UNIVERZITET U TUZLI FARMACEUTSKI FAKULTET

Aldin M.

KULTURA BILJAKA I ELIJA

Seminarski rad iz ,,Botanike

TUZLA, 2012.

SADRAJ:
UVOD...3 Serilizacija biljnog materijala...4 Faze mikropropagancije.......5 Organogeneza...8 Indirektna i direknta organogeneza......8 Kultura kalusa...8 Embriokultura...9 Mehanizam embriokulture9 Kultura meristema10 ZAKLJUAK.12 LITERATURA:..13

UVOD: U ranom periodu tehnike culture elija uglavnom se radilo na iznalaenju naina prevazilaenja problema kontaminacije elijskih kultura (razvoj antibiotika). U novije vrijeme glavno obiljeje razvoja ovetehnike culture elija je njena komercijalizacija. Tehnikom kulture elija se kultiviraju pojedinane elije ije su veze sa okolnim elijama pokidane. Kultiviranje tkiva oznaava se pojmom kultura tkiva. Tehnika kultiviranja cijelih organa s ciljem praenja njihove kontinuirane funkcije ili razvoja zove sekultura organa. Prema vrsti upotrijebljenog materijala, odnosno segmenta biljnog tkiva za regeneraciju, danas je prihvaena podjela kulture biljnih tkiva na pet grupa: kultura elija kultura kalusa kultura meristema kultura organa kultura protoplasta

Slika 1. Tipovi eksplantata koji se koriste za pokretanje in vitro kultura .

Svi ovi tipovi kulture biljnih tkiva izvode se na relativno maloj povrini, gdje se uslovi sredine optimiziraju u odnosu na fizike, hranidbene i hormonalne inioce i gdje se iskljuuju svi mikroorganizmi (gljivice, bakterije, vi rusi) kao i druge tetoine (insekti i nematode).

