polyposis Coli)29 koji pomae favorizaciju degradacije
degradacionog kompleksa za -katenin, to je neophodno za efektivnu fosforilaciju -katenina sa
GSK-3 . (3) Scaffold protein koji se naziva aksin dri proteinski kompleks zajedno.

Slika 5.7. Model Wnt aktivacije katenin signalnog puta.

A - U odsustvu Wnt signala, jedan katenin je vezan za citosolni deo (rep)
kaderin proteina (nije prikazano na slici).
Bilo koji citosolni -katenin moe postati
vezan,
pomo u
APC-axin-GSK-3
degradacionog kompleksa. U ovom
kompleksu
-katenin je fosforilisan
pomo u GSK-3 kompleksa, to aktivira
njegovu ubikvitilaciju i degradaciju u
proteozomima. Geni koji odgovaraju na
Wnt, ostaju inaktivisani pomo u Groucho
ko-represornog proteina, koji je vezan za
genski regulatorni protein LEF-I/TCF. B Wnt se vezuje za Frizzled receptor i RLP i
aktivira
Dishevelled
nepoznatim
mehanizmom. Podjednako misterioznim
mehanizmom, koji zahteva prisustvo
kazein kinaze 1 (nije prikazano na slici),
do i e do inaktivacije GSK-3 u
degradacionom kompleksu. Kao rezultat
ovoga, fosforilacija i degradacija katenina je inhibisana i -katenin se
akumulira u citoplazmi i jedru. U jedru se
-katenin vezuje za LEF-I/TCF, pri emu
se odvaja Groucho, a
-katenin
funkcionie kao koaktivator koji stimulie
transkripciju Wnt ciljnih gena.

APC (engl. Adenomatous Polyposis Coli) je tako nazvan zbog toga to gen koji ga kodira veoma esto mutira u gen za adenom, benigni tip
tumora, colona. Tumor se projektuje u lumen kao polip i eventualno moe da se transformie u maligni tumor.

29

209

Vezivanje Wnt proteina za Frizzled receptor i LRP prouzrokuje inhibiciju fosforilacije katenina, a time i njegove degradacije. Mehanizam ovog procesa nije jasan do detalja, ali se zna
da zahteva prisustvo Dishevelled proteina i nekoliko drugih signalnih proteina koji se vezuju za
Dishevilled protein, uklju uju i i serin/treonin kinazu koja se zove kazein kinaza 1 (engl. casein
kinase 1). Kao krajnji rezultat je akumulacija -katenina u citoplazmi i nukleusu (Slika 5.7B.).
U nukleusu se ciljni geni za Wnt signaling normalno odravaju u stanju mirovanja preko
inhibitornog kompleksa genskih regulatornih proteina, koji uklju uju LEF-1/TCF30 familiju
proteina vezanih za ko-represorni protein Groucho (videti sliku 5.7A.). Pove anje nedegradiranog -katenina prouzrokovano Wnt signalingom dozvoljava ovom -kateinu da ulazi u nukleus i
da se vezuje za LEF-1/TCF, sklanjaju i Groucho. U ovom slu aju b-katenin fukcionie kao koaktivator, indukuju i transkripciju Wnt ciljnih gena (videti sliku 5.7B.).
Medju genima koji se aktiviraju preko -katenina je i c-myc, koji kodira protein c-Myc, mo an
stimulator rasta i proliferacije elija. Mutacije APC gena su prisutne u oko 80% humanih kancera
kolona. Ove mutacije inhibiu sposobnost proteina da se vezuju za -katenin, te se -katenin
akumulira u nukleusu. Ovaj akumulirani, nuklearni, -katenin stimulie transkripciju c-myc
gena, kao i drugih Wnt ciljnih gena, ak i u odsustvu Wnt signalinga, to rezultira
nekontrolisanom proliferacijom elija i favorizuje razvoj kancera.

30

LEF-1/TCF (engl. Lymphoid Enhancer-binding Factor - 1/ T Cell-specific transcription Factor)

210

5.4. HEDGEHOG SIGNALNI PUT

Kao i Wnt proteini, Hedgehog31 proteini su familija sekretornih proteinskih signalnih molekula
koji deluju kao lokalni medijatori u mnogim razvojnim procesima i beski menjaka i ki menjaka,
i klju ni regulator animalnog razvoja konzervisan od muice do oveka. Abnormalnosti u
Hedgehog signalnom putu tokom razvoja mogu biti letalne, a kod elija adulta mogu da vode ga
malignim transformacijama i razvoju kancera. Hedgehog signalni put je dobio ime od njegovog
polipeptdinog liganda, intracelularne molekule koja se zove Hedgehog protein i koji je pronadjen
kod Drosophile melanogaster. Hedgehog je jedan od produkata gena za segmentarnu polarnost
Drosophile melanogaster uklju en u ustanovljavanju baze za plan tela ove muice. Mutacija u
samo jednom genu Hedgehog proteina polarnosti Drosophile melanogaster produkuje larvu sa
iljatim procesima (zubi ima), te ona podse a na jea (engl. hedgehog). Ovi molekui su veoma
vani i tokom kasnijih faza embriogeneze i metamorfoze. Do sada su identifikovana tri gena koja
kodiraju Hedgehog homologe proteine kod ki menjaka: SHh (engl. Sonic Hedgehog) je najvie
istraen, a postoje jo i DHh (engl. Desert Hedgehog) i Ihh (engl. Indian Hedgehog). Sva tri puta su
jednako vana tokom embrionalnog razvoja. Aktivna forma svih Hedgehog proteina je neobi na
u tome to je kovalentno povezana sa holesterolom, to pomae u restrikciji difuzije nakon
sekrecije, te omogu ava i odrava odredjeni stepen lokalizacije. Holesterol se dodaje tokom veoma
markantne faze procesovanja, u kojoj protein cepa/se e sam sebe. Hedgehog proteini su
takodje modifikovani dodatkom lanca masnih kiselina, koji, iz nepoznatih razloga, moe biti
neophodan zahtev za signalnu aktivnost Hedgehog proteina. Dva transmembranska proteina,
Patched i Smoothened, posreduju odgovore na sve Hedgehog, pri emu Patched inhibie
Smoothened.

5.4.1.
Hedgehog
Smoothened33

proteini

deluju

preko

receptornog

kompleksa

Patched32

Patched i Smoothened transmembranski proteini su receptori koji uklju uju signaling za sve
Hedgehog proteine. Pretpostavlja se da Patched protein preseca plazma membranu dvanaest puta
i on je receptor koji vee Hedgehog proteine, dok je Smoothened receptor transmembranski

Hedgehog (sr. je).

