Luan Van Tot Nghiep Dien Di PDF

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN HỆ PROTEIN CỦA MỘT SỐ

GIỐNG LÚA THƠM Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG
BẰNG KĨ THUẬT ĐIỆN DI
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
TS. TRẦN NHÂN DŨNG NHÂM THỊ THU THỦY
MSSV: 3064419
LỚP: CNSH TIÊN TIÉN K32
Cần Thơ, tháng 11/2010

PHẦN KÝ DUYỆT
. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
Trần Nhân Dũng Nhâm Thị Thu Thủy
DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN
Cần Thơ, ngày tháng 11 năm 2010
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG
TS. TRƯƠNG TRỌNG NGÔN

LỜI CẢM TẠ
Luận văn tốt nghiệp tuy không phải là một công trình quá lớn lao nhưng đã đánh
dấu kết quả của cả một quá trình học tập trong suốt mười sáu năm. Để hoàn thành tốt
luận văn này em đã nhận được sự giúp đỡ từ rất nhiều người. Em xin chân thành gửi
lời cám ơn đến:
TS. Trần Nhân Dũng đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, thăm hỏi và động viên.
Th.S. Trần Thị Xuân Mai đã giúp đỡ, hỗ trợ và chỉ bảo.
CN. Nguyễn Thị Xuân Dung đã theo sát, chia sẻ những kinh nghiệm quý báu trong
suốt thời gian làm luận văn.
CN. Nguyễn Vũ Linh đã hỗ trợ trong quá trình hoàn thành luận văn.
Ban giám đốc Viện Nghiên Cứu và Phát Triển Công Nghệ Sinh Học và các thầy cô
của Viện đã quan tâm, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt đề
tài tốt nghiệp.
Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học Tiên Tiến K32 đã giúp đỡ, chia sẻ trong học tập
cũng như trong cuộc sống.
Con xin dành lời tri ân sâu sắc đến ông bà, cha mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo con nên
người. Ông bà, cha mẹ luôn là chỗ dựa vững chắc nhất của con.
TÓM LƯỢC
Nhằm thiết lập quy trình trích ly protein từ hạt lúa và nghiên cứu sự biểu hiện hệ
protein của một số giống lúa thơm ở ĐBSCL, các thí nghiệm được tiến hành trên 5
giống lúa thơm và 2 giống lúa không thơm theo các bước: khảo sát các quy trình trích
ly, điện di SDS và điện di hai chiều. Kết quả quy trình trích ly protein từ hạt sử dụng
dung dịch trích ly bao gồm 125mmol/l Tris HCl, p H 6,8 có chứa 4mol/l urea; 4% SDS
và 5% 2-Mercaptoethanol kết hợp với phương pháp thẩm tích đối chứng nước cho
lượngprotein cao và tinh sạch. Qua phổ điện di hai chiều, chúng tôi đã xác định được
những protein tương quan với mùi thơm của thành phần globulin có điểm đẳng điện
nằm trong khoảng 6,4 - 7,0, trọng lượng phân tử được tìm thấy trên gel điện di hai
chiều là 11,5kDa, 30,7kDa, 33,9kDa, 34,0kDa và 66,8kDa.
Từ khóa: điện di hai chiều, globulin, hệprotein, lúa thơm, mùi thơm trên lúa, SDS-
PAGE.
1
MỤC LỤC
KÍ TÊN HỘI ĐỒNG

LỜI CẢM TẠ
TÓM LƯỢC.............................................................................................................. i
MỤC LỤC..................................................................................................................ii
DANH SÁCH BẢNG................................................................................................v
DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................vi
CÁC TỪ VIÉT TẮT.................................................................................................vii
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU..................................................................................... 1

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU............................................................... 2
I. SƠ LƯỢC VỀ CÁC GIÓNG LÚA THƠM HIỆN NAY............................. 2
1. Các giống lúa thơm trên thế giới................................................................. 2

2. Các giống lúa thơm trong nước................................................................... 2
3. Protein dự trữ trong hạt lúa........................................................................ 3
3.1. Protein dự trữ trong hạt...............................................................................3

3.2. Các thành phần và vị trí protein trong hạt lúa............................................4
4. Mùi thơm trên cây lúa..................................................................................6
5. Những yếu tố ảnh hưởng đến mùi thơm trên cây lúa...............................6
6. Những nghiên cứu cơ bản về lúa thơm trên thế giới và Việt Nam......... 9
6.1. Những nghiên cứu cơ bản về lúa thơm trên thế giới................................... 9
6.2. Những nghiên cứu cơ bản về lúa thơm ở Việt Nam................................... 10
II. KĨ THUẬT ĐIỆN HAI CHIỀU TRONG PHÂN TÍCH PROTEIN.......11
1. Điện di một chiều (SDS-PAGE)..................................................................... 11

2. Điện di dựa vào điêm đăng điện....................................................................13
3. Điện di hai chiều............................................................................................. 14
CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 15
I. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU...............................................15

1. Địa điêm nghiên cứu..................................................................................... 15
ii
2. Thời gian nghiên cứu................. 15
II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................15

1. Dụng cụ và hóa chất.......................................................................................15
1.1. Dụng c ụ ...................................................................................................... 15
1.2. Hóa chất....................................................................................................... 15
2. Nguyên liệu......................................................................................................16
III. PHƯƠNG PHÁP.............................................................................................. 17

1. Quy trình thí nghiệm......................................................................................17
2. Tiến hành thí nghiệm.................................................................................... 17