Sterilizacija biljnog materijala

Kada se izabere poetni biljni materijal pristupa se pripremi za dalji rad. Najprije treba izvriti sterilizaciju i izolaciju, a potom inokulaciju i subkulturu tj. dalje razmnoavanje. Za uspjean rad veoma je bitno da biljni materijal prije njegove izolacije in vitro bude dobro sterilisan. Prije poetka sterilizacije svaki ostatak pre ostalog zemljita ili mrtvih djelova biljke treba ukloniti. Ako je spoljanja kontaminacija vrlo uoljiva i velika najbolje je da se djelovi biljaka speru u vodi. U odreenim sluajevima moe se vriti i ljutenje ili guljenje pojedinih djelova biljke, tonije dobro jer ono dovodi do gubitka najveeg dijela spoljanjih slojeva kao npr. pokoice i dr. Nakon toga vri se sterilizacija na sledei nain. Biljni organ se prvo potapa u 70% alkohol u toku nekoliko sekundi da se odstrane mjehurii vazduha ime se osigurava da steriliua tenost ima vei pristup biljnom materijalu. Potapanje se ne vri u 96% alkoholu jer je on suvie jak i izaziva izuzetno veliku dehidrataciju. Sterilizacija se nastavlja 10-30 u 1% natrijum hipohloritu (NaClO) kome se dodaje nekoliko kapi Tween-a 20 ili 80. DodavanjemTween-a (vlaeeg agensa) smanjuje se povrinska tenzija, imese doputa jai povrinski kontakt. Posle ovoga vri se ispiranje u vodi sa esme obino tri puta utoku 2,5 odnosno 15. Ako su biljke osjetljive na bijeljenje onda se umjesto Na-hipohlorita moe koristiti Ca-hipohlorit, koji u biljna tkiva ulazi sporije. Jedna od mana Ca-hipohlorita je to to se moe uvatisamo ogranieno vrijeme jer je higroskopan.Izbor vremena sterilizacije i koncentracije bjelila zavisi prvenstveno od toga da li povrinskislojevi koji se steriliu treba da ostanu (blaga sterilizacija) ili treba da budu sasjeeni prijeinokulacije (jaka sterilizacija). Ponekad je mogue da se sterilizacija postigne samo pet minuta poslije tretiranja na Na-hipohloritom, a u drugim sluajevima potrebno je i 30. Dua sterilizacija moe imati tetne uticaje na eksplantat, pa pravilno odreivanje vremena ikoncentracije bijeljenja treba podesiti za svaki pojedinani materijal. Uprkos dobroj hemijskoj sterilizaciji poetnog biljnog materijala do infekcije moe doi i kasnije, a uzroci za to su:- tzv. unutranje infekcije. One mogu biti veoma ozbiljan problem, jer su prouzrokovane mikroorganizmima koji su u samoj biljci i ne mogu se eliminisati spoljnom sterilizacijom. U principu postoje dva naina za savladavanje ovog problema: kultura meristema (veina mikroorganizama ne naseljava meristem), ili dodavanje antibiotika hranljivoj podlozi. Poto je kultura meristema veoma sloena a dodavanje antibiotika podlogama u najveem broju sluajeva neefikasno (moe usporiti rast biljke i voditi selekciji otpornog mikroorganizma), najbolje je rjeenje da se koriste internosterilne biljke.-neprecizan rad (neoprane ruke, nesterilisana povrina stola, nesterilisane pincete ili skalpeli,nedovoljno sterilisane ae, papir ili hranljiva podloga itd.). Upotreba maski preko lica, pokrivanjekose i upotreba sterilnih rukavica mogu doprinijeti smanjenju broja infekcija.-neispravna laminarna komora. Treba da se kontrolie svake godine od strane proizvoaa, aeoni filtri da se povremeno obnavljaju.- zaprljan alkohol u koji se umau instrumenti pred opaljivanje, tako da ga treba obnavljati upravilnim intervalima.-nesterilni kontejneri po spoljnjoj povrini, u kojima se nalaze hranljive podloge. - prljavi podovi koji se ne peru redovno i ne vre dezinfekciju. Kada se ulazi u inokulacionu prostoriju preko cipela treba imati plastini pokriva ili stopala treba da se potope u steriliuu tenost. U inokilacionu prostoriju ne treba putati ni mnogo nepotrebnih posjetilaca. -

insekti (grinje) koje prenose naroito gljivine infekcije, a koji se javljaju ako se prostorija ukojoj se vri kultura tkiva ne odrava isto. Poto ovi prenosioci mogu lako proi proz pamune zatvarae i plastini film, ozbiljnost ovog naina infekcije ne smije se zanemariti. nesterilna prostorija u kojoj je laminarna komora. Ovo se moe izbjei uduvavanjemsterilnog vazduha i izraivanjem UV svjetlom u toku noi. -infekcije koje se esto dogaaju prilikom izolovanja vrhova biljnih izdanaka, jer se oni teko steriliu. Da bi se ovo izbjeglo izdanci se esto steriliu postupno tj. u vie faza. Izdanak senajprije opere, sperilie, ukloni nekoliko listova, ponovo sterilie itd. anse za infekciju vrhova izdanaka su manje ako se oni izoluju dok su mali.

Faze mikropropagacije.
Postoje etiri osnovne faze mikropropagacije: Faza I - uspostavljanje eksplantata u kulturi Faza II - umnoavanje Faza III - regeneracija korjena Faza IV aklimatizacija