Patched (sr. zalepljen, zakrpljen).
33 Smoothed (sr. ugladjen, ugla an, poravnan).
31
32

211

protein koji sedam puta preseca membranu sa strukturom sli nom Frizzled receptornim
proteinima. U odsustvu Hedgehog signala Patched protein inhibie aktivnost Smoothened
receptora. Ova inhibicija se ukida kada se Hedgehog protein vee za Patched receptor, te
tako dozvoljava Smoothened receptoru da prenosi signal u eliju. Signalni put koji se
uklju uje nakon aktivacije Smoothened receptora (engl. Smoothened down-stream signaling
pathway) najvie je prou en, razjanjen i prezentovan kod Drosophile, te e on i biti ukratko
opisan kao primer Hedgehog signalinga.
Hedgehog signalni put koji je operativan kod Drosophile, u nekom pogledu, podse a i
operie sli no kao i Wnt signalni put. U odsustvu Hedgehog signala, genski regulatorni protein
Ci (engl. cubitus interruptus) se proteoliti ki cepa u proteazomima. Umesto da bude potpuno
degradiran, on se procesuje da formira manje proteine koji se akumuliraju u nukleusu, gde
deluju kao transkripcioni represori, pomau i inhibiciji nekih Hedgehog-responsive gena (Slika
5.8A.). Proteoliti ko procesovanje Ci proteina zavisi od velikog multiproteinskog kompleksa.
Kompleks sadri (1) serin/treonin kinazu (naziva se, engl. Fused) nepoznate funkcije; (2) protein
za usidravanje (naziva se, engl.
Costal) koji vezuje kompleks za
mikrotubule, te tako dri i uva Ci
protein van nukleusa; (3) adapterni
protein (naziva se, engl. Supressor
of Fused).
Slika 5.8.
Model Hedgehog signalinga kod
Drosophile.
A - U odsustvu Hedgehog proteina, Patched receptor
inhibie Smoothened receptor, verovatno putem
degradacije ili intracelularnog odvajanja Smoothened
proteina. Ci protein je lociran u proteinskom kompleksu
i cepa se kako bi formirao represora transkripcije, koji
se akumulira u jedru i pomae odravanje Hedgehog
gena u inaktivnom stanju. Proteinski kompleks sadri:
serin/treonin kinazu Fused, u vr uju i protein Costal
(koji vezuje kompleks za mikrotubule) i adapterni
protein, koji funkcionie kao supresor za Fused. B Hedgehog protein se vezuje za Patched receptor i time
prekida inhibiciiju Smoothened receptora, koji sada
alje signal proteinskom kompleksu da prekine
procesovanuje Ci proteina, da se odvoji od mikrotubula
i da oslobodi neprocesovani Ci protein, koji sada moe
da se akumulira u jedru i da aktivira transkripciju gena
koji odgovaraju na Hedgehog. Veliki broj deavanja u
okviru ovog puta, jo uvek nisu poznati.

212

Kada se Hedgehog protein vee za Patched receptor aktvira se signalni put, procesovanje Ci
proteina je supresovano, te se neprocesovani Ci protein oslobadja iz njegovog kompleksa, i ulazi u
nukleus gde aktivira transkripciju Hedgehog ciljnih gena (Slika 5.8B.).
Medju genima koji se aktviraju preko Ci proteina je i wnt gen koji kodira Wnt protein koji pomae
u formiranju obrazca tkiva u embrionu Drosophile. Drugi ciljni gen je patched gen sam po sebi, a
kao rezultat pove ane ekspresije Pathced receptornog proteina na povrini elije inhibie se dalji
Hedgehog signaling, to formira negativnu povratnu spregu.
Puno pukotina i nedostataka u informacijama vezanim za Hedgehog signaling treba da se popuni.
Za sada je nepoznato kako, na primer, Patched protein inhibie Smoothened receptor, kako
Smoothened receptor aktivira signalni put, kako je regulisana proteoliza Ci proteina (iako se zna
da je fosforilacija Ci preko PKA neophodna za procesovanje), ili kako je regulisano oslobadjanje
multiproteinskog kompleksa od mikrotubula, ili kako je kontrolisano oslobadjanje
neprocesovanog Ci proteina od multiproteinskog kompleksa.
Hedgehog signalni put kod ki menjaka je jo manje poznat nego kod Drosophile. Pored pomenuta
tri proteina (engl. sonic, desert, indian Hedgehogs; SHh, DHh, IHh respectively) koja su
homologa Hedgehog proteinu Drosophile, postoje dve forme Patched receptora i tri Ci-sli na
proteina (Gli1, Gli2, Gli3). Druga ije nego kod Drosophile, Hedgehog signaling stimulie
transkripciju Gli gena, ali nije jasno da li svi Gli proteini prolaze proteoliti ko procesovanje, iako
postoje podaci da Gli3 prolazi. Inaktivacione mutacije u jednom od humanih patched gena vode
preterano-aktivnom Hedgehog signalingu i deavaju se vrlo esto u naj e oj formi konog
kancera, karcinomu bazalnih elija (engl. basal cell carcinoma), sugeriu i da Patched proteini
normalno pomau u o uvanju kontrole proliferacije elija koe.

213

214

SIGNALNI PUTEVI OD NUKLEARNIH

RECEPTORA

06

6.1. SIGNALING PREKO NUKLEARNIH RECEPTORA

Nuklearni receptori reguliu ekspresiju gena, u zavisnosti od interakcije sa malim lipofilnim
molekulama, i na taj na in se uklju uju u regulaciju velikog broja razli itih funkcija elija. To su
proteini koji su ligand-zavisni transkripcioni faktori, a nalaze u citoplazmi i/ili nukleusu. Ligandi,
difunduju kroz elijsku membranu i vezuju se za receptore u citoplazmi ili u nukleusu. Kompleks
ligand-receptor se vezuje za DNA elemente, u kontrolnim regionima ciljnih gena, i na taj na in
uti e na transkripciju odredjenog gena.

6.1.1. Ligandi za nuklearne receptore

Prirodni ligandi za nuklearne receptore su lipofilni hormoni, kao to su steroidni hormoni, tiroidni
hormoni, derivati vitamina A i D. Ovi hormoni imaju zna ajnu ulogu u regulaciji metabolizma,
razvoja i diferencijacije, kao i funkcije razli itih elija u organizmu. Nedavno je utvrdjeno, da i
intracelularni lipofilni metaboliti, kao to su prostaglandini, leukotrijeni, masne kiseline, derivati
holesterola, u ne kiseline, pa ak i benzoati, mogu da funkcioniu kao ligandi za nulearne
receptore, i da na taj na in reguliu ekspresiju odgovaraju ih gena.
Generalno, ligandi za nuklearne receptore su mali, rigidni hidrofobni molekuli, sa polarnim
delovima na jednom kraju, koji im omogu avaju vezivanje za receptore preko Van der Waals-vih i
hidrofobnih interakcija, kao i formiranje vodonikovih veza.

215

Tabela 6.1. Ligandi i HREs strukture za neke nuklearne receptore

Receptor

Hormon

Pola sekvence (heksamer)

Konfiguracija HRE

Glukokortikoidni receptor, GR

Kortizol

AGAACA

IR-3

Mineralokortikoidni receptor, MR

Aldosteron

AGAACA

IR-3

Progesteronski receptor, PR

Progesteron

AGAACA

IR-3

Androgeni receptor, AR

Testosteron

AGAACA

IR-3

Estrogeni receptor, ER

Estradiol

RGGTCA

IR-3

Receptor za tiroidne hormone, T3R

3,5,3`-L-trijodtironin, T3 hormno

RGGTCA

IR-0, DR-4, ER-6,8

Farnesoid receptor, FXR

Farnesoidi

AGGTCA

IR-1, DR-5

Receptor za vitamin D3, VDR

1,25-Dihidroksi vitamin D3

RGKTCA

DR-3

Receptor za 9-cis retinoicnu kiselinu, RXR

9-cis retinoicna kiselina, Terpenoidi

AGGTCA

DR-1

Receptor za all-trans retinoicnu kiselinu, RAR

all-trans retinoicna kiselina

AGTTCA

IR-0, DR-2,5, ER-8

Receptor za aktivirani proliferator peroksizoma, PPAR

15-Deoksi- 12,14-prostaglandin J2

AGGTCA

DR-1

COUP-TF ( , , )

RGGTCA

Drs, 1Rs

NGFI-B ( , , )

AAAGGTCA

NR, DR-5, IR-O

ROR ( , , )

YYCYRGGTCA

NR

Skracenice: IR invertovano ponavljana (engl. inverted repeated); DR direktno ponavljana (engl. direct repeated); ER (engl. everted repeated); NR bez
ponavljanja. Broj HREs se odnosi na broj parova koji razdvajaju heksamere (pola mesta). NGFI-B (engl. nerve growth factor induced receptor); COUP-TF (engl.
Chicken ovalbumin upstream promotor transcription factor); ROR (engl. Retinoic acid releated orphan receptor); , , su subtipovi receptora, kodirani razli;itim
genima.

