PROTOKOL: TRANSFORMACIJA

Transformacija postupak unoenja strane DNA u bakterijske stanice

(E. coli)

Da bi transformacija bila uspjena, potrebne su KOMPETENTNE STANICE

(komercijalne/homemade). Kompetentne stanice mogu propustiti stranu DNA te ih
integrirati u svoj genom.
Potrebno je napraviti Petrijevke s agarozom:
Na 100 mL 2YT medija dodaje se 1,2g agara (agar se zagrijava postupno dok se
u potpunosti ne razbistri; paziti da ne iskipi!)
U otopljeni agar potrebno je dodati antibiotik (ampicillin) kao selektivni marker za
bakterije u koje se integrirao eljeni plazmid (1000X -> 1X; na 100 mL agaroze
ide 0,1 mL ampicilina)
Pripremljeni agar izliti na petrijevke (20 mL)

Kompetentne stanice se mjeaju s eljenim plazmidom:

15 L kometentnih stanica + 5 L plazmida (resuspendirati)
Staviti na led na 5 min, a nakon toga staviti pripremljenu epicu na 42 o C kroz 30 s
Nakon toga opet na led kroz 5 min
Dodati 0,5 mL 2YT medija u epicu, u svaku petrijevku dodati 30 L sadraja
epice te razmazati staklenim tapiem dok se agar ne pone suiti; poklopiti
petrijevke te ih okrenuti naopake I staviti u najlon vreicu
Mjeati 30 min na 37o C, ostaviti jedan dan dok se ne razviju kolonije
Nakon to su se kolonije razvile, odabrati kolonije te ih oznaiti, te ih tipsom
prenjeti u falkonice od 50 mL (u svaku dodati po 5 mL 2YT medija s antibiotikom);
epovi trebaju biti loose i zaljepljeni sa selotejpom ostaviti preko noi
zamuenje tekueg medija ukazuje na rast bakterija

PROTOKOL: TRANSFORMACIJA