Faza I. U ovoj fazi se prethodno sterilisani i obraeni pupoljci uvode u kulturu. Nakon sterilizacije i ispiranja moe se zapoeti izolacija tj. sjeenje biljnih komadia u sterilnim uslovima (laminarna komora) i uz upotrebu strilnih instrumenata. Eksplantati se paljivo prihvataju pincetom i prenose na hranljivu podlogu razlivenu u malim epruvetama. Smjetaj ovih primarnih eksplantata je pojedinaan, odnosno u jednu epruveticu se stavlja jedan pupoljak. U ovoj fazi eksplantati se mogu razvijati bilo u pojedinane izdanke ili u masu umnoenihizdanaka, pa ak i u oiljene biljke. Prva dva sluaja se koriste u mikropropagaciji dok se u tree msluaju, regeneraciji u jednom koraku, obino daje prednost pri stvaranju bez virusnih biljaka putem kulture meristema.Rastenje apikalnog meristema odnosno rastenje i grananje izdanaka uslovljeno je odgovarajuim odnosom auksina i citokinina u hranljivoj podlozi. Koncentracije regulatora rasta zavise od biljne vrste koja se gaji, od faze u kojoj se biljke nalaze i drugih inilaca. Kod masline se odsjee vrni dio granice duine oko 20 cm. Odstrane se listovi sa dijelom peteljke. Eksplantati su djelovi vrnih granica duine 1,5 2 cm sa vrnim ili bonim pupoljcima koji se prije postavljanja na hranljivu podlogu steriliu 70% etanolom ili Na hipohloritu. Eksplantati tkiva se ne smiju direktno dotai rukom ve pincetom ili drugim priborom koji je prethodno sterilisan potapanjem u 96% alkohol, a potom opaljivanjem tj. provlaenjem kroz plamen. Eksplantati u principu mogu biti isijecani na dva naina: na staklenoj ploi (podlozi) sterilsanoj sa 96% alkoholom (ovdje se kao problem javlja brzo tupljenje noeva), ili izmeu sterilnog filter papira (noevi ostaju due otri). Veoma je lako raditi sa dva tabaka filter papira: jedan se koristi u isijecanju eksplantata (redovno se zamjenjuje), a jedan za postavljanje sterilnih instrumenata (na njemu ili izmeu). Kada se eksplantat postavi pomou sterilnih pinceta na filter papir ili staklenu plou pristupase sijeenju. Ako su povrine sijeenja bile u dodiru sa bjelilom, ovi djelovi se uklanjaju pomou sterilisanog skalpela. Sterilisana sjemena (ako ne treba izolovati klicu) mogu se direktno inokulisati bez ikakvog dodatnog tretmana.

