1 Uvod

Holesterol je otkrio francuski hemiar Chevreul jo 1815. godine, kao komponentu unog kamena kod ljudi. Otuda i naziv za ovaj molekul (na grkom: chole- u i stereosvrst). Gotovo vek kasnije, na poetku XX veka, holesterol je i dalje bio tek izolovana i samo delimino okarakterisana supstanca. Tokom narednih 100 godina odre ena je struktura molekula, utvr en je put njegove biosinteze i otkriveni su elegantni mehanizmi kojima elije reguliu sadraj holesterola i njegovih derivata. Znaaj rezultata ovih istraivanja, prema broju dodeljenih Nobelovih nagrada, uinila je holesterol najnagra ivanijim malim molekulom, "zvezdom" XX veka (Vance & van den Bosch, 2000; Charlton-Menys & Durrington, 2008). Za svoj rad na odre ivanju strukture holesterola i holne (une) kiseline, Heinrich Wieland je nagra en 1927. godine Nobelovom nagradom za hemiju. Zanimljivo je napomenuti da publikovana struktura steroidnog jezgra molekula holesterola iz 1928. godine nije bila u potpunosti tana! Konrad Bloch je dobio Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu, 1964. godine, za svoj mukotrpni, dugogodinji rad na otkrivanju komplikovanog metabolikog puta biosinteze holesterola. Nobelovom nagradom za fiziologiju i medicinu, 1985. godine, nagra eni su Michael S. Brown i Joseph L. Goldstein, za svoje radove o mehanizmima regulacije metabolizma holesterola.

M.E. Chevreul (17861889)

H. Wieland (18771957)

K. Bloch (19122000)

J. Goldstein (1940 ) M. Brown (1941 )

Slika 1.1 Fotografije nekih od najznaajnih istraivaa holesterola. Otkrivanje veze izme u metabolizma holesterola i odre enih patolokih poremeaja u organizmu oveka snano je pojaalo interes za istraivanja u ovoj oblasti. Jo poetkom XX veka, u eksperimentima na ivotinjama, pokazana je povezanost izme u naina ishrane,
1

povienog sadraja holesterola u krvi i razvoja aterogenih promena na zidovima krvnih sudova (Konstantinov et al., 2006). ezdesetih godina prolog veka znatno se uveavaju znanja o prirodi uoenih poremeaja, kljunom znaaju prekomernog unosa triacilglicerola i holesterola ishranom i povezanosti nivoa serumskih lipida sa nastankom oboljenja srca i krvnih sudova. Ovome su najvie doprineli izvetaji, kasnije nadaleko poznate, Framingamske studije (Kannel et al., 1971; Anderson et al., 1987), kao i Studije sedam zemalja sveta, u kojoj je uestvovala i naa zemlja (Kromhout et al., 1989). Vie-decenijska istraivanja dovela su, na kraju prolog veka, do pojave farmakolokih jedinjenja koja efikasno sniavaju nivo holesterola u krvi i time smanjuju uestalost javljanja kardiovaskularnih oboljenja (Brown & Goldstein, 1996). Danas je i laikoj javnosti poznata uloga holesterola u patofiziolokim procesima kao to su aterogeneza i formiranje unih kamenia. U ovoj doktorskoj disertaciji i objavljenim radovima na kojima se ona zasniva po prvi put je pokazano da se fizioloki znaajna koliina holesterola moe nalaziti na "neoekivano oekivanom" mestu u organizmu oveka u citosolu eritrocita, vrsto vezana za molekule hemoglobina. Utvr eni su uzroci i predloeni mehanizmi za nagomilavanje holesterola u unutranjosti eritrocita i diskutovan je znaaj koji bi eritrociti "napunjeni" holesterolom mogli da imaju u sistemskoj regulaciji homeostaze holesterola u organizmu oveka. Nadamo se da e nai rezultati, zajedno sa onima koji e tek uslediti nakon istraivanja problema otvorenih ovim radom, nai mesto u nekom buduem pregledu, kao na skromni doprinos istraivanjima ovog fascinantnog molekula.

2 Pregled literature
Holesterol je kao tipian lipid praktino potpuno nerastvoran u vodenoj sredini, to sutinski utie na sve fenomene povezane sa njegovom unosom u organizam, transportom kroz cirkulaciju, kao i metabolizmom unutar elija i tkiva. U ovom poglavlju bie ukratko predstavljeni najvaniji aspekti metabolizma holesterola u organizmu oveka, ukljuujui i holesterol iz eritrocita. Posebna panja bie posveena vezi izme u povienog sadraja holesterola u cirkulaciji i razvoja aterogenih promena na zidovima krvnih sudova, kao i strukturi holesterol-vezujuih proteina. Na kraju, bie dat krai osvrt na vezivanje malih molekula za hemoglobin, kao i na specifinosti sistema antioksidativne zatite u eritrocitima oveka.

2.1 Holesterol u organizmu oveka

Ukupan sadraj holesterola u telu zdravog odraslog oveka iznosi oko 140 g. Od toga se oko 8 g nalazi u krvi, u sastavu lipoproteina plazme, a ostatak u elijama i tkivima (Frayn, 1996). Vie od 90% holesterola u eliji nalazi se u plazminoj membrani (Goluszko & Nowicki, 2005). Visok sadraj holesterola karkteristian je za mozak i nervno tkivo (Bjrkhem & Meaney, 2004). Ukupan pul izmenljivog holesterola u organizmu odraslog mukarca je oko 60 g. Dnevna razmena ("turnover") holesterola u krvnoj plazmi iznosi oko 5 g. Holesterol u cirkulaciji potie iz dva izvora: biosinteze i ishrane. Oko 1,1 g de novo holesterola ulazi u telesni pul svakoga dana: oko 200 mg iz ishrane egzogeni, ili dijetarni holesterol i oko 900 mg iz biosinteze endogeni holesterol (Charlton-Menys & Durrington, 2008). Sve elije koje imaju jedro mogu da sintetiu holesterol i nema biohemijskih, ili fiziolokih dokaza da je holesterol neophodan u ishrani odraslih ljudi. Glavna mesta biosinteze holesterola su jetra i centralni nervni sistem. Tipina ishrana oveka sadri 200 800 mg holesterola na dan, od ega se do 60% apsorbuje iz tankog creva (Charlton-Menys & Durrington, 2008). Priblino treina dnevne produkcije holesterola katabolie se u jetri u une kiseline: 0,20,4 g unih kiselina nastaje u organizmu oveka svakoga dana (Tietz, 1996). Znatna koliina holesterola (oko 1 g dnevno) direktno se preko jetre izluuje u bilijarni sistem, od ega se priblino polovina resorbuje, a ostatak izluuje iz tela fecesom (Frayn, 1996). Sadraj holesterola u organizmu oveka regulisan je kroz kontrolu unosa i ekskrecije vika holesterola, te kontrolu njegove sinteze i katabolizma, na svim nivoima hijararhijske organizacije organizma oveka. Rasprostranjenost holesterola u ivim sistemima, od minorne komponente elija modro-zelenih algi i gljiva, do glavne lipidne komponente (u mol %) u plazminoj membrani elija sisara (Koumanov et al., 2005), ukazuje na njegove evolutivne prednosti u odnosu na strukturno i biosintetski sline sterole (Bloch, 1979). Holesterol je "mali" molekul sa nebrojeno mnogo "velikih" uloga u organizmu oveka. Holesterol je biosintetska pretea steroidnih hormona (androgena, estrogena, gestrogena, glukokortikoida i mineralokortikoida), vitamina D i unih kiselina (Charlton-Menys & Durrington, 2008). U

kompleksu sa lipidima i proteinima ima nezamenljivu ulogu kao regulator fiziko-hemijskih svojstava biolokih membrana (Odeljak 2.5.3). Holesterol je esencijalan i za provo enje nervnih impulsa, posebno na sinaptikom nivou (Barres & Smith, 2001), kao i za rast elija sisara u kulturi tkiva (Chen et al., 1974). Oksidativno modifikovani molekuli holesterola uestvuju u mnogobrojnim procesima unutar elije (Schroepfer, 2000; Brown & Jessup, 2009), ukljuujui i aktivaciju imunog odgovora organizma (Langlet et al., 2000). Me utim, viak holesterola i njegovih metabolita je tetan za elije i tkiva (Tabas, 2002). Naruavanje homeostaze holesterola u organizmu oveka je uzrok mnogobrojnih patofiziolokih poremeaja od kojih su najpoznatiji (i najbolje izueni) proces ateroskleroze (Odeljak 2.5.4) i formiranja kamena u ui (Admirand & Small, 1968). Zato su organizmi sisara razvili sloene mehanizme za regulaciju sadraja holesterola u cirkulaciji i unutar svojih elija (Odeljak 2.5.2).

2.2 Struktura holesterola i nekih njegovih derivata

Holesterol predstavlja 95% od svih sterola prisutnih u tkivima ivotinja (Matthan & Lichtenstein, 2004). Steroli su organska jedinjenja steroidne strukture koji u molekulu sadre hidroksilnu grupu. Osnov steroidne strukture holesterola je 1,2-ciklopentanoperhidrofenantrensko jezgro, sa dvostrukom vezom izme u ugljenikovih atoma 5 i 6 (Slika 2.1). etiri prstena (AD) su povezana u trans konfiguraciju, to steroidno jezgro ini planarnim, kompaktnim i rigidnim (Bloch, 1983). Hidroksilna grupa je vezana za trei ugljenikov atom (C-3), a boni, izo-oktil ugljovodonini lanac za C-17. Hidroksilna grupa, dve angularne metil grupe (C-18 i C-19), kao i boni lanac nalaze se sa iste strane jezgra (konfiguracija; Slika 2.1). Hidroksilna grupa nepolarnom molekulu holesterola daje amfifilni karakter, to orijentie molekule holesterola u membrani i omoguuje vodonino vezivanje holesterola sa molekulom vode, ili komponentama membranskog dvosloja (Odeljak 2.5.3).

Slika 2.1 Struktura i model ispunjenih sfera molekula holesterola (holest-5en-3-ol). Manji deo u elijama, ali zato glavnina (6080%) molekula holesterola u cirkulaciji je esterifikovana. U adrenalnim lezdama, gde je holesterol prekursor steroidnih hormona, preko 80% sterola u eliji je esterifikovano. Nasuprot tome, u mozgu i nervnom tkivu, gde holesterol ulazi i u sastav mijelina, sadraj estarski vezanog holesterola je zanemarljivo mali
4

(Dietschy & Turley, 2004). Esterifikaciju hidroksilne grupe holesterola, molekulom (dugolanane) masne kiseline, katalizuju enzimi lecitin-holesterol acil-transferaza (LCAT) u cirkulaciji (Jonas, 2000) i acil-holesterol acil-transferaze (ACAT1 i ACAT2) unutar elija (Chang, 2009). Za najvei deo holesterola u krvnoj plazmi oveka vezane su nezasiene masne kiseline (pre svega linolenska kiselina), a unutar elija dominiraju palmitinska i oleinska kiselina (Devlin, 1992). Esterifikacija vikova holesterola u eliji jedan je od mehanizama kojima elije ograniavaju sadraj slobodnog holesterola u svojim membranama (Brown & Jessup, 2009). Oksisteroli, ili oksidativno modifikovani steroli, u molekulu imaju jednu ili vie dodatnih funkcionalnih grupa koje sadre atom kiseonika (hidroksilna, karbonilna ili epoksidna grupa) (Murphy & Johnson, 2008). Pod fiziolokim uslovima, sadraj oksisterola u elijama sisara je za oko 1000 puta manji od sadraja holesterola (Brown & Jessup, 2009). Oksisteroli nastaju oksidacijom steroidnog jezgra, ili bonog lanca molekula holesterola (Slika 2.2). U jetri, pod dejstvom enzima, nastaju 24-, 25- i 27-hidroksiholesteroli, dok se boni lanac holesterola obino modifikuje u membranama elija, pod dejstvom reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) (van Reyk et al., 2006). Relativno visok nivo oksisterola na en je u pojedinim namirnicama bogatim holesterolom (razne vrste mesa, jaja i mleni proizvodi), verovatno kao posledica termike obrade hrane (Brown & Jessup, 2009). Najvanije fizioloke uloge specifinih oksisterola u elijama sisara su: (a) prekursori u sintezi unih kiselina; (b) transport (hole)sterola izme u tkiva i (c) regulacija genske ekspresije (Brown & Jessup, 2009). Potvr eni in vitro i in vivo patofizioloki efekti poveanog sadraja oksisterola u eliji ukljuuju: citotoksinost, aterogenezu, mutagenezu, karcinogenezu, kao i promene u svojstvima elijskih membrana (Schroepfer, 2000).

Slika 2.2 Izvori i strukture fizioloki najaktivnih oksisterola. Prikazana je kompletna struktura molekula holesterola sa obeleenim atomima ugljenika (1-27) i deo strukture svakog oksisterola. Ch25h, holesterol 25-hidroksilaza; CYP, necitohromski P450 enzim; ROS, reaktivne vrste kiseonika (iz Brown and Jessup, 2009).