6.1.2. Osnovni principi prenosa signala preko nuklearnih receptora

Model prenosa signala preko nuklearnih receptora je prikazana na slici 6.1. Nuklearni receptori se
nalaze u citoplazmi i/ili nukleusu. Mnogi od prirodnih liganada za nuklearne receptore su
lipofilni hormoni, koji pasivno difunduju u eliju, ili se ligandi u eliju aktivno transporuju. U
eliji, hormonski ligand se vee za receptor koji je lokalizovan u citoplazmi i/ili u nukleusu, i time
aktivira transkripciono regulatornu funkciju receptora. U slu aju vezivanja za citosolne receptore,
kompleks ligand-receptor se translocira u nukleus gde se vee za odgovaraju i region na DNA tzv.
HRE (engl. hormone-responsive element) i uti e na transkripciju gena.
Neki receptori, kao to su PPARs (engl. peroxisome proliferator-activated receptors) i FXR
(farnesoidni receptor), mogu da reaguju sa velikim brojem razli itih lipofilnih molekula. Zbog

216

toga se smatra da su ovi nuklearni receptori uklju eni u regulaciju metabolizma kao i u
detoksifikaciju stranih materija.
Nuklearni receptori su ligand-zavisni transkripcioni regulatori, koji mogu da funkcioniu kao
aktivatori ili represori transkripcije. Oni se specifi no vezuju za HRE, regulatornog regiona ciljnog
gena tj. gena ija se transkripcija regulie. Zavisno od receptora, vezivanje za DNA je povezano sa
aktivacijom ili represijom susednih gena. Ipak generalno posmatrano, vezivanje liganda za
receptor aktivira transkripciju, a samo u retkim slu ajevima dolazi do blokade transkripcije
ciljnog gena. U nekim slu ajevima, i receptor koji nije aktiviran ligandom je vezan za DNA , i ima
negativan efekat na transkripciju gena.
Vezivanje liganda za takav receptor,
deblokira aktivaciju transkripcije.
Pored vezivanja sa ligandom, nuklearni
receptor moe biti aktiviran i angaovanjem
drugih mehanizama, kao to su fosforilacija
receptora nekom od kinaza, kao i vezivanjem
za regulatorne proteine npr. ciklin D1.
Drugim re ima, moe do i do povezivanja
drugih signalnih puteva sa signalingom
preko nuklearnih receptora.

Slika 6.1 Signalna transdukcija preko nuklearnih receptora.

Nuklearni receptori su ligand-zavisni transkripcioni faktori koji se
vezuju za odredjenu DNA sekvencu tzv. HRE. Hormon funkcionie
kao ligand koji regulie aktivnost receptora. Mnogi receptori
funkcioniu kao homo- i heterodimeri. Aktivirani receptor, vezan za
DNA inicira transkripciju direktno, ili indirektno preko protein-protein
interakcije sa hromatinom i kompleksom proteina koji inicira
transkripciju. Strelice pokazuju mogu u razli itu konfiguraciju HRE.

U poredjenju sa signalnim putevima koji poti u od aktivacije membranskih receptora, signalning

preko nuklearnih receptora je relativno jednostavne strukture. Signalni put uklju uje, skoro
direktan efekat liganda iz ekstracelularnog prostora, uz angaovanje samo nekoliko proteina, na
transkripciju u nukleusu. Danas su poznate i dobro okarakterisane proteinske komponente

217

angaovane u ovom signalnom putu, do nivoa aktivacije transkripcione mainerije. Medjutim,

zbog kompleksnosti aktivacije transkripcije, jo uvek nije potpuno objanjeno kako nuklearni
receptori aktiviraju transkripciju gena. Veliki broj proteina u estvuje u komunikaciji izmedju
aktivatora transkripcije i bazalne transkripcione mainerije. Ovi proteini imaju vrlo vanu
funkciju i u aktivaciji transkripcije gena, preko nuklearnih receptora. Smatra se da su u proces
prenosa signala, od aktiviranog nukearnog receptora do stimulacije transkripcije, uklju eni brojni
koaktivatori, korepresori i medijatori, koji imaju klju nu ulogu u regulaciji transkripcije.
Regulatorni procesi koji funkcioniu preko regulacije transkripcije gena su mnogo sporiji od onih
koji uti u na aktivnost ve postojecih proteina/enzima. Signalna transdukcija preko nuklearnih
receptora dovodi do dugotrajnijih efekata u aktivnosti enzima, kada brzina regulatornog procesa
nije od ve eg znacaja. Regulatorni procesi koji angauju nuklearne receptore se uglavnom odnose,
na adaptaciju aktivnosti glavnih metaboli kih enzima na izmenjene uslove, tj. odnose se na
promenu funkcije organizma. S`obzirom da razvoj i diferencijacija viih organizama, podrazumeva
dugotrajane funkcionalane promene organizma, regulatorni mehanizmi koji kontroliu ove
procese, uklju uju angaovanje nuklearnih receptora. Na primer, hormoni koji aktiviraju
nuklearne raceptore, kao to su seksualni hormoni, tireoidni T3 hormon, D3 hormoni, retinoi na
kiselina, su uklju eni u razvoj i diferencijaciju organizma.

6.1.3. Klasifikacija i struktura nuklearnih receptora

Prvi opisani nuklearni receptori su receptori za glukokortikoide, za estradiol i za progesteron. Od
tada su otkriveni mnogi drugi, strukturno sli ni nuklearni receptori, grupisani u veliku
superfamiliju sa bar est razli itih subfamilija. Svi nuklearni receptori imaju visok stepen
homologije na nivou sekvence aminokiselina, to sugerie da funkcioniu koriste i sli ne
mehanizme. Ipak, jo uvek nije poznata funkcija svih nuklearnih receptora, kao i priroda liganda
koji se za njih veu. Mogu e je da za neke od ovih receptora tzv. orfanskih receptora ne postoji
prirodni ligand i da funkcioniu u ligand-nezavisnom maniru.
Tipi ni nuklearni receptor sadri pet razli itih domena, a svaki od njih ima karakteristi nu
funkciju. To su varijabilni N-terminalni region (A/B), visoko konzervisani domen odgovoran za
vezivanje sa DNA (C), linkerni domen (D) koji sadri signale o nuklearnoj lokalizaciji, ligandvezuju i domen koji je odgovoran i za dimerizaciju (E), i varijabilni C-terminalni domen (F). U A/B

218

regionu, kao i u E i F regionu su nadjeni domeni odgovorni za transaktivaciju (u A/B regionu AF1 (engl. activation function 1), a u E i F regionu AF-2 (engl. activation function 2)).

