Odvajanje limfocita na najlon vuni

Metode ispitivanja
nespecifine imunosti

BECKMAN COULTER CENTRIFUGA

IZDVAJANJE LIMFOCITA
NA GRADIJENTU GUSTINE

1. Uzeti venepukcijom 10 ml. Periferne krvi

2. Krv iz sprica ubrizgati u praznu epruvetu
sa 2-3 kapi heparina i promesati.
3. U istu epruvetu sipati meavinu fikola i
hipak ili komercijalni limfoprep.
4. Paljivo uz zid eprivete pasterovom
pipetom nanosini defibrinisanu krv pazei
da se granicni sloj limfopre/krv je
poremeti.
5. Odnos Limfoprep / periferna krv je 1:3
6. Centrifugirati na 1000 o/min 20 min

IZDVAJANJE LIMFOCITA
NA GRADIJENTU GUSTINE

Posle centrifugiranja zapae se prisustvo 4

sloja: prvi ikasti je seru, drugi u vidu
prstena sivobeliaste prebojenosti su
limfociti, trei je limfoprep a zadnji je talog od
eritrocita.
istom pasterovom pipetom pokupiti sloj
limfocita i preneti ga u drugu istu epruvetu.
Dodati 10 ml PBS-a resuspendovati talog i
centrifugirati na 1000 o/min 5 min.
Proceduru ponoviti jos jednom!

1
ODREIVANJE ODREDJIVANJE
LEUKOCITARNE FORMULE LEUKOCITARNE FORMULE

Bojenje razmaza periferne krvi

1. Obrisati dobro jagodicu prsta pacineta sa 70% etanolom.
2. Ubosti prst sterilnom lancetom ili iglom za pric.
3. Lagano masirati prst od korena ka vrhu dokse ne pojavi kap krvi.
4. Na isto predmetno staklo blie kraju naneti 1-2 kapi krvi.
5. Uzeti drugu predmetnu ploicu i staviti je kraom ivicom uz nanetu
kap krvi pod uglom od 45o i povui energino ja drugom kraju
ploice. Time je nainjen tzv. periferni razmaz.
1. Ploicu sa osuenim razmazom staviti na stalak iznad plastine
kadice.
2. Preliti ga sa 2 ml. apsolutnog metanola i ostaviti da stoji 1,5 min.
3. Dodati na ovu koliinu jo 2 ml. May-Greenvald Giemse i saekati jos
1,5 min.
4. Oprati ploicu sa destilovanom vodom

6. Ostaviti ga da se osui a zatim bojiti May-Greenwald/Giems-om
5. Preliti ploicu sa rastvorom Gimze koja je predhodno raybalaena u
PBS-u u odnosu jedan deo boje i 10 delova PBS-a i ostaviti 10 20
min.
6. Razmaz oprati od boje destilovanom vodom i ostaviti ga da se osui a
zatim gledati pod imerzijom

2
3