Faza II Umnoavanje. Glavni cilj ove faze je da se proizvede maksimalan broj jedinica za umnoavanje. Kada se apikalni meristem organizuje u lisnu rozetu ili izdueni izdanak subkultivira se na hranljivu podlogu za umnoavanje. Iz aksilarnih pupoljaka lisne rozete formiraju se novi izdanci. Od formiranog izduenog izdanka izoluju se nodalni segmenti i gaje na podlozi za umnoavanje. Stopa umnoavanja u ovoj fazi je razliita za razliite biljne vrste i sa svakom narednom subkulturom broj aksilarnih izdanaka se poveava logaritamski. Tako se u toku godine broj izdanaka moe poveati do milionskih cifara. U fazi umnoavanja citokinin se koristi da bi se savladala apikalna dominacija izdanaka i da bi se povealo grananje lateralnih pupoljaka iz lisnih pazuha. Tokom 4-8-12 nedjelja prati se rastenje kulture u epruvetama i vri umnoavanje. U fazi umnoavanja, materijal dobijen postavljanjem kulture se presauje na svjeu hranljivu podloguonoliko puta koliko je potrebno da bi se dobio eljeni broj izdanaka. Faza III- Regeneracija korjena. Cilj ove faze je da novo regeneracija adventivnih korenova iz izdanaka dobijenih u fazi II ili u nekim sluajevima u fazi I i formiranje kompletnih biljaka. Obino in vitro dobijeni izdanci od 10mm ili dui se sijeku i koriste za oiljavanje. Za oiljavanje izdanaka ne mora uvijek da se primjenjuje in vitro metoda. Umjesto rastvora auksina koji se koriste in vitro mogu se koristiti i komercijalno pripremljeni hormoni za oiljavanje potapanjem ili uranjanjem osnove izdanka prije sadnje. Postoje tri faze ukljuene u rizogenezu: a) indukcija, b) inicijacija i c) elongacija korjena. S obzirom da je teko izdvojiti fazu indukcije u mnogim eksperimentima ova faza se ukljuuje u fazu inicijacije. Odavno je poznato da je novo inicijacija korjena zavisi od odnosa visoke koncentracije auksina i niske koncentracije citokinina. Poto u izdancima iz faze II ima dosta rezidualnih citokinina potrebno je malo ili uopto nije potrebno dodati citokinin u medijum faze III. Negdje je dovoljno redukovati samo citokinine ili pak sve hormone, a negdje je ta redukcija radikalnija i ide do smanjenja i mikro i makroelemenata. Nasuprot citokininima, auksini su esencijalni za inicijaciju korena. Najee se koriste auksini kao to su NAA, 1BA, IAA i 2,4-D. Kod mnogih vrsta auksin nije potrebno dodavati u medijum faze III, jer su mladi izdanci bogati auksinom.Kada je koncentracija auksina suvie visoka, u bazalnom dijelu izdanka formira se kalus koji inhibira normalan razvoj korena. Visoka koncentracija auksina inhibira elongaciju korena. Da bi se ovo izbjeglo, izdanci se prvo gaje na podlozi sa auksinom 4-8 dana da bi se inicirao korjen a zatim subkultiviu na podlogu bez auksina da bi on porastao. U literaturi postoje razliita miljenja u vezi uticaja giberelina na oiljavanje i njihove upotrebe u ovoj fazi, ali se moe rei da se oni veoma rijetko koriste za oiljavanje izdanaka. Oiljavanje traje u prosjeku 4 nedjelje s tim to se inicijale korjenova zapaaju 4-14 dana nakon postavljanja na podlogu za oiljavanje. Brzina rasta i eventualno grananje korjenova su varijabilni i zavise od same biljne vrste kao i od metodike i uslova oiljavanja. Faza IV Aklimatizacija. Nakon oiljavanja, in vitro regenerisane biljke se prenose iz aseptinih kontejnera u saksijeradi aklimatizacije. Prije same sadnje u staklari korjenov sistem se vodom ispira od zaostalih estica agara, a cijela biljka se potapa u rastvor nekog fungicida na bazi kaptana.Faktori koji utiu na presaivanje su infekcija i desikacija. Ozbiljni problemi infekcije