2.3 Unos i apsorpcija holesterola iz hrane

Unos i intestinalna apsorpcija holesterola vana je karika u homeostazi holesterola u organizmu oveka (Matthan & Lichtenstein, 2004; Tall, 2008). Kao tipian produkt ivotinjskih elija, holesterol unosimo samo u hrani ivotinjskog porekla. Posebno bogat izvor holesterola u svakodnevnoj ishrani oveka je umance jajeta (Tabela 2.1). Specifian sterol-vezujui protein (Niemann-Pick C1-slian protein L1) posreduje u apsorpciji dijetarnog holesterola u proksimalnom regionu tankog creva (Tall, 2008). U lumenu tankog creva, uneti holesterol emulguju soli unih kiselina obrazujui micele. Micele putuju do intestinalne mukoze, gde ih apsorbuju enterociti, procesima pasivne difuzije. U epitelijalnim elijama holesterol se esterifikuje i potom prikuplja u hilomikronske estice, koje se sekretuju u limfu i potom ulaze u krvotok i sistemsku cirkulaciju (Odeljak 2.4.1.2). Unos holesterola u sistemsku cirkulaciju je regulisan ABCG genima. ABC proteini, iz familije ATP-vezujuih kasetnih proteina, moduliraju kretanje holesterola u i iz enterocita. Poveana ekspresija ABCA1 proteina smanjuje apsorpciju dijetarnog holesterola, vraajui molekule holesterola iz enterocita nazad u lumen tankog creva (Lu et al., 2001). Kod zdravih ljudi, 3060% hranom unetog holesterola organizam zadrava u telu, uz manje od 1% svih drugih sterola. Pri poveanom unosu, organizam oveka usvaja svega etvrtinu dijetarnog holesterola (Matthan & Lichtenstein, 2004). Tabela 2.1 Prosean sadraj holesterola u hrani (US Department of Agriculture, 2005). Vrsta namirnice Specifikacija obrano mleko mleko (3,6% masti) punomasno mleko u prahu jogurt (3,2% masti) kisela pavlaka (10% masti) slatka pavlaka (30% masti) maslac sirni namaz (30% masti) gauda (45% masti) govedina teletina svinjetina jagnjetina piletina tunjevina virle mesni narezak srce jetra mozak mlena kokoije Holesterol (mg/100 g) 2 14 109 13 43 111 225 50 105 72 68 86 90 67 38 50 92 140 270 2000 22 300

Mleko i mleni proizvodi

Meso i mesne prera evine

Iznutrice okolada Jaje

2.4 Holesterol u cirkulaciji

Bioloki problem transporta u vodi nerastvornih lipida do ciljnih elija i tkiva reen je rano tokom evolucije nastajanjem solubilnih supramolekulskih kompleksa lipoproteina, koji se sastoje od specifinih proteina (apolipoproteina) i lipida. Lipoproteini prenose triacilglicerole, holesterol (slobodan i esterifikovan) i masne kiseline kroz cirkulaciju kimenjaka (Daniels et al., 2009). Nastaju u jetri i tankom crevu, ili u cirkulaciji iz metaboliki izmenjenih prekursornih lipoproteina. Lipoproteini u cirkulaciji podleu kontinualnom remodelovanju sastava i strukture, dejstvom enzima na njihove lipidne komponente, spontanim ili olakanim transferom lipida i solubilnih apolipoproteina. Periferna tkiva tokom ovih procesa preuzimaju razliite lipidne sastojke lipoproteina. Na kraju, jetra, bubrezi i (delom) periferna tkiva preuzimaju i kataboliu metaboliki izmenjene estice lipoproteina, receptorom-posredovanim i drugim mehanizmima (Jonas, 2002).

2.4.1 Lipoproteini krvne plazme

Lipoproteini se klasifikuju prema svom poreklu, fiziolokim ulogama, hemijskom sastavu, fizikim svojstvima, ili metodama izolovanja (gustina estica nakon ultracentrifugovanja, ili elektroforetska mobilnost u agaroznom gelu). Glavne klase lipoproteina na osnovu gustine estica su: hilomikroni (CM, engl. Chylomicrons), lipoproteini veoma male gustine (VLDL, engl. Very Low Density Lipoproteins), lipoproteini srednje gustine (IDL, engl. Intermediate Density Lipoproteins), lipoproteini male gustine (LDL, engl. Low Density Lipoproteins) i lipoproteini velike gustine (HDL, engl. High Density Lipoproteins). Svaka od navedenih klasa lipoproteina je heterogena frakcija estica razliite veliine i gustine, sadraja i sastava lipida i apolipoproteina (Daniels et al., 2009). Najzastupljeniji lipidni konstituenti lipoproteina su triacilgliceroli, neesterifikovani holesterol, estri holesterola i fosfolipidi (Tabela 2.2). Glikolipidi i slobodne masne kiseline prisutni su samo u tragovima. Tabela 2.2 Lipidni sastav estica lipoproteina (Jonas, 2002). CM
Gustina (g/mL) Ukupni lipidi (%) Triacilgliceroli (% lipida)a Estri holesterola (% lipida) Neesterifikovani holesterol (% lipida) Fosfolipidi (% lipida)b PC (% fosfolipida) SM (% fosfolipida) Lizo PC (% fosfolipida) Ostali (% fosfolipida)
a b

VLDL
0,94-1,006 90-92 50-58 15-23 4-9 19-21 60-74 15-23 ~5 6-10

LDL
1,006-1,063 75-80 7-11 47-51 10-12 28-30 64-69 25-26 3-4 2-10

HDL
1,063-1,210 40-48 6-7 24-45 6-8 42-51 70-81 12-14 ~3 5-10

<0,94 98-99 81-89 2-4 1-3 7-9 57-80 12-26 4-10 6-7

Svega oko 4% nisu triacilgliceroli, ve diacilgliceroli ili monoacilgliceroli. PC, fosfatidilholin, SM, sfingomijelin.
7

Gustinu lipoproteina odre uje relativni udeo proteina i lipida u sastavu estice. Hilomikroni sadre svega 12% proteina, dok je teinski udeo proteina u HDL oko 50% (Jonas, 2002). U plazmi je normalno prisutan i lipoprotein Lp(a), koji sadri apo(a), glikoprotein disulfidno vezan za apo B-100 iz LDL estice. Apo (a) je strukturno i antigenski slian sa plazminogenom (Scanu, 1988). Lipoproteini su sfernog (VLDL, LDL, HDL), ili diskoidnog oblika (nascentne HDL estice). Opta strukturna organizacija estice je slina za sve lipoproteine (Slika 2.3): apolipoproteini i amfifilni lipidi (uglavnom fosfolipidi i neesterifikovani holesterol) obrazuju polarni omota na povrini estice, koji okruuje jezgro sastavljeno od nepolarnih lipida (triacilgliceroli, estri holesterola i mala koliina holesterola i vitamina rastvornih u mastima) (Margolis & Capuzzi, 1972). Sastav lipoproteina u oveka u najveoj meri odre uju genetske predispozicije i nain ishrane. Koncentracija lipoproteina u krvnoj plazmi zavisi i od godina, pola, uhranjenosti, metabolikog/hormonskog statusa i zdravstvenog stanja ispitanika (Jonas, 2002). Fizioloke uloge lipoproteina zavise od sastava apolipoproteina i lipida u strukturi estice (Jackson et al., 1976).

Slika 2.3 Shematski prikaz strukture tipine estice lipoproteina (modifikovano iz Alberts et al., 2002).

2.4.1.1 Apolipoproteini
Prema rastvorljivosti u vodi apolipoproteini (skraenica apo) krvne plazme dele se na nerastvorne (neizmenljive) i rastvorne (izmenljive) proteine. Apo B100 i apo B48, glavne proteinske komponente LDL, VLDL i Lp(a), odnosno CM estica, veoma su veliki (Tabela 2.3) i u vodi nerastvorni proteini. U endoplazmatskom retikulumu (ER) hepatocita, ili elija tankog creva, udruuju se sa lipidima, obrazujui lipoproteine u ijem sastavu ostaju sve do uklanjanja lipoproteina iz cirkulacije uz pomo specifinih receptora (Schneider, 2002). Nasuprot tome, izmenljivi proteini (npr. apo A1, apo A2, apo C13, apo E) imaju mnogo manju molekulsku masu od apo B100 i apo B48 (Tabela 2.3) i manje ili vie su rastvorni u

vodi. Mogu prelaziti sa jedne na drugu esticu lipoproteina, kao i vezivati lipide u cirkulaciji (Pownall & Gotto, 1992). Solubilni apolipoproteini uglavnom su aktivatori ili inhibitori enzima plazme: apo A1, i u manjoj meri apo E, apo A4 i apo C1 aktiviraju LCAT, apo C2 aktivira lipoproteinske lipaze, a apo C3 i apo A2 deluju i kao inhibitori lipaza iz jetre (Jonas, 2002). Tabela 2.3 Najzastupljeniji apolipoproteini iz krvne plazme oveka (Jonas, 2002). Apolipoproteina Apo A1 Apo A2 Apo A4 Apo(a) Apo B100 Apo B48 Apo C1 Apo C2 Apo C3 Apo D Apo E
a

Molekulska masab 28.100 17.400 44.500 3-8 x 105 512.000 242.000 6.600 9.000 9.000 22.000 34.200

Klasa lipoproteinac HDL, CM HDL CM Lp(a) LDL, VLDL CM VLDL, CM, HDL VLDL, CM, HDL VLDL, CM, HDL HDL VLDL, CM, HDL

Sadraj (mg/dL) 130 40 15 0,140 250 <5 3 12 12 12 7

Drugi, manje zastupljeni apolipoproteini izolovani iz lipoproteina ukljuuju apo F, apo H, apo J, apo L i apo M. Njihova uloga u metabolizmu lipoproteina nije sasvim jasna. b Molekulske mase proteinskog dela, bez saharidne komonente. c Boldom su oznaene klase lipoproteina koje sadre najvie datog apolipoproteina, a italikom one sa manjom zastupljenou istog. Jedinstvena uloga svih apolipoproteina je da pomau solubilizaciju neutralnih lipida u cirkulaciji. Apolipoproteini u vodenoj sredini spontano obrazuju agregate sa fosfolipidima i holesterolom. In vivo, agregiranje apolipoproteina i lipida, uz nastanak zrelih estica lipoproteina, obino zahteva asistenciju elijskih proteina, kao to su mikrozomalni transfer proteini za lipide, ili ABCA1 transporter (Vance, 2002). Apolipoproteini imaju esencijalnu ulogu i u prepoznavanju i vezivanju estica lipoproteina za odgovarajue receptore na povrini (ciljnih) elija (Fielding & Fielding, 2002). Osim u vezivanju i solubilizaciji lipida, modulaciji aktivnosti enzima i vezivanju za specifine receptore, otkrivene su i mnoge druge fizioloke uloge pojedinih apolipoproteina. Tako na primer, pokazano je da apo E uestvuje u in situ regeneraciji nerava (Mahley & Rall, 2000), apo(a) u procesu zgruavanja krvi (Spronk et al., 2004), a apo A4 u signalizaciji sitosti (Culnan et al., 2009).

2.4.1.2 Hilomikroni, lipoproteini veoma male i male gustine

Hilomikroni nastaju u tankom crevu nakon obroka bogatog mastima. Lue se u krvotok preko limfe. Jetra direktno u krvotok sekretuje lipoproteine veoma male gustine. Za razliku od periodinog stvaranja hilomikrona, hepatika sekrecija VLDL estica je relativno stalna. CM i VLDL su triacilglicerolima-bogate estice lipoproteina. Molekul apo B48 je
9

integralni strukturni protein hilomikrona i marker-protein za estice lipoproteina poreklom iz tankog creva, dok je jedan molekul apo B-100 u strukturi marker za praenje katabolizma VLDL estica (Jonas, 2002). Proteinske komponente hilomikrona koji nastaju u tankom crevu su i apo A1, apo A2 i apo A4. U cirkulaciji, me utim, ovi apolipoproteini cirkuliu izme u hilomikrona i HDL estica, dok se za hilomikrone vezuju apo E i apo C poreklom iz HDL estica (Fielding & Fielding, 2002). Apo C2 aktivira lipoproteinske lipaze, smetene u endotelu kapilara perifernih tkiva, koje hidrolizuju triacilglicerole iz jezgra hilomikrona. Okolne elije preuzimaju oslobo ene masne kiseline, a molekuli apo C sa povrine hilomikrona vraaju se na HDL estice, zajedno sa neto fosfolipida. Najvei deo smanjenih i triacilglicerolima-osiromaenih (delipidovanih) estica hilomikrona, tzv. hilomikronski ostaci ili remnanti, sa ouvanim sadrajem apsorbovanog dijetarnog holesterola, preuzimaju elije jetre, preko apo E specifinih receptora (Jonas, 2002). Povean sadraj hilomikronskih remnanta u plazmi smatra se aterogenim (Sakurai et al., 2005). VLDL prenose triacilglicerole sintetisane u jetri, kao i triacilglicerole poreklom iz hilomikronskih remnanta, do tkiva u kojima se masne kiseline deponuju (adipozno tkivo), ili slue kao izvor energije (miino tkivo). Katabolizam VLDL estica veoma je slian onom hilomikrona (Slika 2.4).

Slika 2.4 Uproeni shematski prikaz metabolizma hilomikrona i VLDL estica (modifikovano sa http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/lipoprot/index.htm). Za objanjenje videti tekst. Smanjenjem sadraja triacilglicerola (delipidaciona kaskada), iz velikih i manje gustih VLDL estica, preko lipoproteina srednje gustina (VLDL remnanti) nastaju manje i gue LDL estice. LDL frakcija je heterogena po svom sastavu. Najzastupljenije sub-populacije ovih estica u krvnoj plazmi oveka su: velike, flotirajue LDL-I estice, ujedno i najbogatije holesterolom; LDL-II estice, oznaene i kao fenotip A i najmanje i najgue LDL-III estice (fenotip B), koje sadre veu koliinu triacilglicerola (Krauss, 1991). Lipoproteini male gustine imaju relativno dug poluivot u cirkulaciji od oko 3 dana. Sadre oko 70% ukupnog

10

holesterola u lipoproteinima krvi oveka i glavni su prenosioci holesterola do perifernih tkiva (Frayn, 1996). Izuzev eritrocita i elija centralnog nervnog sistema sve elije u organizmu oveka imaju na svojoj povrini receptore visokog afiniteta za LDL estice. LDL receptori su brojniji u plazminoj membrani elija i u tkivima i organima gde uneti holesterol obezbe uje polazni materijal za biosintetske procese (Tietz, 1996). Visoka koncentracija LDL-holesterola u cirkulaciji smatra se glavnim uzrokom ateroskleroze krvnih sudova srca i osnovnim nezavisnim faktorom rizika za razvoj kardiovaskularnih oboljenja uopte (Odeljak 2.5.4).