2.1. Thí nghiệm 1: Ly trích protein................................................................... 17
2.2. Thí nghiệm 2: SDS-PAGE..........................................................................18
2.3. Thí nghiệm 3: Điện di hai chiều (2-DE).................................................... 19
CHƯƠNG IV: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... 21

1. Ly trích protein............................................................................................... 21
2. SDS-PAGE...................................................................................................... 23
3. Điện di hai chiều.............................................................................................. 25

CHƯƠNG V: KÉT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................. 32
I. KÉT LUẬN......................................................................................................... 32
II. ĐỀ NGHỊ............................................................................................................ 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................34
PHẦN PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Hình gel của điện di hai chiều
Phụ lục 2: Xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Bradford
1. Nguyên tắc
2. Tiến hành thí nghiệm
Phụ lục 3: Điện di SDS
1. Nguyên tắc
2. Tiến hành
iii
Phụ lục 4: Điện di chiều thứ nhất (Isoelectric focusing)
Phụ lục 5: Điện di chiều thứ hai SDS - PAGE cho 2-D
1. Chuẩn bị gel
2. Cân bằng thanh IPG Strip
3. Loading gel
4. Tiến hành điện di
5. Nhuộm gel bằng Biosafe Coomsie Blue
6. Rửa gel
7. Đọc kết quả
Phụ lục 6: Phương pháp tính trọng lượng phân tử trên gel SDS
Phụ lục 7: Ma trận nhị phân thông qua 2-DE
Phụ lục 8: So sánh độ khác biệt giữa các giống lúa thơm ở điện di hai chiều
iv
D A N H SÁ C H B Ả N G
Bảng Tên Bảng Trang
1 Tổ hợp lai tạo và đặc điểm của một số giống lúa được sử dụng 16
2 Kết quả ly trích protein của các phương pháp được khảo sát 21
3 Tóm tắt những protein khác biệt của từng giống lúa thơm 33
v
D A N H S Á C H H ÌN H
[ình Tên Hình
1 Nguyên lí điện di SDS 13
2 Nguyên lí của điện di hai chiều 14
3 Sơ đồ bố trí các bước tiến hành thí nghiệm 17
4 Quy trình trích ly protein từ hạt lúa 17
5 Phổ điện di SDS của các phương pháp ly trích được khảo sát 22
6 Phổ điện di SDS của các giống lúa 23
7 So sánh giữa đối chứng âm và lúa thơm 25
8 So sánh giữa giống lúa MTL513 và đối chứng âm 26
13 Giản đồ tương quan giữa các giống lúa thơm thông qua 2DE 31
vi
CÁC TỪ VIÉT TẮT
KDM Khao Dawk Mali
kDa Kilo Dalton

PMSF Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride
fgr Fragrance
RNA Ribonucleic Acid

DNA Deoxyribonucleic Acid
cM Centi Morgan
ESP External Sense Primer
INSP Internal Non-fragrant Sense Primer

IFAP Internal Fragrant Anti-sense Primer
EAP External Anti-sense Primer
SSR Simple Sequence Repeat

ĐBSCL Đồng Bằng Sông Cửu Long
PCR Polymerase Chain Reaction

2DE 2-Dimensional Electrophoresis
SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis

SDS Sodium Dodecyl Sulphate
IEF Isoelectric focusing
IPG Immobilized pH Gradient
DD Dung dịch
vii
Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 32 - 2010 Trường ĐHCT
CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU
Lúa là một trong những loại cây lương thực phổ biến nhất trong cuộc sống con
người. Đặc tính mùi thơm ở lúa được đánh giá rất cao. Nó được tạo thành bởi hàng
trăm loại chất thơm dễ bay hơi như hydrocarbons, alcohols, aldehydes, ketones, acids,
phenols, pyridine, 2-acetyl-1-pyrroline... (Lorieux et al., 1996); trong đó, 2-acetyl-1-
pyrroline được xem như là nguyên nhân chính tạo ra mùi thơm của hai giống Basmati
và Jasmine (Bradbury, 2005). Tại Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL), ngoài các
giống lúa thơm đặc sản hiện có tại một vài địa phương như Dự Hương, Nàng Thơm
Chợ Đào,... hiện nay các nhà khoa học và các cơ quan nghiên cứu đã và đang tiến
hành nhập nội và lai tạo được một số giống lúa thơm có những đặc tính thích nghi tốt
với điều kiện sinh thái vùng ĐBSCL như Jasmine 85, VĐ20, ST3, ST10,... Hơn nữa,
các giống lúa thơm có ưu điểm là tính trạng mùi thơm thường liên kết với tính trạng
chất lượng nấu nướng tốt và tỉ lệ xay xát cao (Nagarju et al., 1979). Bên cạnh những
ưu điểm đó thì những giống lúa đặc sản chất lượng cao nêu trên cũng mang một số
nhược điểm như thời gian sinh trưởng dài, năng suất thấp, chống chịu sâu bệnh yếu, dễ
rụng hạt và hay bị đổ. Thêm vào đó, các giống lúa thơm ở Việt Nam có mùi thơm
không giữ được lâu, sau khi thu hoạch tồn trữ khoảng hai tháng gạo đã hết mùi thơm
(http://vneconomy.vn/20090511112747952P0C19/lua-thom-ma-van-thua.htm). Việc
chọn tạo những giống lúa mới có mùi thơm khắc phục những nhược điểm nêu và cho
năng suất cao, chất lượng tốt là một chiến lược trong nông nghiệp. Để góp phần giải
quyết vấn đề này, đề tài nghiên cứu “Khảo sát hệ protein của một số giống lúa thơm ở
Đồng Bằng Sông Cửu Long bằng kĩ thuật điện di” được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài: (i) Khảo sát hệ protein của một số giống lúa thơm ở ĐBSCL
hiện nay, từ đó tuyển chọn được những giống lúa tốt áp dụng vào sản xuất, (ii) Xây
dựng quy trình chuẩn để khảo sát hệ protein của các giống lúa thơm.
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học
1
CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
I. SƠ LƯỢC VỀ CÁC GIÓNG LÚA THƠM HIỆN NAY