Slika 6.2 Struktura nuklearnog receptora.

6.1.3.1.
DNA elementi koji se vezuju za nuklearne receptore (HREs)
Receptori za steroidne hormone, su proteini koji se vezuju za specifi nu sekvencu na DNA, tzv.
HREs (engl. hormone-responsive elements). Smatra se da HREs ima zajedni ku strukturu, i da se
sastoji od dve kopije heksamerne sekvence (koja je naravno specifi na za svaki nuklearni receptor,
vidi tabelu 6-1).
Receptori se za HRE vezuju uglavnom kao dimeri, i to kao heterodimeri ili kao homodimeri. Mali
broj nukleranih receptora se vee za HRE kao monomer. O ovom slu aju, HRE sadri samo jednu
kopiju heksamerne sekvence za prepoznavanje, pa se ovi receptori veu za HRE kao monomeri.
Na osnovu strukture subjedinica nuklearnih receptora, preko kojih se vezuju za DNA, i strukture
HRE, mogu se razlikovati etiri kategorije nuklearnih receptora.
Dimeri receptora za steroidne hormone
HREs, za koje se veu receptori za steroidne hormone, imaju palindromnu strukturu34, sli nu
onoj koja je zastupjena u regionu DNA za koji se veu represori prokariota. Na primer,
glukokortikoidni receptor se kao homodimer, koji se formira u citosolu, vee za invertovano
ponovljenu sekvencu, tj. dva heksamera HRE su organizovana kao lik i njegov odraz u ogledalu.
Svaka subjedinica dimera, koji je u kompleksu sa DNA, je u kontaktu sa jednim heksamerom
HRE. Zahvaljuju i postojanju ovakve invertovano ponovljene sekvence prepoznavanja, ostvaruje
se veliki afinitet vezivanja izmedju dimernog receptora i HRE (slika 6.3).
34 Palindromne sekvence DNA vezuju dimerne proteine, u kojima je svaka subjedinica proteina u kontaktu sa jednim heksamerom DNA elementa.

219

RXR sadri heterodimere

Nuklearni receptori, za all-trans retinoi nu kiselinu, 9-cis retinoi nu kiselinu, za T3 hormon i za
vitamin D3, se vezuju za karakteristi nu nesimetri nu sekvencu DNA, koja se ponavlja35 (engl.
direct repeat of recognition sequence). Vezivanje nuklearnih receptora za ovakvu sekvencu,
formira heterodimerne receptore vezane za DNA. Jedna od subjedinica heterodimera, je uvek RXR
(receptor za 9-cis retinoi nu kiselinu) koji se obi no vee za 5` kraj HRE. Od naro itog zna aja za
vezivanje receptora za HRE,
koji sadri sekvencu koja se
ponavlja, je injenica da su
heksameri HRE organizovani u
maniru glava ka repu to
zahteva polarnu organizaciju
receptornih dimera.
Takodje, za HRE ovog tipa je
karakteristi no, da razmak
izmedju heksamera koji se
ponavljaju moe biti razli it
(obi no iznosi od 1-5 baznih
parova).
Drugim
re ima,
variranje rastojanja izmedju
ponovljenih heksamera moe
da kreira razli ite HRE, koje
odredjuju koji e se hetero- i
homodimeri formirati tj. vezati
za sekvencu koju prepoznaju.

Slika 6.3. Oligomerna struktura nuklearnih receptora i struktura HREs. A. Vezivanje homodimernog receptora za dvosimetri ni palindromni
DNA element. (dimer glukokortikoidnog receptora). B. Vezivanje heterodimernog receptora za DNA element koji sadri ponavljanu sekvencu. C.
Vezivanje RXR kao homodimera za HRE koji ima ponovljenu istu sekvencu. D. vezivanje monomernog receptora za HRE sa asimetri nom
sekvencom.

35 Ponavljana sekvenca prepoznavanja, zahteva nesimetri nu prostornu organizaciju subjedinica proteina koji se za nju vezuju. Protein-DNA

kompleks, u ovom slu aju, ima polarni karakter, a dva proteina vezana za dve polovine DNA elementa, mogu da nose razli ite funkcije.

220

Dimerni orfanski receptori

Orfanski receptori mogu da se veu za DNA elemente koji sadre sekvencu koja se direktno
ponavlja. U ovom slu aju, receptori se kao homodimeri, vezuju za HRE, koji sadri dva mesta
(heksamera, medjusobno razdvojena razli itim brojem baznih parova) koja se direktno ponavljaju.
Monomerni orfanski receptori
Ovoj grupi receptora pripadaju receptori (npr. RZR; engl. retinoic Z receptor ili NGFI-B; engl. NGFinduced clone B) koji se kao monomeri veu za asimetricnu sekvencu. Funkcija ovih receptora je
jo uvek slabo poznata.
6.1.3.2. DNA vezuju i domen nuklearnog receptora
Receptor se za HRE vezuje preko DNA-vezuju eg domena, koji je u okviru familije nuklearnih
receptora najkonzervisaniji strukturni element (region C u primarnoj strukturi receptora). DNAvezuju i domen poseduje strukturne elemente
preko kojih specifi no prepoznaje HRE, kao i
elemente koji reguliu dimerizaciju receptora na
HRE. Centralno mesto u DNA-vezuju em domenu
zauzimaju dva Zn2Cys4 motiva. Zn-motivi imaju
ulogu u pozicioniranju DNA heliksa i nuklearnog
receptora, i nisu uklju eni u direktnu interakciju
sa bazama DNA. N-terminalni Zn-motiv u estvuje
u pozicioniranju heliksa preko interakcije sa
ostacima e era i fosfata u ki mi DNA, dok Cterminalni Zn-motiv u estvuje u dimerizaciji i u
kontaktu je sa fosfatnim ostacima DNA.

Slika 6.4 Funkcionalni domeni nuklearnog receptora (na primeru glukokortikoidnog receptora). A. AF-1 i AF-2: domeni koji posreduju u
stimulaciji transkripcije. B. Model dva Zn++-Cys4 vezuju a motiva na domenu koji se vezuje za DNA. C. Kompleks formiran izmedju dimernih DNA
vezuju ih domena GR i HRE. Crni krugovi predstavljaju jone Zn++. D. Koncensus sekvenca i konfiguracija HRE.