2.4.1.3 Lipoproteini velike gustine (HDL)

Lipoproteini velike gustine razlikuju se od svih ostalih lipoproteina plazme po tome to nastaju u cirkulaciji, kao me u- ili zavrni proizvod metabolizma lipidnih i proteinskih komponenti razliitog porekla i metabolike sudbine (Rye et al., 1999). Tako, dok se CM i VLDL izluuju kao ve oformljene estice iz tankog creva, odnosno jetre, a LDL nastaju iz delipidiranih VLDL, HDL estice nastaju u izvanelijskom prostoru, gde im se sastav i struktura stalno remodelira (Nestel, 1987). Metabolizam HDL estica (Gotto & Brinton, 2004) moe da se (uopteno) podeli na: (1) sintezu i sekreciju apo A1 u plazmu, to vodi obrazovanju prekursornih HDL estica; (2) preuzimanje vikova slobodnog holesterola sa povrine perifernih elija; (3) esterifikaciju usvojenog holesterola, uz sazrevanje HDL estice; (4) isporuku holesterola na ciljna mesta u telu (jetra, steroidogeni organi i apo Bsadrujui lipoproteini); (5) katabolizam apo A1. Anaboliki put poinje sintezom i luenjem velikih molekula pro-apo A1 iz jetre i tankog creva u plazmu, gde dejstvom izvanelijskih proteaza sazrevaju u obliku apoproteina (Nestel, 1987). Apo A1, posredstvom ABCA1 proteina, vezuje fosfolipide (preteno fosfatidil-holin) poreklom iz elija obrazujui nascentnu HDL (pre-) esticu (Gotto & Brinton, 2004). Nascentna HDL estica potom usvaja holesterol iz plazmine membrane elija perifernih tkiva preko ABCA1, ABCAG1/G4 u makrofagima, receptora istaa klase B tip 1 (SR-B1), proteina kaveolina, ili pasivnom difuzijom (Schneider, 2002). Holesterol moe da potie i iz hilomikronskih ostataka i VLDL estica. Rano tokom formiranja HDL estica, apo A2 se sekretuje iz jetre u krvotok i vezuje se za povrinu nastajue estice, to doprinosi strukturnom integritetu lipoproteina. Kako HDL estica postaje sve vea i poprima diskoidni oblik vezuju se i ostali apolipoproteini (apo A4 i apo A5, kao i apo C proteini), kao i molekuli LCAT, koje u krvotok sekretuju hepatociti (Tall, 1990). Pod fiziolokim uslovima, -HDL se prevodi u zrelu, -HDL esticu dejstvom LCAT. Novosintetisani estri holesterola kreu se prema nepolarnom sreditu estice, to ne samo da spreava vraanje holesterola nazad u periferne elije, ve i dodatno mobilie efluks vikova holesterola iz makrofaga (Nestel, 1987). U poslednjoj fazi "sazrevanja", HDL estice mogu da prime i molekule apo E, koje sintetiu hepatociti, makrofagi, ali i druge elije (Tall, 1990). Tokom svih ovih procesa HDL poprima sferni oblik (Schneider, 2002). Aktivnou proteina za transport estara holesterola (CETP, engl. Cholesterol Ester Transfer Protein), sekretovanih u krvotok iz jetre i najveim delom vezanih za HDL estice,

11

vie od 50% esterifikovanog holesterola iz HDL estica prelazi u apo B-lipoproteine (Gotto & Brinton, 2004). Na ovaj nain, viak holesterola iz elija moe da bude vraen u jetru ne samo preko HDL-receptorskog puta ("direktan" povratni prenos holesterola, ve i preko LDL-receptorskog puta ("indirektan" povratni prenos holesterola) (Slika 2.5). Istovremeno, me utim, aktivnost CETP doprinosi stvaranju manje gustih LDL estica, veeg aterogenog potencijala (Tallis, 1994).

Slika 2.5 Uproeni prikaz povratnog prenosa holesterola, procesa kojim vikovi holesterola iz perifernih elija odlaze u jetru za izluivanje preko ui. Adenozin-trifosfat vezujui kasetni (ABC)A1 transportni protein posreduje u efluksu molekula slobodnog holesterola iz perifernih elija, pre svega makrofaga, do apolipoproteinom (apo) A-Ibogatim nascentnim lipoproteinima velike gustine (HDL). Esterifikacija holesterola dejstvom lecitin cholesterol aciltransferaze (LCAT) ima za posledicu obrazovanje zrelih i sferinih HDL2 estica. Nakon razmene estara holesterola (CE) sa triacilglicerolima (TG), procesa posredovanog aktivnou transfer proteina za estre holesterola (CETP), TG hidrolizuje lipaza iz jetre (HL). Preostali CE u sastavu HDL2 se selektivno uklanjaju iz plazme pomou receptora-istaa (SR-B1) u jetri ("direktan" povratni prenos holesterola (RCT)), to vodi stvaranju malih, lipidima siromanim, apo A estica (ostareli HDL), koji su pogodni za glomerularnu filtraciju i endocitozu, pomou kubilin/megalin receptora u proksimalnim tubulama bubrega. Deo CE prenetih na estice koje sadre apo B (VLDL), lipoproteini srednje gustine (IDL) i LDL estice transportuje se do jetre, gde se unose u eliju preko LDL receptora ("indirektni" RCT). LDL-R, receptor za lipoproteine male gustine; LPL, lipoproteinska lipaza; mLDL, modifikovani lipoproteini male gustine (iz Gotto & Brinton, 2004). HDL estice imaju relativno dug (56 dana) poluivot u cirkulaciji. Razgradnja se odvija, razliitim intenzitetom, u razliitim tipovima elija. Najizraenija je u jetri i tankom crevu, u fibroblastima i endokrinim elijama je mala, dok ne postoji u humanim eritrocitima (Eisenberg, 1984). Za razliku od jedinstvenog i specifinog receptora za LDL estice, lipoproteini velike gustine imaju nekoliko mogunosti za ulazak svojih lipidnih komponenti u ciljne elije. Receptori istai tipa B1, na povrini hepatocita i elija koje proizvode steroidne

12

hormone, imaju glavnu ulogu u selektivnom preuzimanju estara holesterola iz HDL estica (Acton et al., 1996). U znatno manjoj meri, HDL estice ulaze u hepatocite i preko LDL-u slinog receptora na povrini elije, ukoliko u svojoj strukturi sadre apo E (Hill and McQueen, 1977). Internalizacija i kompletna razgradnja ovako unetih HDL estica je slina LDL degradacionom putu. Aktivnost enzima i transportnih proteina za lipide u plazmi, kao i receptora na povrini elija kompletira sloeni put tzv. povratnog prenosa holesterola (RCT, engl. Reverse Cholesterol Transport), kojim viak holesterola iz perifernih tkiva zavrava u jetri. Holesterol se u jetri prevodi u une kiseline, koje se preko ui izluuju u tanko crevo, gde olakavaju digestiju dijetarnih lipida (Agelon, 2002). Lipidima siromane apo A1 estice (ostareli HDL) podesne su i za glomerularnu filtraciju, preko kubilin/megalin receptora u proksimalnim tubulama bubrega (Christensen & Birn, 2001). Epidemioloke studije su pokazale da je HDL-holesterol nezavistan faktor rizika za razvoj kardiovaskularnih bolesti (Wilson, 1988). Za razliku od hilomikrona, VLDL i LDL estica, HDL estice imaju nesumnjiva anti-aterogena svojstva. Mehanizmi kojima HDL ispoljava zatitnu ulogu na nivou krvnog suda su viestruki (Odeljak 2.5.4). Kao telesni rezervoar za apoproteine klase C izme u obroka, HDL estice imaju i sredinje mesto u razgradnji lipoproteina bogatih triacilglicerolima u cirkulaciji (Tall, 2008).

2.4.2 Koncentracija holesterola u cirkulaciji

Koncentracija lipida u krvnoj plazmi oveka na prvom mestu zavisi od ishrane i genetski predodre enih faktora (Grundy and Denke, 1990). Nakon unosa hrane bogate lipidima koncentracija triacilglicerola u krvi brzo raste, dostie maksimum 23 sata nakon obroka i nakon 4 sata naglo opada. Zbog toga se za analizu lipidnog profila plazme ili seruma krv uzima nakon gladovanja bez hrane i tenosti, u trajanju od najmanje 12 sati uzorak nate. U plazmi zdravih osoba uzetoj nate holesterol, zatim fosfolipidi (od ega oko 75% fosfatidil-holina), a potom i triacilgliceroli su najzastupljeniji lipidi. Kao referentne vrednosti za koncentraciju holesterola i triacilglicerola u krvnoj plazmi, koje je prihvatio i Odbor za lipide Srpskog lekarskog drutva 2005. godine, koriste se vrednosti predloene od strane ekspertske grupe za detekciju, evaluaciju i tretman poviene koncentracije holesterola u odraslih (NCEP ATP III, 2002). Rezultati eksperimentalnih istraivanja na ivotinjama, epidemiolokih i kontrolisanih klinikih studija pokazuju da je povien nivo ukupnog holesterola u lipoprotenima krvi glavni faktor rizika za razvoj kardiovaskularnih oboljenja (CVD, engl. Cardiovascular Disease) (NCEP ATP III, 2002). Zbog toga se kod odraslih ljudi sadraj ukupnog holesterola u serumu klasifikuje po kategorijama rizika (Tabela 2.4). Prilikom interpretacije laboratorijskih nalaza uzimaju se u obzir i drugi faktori rizika, kao to su pol i godine ivota ispitanika, porodina istorija bolesti, visok krvni pritisak, gojaznost i dijabetes. Zato se i preporuuje da se svakom oveku nakon navrene 20. godine ivota uradi kompletan lipoproteinski profil barem jednom u svakih pet godina, a posle 30. godine i ee (NCEP ATP III, 2002). Poetna klasifikacija

13

(kategorija rizika) je zasnovana na vrednostima za sadraj ukupnog i HDL-holesterola u serumu ili plazmi nate (Tabela 2.4). Ukoliko je sadraj ukupnog holesterola najmanje 5,2 mmol/L, ili je sadraj HDL-holesterola nii od 1,0 mmol/L, neophodni su i podaci za sadraj LDL-holesterola i triacilglicerola. Tabela 2.4 Klasifikacija koncentracija lipida u plazmi, prema kategorijama rizika od kardiovaskularnih oboljenja (NCEP ATP III, 2002). Ukupan holesterol Manji od 5,16 mmol/L 5,176,18 mmol/L 6,19 mmol/L i vii HDL holesterol Manji od 1,03 mmol/L (za mukarce) Manji od 1,29 mmol/L (za ene) 1,54 mmol/L i vii LDL holesterol Manji od 2,58 mmol/L 2,583,35 mmol/L 3,364,11 mmol/L 4,124,90 mmol/L 4,91 mmol/L i vii Triacilgliceroli Manji od 1,70 mmol/L 1,702,25 mmol/L 2,265,64 mmol/L 5,65 mmol/L i vii Kategorija rizika Poeljna vrednost Nizak rizik od CVD Granino visok holesterol Visok holesterol Vie nego udvostruen rizik od CVD Kategorija rizika Nizak HDL holesterol Glavni faktor rizika za CVD Nizak HDL holesterol. Glavni faktor rizika za CVD Visok HDL holesterol Smatra se da titi od CVD Kategorija (sugestije) Optimalan Blizu/ iznad optimalnog (provera jednom u 5 godina) Granino visok (provera jednom godinje) Visok (dijetni reim tokom 6 meseci) Veoma visok (dijetni reim i terapija lekovima) Kategorija Odgovarajui Granino povieni Visok Veoma visok

Napomena: nisu utvr ene preporuene vrednosti za sadraj fosfolipida u serumu, s obzirom da kod zdravih osoba on postepeno raste sa godinama ivota (Schaefer et al, 1958). Primarne hiper-holesterolemije nastaju kao posledica genetski uzrokovanih defekata u metabolizmu holesterola i lipoproteina (Tietz, 1996). Me u sekundarnim hiperholesterolemijama vano mesto zauzimaju one koje su rezultat izmenjenih ivotnih navika. Viak holesterola u plazmi esto je egzogenog porekla i u vezi je sa poveanim unosom lipida ivotinjskog porekla (Odeljak 2.4.2.2). Sadraj ukupnog holesterola u lipoproteinima plazme raste za oko 4 mg/dL (oko 0,01 mmol/L) za svaki kilogram vika telesne mase (WHO document, 2000). Usled promena u fluidnosti plazmine membrane, pre svega zbog

14

poveanog unosa zasienih masnih kiselina i holesterola u ishrani, gojazne osobe imaju prekomernu produkciju apo B100 i deliminu supresiju aktivnosti LDL receptora u hepatocitima (Grundy & Denke, 1990). Svakodnevna dozirana fizika aktivnost kod zdravih osoba smanjuje broj VLDL estica u cirkulaciji i podie sadraj HDL-holesterola (Lakka & Bouchard, 2005). Veliki broj lekova utie na metabolizam lipoproteina. Poviena koncentracija holesterola u serumu se javlja tokom korienja steroidnih hormona (glukokortikoida, progesterona i anabolikih hormona), diuretika, -blokatora i imunosupresiva (Stone, 1994). I endokrinoloki poremeaji mogu biti uzrok sekundarnih lipoproteinemija. Hipotireoidizam je jedan od najeih endokrinolokih poremeaja praenih hiper-lipoproteinemijom, koji karakterie porast nivoa cirkuliuih LDL estica, snien HDL-holesterol, kao i porast sadraja triacilglicerola i lipoproteinskih remnanta u plazmi (Stone, 1994). Koncentracija holesterola u plazmi raste i kod oboljenja hepatobilijarnog sistema praenih holestazom (Longo et al., 2001). Estrogeni hormoni smanjuju koncentraciju holesterola u serumu, zbog poveanja broja LDL receptora na povrini hepatocita, to ubrzava katabolizam holesterola u jetri. To je i osnovni razlog zbog kojeg ene do menopauze, u proseku, imaju nie vrednosti za sadraj holesterola u plazmi (Farhat et al., 1996). Nivo ukupnog i LDL-holesterola znaajno je povean i kod neregulisanog dijabetesa (Stone, 1994).

2.4.2.1 Sezonske promene u sadraja holesterola u lipoproteinima

Statistiki znaajne razlike u sadraju holesterola u lipoproteinima plazme u zavisnosti od godinjeg doba na ene su u velikom broju studija, nezavisno od zemlje u kojoj je istraivanje obavljeno, godina, pola, etnike pripadnosti i bazalnog lipidnog profila plazme ispitanika (Kelly, 2005). Utvr eno je da je koncentracija ukupnog holesterola u serumu za 3 10% vea u zimskim u pore enju sa letnjim mesecima (Robinson et al., 1993; Bluher et al., 2001). Neto manje razlike dobijene su za sadraj LDL-holesterola (Mnttri et al., 1993) i HDL-holesterola (Bluher et al., 2001), ponovo sa veim vrednostima tokom zime. Pravilnost u promeni koncentracije holesterola u cirkulaciji tokom kalendarske godine moe da se opie modelom sinusoidne krive: najvee vrednosti belee se, na severnoj polulopti, u decembru i januaru, a najmanje tokom juna i jula (Gordon, 1988). Sezonske varijacije u sadraju holesterola u lipoproteinima plazme rezultat su, pre svega, razlika u nainu ishrane tokom godine, konkretno, poveanog unosa zasienih masnih kiselina i holesterola tokom zime (Shahar et al., 1999). Na razlike u sadraju holesterola u plazmi u zavisnosti od doba godine izgleda da utie i temperatura vazduha i izlaganje sunevim zracima (Jenner et al., 1988), promene u fizikoj aktivnosti ispitanika (Thomas et al., 1961; Antonis et al., 1965), ali i unutranji bioloki inioci (Kelly, 2005). Bez obzira na ubedljive nalaze o ne tako malim razlikama u lipidnom profilu ispitanika, sezonske varijacije u sadraju holesterola u serumu ne uzimaju se u obzir prilikom interpretacije nalaza laboratorijskih analiza (NCEP ATP III, 2002).