mogu se eliminisati sterilizacijom zemljine mjeavine, a da bi se novo presaene biljke adaptirale naspoljne uslove potreban je period humidne aklimatizacije, zato to je odmah nakon presaivanja ustanovljen pretjerano visok gubitak vode iz listova biljaka. Visok nivo gubitka vode pripisuje se redukovanoj koliini epikutikulamog voska, visokom volumenu intercelularnih prostora u mezofilu i usporenoj reakciji stoma na vodni stres. Tokom aklimatizacije, vlanost se postepeno redukuje u periodu od 2-3 nedjelje. U meuvremenu, biljke podlijeu morfolokim i fiziolokim adaptacijama koje im omoguuju darazviju normalan vodni reim. Adaptacija razvijenih biljaka. Biljke koje se obrazuju u in vitro uslovima razlikuju se u mnogim aspektima od biljaka nastalih u in vivo uslovima. Zato posebnu panju na kraju treba posvetiti njihovoj adaptaciji tj. prenoenju sa hranljive podloge u zemljite. Kod biljaka gajenih u in vitro uslovima kutikula (votani sloj) je esto slabo razvijena, jer jerelativna vlanost u kontejnerima 90 -100%. Ovo vodi izuzetno velikim gubicima vode preko kutikularnog isparavanja, kada se biljka presauje u polje, poto je vlanost vazduha u in vivo uslovima mnogo nia. Listovi jedne in vitro biljke esto tanki, mekani i ograniene fotosintetske aktivnosti nisu dobro prilagoeni za in vivo klimat. Biljke iz in vitro kulture imaju manje i sitnije palisadne elije za efikasno korienje svjetlosti. One posjeduju i vei vazduni prostor u mezofilu. Kod biljaka iz in vitro uslova ne funkcioniu dobro ni stome. Otvorene stome kod ovih biljaka prouzrokuju najjai vodeni stres u prvih nekoliko asova aklimatizacije. Kod ovih biljaka oskudne vaskularne veze izmeu izdanaka i korjena mogu umanjiti provoenje vode. Takoe, mora se imati na umu da je biljka iz in vitro uslova nastala kao heterotrof, dok u in vivo uslovima ona mora bitiautotrofna. Aklimatizacija se moe izvriti doputanjem biljkama in vitro da se postupno prilagoavaju nioj relativnoj vlanosti, kao u sluaju gajenja in vivo. Razvie mehanizma za zatvaranje stoma je takoe vana komponenta aklimatizacije. Dokazano je da smanjenje relativne vlanosti in vitro vodi boljem obrazovanju voska na kutikularnom sloju, to sve doprinosi smanjenju kutikularnog isparavanja. Direktna aklimatizacija poslije in vitro faze moe se postii odravanjem relativnovisoke vlanosti in vivo, kao i odravanjem niske osvijetljenosti i temperature. Drugi metod aklimatizacije je da se otvoreni kontejner (epruveta, boca isl.) ostavi u sterilnoj sredini na nekoliko dana, radi prilagoavanja uslovima in vivo. Takoe, mogue je da se prskanjem biljaka sa anti-transpirantima smanji isparavanje in vivo, mada ovo esto moe imati i negativnih posledica. Slino listovima korjenovi koji su obrazovani u in vitro uslovima izgledaju ranjivi i ne funkcioniu dobro u in vivo. Naime, oni imaju mali ili ni malo dlaica, brzo odumiru i moraju se zamijeniti novoobrazovanim podzemnim korjenovima. Razvoj korjenovih dlaica in vitro moe se ponekad stimulisati doputanjem razvoja korjena u tenim podlogama. Slabo razvijen korjenov sistem veoma mnogo oteava rast takvih biljaka in vivo, posebno tamo gdje je veliko isparavanje. Ovdje je bitno da biljka in vitro izgubi to manje vode u in vivo uslovima. Tokom aklimatizacije, vlanost se postepeno redukuje u periodu od 2-3 nedjelje. U meuvremenu, biljke podlijeu morfolokim i fiziolokim adaptacijama koje im omoguuju da razviju normalan vodni reim. Sposobnost aklimatizacije biljaka moe se utvrditi njihovim direktnim izlaganjem uslovima niske relativne vlanosti vazduha. Kada se biljke dobro aklimatizuju na uslove staklare, iznose se u spoljne uslove gdje se dalje gaje radi prouavanja njihove sposobnosti rastenja na sopstvenom korjenu, produktivnosti i kvaliteta plodova. Postoje i novija dostignua u oblasti kulture biljnih tkiva koja se odnose na presaivanjebiljaka iz kontejnera u zemljite.

Organogeneza
Organogeneza u najosnovnijem obliku znaenja predstavlja proces obrazovanja jedinki. U in vitro uslovima kontrolisanje organogeneze se vri dodavanje odreenih komponenti, a najbitnije meu komponentama jesu FITOHORMONI. Skoog i Miller hipoteza (1957), Balans citokinina i auksina regulie organogenezu kalusa. Ova hipoteza govori o odnosu koncentracija auksina i citokinina u hranljivom medijumu i kako zapravo date koncentracije utiu na morfogenezu u uslovima in vitro. Dokazi Milerove hipoteze su: ako se kalusno tkivo prenese na hranljivu podlogu koja sadri veu koncentraciju auksina negocitokinina, pojavie se korjenovi. Ako je koncentracija citokinina vea od koncentracije auksina, pojavie se pupoljci.

Indirektna i direktna Organogeneza

Indirektna Organogeneza je proces u kome se pupoljci regeneriu iz elija kalusa. Eksplantat indukuje nediferenciranu masu kalusnog tkiva, u kojoj se javljaju meristemski centri, ili meristemoidi. Meristemoid se sastoji iz grupe elija i predstavlja inicijalni centar koji se lako uoava, jer se udaljavanjem od njega u elijama znaajno smanjuje mitotski indeks. Meristemoidi postaju ilicentri za proliferaciju kalusnog tkiva, ili se transformiu u nodule iz kojih e se javiti apikalni meristemi ili korenske primordije. Direktna Organogeneza (a-d) posle faze indukcije nema fazu proliferacije elije kalusa. Direktno na eksplantatu dolazi do regeneracije pupoljaka iz epidermalnih ili subepidermalnih elija.