221

Sekvekce koje u okviru HRE, prepoznaju nuklearni receptori, su vrlo sli ne i uglavnom se
razlikuju po polaritetu i veli ini rastojanja izmedju dva heksamera. Zato nije iznenadjuju e da su
strukture dimera receptora, koji se vezuju za heksamere HRE, adaptirane na odredjenu
orijentaciju i rastojanje izmedju sekvenci sa kojima reaguju.
Za palindromnu sekvencu se vezuju homodimerni receptori, koji se formiraju ve u citosolu.
Sekvenca i razmak izmedju heksamera u HRE je komplementarna DNA-vezuju im domenima
dimernih receptora, kao i njihovom rastojanju. Geometrija dimera receptora odredjuje, kakav
razmak izmedju sekvenci prepoznavanja moe da se tolerie da bi se formirao kompleks visokog
afiniteta.
Takodje, u slu aju ponavljanih heksamera HRE (ponavljanih sekvenci prepoznavanja), razmak
izmedju njih, ima klju nu ulogu u odredjivanju koji e se receptor, hetero- ili homodimer, vezati
za HRE.
6.1.3.3. Ligand vezuju i domen nuklearnog receptora
Ligand-vezuju i domen (region E sa slika 6.2 i 6.4) ima tri zna ajne uloge:
odgovoran je za homo- i heterodimerizaciju
vezivanje liganda (agoniste i antagoniste)
transaktivaciju i transrepresiju (vezivanje koaktivatora i korepresora).
Pored DNA vezuju eg domena, koji obezbedjuje neke elemente za dimerizaciju receptora, i
elementi ligand vezuju eg domena u estvuju u dimerizaciji.

6.1.3.4.
Elementi transaktivacije nuklearnog receptora
Ve ina nuklearnih receptora poseduje dva strukturna elementa AF-1 i AF-2, koji su uklju eni u
aktivaciju transkripcije. AF-1 se nalazi u okviru A/B regiona i uklju en je u ligand-nezavisnu
transaktivaciju. On titi mesta fosforilacije i mesta interakcije sa koaktivatorima, a njegova uloga
jo nije u potpunosti razjanjena. Sekvenca AF-2 domena, koji se nalazi u E regionu, je dobro
konzervisana u okviru superfamilije nuklearnih receptora. AF-2 funkcionie u ligand-zavisnom
maniru. AF-2 okruuje heliks H12, koji je deo ligand-vezuju eg domena, kao i druge strukturne
elemente E regiona. Kada se ligand vee za receptor, hidrofilna povrina H12 heliksa je okrenuta

222

ka spoljanosti, i obezbedjuje povrinu za vezivanje komplementarnih regiona koaktivatora i

korepresora.
6.1.4. Mehanizmi preko kojih nuklearni receptori reguliu transkripciju
Funkcije nuklearnih receptora se mogu opisati terminima transkripcione aktivacije i
transkripcione represije tj. blokade. Iako je ve ina nuklearnih receptora uklju ena u aktivaciju
transkripcije (posredovana pozitivnom HRE), postoji odredjeni broj receptora koji dovode do
blokade transkripcije, kada se za njih vee ligand (posredivana negativnom HRE). Takodje, neki
nuklearni receptori inhibiu bazalnu transkripciju, tako to su i u odsustvu liganda vezani za
pozitivnu HRE.
U regulaciju transkripcije preko nuklearnih receptora su uklju ene viestruke protein-protein
interakcije. Pokazano je da nuklearni receptori direktno reaguju sa:
komponentama transkripcionog aparata koji regulie bazalnu transkripciju (TFIIB i TAF
proteini),
koaktivatorima transkripcije,
korepresorima transkripcije,
drugim specifi nim transkripcionim faktorima.
Koaktivatori nuklearnih receptora.
Identifikovan je veliki broj proteina, ili kompleksa proteina, koji imaju funkciju koaktivatora
transkripcije. Ovi proteini specifi no reaguju sa aktiviranim ligand-receptor kompleksom.
Najbrojnija grupa koaktivatora pripada p160 familiji koaktivatora. U ovu grupu se ubraja i
dobro okarakterisan, koaktivator steroidnih receptora 1 (SRC-1, engl. steroid receptor
coactivator 1).
Druga grupa koaktivatora funkcionie kao multiproteinski kompleks. Takav je npr. TRAP
kompleks (TRAP = engl. thyroid hormone receptor activating protein).
Pripadnici p160 familije koaktivatora, reaguju sa drugim proteinima ili proteinskim kompleksima,
koji imaju funkciju posrednika u inicijaciji transkripcije, kao i/ili aktivnost histon acetilaze
(HAT). Smatra se da je primarna funkcija p160 klase koaktivatora, u koncentrisanju HAT
aktivnosti u promotornim regionima ciljnih gena, dok su TRAP proteini odgovorni za
uspostavljanje veze izmedju receptora vezanog za DNA i holoenzima RNA polimeraze II.

223

Reorganizacija hromatina je osnovni korak u aktivaciji transkripcije DNA prekrivene hromatinom.

Stoga je acetilacija histona od izuzuzetnog zna aja za regulaciju transkripcije36. Nuklearni
receptori mogu da regrutuju koaktivatore koji imaju, ili su povezani sa, histon acetilaznom
aktivno u (HAT). Drugim re ima nuklearni receptor vezan za DNA, moe da regrutuje proteinski
kompleks koji ima HAT aktivnost.
Drugi tipovi koaktivatora, uklju uju i i CBP/p300 proteine, takodje mogu direktno da interaguju
sa receptorima vezanim za DNA. Pripadnici SWi/SNF kompleksa, kao i E3 ubikvitin protein ligaza
E6-AP, takodje imaju funkciju koaktivatora.
Korepresori nuklearnih receptora.
Receptori za T3 (T3R) i za retinoi nu kiselinu (RAR), mogu da blokiraju transkripciju u odsustvu
liganda za ove receptore. Blokada transkripcije je povezana sa vezivanjem korepresornih proteina.
Na primer, nuklearni korepresori NcoR i SMRT (engl. silencing mediator for retinoic and thyroid
hormone receptors), se vezuju za ligand-vezuju i domen receptora, a od receptora se odvajaju
kada se za njega vee odgovaraju i ligand.
Glavni mehanizam preko koga se ostvaruje blokada transkripcije, je angazovanje proteina koji
imaju aktivnost histon deacetilaza (HDAC), u promotornom regionu gena. Ve spomenuti
nuklearni korepresori, NcoR i SMRT proteini, reaguju sa proteinskim kompleksom (npr. mSin3 i
NuRD kompleks) koji ima histon deacetilaznu aktivnost. Drugim re ima, korepresori nuklearnih
receptora, regrutuju proteine sa histon deacetilaznom aktivnosti u promotorni region, i na taj
na in odravaju tzv. represovano stanje hromatina koje spre ava transkripciju.

6.1.5. Regulacija signalinga preko nuklearnog receptora

Prenos signala preko nuklearnog receptora je regulisan na nekoliko nivoa (slika 6.6). U narednom
tekstu e biti navedena glavna mesta regulacije signalinga preko nuklearnih receptora.

Odredjene konformacije hromatina su povezane sa blokadom transkripcije. Za formiranje viih struktura hromatina najve im delom su odgovorani
histoni koji su podloni kovalentnim modifikacijama: acetilaciji (uglavnom rezidue lizina), fosforilaciji (Ser/Thr residue), metilaciji (ostaci lizina i
arginina), i ubikvitinaciji. esto su modifikacije prisutne na N-terminalnom kraju histona, a njihovo prisustvo je u korelaciji sa transkripciono aktivnim
stanjem histona.