15

2.4.2.2 Uticaj ishrane na sadraj holesterola u lipoproteinima

Sistematska istraivanja uticaja glavnih nutrijenata (lipidi, ugljeni hidrati i proteini) na sadraj lipida u serumu oveka poela su od 60-tih godina prolog veka i klasinih radova Keys-a i Hegsted-a (Keys et al., 1965; Hegsted et al., 1965). Ova istraivanja su pokazala da na nivo LDL-holesterola od sastojaka hrane najvie utie unos zasienih masnih kiselina. Epidemioloke studije pokazuju da populacije koje u ishrani koriste velike koliine zasienih masnih kiselina i holesterola imaju visok rizik od kardiovaskularnih oboljenja (Keys et al., 1986). Analize rezultata ogromnog broja studija pokazuju da za (svakih) 1% poveanja unosa zasienih masnih kiselina (u odnosu na ukupan kalorijski unos) LDL-holesterol u serumu raste za oko 2% (NCEP ATP III, 2002). Glavni izvori zasienih masnih kiselina u ishrani oveka su mleni proizvodi sa visokim sadranjem masnoa (punomasno mleko, sirevi, puter, sladoled, kremovi), masna mesa, tropska ulja, kao i pekarski proizvodi koji sadre ivotinjske masti (NCEP ATP III, 2002). Smatra se da sadraj LDL-holesterola u cirkulaciji raste kao posledica poremeaja u uklanjanju LDL estica iz cirkulacije, zbog promena u fluidnosti plazmine membrane koje izazivaju zasiene masne kiseline (Grundy and Denke, 1990), kao i zbog pojaane sinteze i sekrecije apo B lipoproteina (Slika 2.6). Veliina hiperholesterolskog efekta zavisi od vrste zasienih masnih kiselina u ishrani. Dok kratkolanane masne kiseline (612 ugljenikovih atoma u molekulu) praktino ne utiu na sadraj holesterola u plazmi, miristinska (C-14) i palmitinska (C-16) kiselina imaju najizraeniji hiper-holesterolski efekat (Schaefer et al., 1995). Masna ivotinjska mesa su posebno bogata palmitinskom, a puter miristinskom kiselinom. Stearinska kiselina (C-18), zbog brzog prevo enja u mononezasienu oleinsku kiselinu, ne poveava nivo holesterola u lipoproteinima plazme (Grundy and Denke, 1990).

Slika 2.6 Shematski prikaz mehanizma poveanja sadraja LDL-holesterola u serumu usled poveanog unosa zasienih masnih kiselina. Poveani sadraj holesterola u hepatocitima, kao posledica ishrane bogate lipidima, inhibira sintezu LDL receptora, to smanjuje unos LDL estica i VLDL remnanta. Ovo smanjuje katabolizam LDL frakcije i ubrzava prevo enje VLDL remnanta u LDL estice (iz Grundy and Denke, 1990).

16

Klinika istraivanja su ukazala na posebno tetne efekte poveanog unosa namirnica za iju se proizvodnju koriste delimino hidrogenizovana biljna ulja koja sadre trans masne kiseline (trans-izomeri nezasienih masnih kiselina) (NCEP ATP III, 2002). Ovi efekti se ogledaju u smanjenju sadraja HDL-holesterola i poveanju sadraja LDL-holesterola u plazmi (Ascherio et al., 1999; Judd et al., 1994). Mononezasiene masne kiseline (na primer oleinska kiselina) sniavaju nivo LDLholesterola u serumu, ali ne utiu znaajno na sadraj HDL-holesterola, ili triacilglicerola (Mensink & Katan, 1992). Zbog toga se, u cilju korekcije poveanih vrednosti holesterola u plazmi, preporuuje povean unos mononezasienih masnih kiselina iz biljnih izvora (maslinovo ulje i oraasti plodovi), do najvie 20% ukupnog kalorijskog unosa (Tabela 2.5). Dva tipa polinezasienih masnih kiselina (PUFA, engl. Polyunsaturated Fatty Acids), dominiraju u ishrani oveka: n-6 i n-3. U biljnim uljima soje, suncokreta, uljane repice i lana, najvie ima n-6 linolne (18:2) i n-3 linolenske kiseline (18:3). Riblja ulja, posebno ona lososa, bakalara, haringe, skue i tune, su izuzetno bogata u dve n-3 polinezasiene masne kiseline: eikozapentaenskom i dokozaheksaenskom kiselinom. Kao zamena za zasiene masne kiseline, PUFA iz biljnih ulja blago smanjuju LDL-holesterol u serumu (do 5%). Efekat potie od inhibicije sinteze apo-B lipoproteina u jetri (Mensink & Katan, 1992). Zbog smanjenog nastajanja VLDL estica, visok unos n-3 masnih kiselina iz riba sniava koncentraciju triacilglicerola u cirkulaciji i do 15% (Davidson, 2006). Kontrolisane klinike studije pokazuju da izokalorijska zamena zasienih masnih kiselina nezasienim znaajno smanjuje ukupan rizik od kardiovaskularnih oboljenja (Gordon, 1995). Me utim, zbog mogue tetnih posledica oksidacije polinezasienih masnih kiselina i rizika od maligniteta (Schaefer et al., 1995), prema sadanjim preporukama, unos PUFA u terapeutske svrhe treba ograniiti na najvie 10% od ukupno unete energije (NCEP ATP, 2002). Tabela 2.5 Preporuke Svetske zdravstvene organizacije o dnevnom unosu makro-nutrijenata (WHO document, 2000). Nutrijent Ukupne masti Zasiene masti Mononezasiene masti Polinezasiene masti Proteini Ugljeni hidrati kompleksni prosti Vlakna (ne-skrobni polisaharidi) Voe i povre So (NaCl) Holesterol Preporuka o unosu 1530% od ukupne energije <10% od ukupne energije do 20% od ukupne energije 37% od ukupne energije 1015% od ukupne energije 5565% od ukupne enrgije <10% od ukupne enrgije 1624 g/dan >400 g/dan <6 g/dan <300 mg/dan

17

Povean unos holesterola ishranom uzrokuje izraenu hiper-holesterolemiju kod laboratorijskih ivotinja, ukljuujui nehumanoidne primate (NCEP ATP, 2002). Visok unos holesterola kod ljudi nema tako dramatine efekte (Grundy & Denke, 1990). Rezultati kontrolisanih metabolikih studija nesumljivo pokazuju da kontinuirano visok unos holesterola podie nivo LDL-holesterola u serumu oveka (Clarke et al., 1997; Hopkins, 1992). Procenjuje se da na svakih 100 mg holesterola, unetog sa 1000 kcal, koncentracija holesterola u serumu raste za oko 0,026 mmol/L (Grundy et al., 1988). Znatno manji efekat dijetarnog holesterola na koncentraciju lipida u serumu je na en u manje striktno kontrolisanim studijama (Howell et al., 1997). Smatra se da su kod zdravih ljudi velike me usobne razlike u intenzitetu hiperholesterolskog efekta holesterola iz ishrane posledica genetskih razlika (NCEP ATP, 2002). Ipak, smanjenje unosa dijetarnog holesterola od veoma visokog do niskog znaajno smanjuje sadraj LDL-holesterola kod veine ispitanika (Denke, 1995). Meta-analiza veeg broja kontrolisanih studija je pokazala da dugotrajni poveani unos holesterola poveava kolinik ukupnog i HDL-holesterola, to potvr uje njegov nepovoljan efekat na profil holesterola u serumu (Weggemans et al., 2001). Razloge za porast koncentracije LDL-holesterola kod ljudi sa poveanim unosom holesterola iz hrane treba traiti, slino efektu zasienih masnih kiselina, u supresiji aktivnosti receptora za LDL estice (Slika 2.6). Poslednjih decenija uoen je trend smanjivanja unosa holesterola u visoko-industrijalizovanim zemljama sveta, to je rezultat smanjenog korienja mesa i mlenih proizvoda u svakodnevnoj ishrani (Tippett & Cleveland, 1999). Oko treina dijetarno unetog holesterola je poreklom iz umanceta jajeta i ovaj udeo blago raste u poslednje vreme (Putnam & Gerrior, 1999). Poveani unos ugljenih hidrata ne utie na sadraj holesterola u lipoproteinima plazme (Grundy & Denke, 1990). Me utim, veoma visok unos ugljenih hidrata (vie od 65% ukupne energije) se povezuje sa blagim smanjenjem sadraja HDL-holesterola i znaajnijim porastom koncentracije triacilglicerola u serumu (Turley et al., 1998). Ishrana bogata dijetarnim vlaknima smanjuje hiper-triglicerolemini efekat ugljenih hidrata (Jenkins et al., 1993). Proteini imaju zanemarljiv efekat na koncentraciju lipida u plazmi, osim to zamena ivotinjskih proteina proteinima iz soje izgleda da blago sniava LDL-holesterol (Anderson et al., 1995). Umereni unos alkohola (najvie 30 g dnevno za mukarce i 20 g za ene) poveava sadraj HDL-holesterola i apo A1 (Rimm et al., 1999). Visok dnevni unos (510 g) rastvornih biljnih vlakana (iz jema, ovasa, pektinima bogatog voa ili pasulja) sniava nivo LDL-holesterola za oko 5%, poto smanjuje apsorpciju dijetarnog holesterola (Brown et al., 1999). Redovni dnevni unos (23 g) fitosterola moe da smanji sadraj LDL-holesterola 615%, bez veih promena u sadraju HDL-holesterola i triacilglicerola u serumu (Gylling & Miettinen, 1999).

18

2.5 Holesterol u eliji

Da bi zadovoljile svoje mnogobrojne potrebe za holesterolom i njegovim derivatima elije kontinuirano sintetiu i/ili unose holesterol iz lipoproteina plazme. Endogeni holesterol je esencijalan za normalan razvoj i odranje funkcije modanog tkiva, koje ne usvaja holesterol poreklom iz lipoproteina plazme. U hepatocitima je glavnina holesterola poreklom iz receptorima posredovanog unosa LDL estica, dok je u ostalim tkivima holesterol uglavnom iz de novo sinteze (Dietschy & Turley, 2001). Da holesterol iz ishrane inhibira biosintezu holesterola u elijama jetre utvr eno je jo 50-tih i 60-tih godina prolog veka. U 70-tim je pokazano da je prvi i najvaniji ograniavajui korak u nastajanju holesterola fosforilacija kljunog enzima u biosintetskom putu, HMG-CoA reduktaze (Vance and van den Bosch, 2000). Istraujui porodinu hiper-holesterolemiju, nasledno metaboliko oboljenje koje karakterie izuzetno visok sadraj holesterola u cirkulaciji, Brown i Goldstein otkrivaju receptor za LDL estice (Brown & Goldstein, 1976; Brown & Goldstein, 1986). Sadraj holesterola u eliji, a posebno u plazminoj membrani elija sisara, odrava se u veoma uskim intervalima fiziolokih vrednosti. Danas znamo da su biosinteza i unos holesterola u eliju precizno regulisani transkripcionim, translacionim i post-translacionim mehanizmima (Goldstain & Brown, 2009). Sloeni procesi u kojima viak holesterola iz perifernih tkiva, uz pomo HDL estica, prelazi u jetru gde se katabolie i/ili eliminie iz tela, tako e su od izuzetnog znaaja za sistemsku homeostazu holesterola u organizmu oveka (Fielding & Fielding, 2002).

2.5.1 Biosinteza holesterola

Izuzev u zrelim eritrocitima, sinteza holesterola je mogua u svim elijama oveka. Najintenzivnija je u jetri, sledi sluzokoa tankog creva, testisi, ovarijum, placenta, kora nadbubrega i koa (Bloch, 1983). Biosinteza holesterola odvija se u citosolu i membrani endoplazmatskog retikuluma i peroksizoma elije (Liscum, 2002). To je izuzetno sloen i za eliju energetski veoma zahtevan proces, iji je pojednostavljeni prikaz dat na slici 2.7. Na primer, samo za prevo enje molekula lanosterola u molekul holesterola potrebno je 18 enzimima katalizovanih hemijskih reakcija. Za ciklizaciju skvalena u lanosterol, uvo enje hidroksilne grupe, kao i oksidativno uklanjanje metil- grupa sa molekula lanosterola, neophodan je molekulski kiseonik (Tabas, 2002). Holesterol nastaje iz dva molekula acetil-CoA, kroz tzv. izoprenoidni put. Esencijalni nesteroidni izoprenoidi (dolihol, prenilovani proteini, hem A, ili izopentenil adenozin tRNKe) tako e nastaju u ovom putu (Slika 2.7). Stoga ne udi da metaboliki defekti u biosintezi holesterola imaju razorne posledice po elije i organizam u celini (Waterham, 2006).

19

Slika 2.7 Put biosinteze holesterola: navedeni su glavni intermedijeri i krajnji proizvodi, kao i lokalizacija enzima iz biosintetskog puta unutar elije (iz Olivier & Krisans, 2000).

2.5.2 Regulacija sadraja holesterola u eliji

Homeostaza holesterola u eliji se postie usaglaenim odvijanjem tri procesa: (1) unosa holesterola u eliju; (2) biosinteze holesterola unutar elije; i (3) eksporta (efluksa) vika holesterola iz elije. Homeostazi doprinosi i raspodela raspoloivog holesterola izme u plazmine membrane i membrana elijskih organela (Simons & Ikonen, 2000). Proteini kaveolini uestvuju u raspodeli unetog, ili endogeno sintetisanog holesterola izme u membranskih kompartmenta elije (Ikonen et al., 2004). Unos holesterola u eliju odvija se desorpcijom i transferom molekula holesterola sa povrine estice lipoproteina na spoljanju povrinu membranskog lipidnog dvosloja, ili unosom itave estice lipoproteina, posredstvom specifinih proteinskih receptora na povrini elije (Fielding & Fielding, 1995). Najbolje proueni i kvantitativno najznaajniji proces
20