Kultura kalusa
Kultura tkiva odnosno kultura kalusa je tehnika kojom se tkivo moe odravati u nediferenciranom stanju neogranieno dugo (Slika 2). Kalus je neorganizovana masa diferenciranih biljnih elija. On moe nastatii nakon povrede nekog biljnog organa kao to je stablo ili koren. Kultura kalusa se moe dobiti iz bilo kog vegetativnog tkiva diferencijacijom, tako da kalusna tkiva najee nisu fotosintetika. Kalusi se esto gaje u mraku jer svetlost moe podstai diferencijaciju. Kalusi se, generalno, mogu podeliti na dva tipa: kompaktne i rastresite. Najvei znaaj kalusa je u tome to ima sposobnost da se iz njega zane pupoljak, korijen ili embrion. Inicijacija i rast kalusa zavisi od biljne vrste (genotipa), vrste i koncentracije hormona i nekih organskih supstanci kao i od uslova kulture. Prilikom inokulacije podloge bitno je da inokulum ne bude isuvie mali, jer je tada i slab rast kalusa. Najbolja veliina inokuluma je 5-10 mm u preniku ili 20-100 mg (Street, 1969). Znatno je lake raditi subkulturu sa kompaktnim kalusom, jer se on lako see na manje dolove, dok se rastresit kalus raspada i mora se direktno prebaciti na novu podlogu.

Slika 2. Organogeneza iz kalusa.

Embriokultura
Embriokultura je postupak gajenja embriona ili njegovih pojedinih djelova na vjetakoj hranljivj podlozi pod aseptinim uslovima. Ova metoda se moe primijeniti u svim onim situacijama kada doe do oplodne ali embrion pone da degenerie tj. abortira u odreenom stadijumu razvitka prije pune zrelosti. Degeneracija embriona nastupa zbog nesposobnosti endosperma da odigra svoju normalnu ulogu u snabdijevanju embriona hranivima ili zbog antagonizma materinskog tkiva prema embrionu. Embrion obino abortira 5 do 35 dana nakon oplodnje, to najee zavisi od vrsta koje se meusobno ukrtaju. U principu postoje dvije vrste embriokulture: kultura nezrelih embriona porijeklom iznedozrelih sjemena i kultura zrelih embriona porijeklom iz zrelih sjemena. Kultura nezrelih embriona uglavnom se koristi da bi se izbjegla rana smrt klice (abortus), sa ciljem da se razvije normalna biljka. Ovaj tip kulture je izuzetno teak ne samo zbog zamorne disekcije klice ve i zato to je neophodna sloena hranljiva podloga. Kultura zrelih embriona je relativno laka i koristi se da bi se eliminisala apsolutna inhibicija klijanja sjemena. Za ovaj tip kulture u veini sluajeva dovoljno je korienje jednostavne hranljive podlogesa agarom, eerom i mineralima. Mehanizam embriokulture Kada se pripremi odgovarajua hranljiva podloga pristupa se njenom razlivanju u epruvete dovisine od 2-3 cm. Zatim se epruvete zatvore zapuaima i stave u autoklav radi sterilizacije u vremenu 20-35, a pod pritiskom 1,5-2,0 atm i temperature od 100 stepeni celzijusa. Poslije zavrene strilizacije epruvete sa hranljivom podlogom se vade iz autoklava i dre na sobnoj temperaturi do vremena njihove upotrebe, ali najbolje je odmah im se ohlade obaviti ubacivanje sjemena za naklijavanje embriona. Na hranljivu podlogu sem itave sjemenke mogu se nanositi sjemenka bez sjemenjae, sjemenka kojoj je odstranjen vrh i kotiledoni biljke.