1. Các giống lúa thơm trên thế giới
Trên thế giới có 114 nước trồng lúa, phân bố trên tất cả các châu lục, nhưng tập
trung nhiều nhất vẫn là Châu Á. Chủng loại các giống lúa ngày càng đa dạng. Đặc tính
thơm là một trong những phẩm chất được đánh giá cao. Lúa thơm được trồng và tiêu
thụ chủ yếu ở Ản Độ, Pakistan, Thái Lan, Bangladesh, Afghanistan, Indonesia, Iran và
Mỹ. Trong đó, các nước Ản Độ, Thái Lan và Pakistan phần lớn xuất khẩu gạo thơm
sang các nước Trung Đông, Châu Âu và Mỹ với thu nhập mỗi năm hàng triệu đôla.
Trong các nước nêu trên, Pakistan là quốc gia đứng đầu trong xuất khẩu lúa thơm với
tổng diện tích sản xuất lúa thơm ở Pakistan hơn 2,1 triệu ha. Đối với Mỹ lúa thơm chỉ
được trồng trong một khu vực giới hạn tại Mỹ. Trong đó, giống lúa Della là giống
được trồng nhiều hơn so với các giống lúa khác và một số giống lúa thơm khác cũng
được trồng như Dellamont, A201 và Jasmine 85. Trong các nước Thái Lan,
Bangladesh, Việt Nam và Iran, thì Thái Lan là nước chủ lực trong sản xuất và xuất
khẩu gạo thơm chất lượng cao trên thị trường thế giới (Singh et al., 2000). Lúa
Basmati là giống lúa thơm nổi tiếng. Lúa Basmati gốc ở Ản Độ, Pakistan và Nepal,
được trồng độ 2 triệu ha trên thế giới hàng năm. Gạo thơm này có hạt nhỏ, dài từ 6,8 -
7,0mm, tỉ lệ chiều dài và chiều rộng từ 3,5 - 3,7 và có hàm lượng amylose trung bình
20 - 22%. Gạo Basmati sau khi nấu nở dài ra, nhưng vẫn thon và hạt cơm mềm rời
nhau sau nhiều giờ. Hai đặc tính chính của Basmati là mùi thơm và cơm nở dài; đặc
tính sau này bị chi phối bởi nhiều gen nên gây khó khăn trong tạo giống truyền gen
(Khush, 2001).
2. Các giống lúa thơm trong nước
Nhóm lúa Tám thơm có hạt gạo dài, trong và thơm, cung cấp một số lượng cao để
xuất khẩu, nhất là Trung Quốc. Nổi tiếng nhất ở miền Bắc là Tám thơm, cây thấp,
cứng, gié trung bình, chịu lạnh, nhưng ở vùng đất phì nhiêu có nhiều gié. Sau đó là
Tám xoan, thân cao hơn, gié dài có nhiều hạt lúa. Hai giống lúa này luôn được trồng ở
đất màu mỡ và có năng suất cao độ 2 - 3 t/ha (Dumont, 1995).
2
Ở miền Nam, giống lúa nổi tiếng là Nàng Thơm Chợ Đào, còn gọi là lúa hạt lựu vì
có đốm bạc bụng. Nàng Thơm Chợ Đào có thân cao, gié nhỏ, trọng lượng 1000 hạt từ
19 đến 29g/hạt (bình quân 22g). Năng suất trung bình 2 - 3 t/ha. Ngoài ra còn có các
giống lúa nổi tiếng khác như lúa Móng Chim, Nàng Hương, Nanh Chồn (Bà Rịa), Tàu
Hương, Thơm Sớm, Thơm Lùn, lúa Huyết Rồng (Long An),... ST3 là giống lúa biến
dị từ VD 20 - có nguồn gốc từ giống lúa KDM 105 được Viện Lúa quốc tế (IRRI) cho
lai với IR262 tạo nên IR84 là loại lúa đặc sản của tỉnh Sóc Trăng. Giống lúa ST3 được
công nhận là giống quốc gia năm 2002. Từ năm 2002 - 2009, các giống ST5 - ST20
được phóng thích. Trong đó ST15, ST16, ST19, ST20 có phẩm chất gạo cao cấp. Điều
đáng chú ý là lúa thơm ST trên ruộng tôm - lúa luôn trúng giá, được các thương lái săn
đón vì nông dân hạn chế tối đa phân bón hóa học, nông dược, lúa khô ráo tự nhiên, giữ
hương thơm lâu, phẩm cấp gạo hơn hẳn cùng giống đem trồng ở nơi khác. (Theo báo
SGGP, 2009).
Miền Trung và Tây Nguyên có các giống lúa thơm nổi tiếng như lúa Ngự, Cúc
Thơm, Thái Thơm, Nếp Than, Nếp Trắng, Bake Dẻo, Nếp Cái Hoa Vàng. Hai giống
lúa thơm nổi tiếng nhất miền Trung là Đế An Cựu và lúa Ngự, nhưng nay không còn
tìm thấy nữa. Lúa thơm ở Tây Nguyên có trọng lượng 1000 hạt trên 25g.
Hiện nay có nhiều giống lúa thơm được du nhập vào Việt Nam như Basmati 370,
Basmati đột biến (Ân Độ), Khaodawkmali (Thái Lan) Jasmine 85 (Thái Lan), VD10,
VD20 (Đài Loan), IR841 (IRRI, Philippines), Bác Thơm, Quế Hương Chiêm, Qua Dạ
Hương, Chi Ưu Hương (Trung Quốc), v.v... Các nhà khoa học đã dựa vào các giống
lúa thơm này để tiến hành lai tạo và chọn lọc ra các giống lúa mới phù hợp với điều
kiện khí hậu và dinh dưỡng ở Việt Nam.
3. Protein dự trữ trong hạt lúa