ulaska holesterola u elije ukljuuje LDL estice i njihov receptor (Brown & Goldstein, 1976). Receptor za LDL je integralni membranski glikoprotein, za iji se izvanelijski domen vezuju lipoproteini koji sadre apo B100 ili apo E. Apolipoproteini klase E imaju vei afinitet za vezivanje za LDL receptor od apo B100, zbog ega se CM ostaci i VLDL estice efikasnije odstranjuju iz krvotoka od LDL estica (Schneider, 2002). Nakon vezivanja, nastali kompleks procesom endocitoze ulazi u unutranjost elije. Nakon internalizacije, ATPzavisna protonska pumpa sniava pH u endozomu, kompleks disosuje i LDL receptorni protein se reciklira, preko ER, nazad na povrinu elije. Endocitotske vezikule se potom fuzioniu sa lizozomima, u kojima enzimi hidrolizuju estre holesterola iz jezgra lipoproteina, a kisele hidrolaze razlau molekul apo B100. Smatra se da veina molekula apo E izbegava hidrolizu i vraa se u cirkulaciju kao komponenta HDL estica (Schneider, 2002). U eliji postoji kontinualni fluks fosfolipida, glikolipida i holesterola od mesta sinteze (ER i Goldi sistem) do drugih unutarelijskih membranskih struktura, ukljuujui i plazminu membranu. Mehanizmi transporta holesterola unutar elije su viestruki (Slika 2.8). Molekuli holesterola, oslobo eni iz kasnog endozoma i lizozoma u citosol elije, posredstvom razliitih sterol-vezujuih proteina mogu da budu preneseni do plazmine membrane elije. Viak holesterola iz plazmine membrane i Goldi aparata elije, istim putevima, moe da se vrati u ER, gde regulie sopstvenu biosintezu (Maxfield & Tabas, 2005). Kao brzi odgovor elije na poveani unos holesterola nastaje ACAT-om katalizovana esterifikacija vikova slobodnog holesterola (Chang, 2009). Esterifikovani holesterol se skladiti i uva u lipidnim kapljicama rasutim u citoplazmi. Ukoliko eliji zatreba holesterol, estri holesterola iz ovih kapljica bie efikasno izhidrolizovani dejstvom neutralnih holesterol-estar hidrolaza, koje u nekim elijama ukljuuju i hormon-osetljive lipaze, enzime koji hidrolizuju triacilglicerole u adipocitima (Yeaman, 2004). Naizmenini ciklusi esterifikacije i hidrolize estarski vezanog holesterola omoguuju kratkotrajno puferisanje sadraja holestrola u eliji. Aktivnost ACATa, kao homeostatskog senzora, je regulisana koncentracijom holesterola u eliji (Maxfield & Tabas, 2005). elije reguliu sadraj holesterola i preko regulacije aktivnosti nekoliko enzima iz biosintetskog puta holesterola. Pod svim fiziolokim uslovima, 7590% HMG-CoA reduktaze, kljunog enzima koji kontrolie brzinu sinteze holesterola, je fosforilovano i inaktivno. Rezerve inaktivnog enzima omoguuju elijama brzi odgovor na kratkotrajne potrebe za holesterolom (Liscum, 2002). ak i uz dodatak egzogenog holesterola, potpuna inhibicija HMG-CoA reduktaze bi dovela do smrti elije, usled nedostatka esencijalnih nesteroidnih izoprenoida, derivata mevalonata. HMG-CoA reduktaza je i najvanija terapeutska meta za tretman hiper-holesterolemija. Enzim inhibiraju statini, potentni kompetitivni inhibitori HMG-CoA reduktaze (Liscum, 2002). Regulacija enzima ukljuenih u biosintezu holesterola odvija se i na nivou stabilnosti iRNK, translacije i enzimske degradacije (Liscum, 2002). Izoprenoidni put nastajanja sterola u eliji reguliu ne samo krajnji proizvodi biosintetskog puta, ve i nesteroidni intermedijeri (Goldstein & Brown, 1990). Najvaniji fizioloki faktori koji utiu na sintezu holesterola su: urinarni ritam, insulin

21

i glukagon, tiroidni hormoni, glukokortikoidi, estrogen i une kiseline (Ness & Chambers, 2000).

Slika 2.8 Transport holesterola unutar elije. LDL estice (narandasti krugovi) vezuju se za LDL receptore na povrini elije (svetlo plavi Y-oblik) i nakon internalizacije prelaze u endozomsko-lizozomski sistem iz kojeg holesterol moe da pre e u elijske kompartmente, pre svega plazminu membranu i endoplazmatski retikulum (ER). LDL receptori se vraaju u plazminu membranu preko endocitotskog reciklujueg kompartmenta (ERC). Holesterol moe da pre e iz plazmine membrane do ERC nevezikularnim, od ATP-a zavisnim, procesom. Povratak holesterola u plazminu membranu odvija se ne-vezikularnim transportom i preko membranskih vezikula koje sadre i druge reciklovane komponente membrana. Novo-sintetisani molekuli holesterola iz ER uglavnom direktno odlaze u plazminu membranu elije, iako neki slede biosintetski sekretorni put iz ER do Goldijeve oblasti. Vikovi holesterola u ER bivaju esterifikovani pomou acil-holesterol acil-transferaze (ACAT) i uskladiteni u citoplazmi elije, u obliku lipidnih kapljica. TGN, trans-Goldijeva mrea (iz Maxfield & Tabas, 2005). Noviji radovi (na primer Brown & Goldstein, 1997) su ubedljivo pokazali da je SREBP/SCAP proteinski kompleks esencijalni regulator sadraja holesterola u eliji na molekulskom nivou (Slika 2.9). Proksimalni promotori gena ukljuenih u metabolizam holesterola sadre SRE (engl. Sterol Regulatory Element). Transkripcioni faktori koji se vezuju za ove elemente su SRE-vezujui proteini (SREBPs, engl. Sterol Regulatory Element Binding Proteins), iji se prekursor nalazi u membrani ER elija. Proteolitikim cepanjem SREBP osloba a se amino-terminalni deo proteina iz Goldi oblasti u citosol, koji potom putuje do jedra elije i vezivanjem za SRE regulie ekspresiju proteina ukljuenih u metabolizam lipida (Horton et al., 2002). Transkripciona aktivacija ukljuuje ne samo enzime iz biosintetskog puta holesterola (HMG-CoA sintaza, HMG-CoA reduktaza, farnezil-difosfat sintaza i skvalen sintaza), nego i receptorski protein za LDL estice, kao i enzime ukljuene u sintezu i unos masnih kiselina u eliju (acetil-CoA karboksilaza, sintaza masnih kiselina i lipoproteinska lipaza) (Brown & Goldstein, 1999).
22

Proteolitina aktivacija SREBPs je regulisana od strane, tako e za membranu ER vezanog, SCAP proteina (engl. Sterol Cleavage Activating Protein) (Brown & Goldstein, 1997). Za osloba anje iz membrane ER i prelazak u jedro elije, prekursorni SREBP mora prvo da vee SCAP i da, potom, SCAP/SREBP kompleks napusti ER i pre e u Goldi kompleks elije (Slika 2.10). Transport je vezikularni, uz posredovanje specifinih COPII proteina (engl. Coat Protein). SCAP sadri specifini vezujui domen za holesterol koji je senzor sadraja holesterola u eliji i smatra se da promene u koncentraciji holesterola u membrani na neki nain menjaju prirodu interakcija izme u SCAP i SREBPs (Goldstein & Brown, 2009). Vezivanje holesterola za SCAP izgleda da favorizuje vezivanje SCAP/SREBP kompleksa za druga dva proteina (Insig-1 i Insig-2), to blokira asocijaciju SCAP sa COPII proteinima (Sun et al., 2007) i translokaciju SCAP/SREBP kompleksa u Goldi aparat. Nedavno je pokazano da se oksisteroli, posebno 25-hidroksi-holesterol, vezuju za Insig proteine sa veim afinitetom nego SCAP (Radhakrishnan et al, 2007), inhibirajui biosintezu holesterola u eliji. Kada je sadraj holesterola u eliji visok, proteaza nije aktivirana, SREBP nije oslobo en, ekspresija gena za HMG-CoA reduktazu i LDL receptor nije indukovana, tako da su unos i endogena biosinteza holesterola u eliji minimalni. Kada je sadraj holesterola u eliji nizak, prekursorni SREBP se cepa, SREBP migrira do jedra i omoguuje ekspresiju navedenih gena, to za posledicu ima povien i unos i sintezu holesterola u eliji (Goldstein & Brown, 2009).

Slika 2.9 Mehanizmi regulacije sadraja holesterola u eliji. (a) Kada je sadraj holesterola u eliji odgovarajui, sterol vezujui regulatorni protein (SREBP) koji aktivira cepanje SREBP (SCAP) i Insig-1 obrazuju makromolekulski kompleks u membrani endoplazmatskog retikuluma. (b) Sniavanje sadraja holesterola u ER stimulie osloba anje Insig-1 iz kompleksa, to omoguava da SCAP sprovede SREBP do vezikula ogrnutim COPII proteinom. (c) COPII vezikule prenose SCAP/SREBP do Goldi aparata. (d) U Goldi aparatu, SREBP se proteolitiki cepa na dva mesta, uz osloba anje sterol-vezujueg elementa koji migrira do jedra (iz Goldstein & Brown, 2009).

23

Nedavno je indentifikovan jedarni hormonski receptor, nazvan LXR (engl. Liver X Receptor ), kao drugi glavni transkripcioni faktor ukljuen u homeostazu holesterola u elijama jetre. Smatra se da ovaj receptor uestvuje u regulaciji unosa dijetarnog holesterola u hepatocite (Zhao & Dahlman-Wright, 2010). Kako je za nekoliko razliitih oksisterola na eno da su fizioloki ligandi za LXR, izgleda da su oksisteroli vani regulatori sadraja holesterola u elijama jetre. Aktiviranje LXR stimulie sintezu i sekreciju unih kiselina, sintezu masnih kiselina, verovatno i esterifikaciju holesterola (Zhao & Dahlman-Wright, 2010). Istovremena regulacija biosinteze holesterola i sinteze masnih kiselina izgleda da omoguuje eliji da istovremeno regulie sadraj holesterola i fosfolipida u svojim membranama (Brown & Goldstein, 1997). Trei nivo regulacije sadraja holesterola unutar elije obezbe uju mehanizmi eksporta vikova slobodnog holesterola iz elije u izvanelijsku sredinu. Poznata su tri takva mehanizma (Slika 2.10): (a) difuzija holesterola u vodenu fazu; (b) efluks holesterola posredovan SR-B1 proteinima; (3) kvantitativno najznaajniji, efluks holesterola posredovan ABCA1 proteinima. Kljuni akceptori holesterola iz elija su HDL estice i za njih asosovan apo A1 (Yancey et al., 2003). Smatra se da su kaveole, holesterolom bogati mikro-domeni plazmine membrane, mesta efluksa molekula holesterola iz elije (Ikonen et al., 2004).

Slika 2.10 Shematski prikaz mehanizama efluksa holesterola iz perifernih elija: difuzija kroz vodenu fazu i ugradnja holesterola u HDL esticu (spori proces koji se odvija u svim tipovima elija); SR-BI posredovani efluks holesterola (SR-BI vezuje lipoproteine i potpomae dvosmernu razmenu holesterola izme u elije i izvanelijskih akceptora); ABCA1 posredovani efluks holesterola (potpomae jednosmerni efluks holesterola i fosfolipida iz membrane elije do apolipoproteina) (iz Yancey et al., 2003). Difuzija holesterola u izvanelijsku sredinu putem vodene faze se odvija u svim tipovima elija. To je pasivan i relativno spor proces u kojem se desorbovani molekuli holesterola iz plazmine membrane vezuju za serum albumin, LDL estice i, pre svega, za zrele HDL estice. Holesterol vezan za albumin brzo se redistribuira u lipoproteine (Zhao &

24

Marcel, 1996). SR-B1 nespecifino prepoznaje i vezuje estice lipoproteina, to omoguuje dvosmernu pasivnu razmenu holesterola izme u elije i izvan-elijskog matriksa. Zrele, fosfatidil-holinom bogate HDL estice su najbolji akceptori holesterola eksportovanog iz elije putem SR-B1 proteina u plazminoj membrani. Osim uloge u eliminisanju vikova slobodnog holesterola iz elija, SR-B1 posreduje i u selektivnom unosu fosfolipida, estara holesterola i triacilglicerola u eliju (Thuahnai, 2001), pospeujui delipidaciju (pre svega) HDL estica. Smer i veliina neto transfera holesterola iz perifernih elija u cirkulaciju, procesima pasivne difuzije i preko SR-B1, zavisi od gradijenta sadraja holesterola (izraenog na sadraj ukupnih fosfolipida) izme u kompartmenta ukljuenih u razmenu (Thuahnai, 2001), kao i od sastava akceptorskih lipoproteina (Rothblat, 1999). ABCA1, lan velike familije kasetnih transportnih proteina me usobno sline strukture, koristi ATP za transport razliitih lipidnih supstrata (Dean et al., 2001). Stoga je, za razliku od prethodna dva mehanizma, smer prenosa molekula holesterola i fosfolipida uvek isti: iz plazmine membrane elije prema nascentnim HDL esticama (Slika 2.10). Humani makrofagi, glatke miine elije aorte ili fibroblasti, ali ne i eritrociti, ostvaruju preko ABCA1 intenzivan efluks vikova holesterola iz svojih elija (Fielding & Fielding, 1995). Aktivnost LCAT u krvnoj plazmi stvara i odrava gradijent (slobodnog) holesterola izme u plazmine membrane i akceptornih lipoproteina, to omoguuje neto transfer holesterola iz elijskih membrana u lipoproteine plazme (Glomset, 1968). LCAT uglavnom deluje na holesterol iz HDL estice (Akanuma & Glomset, 1968), to je jedan od razloga za jedinstvenu ulogu lipoproteina velike gustine u efluksu elijskog holesterola. Katalitiko delovanje LCAT i CETP u plazmi oveka deo je regulisane sekvence koraka kojima molekuli slobodnog holesterola iz elija prelaze u estarski vezan holesterol u jezgru lipoproteina, to, na posletku, omoguuje katabolizam holesterola u hepatocitima (Fielding & Fielding, 1982). Efikasno vraanje vikova holesterola iz perifernih elija i tkiva u jetru usporava njegovo nagomilavanje u zidovima arterija (Yancey et al., 2003). Transfer molekula holesterola iz elije ili u eliju predstavlja tako fiziki fenomen koji se kvalitativno deava u svim tkivima u organizmu oveka, ali iji kvantitativni znaaj, pre svega, zavisi od metabolikog stanja elije.