Pri nanoenju itave sjemenke u epruvete, povrina sjemenke se mora prethodno sterilisati, a zatim isprati destilovanom vodom. Takoe, treba sterilisati pincete i otvor epruvete njihovim prevlaenjem preko plamena piritusne lampe. Poslije toga sjemenka se nanosi u epruvetu tako to joj se vrh zaroni nekoliko mm u hranljivu podlogu zbog geotropizma sjemena. Epruveta se nekoliko puta ponovo prevue preko plamena piritusne lampe i na kraju se zatvara spremljenim zatvaraem. Ovako pripremljene epruvete stavljaju se u friider na temperaturiod 25 stepeni do pojave korjenka. U tom periodu vri se proces jarovizacije. Kada se korjenak embriona pojavi kultura se moe sa hladnog prenijeti u klima komoru radi klijanja na temperaturi 22-25 stepeni sa reimom osvjetljenja od 16h svjetlosti (intenziteta 3000 luxa) i 8h mraka. U ovim uslovima kultura ostaje nekoliko nedjelja nakon ega se moe izvriti brojanje isklijalih embriona. Na osnovu razliitog stepena razvijenosti embriona pri klijanju dobijeni sejanci kod Prunus-amogu se svrstati u 6 klasa: Nulta klasa - embrion uginjava I klasa - nema rasta korjena i stabla, ali je embrion iv II klasa - korjen se razvija ali ne i stablo III klasa - razvijaju se i korjen i stablo, ali je stablo malo formisano IV klasa - razvijaju se i korjen i stablo, ali je stablo rozetasto V klasa - normalan razvitak korjena i stabla. Sijanci III, IV i V klase smatraju se isklijalim. Kada sejanci razviju 4-6 listova iznose se u uslove staklare gdje se presauju u supstrat kojise najee sastoji od pijeska, treseta i perlita u razliitim odnosima. Prije presaivanja sa korjena se moraju dobro sprati sve estice hranljivog medijuma jer njihovo prisustvo poveava rizik od gljivinih infekcija. Ustanovljeno je da najkritiniji momenat u kulturi embriona predstavlja upravo prebacivanje biljaka sa podloge i sterilnih uslova u zemljite tj. nesterilne uslove. U tom periodu propadne najvei broj biljaka. Osnovni uzrok propadanja je veliki gubitak vode koji je prouzrokovan smanjenom debljinom votane prevlake, visokom zapreminom intercelularnih prostora i usporenim reagovanjem stominog aparata na stresne uslove. Zato je neophodno mlade biljice drati izvjestan period u uslovima visokerelativne vlanosti vazduha (95-99%), to se postie stalnim oroavanjem mist sistemom. Poto takvi uslovi pogoduju razvitku gljivinih bolesti u ovom periodu neophodno je obezbijediti i dopunsko tretiranje fungicidima. Biljke pod mistom ostaju oko dvije nedjelje, a poslije toga se mogu iznijeti u spoljne uslove i dalje gajiti.

Kultura meristema
Eliminacija virusnih oboljenja kulturom meristema je jedna od mnogih interesantnih primjena kulture tkiva. U sutini postoje dva tipa meristemskog eksplantata: apikalni meristem izdanka, nediferencirano tkivo, locirano unutar apeksa izdanka, koji se pojavljuje kao sjajna pupolika struktura distalno u odnosu na najmlau lisnu primordiju, veliinemanje od 0,1 mm u duini, apeks izdanka - struktura koja se sastoji od apikalnog meristema izdanka i jedne do nekoliko lisnih primordija, obino veliine od 0,1-1 mm u duinu. U sluaju da je u apeks

10

ukljueno vie odraslih listova struktura moe iznositi i do nekoliko centimetara u duini. Ako se koristi eksplantat vei od 0,1 mm duine anse za rast i razvoj u kulturi in vitro su vee. Lokacija meristema. Kod biljaka su razlikuju meristemi koji se nalaze u vrnim i aksilarnim pupoljcima. Eksplantati uzeti sa vrha izdanka nalaze se u mlaem razvojnom stadijumu nego oni iz bazalnog dijela. Zaregeneraciju izdanka optimalan je mlai razvojni stadijum eksplantata. Terminalni pupoljci imaju jai potencijal rasta nego lateralni. Zato je, kod veine biljnih vrsta, bolje koristiti terminalne eksplantate. Ukoliko ima samo jedan terminalni pupoljak po izdanku, mogu se koristiti i aksilarni.