3.1. Protein dự trữ trong hạt
Theo Hingins (1984), protein dự trữ là tất cả các proteon tích lũy với hàm lượng
đáng kể trong quá trình phát triển của hạt. Khi hạt nảy mầm chúng sẽ thủy phân nhanh
để cung cấp nguồn đạm cho các giai đoạn đầu phát triển của cây con.
3
Protein dự trữ không biểu hiện hoạt tính ezyme (Shewry et al., 1999). Chúng được
tích lũy bên trong các mô đặc biệt. Đối với cây họ đậu thì protein này tích lũy trong tử
diệp, còn ở ngũ cốc thì trong phôi nhũ.
Thành phần protein dự trữ ở hạt lúa là nhân tố dinh dưỡng quan trọng và được tổng
hợp chủ yếu trong giai đoạn phát triển sớm (Zhu, 1995).
3.2. Các thành phần và vị trí protein trong hạt lúa
• Albumin
Albumin tan trong nước, bị kết tủa ở nồng độ muối (NH4)2SO4 khá cao (70-80%).
Các protein ở nhóm này phổ biến ở tế bào động vật và thực vật. Tinh thể albumin lòng
trắng trứng, albumin huyết thanh được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực. Trọng
lượng phân tử của các protein thuộc nhóm này rất khác nhau, từ 12kDa đến 16kDa
hoặc có thể đến 17kDa trên gel SDS, điểm đẳng điện là 4,8 (Trần Tố, 2008) trên gel
của điện di hai chiều.
Theo Yamagata (1982), trong thành phần albumin có hàm lượng lysine cao nhất,
kế đến là glutelin và prolanin. Hai thành phần albumin và globulin tập trung ở lớp
aleuron, không giữ được ở gạo xay chà trắng, còn hai thành phần glutelin và prolanin
phân bố đều trong nội nhũ.
• Globulin
Globulin không tan hoặc rất ít tan trong nước, tan trong dung dịch loãng của muối
trung hòa NaCl, KCl, Na2SO4, K2SO4. Các protein nhóm này thường bị kết tủa ở nồng
độ (NH4)2SO4bán bão hòa. Theo Yamagata et al. (1982), globulin có trọng lượng phân
tử là 26kDa trên gel SDS và chủ yếu tập trung ở tầng aleuron của hạt lúa. Các protein
thuộc nhóm này cũng có trọng lượng phân tử rất khác nhau và thường chứa nhiều
amino acid có chứa lưu huỳnh thiết yếu (Tanaka, 1975). Theo Komatsu et al. (1992)
thì globulin trong lúa có điểm đẳng điện nằm trong khoảng 6,4 - 7,0.
• Prolamin
Prolamin không tan trong nước hoặc dung dịch muối loãng, tan trong ethanol hoặc
isopropanol 70-80%. Prolamin là một trong hai dạng protein dự trữ, chiếm từ 18-20%
protein tổng trong nội nhũ của lúa, được tổng hợp ở mạng lưới nội chất (Tanaka et al.,
1980). Prolamin bao gồm ít nhất 4 polypeptide 16kDa, 13AkDa, 13BkDa và 10kDa
4
(Ogawa et al., 1987). Mỗi tiểu đơn vị polypeptide của nó gồm một vài thành phần với
điểm điện di khác nhau (Hibino et al., 1989). Trong đó, prolamin 10kDa là protein
giàu amino acid có sulfur (Masumura et al., 1989). Những protein dạng prolamin này
được phân chia thành hai dạng: prolamin nghèo cystein (CysP) và prolamin giàu
cystein (CysR) và có ít nhất hai cơ chế quy định cho quá trình tổng hợp và tích lũy
prolamin trong hạt lúa.
• Glutelin
Glutelin chỉ tan trong dung dịch kiềm và acid loãng. Trong hạt lúa, thành phần
glutelin là protein dự trữ chính chiếm khoảng 80% tổng số protein trong nội nhũ
(Juliano, 1972). Theo Yamagata et al. (1982), glutelin khi được ly trích và điện di bằng
SDS - PAGE có hai tiểu nhóm phân tử với trọng lượng phân tử khác nhau. Nhóm tiểu
đơn vị acid dạng a có trọng lượng phân tử 37kDa - 39kDa và nhóm tiểu đơn vị base
dạng p có trọng lượng phân tử 22kDa-23kDa.
Theo Yamagata et al. (1982), các protein globulin, albumin và prolamin có trọng
lượng phân tử lần lượt là 26kDa, 16kDa, 13kDa trên gel SDS.
• Protein tổng số
Hàm lượng protein là một chỉ tiêu tương đối quan trọng với chất lượng dinh dưỡng
của hạt lúa. Protein trong gạo có giá trị cao hơn các loại ngũ cốc khác bởi vì hàm
lượng lysine của nó khá cao 3,5-4% (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). Do đó,
hàm lượng protein của gạo tuy thấp (khoảng 7-8%) nhưng nó được xem là protein có
phẩm chất cao nhất.
Các nhà chọn giống đã cố gắng cải tiến nâng cao hàm lượng protein trong các
giống lúa mới nhưng ít thành công. Nghiên cứu của Chang và Somrith (1979) cho biết
sự di truyền tính trạng protein do đa gen điều khiển có hệ số di truyền khá thấp, có thể
do ảnh hưởng mạnh mẽ giữa kiểu gen và môi trường.
Trong quá trình canh tác nếu không bón hay bón ít đạm thì các giống lúa cải tiến
chỉ chứa một lượng protein tương đương với lúa địa phương. Ngược lại, nếu bón đủ
đạm và áp dụng đúng các biện pháp kĩ thuật canh tác thì hàm lượng protein sẽ tăng 1-
2% mà năng suất vẫn không giảm. Theo Gomez (1979), việc quản lý kĩ thuật canh tác
5
cho thấy có ảnh hưởng rất lớn đến hàm lượng protein hạt gạo. Hàm lượng protein cao
hơn ở những chỗ sạ thưa ở cùng nơi có hàm lượng đạm hữu dụng.
4. Mùi thơm trên cây lúa
Cho tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu về các chất tạo mùi thơm ở lúa cũng như
bản chất di truyền của gen tạo mùi thơm. Người ta đã chứng minh rằng, chất thơm
trong lúa được hợp thành từ hơn một trăm hợp chất dễ bay hơi như hydrocarbons,
alcohol, aldehydes, ketones, acids, esters, phenols, pyridines, pyrazines và những hợp
chất khác (Yajima et al., 1978) . Tính trạng mùi thơm trên lúa chịu ảnh hưởng bởi cả
hai nhân tố di truyền và môi trường. Đặc tính sinh hóa của mùi thơm được biết đến do
sự có mặt của chất 2-acetyl-1-pyrroline (Tanchotikul và Hsieh, 1991). Chất tạo mùi 2-
acetyl-1-pyrroline được tìm thấy ở hầu hết các bộ phận của cây, trừ phần rễ (Lorieux et
al., 1996). Những giống lúa không thơm chứa một lượng rất ít chất 2-acetyl-1-
pyrroline trong khi những giống lúa thơm chứa lượng lớn chất này (Widjaja et al.,
1996). Theo Bradbury (2005), một gene lặn (fgr) trên nhiễm sắc thể số 8 điều khiển
tính trạng này. Lorieux et al. (1996) đã nhận định rằng có sự liên kết chặt chẽ giữa
RG28 và fg r với khoảng cách là 4,5cM.
5. Những yếu tố ảnh hưởng đến mùi thơm của lúa
Tuỳ loại gạo thơm mà khác nhau về mức độ thơm (đậm, trung bình và nhẹ). Mùi
thơm và chất lượng cơm chịu ảnh hưởng nhiều bởi kiều kiện môi trường. Một số giống
có thể trồng ở nhiều nơi và cho năng suất tương đương nhau nhưng về chất lượng thì
lại rất khác nhau đặc biệt là mùi thơm. Theo Singh et al. (1997) các yếu tố ảnh hưởng
đến sự hình thành mùi thơm bao gồm:
• Những yếu tố thuận lợi