2.5.3 Holesterol u membranama elija

Najvei deo holesterola u eliji nalazi se unutar membrana, iskljuivo u slobodnoj (ne-esterifikovanoj) formi. Holesterol se u membranu umee vertikalno na ravan dvosloja, sa polarnom hidroksilnom grupom na povrini, hidrofobnim steroidnim jezgrom u unutranjosti i bonim lancem prema centru dvosloja (Slika 2.11). Holesterol je podjednako zastupljen u oba sloja, bez obzira na tip elijske membrane (Blau & Bittman, 1978). Razlog za ovo treba traiti u veoma brzoj translokaciji molekula holesterola unutar membranskog dvosloja. Za razliku od molekula fosfolipida, za koje polu-vreme prelaska iz jednog u drugi sloj membrane iznosi oko 270 minuta, za molekule holesterola je, na primeru membrana humanih eritrocita, na eno da iznosi manje od 50 minuta (Brasaemle et al, 1988). Holesterolom je najbogatija

25

plazmina membrana elije (3050% ukupnih lipida). Membrane mitohondrija i ER sadre relativno malo holesterola (515%), dok je sadraj holesterola u Goldi kompleksu izme u ovih vrednosti (Yeagle, 1985). Razliiti sadraj holesterola u razliitim membranskim kompartmentima posledica je ne-vezikularnog puta transporta holesterola kroz eliju, pomou specifinih sterol-vezujuih proteina koji prenose holesterol iz membrana organela (ER i Goldijeva oblast) u plazminu membranu elije (Maxfield and Tabas, 2005). Holesterol je jedan od najvanijih regulatora lipidne organizacije, strukturnih i funkcionalnih karakteristika biolokih membrana. Uspostavljajui mnogobrojne kontakte sa molekulima (gliko)fosfolipida, (gliko)sfingolipida i proteina, holesterol poveava mehaniku stabilnost lipidnog dvosloja (Slika 2.11) i pomae u odranju lipidnog miljea neophodnog za aktivnost membranskih proteina. Za opisivanje "vrstoe" strukturne organizacije biolokih membrana koriste se pojmovi fluidnost i viskoznost (reciprona vrednost fluidnosti). Fluidnost zavisi od strukturnih (neure enost ugljovodoninih nizova u lipidnom dvosloju) i dinamikih svojstava (brzina kretanja makromolekula) membrana (Owen, 1981). Fluidnost biolokih membrana, pre svega, zavisi od strukture i sadraja membranskih glicerofosfolipida i sfingolipida, temperature i prisustva (prirodnih i/ili sintetikih) amfifilnih supstranci (Cooper, 1977). Zahvaljujui svojoj jedinstvenoj trodimenzionalnoj strukturi, holesterol modulira fluidnost biolokih membrana, pre svega, obrazovanjem kompleksa sa ostacima zasienih dugolananih masnih kiselina iz molekula sfingomijelina i fosfatidil-holina (Slotte, 1999). Interkalacija molekula holesterola u membranski dvosloj poveava ure enost pakovanja lipidnih molekula i smanjuje mobilnost ugljovodoninih lanaca fosfolipida, u irokom opsegu temperatura (Ohvo-Rekila et al., 2002). Poveani sadraj holesterola u plazminoj membrani elije smanjuje, me utim, njenu pasivnu propustljivost za rastvorene supstance. Stoga su elije sisara razvile sofisticirane mehanizme kojima se nivo holesterola u membranama odrava unutar uskih granica (Goldstein & Brown, 2001). Viak holesterola iz plazmine membrane se efikasno vraa u unutranjost elije, gde moe biti signal sa smanjenje ukupnog pula holesterola u eliji, ili podlee efluksu u izvanelijski prostor (Odeljak 2.5.2).

Slika 2.11 Poloaj holesterola u fosfolipidnom dvosloju biolokih membrana. Strukturu holesterola karakterie ravno i glatko lice, koje sadri samo aksijalne atome vodonika, to favorizuje van der Waals-ove interakcije sa acil-ostacima zasienih masnih kiselina fosfolipida, kao i rapavo lice, od prisustva metil grupa u molekulu, koje interaguje sa acilostacima zasienih masnih kiselina fosfolipida ili sfingolipida, kao i sa transmembranskim domenima integralnih membranskih proteina (iz Paila & Chattopadhyay, 2010).

26

Interakcije izme u proteina i lipida unutar membrane, kao i relativni sadraj proteina u odnosu na ukupne lipide, mogu da modifikuju fluidnost membrana (Chapman et al., 1979). Preko efekta na ure enost pakovanja membranskih fosfolipida, holesterol (indirektno) modulira aktivnost membranskih proteina. Naime, integralni membranski proteini (jonski kanali, receptori i enzimi) su osetljivi na fizike promene u lipidnom miljeu koji ih okruuje (Ohvo-Rekila et al., 2002), posebno oni smetani u membranskim raftovima (Kurzchalia & Parton, 1999). Holesterol asosovan sa sfingolipidima esencijalna je komponenta ovih membranskih sub-domena, koja su mesta intenzivne signalne aktivnosti (Ohvo-Rekila et al., 2002). Protein kaveolin na en je u posebnoj grupi lipidnih raftova, nazvanim kaveolama (Fielding & Fielding, 2000). Vei broj (uglavnom perifernih) membranskih proteina iz kaveola vezuju holesterol i ukljueni su, direktno ili indirektno, u odravanje homeostaze holesterola u eliji (Schroeder et al., 2010). Zajednika strukturna karakteristika ovih proteina je da sadre konzervirane regione u aminokiselinskoj sekvenci, takozvane "sterol-sensing" domene (Odeljak 2.7). Prisustvo molekula holesterola u biolokim membranama omoguuje, tako, delikatno podeavanje strukture, organizacije i, shodno tome, normalno funkcionisanje biolokih membrana, bez obzira na promene u spoljanjem i unutranjem okruenju elije.

2.5.4 Holesterol i ateroskleroza

Ateroskleroza je oboljenje arterijskih krvnih sudova koje zahvata sva vaskularna korita i karakterie se zadebljanjem i otvrdnuem zida arterija. Nastaje kao posledica stvaranja ateroma (plaka sainjenog od lipidnog jezgra okruenog vezivnim tkivom) na mestu povrede endotela krvnog suda. Plakovi nastaju usled akumulacije izvanelijskih i unutarelijskih lipida, infiltracije monocita i makrofaga, formiranja penastih elija, proliferacije glatkih miinih elija i akumulacije vezivno-tkivnih proteina (Schachter, 1997). Sve ovo moe da smanji dotok krvi do vitalnih organa, ukljuujui srce, mozak i ekstremitete, a zbog smanjenja elastinosti krvnih sudova poveava se i krvni pritisak. Ishemija nastaje kao posledica pucanja plaka i formiranja tromba, koji moe i da potpuno blokira protok krvi na mestu povrede endotela, to uzrokuje embolizam, ili nekrozu (infarkt) tkiva. Infarkt miokarda izaziva srani udar, a infarkt modanog tkiva log, ili modani udar, esto sa smrtnim ishodom. Ateroskleroza je tihi ubica: endotel nema inervaciju i zato aterosklerotski proces ne izaziva bolove i dugo je asimptomatian (Scott, 2002). Ateroskleroza je izuzetno kompleksno patofizioloko stanje (Slika 2.12). Neki od najbitnijih faktora rizika su poremeaji u metabolizmu lipida, arterijska hipertenzija, puenje, gojaznost, dijabetes, starost, porodina anamneza za kardivaskularne bolesti kod ro aka u prvoj liniji (mukarci mla i od 55 godina, ene mla e od 65 godina) i nedovoljna i neredovna fizika aktivnost (Wilson et al., 1988). Novija istraivanja su pokazala da pored navedenih postoje i netradicionalni faktori rizika, koji obuhvataju povieni oksidativni stres, disfunkciju endotela krvnog suda, inflamaciju i stres (Hackam & Anand, 2003). Interventne studije

27

pokazuju da se regulacijom promenljivih predisponirajuih faktora rizika znaajno smanjuje uestalost kardiovaskularnih oboljenja (Chisolm & Steinberg, 2000). Uobiajeni biomarkeri za procenu rizika su koncentracija ukupnog, HDL- i LDL-holesterola, kolinik ukupnog i HDL-holesterola, sadraj homocisteina, C-reaktivnog proteina i apolipoproteina A1 i B100 u serumu ispitanika. Smatra se da je najbolji dugoroni prediktor rizika visok odnos ukupnog i HDL-holesterola, te prisustvo malih i gustih LDL estica u cirkulaciji (Castelli, 1988). Uprkos tome to u patogenezi ateroskleroze uestvuje veliki broj faktora i dalje se centralna uloga pripisuje poremeajima metabolizma holesterola. Hipoteza lipidne teorije ateroskleroze zasniva se na poveanom nakupljanju i potom akumulaciji LDL estica u zid krvnog suda, na mestu povrede endotela, uporedo sa njihovom transformacijom u mnogo aterogeniji, oksidativno modifikovani oblik (Chisolm & Steinberg, 2000). Zbog svoje sloene lipidno-proteinske strukture LDL estice su posebno podlone oksidativnim oteenjima. Svaka LDL estica sadri oko 700 molekula fosfolipida, 185 molekula triacilglicerola i 1600 molekula estarski vezanog holesterola. PUFA u sastavu ovih lipida, holesterol iz estara holesterola i oko 600 molekula slobodnog holesterola podloni su reakcijama oksidacije. Apolipoprotein B100 u strukturi LDL estice, sa velikim brojem izloenih ostataka tirozina i lizina na svojoj povrini, moe biti direktno oksidovan, ili modifikovan proizvodima oksidacije lipida (Miller et al., 2010). Male i guste LDL estice su posebno aterogene, s obzirom da lake prodiru kroz sloj endotelijalnih elija i podlonije su oksidativnoj transformaciji (Hackam & Anand, 2003). Oksidacija LDL estica u plazmi, ili unutar arterijskog zida, posredovana je dejstvom enzima (lipooksigenaze, mijeloperoksidaze, NADPH oksidaze), jonima metala (Cu2+, Fe2+) i/ili reaktivnim vrstama kiseonika i azota (Miller et al., 2010). Oksidativno modifikovane LDL estice postaju ligandi za razliite receptore istae (SR, engl. Scavenger Receptors) na makrofagima, delom i na endotelnim i glatkomiinim elijama (Chisolm & Steinberg, 2000). Naime, fagocitne elije retikulo-endotelijalnog sistema na svojoj povrini imaju receptore istae koji prepoznaju i vezuju LDL estice, to omoguuje da razgrade preostale koliine LDL estica u cirkulaciji. Me utim, za razliku od LDL receptora, receptori istai ne samo da nisu pod nishodnom regulacijom, ve specifino vezuju i unose u eliju i modifikovane LDL estice (Hackam & Anand, 2003). Stoga e se holesterol, u uslovima kada je u plazmi poveana koncentracija LDL-a (hiperholesterolemije) i/ili oksidativno modifikovanih LDL estica, brzo nagomilavati u fagocitima (Miller et al., 2010). Zbog ogromne koliine lipidnih kapljica esterifikovanog holesterola u citosolu makrofagi se pretvaraju u takozvane "penaste" elije (engl. foam cells). U zidovima arterija ovo izaziva inflamaciju i aktivaciju imunog odgovora organizma, to na posletku dovodi do obrazovanju aterosklerotskog plaka i eventualno tromba (Slika 2.12). Najnovije studije potr uju znaaj oksisterola kao lipidnih medijatora u procesu aterogeneze, s obzirom da su oksidativno modifikovani steroli na eni u aortnom tkivu aterosklerotskog plaka (Brown & Jessup, 1999).

28

Slika 2.12 Shematski prikaz uzroka i mehanizama nastanka ateroskleroze. PUFA, polinezasiene masne kiseline; VLDL, lipoproteini veoma male gustine; LDL, lipoproteini male gustine; HDL, lipoproteini velike gustine; TAG, triacilgliceroli; NEFA, neesterifikovane masne kiseline (prema Harwood at al., 2007). Nizak sadraj HDL estica u serumu je nezavistan faktor rizika za nastanak kardiovaskularnih bolesti. Procenjuje se da u optoj populaciji oko 35% mukaraca i 15% ena ima nizak HDL-holesterol (WHO document, 2000). Meta analiza etiri velike prospektivne studije pokazala je da porast HDL-holesterola za 1 mg/dL (oko 0,026 mmol/L) smanjuje rizik od ishemijske bolesti srca za 2% kod mukaraca i 3% kod ena, nezavisno od nivoa LDL-holesterola (Gordon et al., 1977). Osim to omoguava odstranjivanje vikova holesterola iz perifernih tkiva, u procesu povratnog prenosa holesterola (Schneider, 2002), drugi kardioprotektivni mehanizmi HDL estica obuhvataju: zatitu normalne funkcije endotela, antioksidativni, antiinflamatorni i antitrombozni efekat (Stein & Stein, 1999; Assmann & Gotto, 2004; Tall, 2008). Antioksidativna aktivnost potie od prisustva velike koliine antioksidanasa i antioksidativnih enzima u strukturi estice. Zatitna uloga u odnosu na endotel ogleda se u sposobnosti HDL estica da izazovu poveanje sadraja endotelne azot-oksid sintaze i spree apoptozu endotelnih elija. HDL estice poseduje i profibrinolitiko dejstvo poto inhibiraju aktivaciju trombocita i koagulaciju. Antiinflamatorna aktivnost se ogleda u suprimiranju ekspresije nekoliko adhezionih molekula i antigena. Novije eksperimentalne studije pokazale su i direktan antiaterogeni efekat apo A1. Kod bolesnika sa akutnim koronarnim sindromom, intravenska primena rekombinantnog apo A1 Milano dovela je do znaajnog smanjenja veliine ateroma (Nissen et al., 2003).

29

2.6 Holesterol u eritrocitima

Krv je specijalizovano teno vezivno tkivo koje se sastoji iz oformljenih elemenata (eritrocita, leukocita i trombocita) i plazme. U pore enju sa ukupnom zapreminom ekstracelularne tenosti, zapremina krvi u organizmu oveka je mala: 70 mL/kg telesne mase. Formirani elementi zauzimaju 3754% ukupne zapremine krvi, od kojih su eritrociti najzastupljeniji (99,9% elija). Tipino, mililitar krvi sadri 4,56,3 x 109 eritrocita kod mukarca, a kod ena neto manje: 4,25,5 x 109 RBC/mL krvi (Ashton, 2007). Eritrociti su elije bikonkavnog oblika, prenika oko 7,8 m, i visine 2,6 m na najdebljem delu i 0,8 m u sredini. Ovakav oblik reflektuje odsustvo organela u zrelim eritrocitima i obezbe uje da elija ima veliku povrinu u odnosu na zapreminu, to je idealno za razmenu gasova. Bikonkavni oblik omoguuje i da se eritrociti me usobno slepljuju, to olakava kretanje elija kroz male kapilare i ini eritrocite dovoljno fleksibilnim da pro u kroz kapilare prenika svega oko 4 m (Ashton, 2007). ivotni vek humanih eritrocita iznosi oko 120 dana. U krvi oveka oko 1% eritrocita se zameni svakoga dana, to ukazuje na njihov visok obrt ("turnover"). Eritropoeza kod odraslih ljudi se odvija u kotanoj sri, iz mijeloidnih matinih elija, i stimulisana je eritropoetinom, hormonom bubrega. Ostarele eritrocite iz cirkulacije uklanjaju mononuklearni fagociti u slezini, jetri i kotanoj sri. Smatra se da makrofagi prepoznaju apoptotske promene u lipidnoj organizaciji plazmine membrane eritrocita (Ashton, 2007).