36

224

Slika 6.5. Model blokade i aktivacije transkripcije

preko T3R. U odsustvu T3 hormona, heterodimerni
RXR-T3R receptor blokira transkripciju, svojim
vezivanjem za TRE (T3 responsive element).
Blokada transkripcije se odrava, zahvaljuju i
regrutovanju korepresornog kompleksa proteina,
koji ima histon deacetilaznu aktivnost. X =
neidentifikovani kofaktor, koji pomae odravanje
bazalnog transkripcionog aparata, vezanog za
promotor, u neaktivnom stanju. U prisustvu T3
hormona, korepresori se odvajaju i koaktivatori
(SRC/p160 kompleks) se vezuju za heterodimerni
receptor. Proteini koji imaju aktivnost histon
acetilaze, pomau u indukciji transkripcije. Takodje,
promotor regrutuje i drugi kompleks koaktivatora,
DRIP/TRAP, koji je uklju en u stabilizaciju vezivanja
holoenzima RNA polimeraze.

Regulacija na nivou koncentracije liganda

Koli ina liganda koji moe da reaguje sa receptorom je prvi regulatorni nivo ovog signalnog
puta. Koncentracija liganda moe biti regulisana na razli ite na ine: sintezom i degradacijom
hormona; modifikacijom hormona; sekrecijom, njihovim transportom i skladitenjem;
mehanizmima povratne sprege, preko koncentracije hormona u cirkulaciji.

Regulacija fosforilacijom (delovanje drugih signalnih puteva)

Fosforilacija Ser/Thr ostataka, na receptornom molekulu, je osnovni mehanizam povezivanja
signalnog puta preko nuklearnih receptora sa drugim signalnim putevima u eliji.
Fosforilacija mnogih nuklearnih receptora obezbedjuje regulatorni mehanizam koji je
nezavisan od receptor-ligand interakcije. Steroidni receptori su fosfoproteini, koji na Nterminalnom delu obi no sadre nekoliko fosforilisanih aminokiselina. Posledice fosforilacije
receptornog proteina mogu biti razli ite. Na primer, fosforilacija uti e na vezivanje liganda, na
transport u nukleus, na vezivanje za DNA i transaktivaciju. Poznato je da MAP kinaza moe

225

da fosforilie Ser 111 u A/B regionu estrogenog receptora, i da aktivira receptor, nezavisno od
njegovog vezivanja za ligand. U ovom slu aju dolazi do transkripcije ciljnih gena, i u
nedostaku estradiola. Fosforilacija estrogenog receptora preko MAP kinze, predstavlja primer
ukrtanja dva signalna puta u eliji: RTKs MAP signalnog puta i signalniga preko
nuklearnog receptora. Takodje, drugi signalni putevi kao to je signalni put PKA, TGF signalni put, ili put Akt kinaze, mogu fosforilacijom da reguliu aktivnost nuklearnog
receptora. Moe se re i da su signali koji se prenose preko nuklearnih receptora, integrisani u
intracelularnu signalnu mreu, i povezani sa ekstracelularnim signalima.
Pored fosforilacije samih receptora, mnogi koaktivatori i korepresori, takodje, mogu biti
fosforilisani i na taj na in regulisani.
Interakcija sa drugim aktivatorima transkripcije
Nuklearni receptori mogu modulisati ekspresuju gena, menjaju i aktivnost drugih
transkripcionih aktivatora. Na primer, ER, T3R, RAR, GR proteini deluju kao transrepresori
transkripcionog
faktora
AP-1
(heterodimer koji se
sastoji od c-Jun i cFos
proteina),
i
obrnuto, AP-1, moe
da
inhibie
transaktivaciju ovih
nu-klearnih
receptora. Tako-dje,
poznat je uzajamni
antagonisticki efekat
GR
i
funkcije
transkripcionog
aktivatora NF B.

Slika 6.6. Funkcije domena nuklearnog receptora. A/B, C, E i F domeni nuklearnog receptora, su uklju eni u multiplu protein-protein interakciju i
na taj na in podloni regulatornim uticajima. Kompleksi proteina sa histon deacetilaznom aktivno u (HDAC) i histon acetilaznom aktivno u
(HAT) se preko korepresora ili koaktivatora vezuju za promotorni region.

226

Regulacija preko ubikvitinacije

Nivo nuklearnih receptora, kao i korepresora i koaktivatora ovih receptora, u
regulisan ubikvitinin-posredovanom degradacijom proteina.

eliji je

6.1.6. Signaling preko nuklearnih receptora za steroidne hormone

U zavisnosti od mehanizma aktivacije nuklearnih receptora, receptori su podeljeni u dve osnovne
grupe. U prvu grupu se ubrajaju receptori koji mogu biti lokalizovani i u citoplazmi i u nukleusu
(ve ina receptora za steroidne hormone). U drugu grupu se ubrajaju receptori koji su uvek u
nukleusu (receptori za derivate retinoi ne kiseline, receptori za T3 hormon i vitamin D3).
Steroidni hormoni, mogu da se veu za receptor koji se nalazi ili u citoplazmi ili u nukleusu.
Vezivanje steroidnog hormona za svoj receptor u citosolu, dovodi do aktiviranja receptora i
translokacije u nukleus, gde inicira transkripciju ciljnih gena. Na slici 6.7. je prikazana signalna
transdukcija preko nuklearnog receptora za steroidne hormone.
6.1.6.1. Aktivacija citoplazmati nog aporeceptornog kompleksa
Steroidni hormoni, se kao i drugi hormoni, cirkulacijom distribuiraju po organizmu. U cirkulaciji,
steroidni hormoni, su obi no vezani za specifi an proteinski nosa (npr. transkortin transportuje
kortizol). Steroidni hormoni, difuzijom ulaze u eliju i aktiviraju receptor koji se nalazi u
citoplazmi.
Receptor, se u odsustvu hormona, u citosolu nalazi u formi neaktivnog kompleksa tzv.
aporeceptorni komleks. Hormon se u aporeceptornom kompleksu proteina, vee za proteine koji
pripadaju klasi aperona. aperoni su proteini, iji se nivo u eliji pove ava kao rezultat
delovanja nepovoljnih stresogenih uslova, npr. delovanja poviene temperature. Oni imaju
centralnu ulogu u formiranju adekvatne konfiguracije savijanju proteina (engl. folding process) u
eliji. Oni u estvuju u oblikovanju proteina tokom, i posle, biosinteze proteina na ribozomima,
tokom transporta proteina u membrani, i u nastajanju proteinskih kompleksa.

227

Analizom u kojoj je kori ena ko-imunoprecipitacija je utvrdjeno, da steroidni hormoni reaguju sa

multi-proteinskim kompleksom aperona, koji sadri i proteine Hsp90, Hsp70, i Hsp56 (Hsp,
engl. heat shock protein37). Smatra se, da se receptor nalazi u optimalnoj konformaciji za
vezivanje hormona, kada je u kompleksu sa Hsp90. Aktivacija receptora zahteva prisustvo Hsp90,
koji se vezuje za dimerni receptor. Hsp90 odrava receptor u unfolded konformaciji, sposobnoj
za interakciju sa ligandom. aperoni,
klase Hsp70,
potpomau pravilno
povezivanje Hsp90 sa receptorom.
Takodje, i drugi aperoni, kao to su
Hsp56 i p23 (protein mase 23 kD), su
uklju eni u proces aktivacije receptora. Kao to je ve spomenuto, vezivanje hormona za aporeceptorni kompleks inicira translokaciju receptora
u nukleus. Aktivirani receptor sadri
sekvencu za odgovaraju u lokalizaciju u nukleusu, kao za interakciju
sa DNA i transaktivaciju. Vezivanje
hormona za receptor, postavlja transaktivacione domene u odgovaraju u
poziciju i time omogu ava interakciju
sa transkripcionim aparatom.