- Nhiệt độ thấp trong thời kỳ trỗ và phát triển của hạt
- Bón phân chuồng/ phân hữu cơ
- Đất màu mỡ
- Sạ
- Đất nhẹ và đất rẫy
- Không xay chà bằng máy
6
• Những yếu tố bất thuận

- Thời tiết nóng trong thời kỳ trổ và phát triển của hạt
- Bón phân ure
- Đất xấu
- Cấy
- Đất nặng
- Thu hoạch trễ
- Dùng máy xay chà
• Anh hưởng của nhiệt độ
Các nhà khoa học đồng ý chung là sự hình thành và duy trì mùi thơm được gia tăng
nếu trong giai đoạn hạt vào chắc nhiệt độ xuống thấp. Gieo cấy muộn dẫn đến trổ bông
và chín trong những ngày nhiệt độ thấp hơn đã làm tăng chất lượng gạo nhưng giảm
năng suất của lúa thơm (Chandra et al., 1997; Rao et al., 1996).
• Anh hưởng của đất đai
Nhiều nông dân cho rằng ở những vùng đất thịt nhẹ và xốp như vùng đồi núi thì
thuận lợi cho việc hình thành mùi thơm trong khi hầu hết các giống lúa đặc sản, lúa
thơm lại được gieo trên những cánh đồng bằng phẳng và được tuới tiêu thuận lợi. Lúa
thơm sinh trưởng tốt trong điều kiện đất phù sa trẻ ít chua, ảnh hưởng mặn tiềm tàng ở
tầng dưới. Nếu không đáp ứng được những yêu cầu đó thì lúa thơm vẫn trồng được
nhưng năng suất thấp, mùi thơm giảm.
• Yếu tố dinh dưỡng và phân bón
Suwanarit et al. (1996) cho biết mùi thơm, độ mềm cơm, màu trắng sáng, độ dính
của cơm gạo KDM105 bị ảnh hưởng nếu bón phân đạm. Bón nhiều đạm sẽ gia tăng
năng suất nhưng mùi thơm sẽ giảm. Gạo đặc sản trồng trên những đất nghèo đạm có
chất lượng cao hơn. Phân kali ảnh huởng tốt đến chất lượng và hương vị của cơm. Nếu
bón nhiều kali hơn lượng dùng để đạt năng suất tối đa của giống KDM105 thì sẽ làm
tăng mùi thơm và góp phần làm cho hạt gạo sáng hơn nhưng độ mềm cơm giảm
(Suwanarit et al., 1997a). Sở dĩ bón phân kali làm tăng năng suất hạt vì kali làm cho
cây cứng, không bị đổ ngã. Hơn nữa, kali giúp tăng trọng lượng hạt vì tăng khả năng
tích lũy chất khô trong hạt và giảm hiện tuợng bất thụ. Bón phân lân làm tăng hàm
7
lượng protein trong gạo. Tuy nhiên nếu bón nhiều sẽ làm cho chất lượng gạo giảm.
Bón phân chứa kẽm làm tăng lượng amylose trong gạo (Chen và Fan, 1997).
• Các biện pháp canh tác