2.6.1 Holesterol u plazminoj membrani eritrocita

Kao i druge bioloke membrane, plazmina membrana eritrocita se sastoji od lipidnog dvosloja i uronjenih proteina (Darnell et al., 1986). Liziranjem eritrocita u hipotonim rastvorima moe da se izoluje nefragmentisana elijska membrana, koja se sastoji od 49% proteina, 43% lipida i 8% ugljenih hidrata (Voet & Voet, 2004). Lipidni deo membrane izgra en je od fosfolipida, sfingolipida, holesterola, glikolipida i fosfatidne kiseline. Najzastupljeniji fosfolipidi su, kao i kod drugih membrana, nejednako raspore eni u membranskom dvosloju. Fosfatidil-holin (19,0%) i sfingomijelin (17,5%) dominiraju u spoljanjem, a fosfatidil-etanolamin (18% ukupnih lipida) u unutranjem delu membrane, dok se fosfatidil-serin (8,5%) iskljuivo nalazi u unutranjem sloju membrane eritrocita oveka (Op den Kamp, 1981). U membranama bogatim holesterolom, asimetrinu distribuciju membranskih fosfolipida odrava aktivnost proteinskih translokaza, specifinih lipidnih transportera. Dva takva integralna membranska proteina, aminofosfolipid Mg2+-ATP-azna translokaza i Ca2+-zavisna skramblaza, su izolovana iz humanih eritrocita (Ikeda et al., 2006). Holesterol je pojedinano glavna lipidna komponenta plazmine membrane humanih eritrocita (25% ukupnih lipida) i ravnomerno je zastupljen u oba sloja lipidnog dvosloja. Prisustvo raftova, membranskih domena nerastvornih u nejonskim detergentima, na eno je i u membrani humanih eritrocita (Civenni et al., 1998). Citoskelet eritrocita razlikuje se od tipinog citoskeleta u elijama sisara poto formira proteinski "oklop" koji se protee ispod celokupne membrane i sa njom je povezan na mnogim mestima (Slika 2.13). Ovo omoguuje
30

eliji da bude jaka i fleksibilna (Voet & Voet, 2004). Citosolna povrina membrane eritrocita sadri veliki broj vezivnih mesta za molekule hemoglobina: anjonski kanal (traka 3), integralni transmembranski protein, specifino vezuje hemoglobin sa visokim afinitetom, dok se hemoglobin slabije (elektrostatikim interakcijama) vezuje za fosfatidil-serin (Shviro et al., 1982).

Slika 2.13 Model membrane humanih eritrocita (modifikovano sa: http://course1.winona.edu/sberg/ILLUST/memb-mod.jpg). Vei broj in vitro i in vivo studija je pokazao da je holesterol u membrani eritrocita u dinamikoj ravnotei sa holesterolom iz lipoproteina plazme, mogue i sa holesterolom iz endotela arterija (Chung, 1998). Holesterol iz membrane eritrocita iskljuivo se izmenjuje sa slobodnim holesterolom iz lipoproteina plazme (Hagerman & Gould, 1951) i sam proces ne zahteva utroak energije (Murphy, 1962). Usled stalne razmene, sastav lipida u eritrocitima, posebno masnih kiselina u sastavu membranskih (fosfo)lipida, slian je onom u plazmi (Cooper, 1977). Praktino sav holesterol iz membrane eritrocita je dostupan za razmenu, poto i do 80% molekula moe da pre e u lipoproteine plazme sa smanjenim sadrajem slobodnog holesterola u njima (Gottlieb, 1978). Kroz procese ravnotene raspodele, eritrociti mogu da usvajaju viak holesterola iz lipoproteina plazme. "Spur-cell" anemiju, estu kod osoba sa cirozom jetre, karakterie znaajno vei sadraj holesterola u membrani eritrocita (2565%), uz nepromenjen sadraj fosfolipida (Cooper et al., 1972). Ovo poveava molski odnos holesterola i fosfolipida (Ch/PL) u membrani eritrocita, sa fizioloke vrednosti od oko 0,9, na vrednosti vee i od 1,6, to dovodi do ireverzibilnih promena u morfologiji eritrocita koji poprimaju iljat ("spiculated") oblik, imaju smanjenu deformabilnost i skraeni ivotni vek (Cooper et al., 1975). I normalni eritrociti mogu da poprime karakteristike "spur" elija, ukoliko se prenesu u plazmu pacijenata sa "spur-cell" anemijom (Allen & Manning, 1996). Post-prandijalna i plazma nate, u prisustvu aktivnih LCAT i CETP, moe da usvoji znaajne koliine holesterola iz membrane humanih eritrocita (Chung, 1998). Svi lipoproteini u plazmi mogu da prihvate esterifikovane molekule membranskog holesterola, to ukazuje da

31

lipoproteini deluju kao "odlivnik" za viak holesterola iz eritrocita (Atger et al., 1997). Oko 35% holesterola iz membrane eritrocita moe biti akumulirano od strane lipoproteina iz svee plazme (Murphy, 1962). Efluks holesterola iz membrane eritrocita u plazmu izgleda da je mogu jedino putem nespecifine difuzije molekula holesterola kroz vodenu fazu, pri emu brzina efluksa zavisi od sadraja holesterola u kompartmentima ukljuenim u razmenu i aktivnosti LCAT (Yancey et al., 2003; Czarnecka & Yokoyama, 1996). Zbog toga se, u in vitro uslovima, intenzitet i smer efluksa holesterola iz eritrocita u krvnu plazmu moe lako menjati promenom koliine elija u inkubacionoj smei (Chung, 1998). Iako je razmena molekula holesterola i fosfolipida izme u lipoproteina plazme i eritrocita veoma intenzivna fizioloki znaaj ovih procesa nije u potpunosti razjanjen (Cooper, 1977). Lipidi iz membrane eritrocita jedan su od glavnih rezervoara lipida u cirkulaciji (Mindham & Mayes, 1991). Razmena holesterola izme u eritrocita i lipoproteina plazme mnogo je intenzivnija nego to je to sluaj sa razmenom holesterola u slezini, pluima, srcu, miiima, bubrezima i mozgu (Avigan et al., 1962). Pokazano je da se holesterol akumulira u ogranienom broju organa kod pacijenata sa LCAT deficijencijom i da su eritrociti jedno od glavnih mesta u organizmu gde se ovaj proces deava (Glomset, 1983; Simon & Scheig, 1970).

2.6.2 Sadraj holesterola u eritrocitima

Za razliku od holesterola u plazmi koji se rutinski odre uje u klinikoj praksi, analiza ukupnog sadraja holesterola u eritrocitima mnogo se re e radi. Koncentracija holesterola u eritrocitima odre uje se u ekstraktu ukupnih lipida primenom uobiajenih hemijskih metoda (Huang et al., 1961), ili primenom komercijalnih enzimskih testova. Za ekstrakciju lipida iz hemolizovanih eritrocita najee se koristi jedan od tri postupka: po Folch-u i saradnicima (1957), Reed-u i saradnicima (1960), ili Rose-u i Oklander-u (1965). U svim radovima autori eksplicitno (na primer Cooper et al., 1978), ili implicitno (na primer Owen & McIntyre, 1978) polaze od pretpostavke da se holesterol u eritrocitima iskljuivo nalazi u plazminoj membrani. U tabeli 2.6 sumirane su vrednosti za sadraj holesterola i ukupnih fosfolipida u eritrocitima iz ovih studija. Iz tabele 2.6 se vidi da se koncentracija holesterola u humanim eritrocitima kree u irokom intervalu srednjih vrednosti (2,04,3 mmol Ch/L RBC), pri emu je u veini studija koncentracija holesterola ispod 4,0 mmol Ch/L RBC. Visoke koncentracije holesterola su praene i odgovarajue visokim koncentracijama ukupnih fosfolipida (2,24,9 mmol PL/L RBC), dok je Ch/PL odnos u svim studijama slian: od 0,76 (Cignarelli et al., 1983) do 0,95 (Prisco et al., 1991). Samo u dve studije (Prisco et al., 1991; Zailaie et al., 2003) sadraj holesterola i fosfolipida u eritrocitima je izuzetno nizak (oko 2,0 mmol Ch/L RBC i oko 2,2 mmol PL/L RBC) i znatno odstupa od vrednosti na enih u svim ostalim studijama (Tabela 2.6). Me utim, vano je istai da samo vrednosti iz ovih studija (priblino) odgovaraju literaturnim vrednostima za sadraj holesterola koji se navodi da se nalazi u izolovanoj membrani humanih eritrocita: 2,22,5 mmol Ch/L RBC (na primer Dodge et al., 1963).

32

Tabela 2.6 Literaturne vrednosti za sadraj holesterola i ukupnih fosfolipida u eritrocitima oveka. Holesterol (mmol/L RBC) 3,54 0,10 3,08 0,22 3,71 0,19 4,21 0,22 3,42 4,53 4,24 0,13 3,60 0,48 3,30 0,23 3,00 0,20 1,97 0,24 3,00 0,29 2,13 0,07 Ukupni fosfolipidi (mmol/L RBC) 4,42 0,21 3,77 0,25 4,54 0,34 4,86 0,14 4,58 5,19 4,81 0,19 4,00 0,45 3,86 0,25 4,00 0,30 2,17 0,13 3,48 0,26 2,19 0,11 Referenca: Reed et al., 1960 Farquhar & Ahrens, 1963 Ways et al., 1963 Cooper, 1969 Bagdade & Ways, 1970 Cooper & Gulbrandsen, 1971 Gottfried & Robertson, 1974 Owen & McInture, 1978 Cignarelli et al., 1983 Prisco et al., 1991 Lijnen & Petrov, 1995 Zailaie et al., 2003

2.7 Holesterol-vezujui proteini

U humanim tkivima je na en vei broj proteina koji specifino vezuju holesterol. To su na primer: apo A1, StAR familija steroidogenih regulatornih proteina (engl. Steroidogenic Acute Regulatory Proteins), periferni tip benzodiazepinskog receptora (PBR), NPC2 (engl. Protein Deficient in Niemann-Pick type C2 disease), citohrom P450c26/25, sterol transportni protein-2, holesterol 7-mono-oksigenaza, holesterol oksidaza, holesterol esteraza i ACAT (Epand, 2006). Vezivanje holesterola za navedene proteine ima esencijalnu ulogu u odranju homeostaze holesterola u eliji, kroz regulaciju procesa biosinteze, transporta i raspodele holesterola unutar elije, a utie i na uvijanje i stabilnost sterol-vezujuih proteina i/ili njihovu lokalizaciju u eliji (Epand, 2006). Strukturni motivi za vezivanje holesterola u sterol-vezujuim proteinima obuhvataju: (1) tunel ili upljinu u koju se vezuje holesterol, (2) evolutivno konzervirani START domen, (3) "sterol-sensing domen" (SSD), (4) holesterol prepoznajuu aminokiselinsku konsenzus sekvencu (CRAC, engl. Cholesterol Recognition Amino acid Consensus) i (5) holesterol konsenzus motiv (CCM, engl. Cholesterol Consensus Motif). Me utim, treba naglasiti da vei broj proteina koji specifino interaguju sa holesterolom ne sadre ni jedan od gore navedenih motiva (Gimpl, 2010). Tunel ili upljina u koju se vezuje holesterol predstavlja hidrofobni "dep" koji je esto pokriven "poklopcem" i ispunjen mreom molekula vode (Natarajan et al., 2004). Na eni su kod apolipoproteina A1 (Natarajan et al., 2004), enzima i drugih proteina, na primer NPC2 (Xu et al., 2007). Ovi proteini mogu da veu jedan molekul holesterola sa (relativno) visokim afinitetom. START proteini predstavljaju superfamiliju proteina koji vezuju hidrofobne ligande i sadre ligand-vezujui domen od oko 210 aminokiselina. Proteini sa START domenom

33

na eni su u citosolu, privreni za membranu, ili u jedru elija sisara. Kod oveka, START domeni su na eni kod 15 proteina (StARD1-StARD15), podeljenih u 6 familija (Alpy & Tomasetto, 2005). Pet od njih specifino vezuju holesterol: StAR, MLN-64 (StARD3), StARD4, StARD5 i StARD6 (Lavigne et al., 2010). SSD se nalazi kod transmembranskih proteina kao to su SCAP, HMG-CoA reduktaza, ili NPC1 i sastoji se od pet transmembranskih heliksa, samo delimino konzervirane strukture (Kuwabara & Labouesse, 2002). Njegova uobiajena, iako ne i univerzalna strukturna karakteristika je prisustvo sekvence YIYF u C-terminalnom delu poslednjeg transmembranskog segmenta. U nekim proteinima YIYF je deo CRAC domena (Epand, 2006). CRAC motiv je prvi put identifikovan kao holesterol vezujui motiv u C-terminalnom delu poslednjeg trans-membranskog heliksa PBR (Li et al., 2001). Konsenzus sekvencu obrazuje: (a) ostatak neutralne i nepolarne aminokiseline, leucina ili valina; (b) ostatak neutralne i polarne aminokiseline, tirozina i (c) bazni aminokiselinski ostatak arginina ili lizina. Jedan do pet razliitih (bilo kojih) aminokiselinskih ostataka umetnut je izme u ova tri aminokiselinska ostatka za koje se smatra da interaguju sa holesterolom: ~L/V(X)1-5Y(X)1-5R/K~ (Li & Papadopoulos, 1998). U tabeli 2.7 navedeni su primeri CRAC sekvenci u holesterol vezujuim proteinima. Holesterol konsenzus motiv je opisan u kristalnoj strukturi 2-adrenerginog receptora (Hanson et al., 2008) i u jo oko 40 membranskih receptora kuplovanih sa Gproteinima, na primer kod receptora koji vzuju oksitocin i serotonin (Gimpl, 2010). Dva molekula holesterola su na ena u vezivnom mestu receptora koje obrazuju segmenti transmembranskih heliksa 1-4. Prema Ballesteros-Weinstein-ovoj nomenklaturi za obeleavanje aminokiselina u transmembranskim heliksima definisan je sledei CCM: [4,394,43(R,K)][4,50(W,Y)][4,46(I,V,L)][2,41(F,Y)] (Gimpl, 2010). Tabela 2.7 Primeri CRAC sekvenci u holesterol vezujuim proteinima (Li & Papadopoulos, 1998; Epand, 2006). Protein PBR oveka P450scc oveka Apo A1 mia Kaveolin oveka Hh oveka StAR mia Holesterol oksidaza strept. Aneksin II pacova Lipaza aktivirana solima unih kiselina oveka Holesterol 7-monooksigenaza mia P450c26/25 pacova ACAT zeca CRAC motiv* 147-ATTLNYCVWRDN 86-PWVAYHQYYQRPIG 207-NPTLNEYHTRAK 91-TFTVTKYWFYRLL 247-GAKKVFYVIETREP 5-KLCAGSSYRHMRNG 417-ETWVSLYLAITKNP 144-RVYKEMYKTDLEKD 222-SLQTLSPYNKGLIRRI 166-WVTEGMYAFCYRVM 422-QFVLCTYVVSRDP 93-STLVVDYIDEGRLV

* Boldom su obeleena tri aminokiselinska ostatka esencijalna za vezivanje holesterola. 34

Najvei broj proteina koji specifino vezuju holesterol su nerastvorni u vodi, ili ne kristaliu sa holesterolom kao svojim prirodnim ligandom, to oteava odre ivanje njihove 3D strukture i prirode interakcija sa holesterolom. Do sada je odre ena kristalna struktura tri proteina sa START domenom koji specifino vezuju holesterol (StARD3-5). Zajedniko za ove proteine je prisustvo konzervirane / "heliks-grip" strukture, kao i prisustvo unutranje upljine dovoljno velike da prihvati hidrofobni ligand (Lavigne et al., 2010). U StARD3 proteinu (Slika 2.14), centralna antiparalelna -nabrana ploica je okruena N-terminalnim i C-terminalnim -heliksima (1 i 4), a potonji heliks je spakovan iznad izvijene -nabrane ploice od devet segmenata (Iyer et al, 2001). Dve omega petlje su umetnute izme u segmenata 5 i 6 ( 1) i segmenata 7 i 8 ( 2). Trodimenzionalna organizacija domena gradi unutranji tunel. Izvijena -nabrana ploica, tri -heliksa (2, 3, 4) i jedna petlja ( 1) grade zid hidrofobnog tunela koji je dovoljnih dimenzija da prihvati jedan molekul holesterola (Slika 2.14). Smatra se da konformaciono fleksibilni heliks u C-terminalnom delu StARD3 kontrolie pristup i vezivanje molekula holesterola (Alpy & Tomasetto, 2005).