Slika 6.7. Signalna transdukcija preko receptora za

steroidne hormone. U citosolu steroidni receptor je u
neaktivnoj formi u kompleksu sa Hsp proteinima (Hsp90,
Hsp56, protein p23). Vezivanje za hormon, aktivira
receptor, on se transportuje u nukleus, gde moe da
reaguje sa odgovaraju om HRE.

Detaljan mehanizam aktivacije i transporta receptora u nukleus je jo uvek nepoznat. Smatra se

da jo neki proteini, kao to je npr. RAP46 (engl. nuclear receptor-associating protein of 46

37

Naziv Hsp (heat shock protein) poti

e od zapaanja da se produkcija ovih proteina pove ava nakon delovanja povienih temperatura

228

kDa), funkcioniu u kooperaciji sa aperonima i doprinose transportu, i aktivaciji receptora.

Nakon disocijacije od Hsp proteina, receptor-hormon kompleks je sposoban za vezivanje sa HRE i
transaktivaciju.
aperoni u ovom sistemu funkcioniu kao regulatori aktivnosti receptora za steroidne hormone.
Njihova funkcija je da fiksiraju receptor u optimalnoj konformaciji koja omogu ava da se receptor
vee za hormon sa visokim afinitetom. Drugim re ima, funkcija aperona je da stabilizuju
odredjenu konformaciju, optimalnu za vezivanje hormona. Takodje, neaktivan kompleks
nuklearnog receptora vezanog za aperone, moe biti nadjen i u nukleusu. Na primer, estrogeni
receptor, se nalazi u nukleusu, u sastavu velikog kompleksa sa Hsp proteinima. Vezivanje
estradiola za receptor, omogu ava njegovo odvajanje od Hsp, vezivanje za DNA, formiranje dimera
receptora, i interakciju sa koaktivatorima i aparatom za transkripciju.

229

230

REGULACIJA RECEPTORA

07

Ve je vie puta spomenuto da su putevi signalne transdukcije viestruko regulisani. Nivo

hormona koji se produkuju i sekretuju iz odredjenih elija se konstantno podeava, u smislu
zadovoljavanja odredjenih potreba organizma. Na primer, elije tubula bubrega sintetiu i
sekretuju vie eritropoetina, kada je nivo O2 u krvi nizak i kada je organizmu potrebno vie
eritrocita. Nakon stimulacije sa TNF , ili sa citokinima, indukuju se intracelularni proteini kao to
su Ski i SOCS, koji negativno reguliu aktivirane signalne puteve. Fosforilisani receptori i
downstream signalni proteini se defosforiliu kontrolisanim delovanjem fosfataza. U ovom delu
teksta e biti opisani mehanizmi koji down reguliu signalne puteve.

7.1. ENDOCITOZA MEMBRANSKIH RECEPTORA

Ukoliko nivo hormona u elijskom okruenju ostane visok nekoliko sati, elije se obi no
desenzitiviu, tako da ne mogu vie da odgovore na tu koncentraciju hormona. Ovo spre ava
neadekvatnu produenu aktivnost receptora, ali i u tim uslovima elije e obi no odgovoriti na
dalji porast hormona. Ligand-zavisna receptorom-posredovana endocitoza je osnovni
mehanizam koji smanjuje broj receptora na povrini elije. Na ovaj na in se elije desenzitiviu na
delovanje peptide i mnogih hormona.
Na primer, vezivanje EGF-a za svoj receptor, izaziva konformacionu promenu u citoplazmati nom
repu receptora. Ova promena otkriva motiv, koji olakava regrutovanje receptora u klatrinomobavijene jamice, i internalizaciju receptora. Posle internalizacije, neki receptori (npr. LDL
receptor) se efikasno recikliraju na povrinu elije. Ipak, mnogi internalizovani receptori za

231

peptidne hormone se uglavnom transportuju, zajedno sa vezanim ligandima, do lizozoma gde se

degradiraju.
Stimulacija fibroblasta visokom koncentracijom EGF-a u toku jednog sata, izaziva internalizaciju
receptora i degradaciju ve ine receptornih molekula. Ako nivo ekstracelularnog EGF-a padne, broj
receptora na membrani se obnavlja sintezom novih molekula receptora. De novo sinteza je spor
proces, koji moe da traje due od jednog dana. Ovaj primer ilustruje smanjenje osetljivosti elije
na kontinualnu stimulaciju visokim koncentracijama hormona, i kako se nakon smanjenja nivoa
hormona, obnavlja po etni nivo membranskih receptora tj. elija postaje ponovo osetljiva na nizak
nivo hormona.
Eksperimenti na mutiranim elijskim linijama, pokazuju da internalizacija RTKs ima zna ajnu
ulogu u regulaciji elijskog odgovora na EGF i druge faktore rasta. Na primer, mutacija na EGF
receptoru koja ga ini otpornim na ligand-zavisnu endocitozu, tako to spre ava inkorporaciju
receptora u klatrinske jamice, pove ava osetljivost elija na mitogeni signal (EGF). Ovakve
mutirane elije su sklone elijskoj transformaciji koja je indukovana EGF-om. Intersantno je da
internalizovani receptori, pre degradacije, mogu iz intacelularnih kompartmana da nastave svoju
funkciju indukcije signalnih puteva.
U mnogim elijama se peptidni hormoni, koji se internalizuju vezani za receptore, degraduju
intracelularno. Ako ekstracelularani nivo hormona nizak, ovaj proces moe zna ajno da smanji
nivo hormona, ak toliko da za nekoliko sati prestane dalja aktivacija signalnog puta. Na primer,
nivo IL-2 u ekstracelularnom fluidu, (IL-2 stimulie proliferaciju T limfocita), moe, ovim
mehanizmom, toliko da se smanji da potpuno prekine stimulaciju T limfocita. Takodje, mutirana
forma IL-2, se vezuje za receptor, normalno, kada je pH ekstracelularnom medijumu 7.5, ali vrlo
slabo u uslovima pH=6, koji su u endocitoznoj vezikuli ili endozomu. Niska pH vrednost, dovodi
do disocijacije mutiranog IL-2 od receptora u endosomu, tako da se on reciklira u ekstracelularni
medijum. Poluivot ovog mutanta IL-2, je dui od normalnog, to moe biti korisno u terapiji, kada
je potrebna proliferacija T limfocita.