Các biện pháp canh tác như chuẩn bị đất, phương pháp gieo sạ, thời gian gieo, thời
gian thu hoạch đều ảnh hưởng lớn đến chất lượng gạo và việc hình thành mùi thơm.
Nếu đất được làm kỹ và để ẩm khoảng 30 trước khi cấy thì trọng lượng 1000 hạt, tỷ lệ
xay chà, chiều dài hạt, hàm lượng protein và độ bền gel là cao nhất. Tuy nhiên nếu chỉ
làm đất khô rồi đưa nước vào cấy thì các giá trị trên đều thấp. Mật độ cây c
hưởng đến trọng lượng 1000 hạt, tỷ lệ xay chà, hàm lượng protein và chiều dài hạt.
Nếu mật độ sạ dày các chỉ tiêu trên đều giảm. Theo kinh nghiệm của nông dân thì lúa
sạ có mùi thơm hơn lúa cấy (Singh et al., 1998).
• Anh hưởng của mùa vụ
Về mùa vụ, do các giống lúa thơm đều yêu cầu biên độ nhiệt ngày và đêm khá
chênh lệch nên thời vụ gieo trồng cần được tính toán sao cho giai đoạn trổ, giai đoạn
hạt vào chắc phải phù hợp với nhu cầu sinh lý của cây để đạt được chất lượng gạo cao.
Nếu cấy sớm mùi thơm sẽ giảm, cấy trễ thì hàm lượng amylose tăng (Ali et al., 1991).
Thời gian thu hoạch cũng ảnh hưởng lớn đến chất lượng gạo và mùi thơm. Nếu
gặt trễ sẽ giảm mùi thơm và các chỉ tiêu chất lượng khác. Thời điểm thu hoạch tốt nhất
để thu được năng suất và tỷ lệ xay chà cao là ở 35 ngày từ khi lúa trổ 50%. Tốt nhất là
sấy hoặc phơi trên sân phơi. Đối với lúa, đặc biệt là lúa mùa hay những giống lúa đặc
sản thì câu nói "càng cũ càng tốt" được nhiều người ưa chuộng. Thực tế là lúa được
bảo quản vài tháng có chất lượng tốt hơn, vì sau khi bảo quản được vài tháng khả năng
hấp thụ nước của gạo tăng khoảng 15% trong quá trình nấu. Nhưng bảo quản lâu hơn
nữa thì sẽ có các vấn đề cần lưu ý như dịch hại trên nông sản, chưa kể đến những biến
đổi hoá tính của hạt lúa trong quá trình bảo quản lâu. Kinh nghiệm cho thấy môt số
giống lúa thơm nếu bảo quản lâu hơn 3 tháng sẽ giảm mùi thơm.
8
• Ảnh hưởng của độ thuần giống