11

ZAKLJUAK: Metoda kulture biljnih stanica i tkiva podrazumijeva laboratorijski uzgoj stanica, tkiva, organa i kompletnih organizama na umjetnim hranidbenim podlogama i u aseptinim uvjetima. Ta je tehnika postala nezaobilazna u primjeni genetikog inenjerstva na biljkama te kao metoda alternativna kemijskim metodama u svrhu dobivanja biolokih vrijednih spojeva koji se koriste u npr. farmaciji i medicini. Metoda kulture biljnog tkiva danas je vrlo vana u brojnim istraivanjima biljnih organizama (fiziolokim, genetikim, molekularnim, biokemijskim) te ima vrlo rairenu primjenu u vegetatitvnom razmnoavanju brojnih agronomskih, hortilkulturnih i umskih vsta. Njenom primjenom mogue je dobivanje biljaka bez patogenih klica (posebno biljnih virusa), to je danas u monokulturnim staklenikim uvjetima uzgoja gdje se bolesti ire izuzetno brzo, jako bitno. Metoda se koristi i za ouvanje zdravih biljaka ("germplasm collections"). Namjena kulture odreuje sastav hranidbene podloge.Hranidbena podloga treba sadravati mikro- i makroelemente, eer kao izvor energije, vitamine, hormone rasta, nekada pojedine aminokiseline i esto agar kao inertni materijal za potporu tkiva eksplantata (dijelovi tkiva ili stanice). Eksplantati se mogu uzgajati u razliitim okolinim uvjetima (ritam svjetlotama, temperatura), no to nije uvijek vano s obzirom da se, u stvari, uzgajaju u zatvorenim sustavima (tikvica, epruveta i sl.). Upravo u toj izoliranosti od raznih klica iz atmosfere lei i glavni klju uspjenosti pojedine kulture. Naime, odravanje sterilnosti ili aseptinosti je neophodno u svim fazama (sav koriteni pribor, posude za kulturu, hranjiva podloga, biljni materijal). Tu je i najvea potencijalna potekoa pri uspostavi odreene kulture u kolskom laboratoriju. I dok se sterilizacija posua i hranjive podloge moe napraviti i u pretis loncu, a u novije vrijeme se radi i s mikrovalnim penicama, problem sterilizacije biljnog materijala je tee rijeiti. Naime ukoliko u kulturu uvedete biljni materijal s nekom klicom, ona e se vrlo uspjeno razviti u uvjetima kulture "in vitro" gdje je pristup drugih konkurentnih patogena sprijeen. Postoji mogunost da pokuate sterilizirati sjemenke pomou razrijeenog kalcij-hipoklorida (npr. sredstvo za ienje "Domestos" ili neko slino). Ako ete koristiti dijelove biljke odaberite neku kod koje je prisutno vegetativno razmnoavanje (npr. jagoda). Posude u kojima se kultura razvija (npr. tikvice ili epruvete) trebaju biti zatvorene epovima od vate koji omoguuju dovoljnu izmjenu plinova a sprijeavaju ulazak raznih klica. Moete koristiti osvjetljavanje fluorescentnim lampama, ali i danje svijetlo no u tom sluaju treba izbjegavati direktnu sunevu svjetlost.

12

LITERATURA: Mari, Miodrag, Kultura biljnih tkiva, 1995. Hulina, Nada, Vie biljke stablaice, Golden marketing, 2011. Dubravec, Regula, Fiziologija bilja, Zagreb, 1995. Jani, R: Lekovite biljke sa kljuem za odreivanje, Nauna knjiga, Beograd, 1990.

13