232

7.2. SEKRETOVANI PROTEINI MOGU DA VEU HORMONE I NA TAJ NA IN SPRE E

AKTIVACIJU RECEPTORA
Drugi na in smanjenja aktivnosti membranskih receptora, je sekrecija proteina koji sadre
sekvencu, za koju mogu da se veu hormoni, ali ovi proteini/receptori nemaju funkciju u prenosu
signala. Hormoni se vezuju za ovakve mamce receptore (engl. decoy receptors), to smanjuje
koli inu hormona za interakciju sa receptorima sa signalnom funkcijom. Ovakav tip regulacije je
zna ajan u kontroli reapsorpcije kosti, kompleksnom fiziolokom procesu koji integrie nekoliko
molekularnih mehanizama.
Kod sisara, do puberteta se zavrava neto rast kostiju, medjutim dinami ki proces resorpcije i
ponovnog formiranja kostiju (engl. remodeling) se odrava u toku itavog ivota. Proces
remodelovanja omogu ava obnavljanje ote enih kostiju, kao i oslobadjanje kalcijuma, fosfata i
drugih jona, iz mineralizovanih kostiju u krv za upotrebu bilo gde u organizmu.
Osteoklasti, elije odgovorne za resorpciju kostiju, su makrofage koje sadre visoko dinami ne
adhezivne strukture tzv. podosome u plazma membrani. v 3 integrin u podosomima je vrlo
vaan za inicijalno vezivanje osteoklasta za povrinu kosti38. Nakon, inicijalnog vezivanja,
osteoklasti formiraju specijalizovan vrlo vrst spoj/pe at (engl. tight seal) sa kotanom povrinom,
koji okruuje zatvoren ekstracelularan prostor. U taj prostor, adherirani osteoklasti, po inju da
sekretuju korozivnu meavinu HCl i proteaza, koja razlae neorgansku komponentu i vri
hidrolizu proteina kosti. Mehanizam nastanka i sekrecije HCl je vrlo sli an mehanizmu produkcije
HCl-a u acidnim elijama eluca. Kao i u slu aju gastri ne sekrecije, i u produkciju H+ u
osteoklastima, su uklju eni karboanhidraza i anjonski antiport. Aktivacijom protonske pumpe, V
tipa, H+ se pumpaju u ekstracelularni prostor.
Resorpcija kosti je regulisana elijskim interakcijama osteoklasta sa susednim osteoblastima.
Osteoblasti su elije uklju ene u formiranje kosti. Oni produkuju kolagen I, glavnu organsku
komponentu kostiju. Osteoblasti na svojoj povrini ekspresuju trimerni signalni protein, RANKL
(engl. Receptor Activator for Nuclear Factor
B Ligand), koji pripada TNF- superfamiliji
trimernih proteina. RANKL je ligand za RANK (engl. Receptor Activator of Nuclear Factor B),
receptor koji se ekspresuje na povrini osteoklasta. Interakcija RANKL sa RANK, aktivira multiple
38 v 3 integrin je vaan za inicijalno vezivanje osteoklasta za povrinu kosti. Ukoliko se dodaju antitela za v 3 integrin, koja blokiraju njegovu
aktivnost, blokira e se i resorpcija kosti.

233

intracelularne signalne puteve u osteoklastima, uklju uju i i NF -B signalni put. Aktivacija ovih
signalnih puteva, indukuje diferencijaciju osteoklasta, koji menjaju oblik i vrsto se vezuju za
kost.
Osteoblasti, takodje, produkuju i sekretuju protein mamac tzv. OPG (engl. osteoprotegerin) koji
je dobio naziv po svojoj osobini da zatiti kosti. Sekretovani OPG vezuje RANKL na povrini
osteoblasta, spe avaju i RANKL-RANK interakciju, a time i inhibiciju aktivacije osteoklasta i
resorpciju kosti.

Slika 7. 1. Regulacija resorpcije kosti. Osteoklasti se inicijalno vezuju za kost

preko integrina iz podosoma. Interakcija sa susednim osteoblastima aktivira
osteoklaste, preko interakcije trimernih proteina RANKL i RANK (1) to izaziva
reorganizaciju citoskeleta, koja dovodi do formiranja specijalizovane vrste veze
(tight seal) sa kosti (2). Aktivirani osteoklasti sekretuju u ekstracelularni prostor,
korozivnu meavinu HCl i proteaza koja resorbuje kosti (3). Osteoblasti mogu da
smanje resorpciju kosti, sekrecijom OPG. Vezivanjem ovog receptora mamca za
RANKL (4), to blokira vezivanje RANKL za RANK osteoklasta, a time i njihovu
aktivaciju.

Osteopetroza je nasledna bolest, koja se manifestuje pove anom gustinom kosti i nastaje usled
nenormalno male resorpcije kosti. Mnogo es a je osteoporoza, koja se vrlo esto javlja kod ena u
postmenopauzi. Ovaj metaboli ki poreme aj dovodi do neproporcionalno velike resorpcije kostiju,
dovode i do nastajanja poroznih kostiju, koje se lako lome. Mnogi steroidni hormoni (npr.
estrogeni hormoni, glukokortikoidi), vitamin D, polipeptidni hormoni i lekovi mogu da uti u na
metabolizam kosti, direktnim uticajem na osteoblaste menjanjem RANKL-RANK signalnog
sistema. Na primer, estrogeni hormoni indukuju sekreciju OPG i tako inhibiu resorpciju kosti.
Kada je nivo estradiola nizak, kao to je kod postmenopauzalnih ena, resorpcija raste i kosti su
slabije. Moda je mogu razvoj tretmana osteoporoze koji se bazira na menjanju signalnog sistema
koji kontrolie resorpciju kosti.

234

LITERATURNI IZVORI

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K & Walter P (2002): Molecular Biology of the
Cell 4ed with CD. Garland Science.
Bolander FF (2004): Molecular Endocrinology. Elsevier Academic Press
Bradshaw RA & Dennis EA (2004): Handbook of Cell Signaling, three volume set 1-3.
Academic Press.
ConnMP & Means AR (2000): Principles of Molecular Regulation. Humana Press.
Gomperts BD, Kramer IM & Tatham PER (2003): Signal Transduction. Elsevier Academic Press
Griffin EJ, Ojeda RS [2004]. Text Book of Endocrinology Physiology. Oxford University
Hancock JT (2005): Cell Signaling. Oxford University Press.
Hardy MP & Griswold MD (2005): Testicular Cell Dynamics and Endocrine Signaling.
ANN.NY.ACAD.SCI.
Krauss G (2005): Biochemistry of Signal Transduction and Regulation. WILEY-VCH.
Kosti T & Andri S (2007): Molekularna i elijska imunologija. Skripta. WUS Austria.
Lucas KV, Pitari GN, Kazerounian S, Ruiz-Stewart I, Park J, Schulz S, Chepenik KP & Waldman
SA (2000): Guanylyl Cyclases and Signaling by cGMP. Pharmacological Reviews 52(3):375-413.
Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky LS & Darnell J (2004):
Molecular Cell Biology. WH Freeman and Company.
Andri S, Kosti T, Andri N & Zori S (2005): Uporedna fiziologija ivotinja. WUS Austria.
Niehoff D (2005): Language of Life: How Cells Communicate in Health and Disease. Joseph
Henry Press.
Wilson J & Hunt T (2002): Molecular Biology of the Cell Problems Approach Book 4thed.
Garland Science.

235

Autori:
Silvana Andri i Tatjana Kosti
Izdaje:
WUS Austria
Prirodno-matemati ki fakultet, Univerzitet u Novom Sadu
Naslovnu stranu osmislili:
NINI i TEJ
Grafi ko oblikovanje korica:
Predrag Nikoli
tampa:
Daniel Print

236

CIP -

576.5(075.8)

Mehanizmi elijske komunikacije

Silvana Andri i Tatjana Kosti
WUS Austria, Daniel Print, Prirodno-matemati ki fakultet
Novi Sad, 2007
- 237 str. : ilustr. ; 21 cm
Tira: 100.
ISBN 987-86-7031-119-0
1. Andri , Silvana
a) Signaling - elije
COBISS.SR-ID 221486087

237