Độ thuần của giống ảnh hưởng rất lớn đến mùi thơm sử dụng giống không đạt chất
lượng sẽ ảnh hưởng đến chất lượng gạo và mùi thơm, nên mua giống ở những nơi tin
cậy để bảo đảm giống đúng cấp, đúng chất lượng.
6. Những nghiên cứu cơ bản về lúa thơm trên thế giới và Việt Nam
6.1. Những nghiên cứu cơ bản về lúa thơm trên thế giới
Vấn đề lúa thơm cũng được các nhà khoa học trên thế giới hết sức quan tâm. Việc
phân tích và xác định mùi thơm được tiến hành bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Sood và Siddiq (1978) đã khởi đầu việc xác định mùi thơm bằng phương pháp ngửi
mùi thơm khi nấu, phương pháp phân tích KOH 1,7%. Tiếp sau đó, phương pháp phân
tích DNA được Bradbury et al. (2005) sử dụng; dựa vào gen fgr, Bradbury xác định
marker RM515 và SSRJ07 là marker chuẩn để xác định mùi thơm của lúa với kích
thước là 386591bp. Nghiên cứu này cũng kết luận rằng khi sử dụng bốn cặp mồi ESP
(external sense primer), INSP (internal non-fragrant sense primer), IFAP (internal
fragrant anti-sense primer) và EAP (external anti-sense primer) trong cùng một phản
ứng PCR sẽ cho băng 577/585bp cả giống lúa thơm và không thơm do sự khuếch đại
của cặp mồi ESP và EAP. Cặp mồi INSP và EAP khuếch đại một đoạn với kích thước
là 355bp cho các giống lúa không thơm trong khi cặp mồi ESP và IFAP khuếch đại
một đoạn có kích thước là 257bp cho các giống lúa thơm. Bốn mồi này cho phép chọn
được những cá thể thơm đồng hợp tử, không thơm đồng hợp tử và không thơm dị hợp
tử. Tuy nhiên, phương pháp xác định mùi thơm phổ biến và chính xác nhất là phương
pháp sắc kí khối phổ. Yoshihashi (2002) áp dụng phương pháp sắc kí khối phổ để xác
định xem mùi thơm có được thành lập trong thời gian nấu hay không. Yoshihashi et al.
(2004) đã ứng dụng phương pháp này để xác định hàm lượng 2-acetyl-1-pyrroline trên
giống lúa KDM105. Laksanalamai và Ilangantileke (1993) còn sử dụng phương pháp
sắc kí khí để so sánh mùi thơm trên lá của hai giống Pandanus amaryllifolius và
KDM105. Bergman et al. (2000) cho rằng sử dụng phương pháp sắc kí khối phổ trong
công tác chọn giống là nhanh và chính xác cao vì chúng ta có thể xác định được 2-
acetyl-1-pyrroline trong hai thế hệ lai so với 4 thế hệ lai như phương pháp truyền
thống và có thể phân tích tới 50 mẫu/ngày.
9
6.2. Những nghiên cứu cơ bản về lúa thơm ở Việt Nam
Việc phát triển các giống lúa thơm là một trong những nhu cầu cấp thiết trong giai
đoạn hiện nay cũng như trong thời gian tới vì điều này sẽ làm tăng hiệu quả xuất khẩu
gạo (Dung, 2004; Trịnh Khắc Quang, 2004). Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông
Thôn đã chọn bảy tỉnh thành ĐBSCL tổ chức mô hình sản xuất lúa chất lượng cao như
các tỉnh: Đồng Tháp, An Giang, Long An, Sóc Trăng và Thành phố Cần Thơ. Các tỉnh
thành này sẽ sản xuất một triệu tấn lúa chất lượng cao để xuất khẩu. Chính vì thế, việc
chọn tạo ra những giống lúa chất lượng cao, đặc biệt là lúa thơm đã được rất nhiều tác
giả nghiên cứu. Viện Nghiên cứu và Phát triển ĐBSCL - Đại học Cần Thơ đã tiến
hành lai tạo và chọn lọc được một số giống lúa thơm ngắn ngày, năng suất cao, có khả
năng chịu mặn và chịu phèn như MTL495, MTL513, MTL514, MTL250, MTL548,
MTL555... Các giống OM3536, OM5649.... cũng được Viện lúa ĐBSCL cho ra đời
đáp ứng tiêu chuẩn. Những giống lúa ST3, ST5, ST10, ST3 đỏ... từ tỉnh Sóc Trăng bắt
đầu được nông dân mở rộng sang nhiều tỉnh, nhất là một số tỉnh ven biển vùng
ĐBSCL. Dựa vào những nghiên cứu đó, nhiều tác giả đã tiến hành phân tích các đặc
điểm di truyền của các giống lúa thơm nhằm nâng cao công tác tuyển chọn và lai tạo
giống. Nguyễn Thành Tâm (2008) đã kết hợp kĩ thuật PCR và phương pháp phân tích
sinh hóa để chọn giống lúa thơm chất lượng cao kết hợp với các đặc tính phẩm chất và
tính chống chịu rầy nâu và bệnh cháy lá với 4 cặp mồi chuyên biệt ESP, IFAP, INSP
và EAP; kết quả đã chọn ra các giống lúa thơm MTL495, MTL513, MTL5459 và
MTL578 có mùi thơm tương đương với giống Jasmine 85. Nguyễn Thị Lang và Bùi
Chí Bửu (2004) đã ứng dụng marker phân tử đánh dấu mùi thơm trên lúa, xác định gen
fg r điều khiển tính trạng mùi thơm bằng phương pháp Fine Mapping với
microsatellite, phân tích quần thể tổ hợp lai KhaoDawkMali/OM1490 cho thấy rằng
gen fgr diều khiển mùi thơm là gen lặn trên nhiễm sắc thể số 8. băng thể hiện mùi
thơm xuất hiện ở độ lớn 190bp và không thơm ở độ lớn 90bp (cặp mồi RG28F-R),
băng thể hiện mùi thơm xuất hiện ở độ lớn 160bp và không thơm ở độ lớn 120bp (cặp
mồi RM223). Việc ứng dụng kĩ thuật điện di SDS cũng được nhiều tác giả áp dụng để
xác định mùi thơm. Qua đó, Quan Thị Ái Liên và Võ Công Thành (2007) đã kết luận
rằng băng protein thể hiện mùi thơm trên lúa liên quan đến protein thành phần globulin
10
và có trọng lượng phân tử là 24,4kDa. Nguyễn Thị Mỹ Phương et al. (2005) đã xác
định protein liên quan đến tính thơm thuộc thành phần protein albumin với 3 băng trên
phổ điện di SDS là 59,7kDa, 27,7kDa và 24,5kDa. Theo Trần Thị Kim Thúy (2002)
thì có thể mùi thơm của lúa thể hiện qua protein thành phần globulin. Lê Nguyệt Ánh
(2005) qua quá trình phân tích bước đầu trên nhiều phổ điện di albumin giữa lúa thơm
và không thơm đã nghi ngờ trong protein thành phần albumin có protein tương quan
đến mùi thơm. Nguyễn Bích Hà Vũ (2006) cũng đã sử dụng kĩ thuật này để xác định
các giống lúa thơm quốc gia MTL250, MTL233, MTL241 và ST3.
II. KĨ THUẬT ĐIỆN DI HAI CHIỀU TRONG PHÂN TÍCH PROTEIN