Slika 2.14 Model strukture START domena u StARD3 proteinu (levo) na kojoj se vidi karakteristino / "heliks-grip" uvijanje polipeptidnog niza (iz Alpy & Tomasetto, 2005). Molekul holesterola vezan u upljinu unutar domena (desno) (iz Lavigne et al., 2010). Vezivanja holesterola za StARD3 i StAR proteine prikazano je detaljnije na slici 2.15. Smatra se da je za vezivanje holesterola kljuno prisustvo konzerviranog sonog mosta izme u kiselog aminokiselinskog ostatka u -segmentu 5 i ostatka Arg u -segmentu 6, pri dnu vezivnog mesta, kao i da hidroksilna grupa holesterola specifino interaguje sa guanidino grupom konzerviranog ostatka Arg, pri emu oblik upljine gotovo idealno odgovara 3-D strukturi molekula holesterola (Lavigne et al., 2010). Naveemo i primer humanog NPC2 proteina koji vezuje dihidroergosterol, fluorescentni analog holesterola, sa mikromolarnim afinitetom i stehiometrijom 1:1 (mol/mol), na neutralnom i kiselom pH (Ko et al., 2003). Za razliku od drugih sterolvezujuih proteina, iz kristalne strukture NPC2 proizilazi da protein ne sadri (preoformljenu) dovoljno veliku upljinu, tunel, ili povrinski dep u koji bi mogao da se smesti

35

holesterol (Friedland et al., 2003). Studije mutageneze ubedljivo pokazuju da se holesterol (ipak) vezuje u hidrofobnu unutranjost proteina, za ta su izgleda esencijalni kontakti holesterola sa ostatkom Val i jo dva aromatina aminokiselinska ostatka: Phe i Tyr (Slika 2.16). Humani NPC2 od sekundarnih struktura sadri samo -ploice (Friedland et al., 2003). Proteini ovakve sekundarne strukture najee imaju imunoglobulinima-slian tip uvijanja, sa "labavo" spakovanim hidrofobnim jezgrom, ija hidrofobna upljina mora da se proiri da bi primila molekul holesterola. Stoga se smatra da je konformaciona promena u molekulu NPC2 preduslov da bi molekul holesterola uopte mogao da se vee (Friedland et al., 2003).

Slika 2.15 Vezivno mesto za holesterol u StAR proteinu (iz Mathieu et al., 2002). Obratiti panju na konzervirani soni most izme u ostatka Glu i Arg, kao i na vodoninu vezu izme u hidroksilne grupe holesterola i guanidino grupe Arg (Murcia et al., 2006).

Slika 2.16 Predloena struktura vezivnog mesta za holesterol u NPC2 proteinu: crvenom bojom su obeleeni boni ostaci (Phe66, Val96 i Tyr100) za koje je pokazano da su esencijalni za vezivanje holesterola (Ko et al., 2003).

36

2.8 Interakcije hemoglobina sa malim molekulima

Dobro je poznato da reaktivni molekuli koji su due vremena prisutni u cirkulaciji i mogu da pro u kroz membranu eritrocita mogu da reaguju sa odre enim bonim aminokiselinskim ostacima u molekulu hemoglobina (Harding, 1985). Od ovih primera najpoznatiji je glikozilovani hemoglobin kod kojeg se molekul glukoze vezuje za Nterminalnu amino grupu u -nizu molekula hemoglobina (Bunn et al., 1979). Ove modifikacije mogu da izazovu strukturne promene u molekulu hemoglobina i da izazovu promene u njegovoj aktivnosti (Harding, 1985). Pored kovalentnog vezivanja, mali molekuli mogu i da interaguju sa molekulom hemoglobina, to tako e moe da utie na strukturna i funkcionalna svojstva hemoglobina. Tako je na primer pokazano da jedinjenja hidroksilamina i supstituisani derivati fenola izazivaju oksidaciju oksihemoglobina do methemoglobina, to je praeno oksidativnim stresom u eritrocitima i njihovom poveanom hemolizom (Nohl & Stolze, 1998). Pomenuemo i nedavno objavljene radove u kojima je pokazano primenom spektroskopskih metoda da neki antipsihotici interaguju sa molekulom hemoglobina, to dovodi do konformacionih promena u molekulu hemoglobina (Chakraborti 2003; Kar et al., 2006; Maitra, 2007). Detaljna strukturna ispitivanja vezivanja odre enih supstanci razliite hemijske strukture, od kojih su neke i lekovi, za molekul hemoglobina primenom rengenske strukturne analize opisana su samo u jednom radu (Perutz et al., 1986). Prikazaemo ukratko najvanije rezultate ove izvanredne studije. U ovom radu je odre ena detaljna kristalna struktura kompleksa ispitivanih supstanci (Slika 2.17) sa dezoksihemoglobinom. Za ova ispitivanja izabran je antihiper-lipoproteinski lek, bezafibrat (I), diuretik, etakrinska kiselina (II), peptid, sukcinil-L-triptofan-L-triptofan (III) i p-bromobenziloksi siretna kiselina (IV). Na slici 2.18 obeleili smo mesta vezivanja ovih supstanci na dobro poznatom modelu molekula dezoksihemoglobina.

I - Bezafibrat (BZF)

II - Etakrinska kiselina (ECA)

III - Sukcinil-L-triptofan-L-triptofan (STT)

IV - p-bromobenziloksi siretna kiselina (BBA)

Slika 2.17 Strukture ispitivanih jedinjenja (IIV) (iz Perutz et al., 1986).

37

Slika 2.18 Mesta vezivanja supstanci IIV sa slike 2.18 na molekulu dezoksihemoglobina (na osnovu Perutz et al., 1986). BZF (I) se vezuje van der Waals-ovim interakcijama za najmanje devet aminokiselinskih ostataka iz centralne upljine molekula hemoglobina, gradei kontakte sa jednom - i dve -subjedinice. Interakcije su uglavnom nepolarne prirode, bez formiranja (jaih) vodoninih veza koje bi vre vezivale molekul leka za molekul hemoglobina. Analizom kristalne strukture pokazano je da ECA (II) reaguje sa oba ostatka Cys u poloaju -93, kao i sa oba ostatka His u poloaju -117, to je praeno nizom polarnih i nepolarnih interakcija izme u molekula ECA i hemoglobina. Tako, kod molekula ECA koji je kovalentno vezan za His na eno je da karboksilna grupa gradi soni most sa -amino grupom ostatka lizina u poloaju -14 susednog polipeptidnog niza, dok karbonilni kiseonik gradi vodoninu vezu sa NH- grupom iz Asn -19, na rastojanju od 2,8 . STT (III) se vezuje za centralnu upljinu molekula hemoglobina izme u dve subjedinice, uglavnom vodoninim vezama sa polarnim grupama globina, dok van der Waals-ove interakcije povezuju indolova jezgra u strukturi leka sa susednim ostacima aminokiselina. Vezivno mesto za BBA (IV) nalazi se u unutranjosti lanca molekula dezoksihemoglobina, unutar upljine koju obrazuju nehelikoidni CD segment i B heliks. Karboksilna grupa leka obrazuje soni most sa ostatkom Lys na poziciji -40, koji izgleda da usmerava lek u svoje mesto vezivanja. Autori na kraju rada zakljuuju da ispitivani molekuli "trae" udubljenja u proteinskom delu molekula hemoglobina, te da je stereohemija vezivanja odre ena van der Waals-ovim prostorom i maksimalnim elektrostatikim interakcijama, kao i hidrofobnim efektom. Istaknut je i znaaj vodoninog vezivanja (Perutz et al., 1986). Interesantno je da su mesta vezivanja ispitivanih supstanci za molekul hemoglobina krajnje razliita i da se ne

38

podudaraju niti sa aktivnim mestom na hemu, niti sa mestom vezivanja 2,3-difosfoglicerata, prirodnog alosternog modulatora hemoglobina. Paralelno sa ispitivanjem strukture u nezavisnim eksperimentima je ispitivan i efekat navedenih supstanci na afinitet hemoglobina za kiseonik. Utvr eno je da ECA poveava, dok BZF i STT smanjuju afinitet hemoglobina za kiseonik. STT moe da se vee jedino za T (dezoksi) oblik hemoglobina, poto se prelaskom molekula u R (oksi) oblik centralna upljina smanjuje i molekul STT-a ne moe vie u nju da se smesti (Perutz et al., 1986). Na kraju ovog kratkog pregleda emo spomenuti i rezultate elektroforetske i NMR studije vezivanja antiepileptika fenobarbitala (PB) i oksihemoglobina iz nae laboratorije (Niketi et al., 1994). Elektroforetska ispitivanja su pokazala da se pKa vrednost hemoglobina u prisustvu PB-a smanjuje sa 7,0 na 6,8. Ovo je u skladu sa rezultatima NMR ispitivanja koja su pokazala da se PB vezuje u blizini C-terminala oksihemoglobina gradei vodonine veze sa ostacima His -2 i terminalnom -NH2 grupom. Ovo dovodi do smanjenja pKa vrednosti -NH2 grupe i objanjava zapaeno poveano ne-enzimsko glikozilovanje hemoglobina u prisustvu PB in vivo i in vitro (Niketi et al., 1994) .

2.9 Specifinosti sistema antioksidativne zatite u eritrocitima oveka

Zbog svojih strukturnih i funkcionalnih karakteristika, pre svega visokog sadraja kiseonika, polinezasienih masnih kiselina u sastavu membranskih lipida, kao i Fe2+ jona u strukturi hemoglobina, humani eritrociti su izloeni oksidativnom stresu (Clemens & Waller, 1987; Cimen, 2008). Eritrociti su zato razvili potentan antioksidativni zatitni sistem koji ini skup enzima i jedinjenja male molekulske mase, sa ciljem da spree lanane reakcije oksidacije i oteenja makromolekula, inicirane reaktivnim vrstama nastalih od molekulskog kiseonika (Halliwell & Gutteridge, 2007). Glavni izvor reaktivnih vrsta kiseonika u eritrocima je auto-oksidacija oksihemoglobina (Hb) do met-hemoglobina (MetHb), uz osloba anje superoksid anjon radikala (Rifkind et al., 2003; Winterbourn, 1983). Superoksid anjon radikal se dismutuje aktivnou CuZn superoksid dismutaze (SOD1; EC 1.15.1.1), pri emu se nastali vodonik peroksid razlae dejstvom katalaze (CAT; EC 1.11.1.6), ili redukuje pomou Se-zavisne glutation peroksidaze (GSH-Px; EC 1.11.1.9) do vode, mehanizmom zavisnim od redukovanog glutationa (GSH). Ovi enzimi, zajedno sa glutation reduktazom (GSH-R; EC 1.6.4.2), odravaju visoku koncentraciju redukovanog glutationa u eritrocitima (Cimen, 2008). Sadraj dijetarnih antioksidanasa u eritrocitima oveka veoma je visok (Gabbianelli et al., 1998). Glutation i tokoferoli mogu da spree oksidaciju gvo a u hemu i sulfhidrilnih grupa u molekulu hemoglobina i u plazminoj membrani eritrocita (Richards et al., 1998). Posedujui i sam antioksidativnu aktivnost i hemoglobin doprinosi zatiti od oksidativnih oteenja eritrocita (Gabbianelli et al., 1998). Plazmina membrana dodatno titi hemoglobin unutar eritrocita od izvora oksidativnog stresa izvan elija (Lenfant et al., 2005). Dvostruke veze u acil-lancima fosfolipida i sfingolipida u plazminoj membrani podlone su oksidativnim modifikacijama. Iako u

39

eritrocitima nema de novo sinteze lipida, elije poseduju efikasan sistem za popravku, deacilacijom oksidovanih ostataka masnih kiselina, uz brzu i selektivnu reacilaciju lizofosfolipida, molekulom masne kiseline iz plazme. Na ovaj nain, sastav masnih kiselina u plazminoj membrani eritrocita ostaje relativno slian tokom ivotnog veka elije. Supstratni pul masnih kiselina odre en je unosom masnih kiselina ishranom (Kuypers, 2007). Iako mehanizam nije u potpunosti razjanjen, smatra se da acil-CoA vezujui enzimi iz citosola eritrocita reguliu aktivnost enzima ukljuenih u proces reparacije oksidativno modifikovanih lipida (Fyrst et al., 1995). S obzirom da eritrociti ne mogu da zamene proteine ireverzibilno osteene dejstvom reaktivnih vrsta oksidativni stres uzima svoj danak u relativno kratkom ivotnom veku eritrocita u cirkulaciji (Cimen, 2008). Zbog svoje izuzetne reaktivnosti i nestabilnosti direktno odre ivanje koncentracije slobodno-radikalskih vrsta u elijama i tkivima nije mogue. Indirektno, stepen oksidativnog stresa moe da se proceni na osnovu uvida u stanje antioksidativne odbrane organizma, odre ivanjem neke od njegovih komponenti u krvi (Cimen, 2008). Merenje aktivnosti enzima antioksidativne odbrane u eritrocitima (CuZn SOD, CAT, GSH-Px i GSH-R), uz odre ivanje koncentracije GSH i vitamina C i E u krvnoj plazmi, prua relativno pouzdane podatke o statusu antioksidativne zatite u organizmu oveka (Lenfant et al., 2005). Pri tome treba imati u vidu da se aktivnost CuZn SOD znaajno smanjuje sa godinama ivota, a da je aktivnost GSH-Px pod uticajem tetnih ivotnih navika i faktora spoljanje sredine (Andersen, 1997).

40