Để đánh giá quá trình tinh sạch protein có hiệu quả hay không, ngoài cách xác
định hoạt tính đặc trưng của protein có tăng lên sau mỗi bước tinh sạch, còn một cách
là làm hiện hình các protein hiện diện trong mẫu sau mỗi bước; điều này được thực
hiện nhờ kỹ thuật điện di.
1. Điện di một chiều (SDS-PAGE)
Một phân tử có mang điện tích sẽ di chuyển trong điện trường. Hiện tượng này,
được đặt tên là điện di, giúp hướng tới một kỹ thuật rất mạnh để phân tách protein và
các đại phân tử khác như DNA và RNA. Vận tốc di chuyển (v) của một protein (hay
bất kỳ phân tử nào) trong điện trường phụ thuộc vào lực điện trường (E), điện tích thực
của protein (z) và hệ số ma sát (f).
Điện di luôn được thực hiện trên gel (hay trên vật thể rắn như giấy) bởi vì gel
giống như một cái ray phân tử sẽ làm tăng sự phân tách. Những phân tử nhỏ hơn kích
thước lỗ gel sẽ có thể di chuyển xuyên qua gel, trong khi đó những phân tử lớn hơn lỗ
gel thì gần như không di chuyển. Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển
trong gel với nhiều vận tốc khác nhau. Điện di được thực hiện trên một bản
polyacrylamide mỏng, thẳng đứng. Hướng của dòng điện từ trên xuống.
Gel polyacrylamide được tạo thành từ sự polymer hóa acrylamide và sự liên kết
chéo của methylenebisacrylamide, được chọn làm môi trường cho điện di vì nó có tính
trơ về mặt hóa học và được tạo hình nhanh chóng. Điện di là một cách lọc qua gel mà
theo đó tất cả các phân tử, không xét về kích thước, sẽ bị tác động một lực để di
11
chuyển trong cùng một chất nền. Gel ở đây có thể xem tương đương với một hạt trong
cột lọc gel.
Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng điện di trên
acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính. Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung
dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm sẽ phá tất cả các
nối không cộng hóa trị của protein ban đầu. Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay
dithiothreitol cũng có thể được thêm vào để làm giảm số nối disulííde. Phức hợp SDS
với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của
protein. Điện tích âm có được do gắn với SDS lớn hơn rất nhiều điện tích của bản thân
protein ban đầu; vì thế, điện tích ban đầu của protein không ảnh hưởng đáng kể đến
điện tích của phức hợp. Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di. Khi
điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhìn thấy là một dãy các băng bằng
cách nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue. Những đánh dấu
phóng xạ có thể được phát hiện bằng cách đặt một tấm phim chụp x-quang lên miếng
gel, quá trình này gọi là phóng xạ tự ghi.
Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía
đầu, gần vị trí nạp mẫu. Tính di động của phần lớn các chuỗi polypeptide dưới những
điều kiện như thế tỉ lệ với khối lượng của chúng. Tuy nhiên, cũng có vài protein giàu
carbohydrate và protein màng không tuân theo mối tương quan này. SDS-PAGE có độ
phân tách cao, cho kết quả nhanh và độ nhạy cao. Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0,1pg
(~2pmol) protein đã cho vạch rất rõ khi nhuộm với Coomassie blue và thậm chí ít hơn
(~0,02pg) vẫn có thể được phát hiện khi nhuộm bằng bạc. Vì vậy, SDS-PAGE giúp
chúng ta đánh giá kết quả của quá trình tinh sạch.
http://www.hcmbiotech.com.vn/technology detail.php?cateid=4&id=85
____
Chuyên ngành
D X 2- 'ệ Sinh Học
P ro te ỉn 0 OD
k
SDS g ắ n v ào am in o ac id k h iế n cho
p ro te in tíc h đ iệ n â m v à là m cho
(www.molecularstation.com/images/protein-gel-electrophoresis.jpg)
Hình 1. Nguyên lí điện di SDS
2. Điện di dựa vào điêm đăng điện
Phương pháp điện di đẳng điện (IEF: Isoelectricfocusing) là điện di trong phân
tích protein dựa vào điểm đẳng điện pI (pI là giá trị pH mà ở đó các protein trung hòa
về mặt điện tích, tổng điện tích bằng 0). Gel điện di IEF được tẩm hợp chất gồm các
phân tử lưỡng tính (các ampholyte) chủ yếu là các polycarboxylic acid, polyamin tổng
hợp. Các ampholyte sẽ tạo một gradient pH từ thấp đến cao trên gel thường được gọi
là các thanh Strip với các khoảng pH khác nhau (3-10, 4-7). Môi trường ở pH> pI thì
protein tích điện âm và pH < pI thì protein tích điện dương. Trong điện trường IEF,
các protein tùy thuộc điện tích sẽ dịch chuyển về cực âm hay dương và ở giá trị pH =
pI trên gel thì chúng sẽ dừng lại.
3. Điện di hai chiều

Đây là một phương pháp có khả năng phân tách cao do sư kết hợp SDS-PAGE với
điện di dựa vào điểm đẳng điện. Mẫu protein đầu tiên sẽ được chạy điện di dựa vào
điểm đẳng điện. Sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein vừa được điện di lên tấm gel
SDS-polyacrylamide theo phương nằm ngang. Protein sẽ chịu một điện trường theo
chiều dọc. Kết quả là một mô hình các điểm được phân tách hai chiều, chiều ngang
theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng. Khả năng phân tách của phương pháp
13
này được chứng minh khi hơn một ngàn protein của vi khuẩn E. coli có thể được phân
tách trong một lần chạy điện di.
Những protein được phân tách từ tế bào ở các điều kiện sinh lý khác nhau có thể
phân tách được bằng phương pháp này, sau đó cường độ của tín hiệu sẽ được xác định.
Với cách này, những protein cụ thể sẽ được thấy ở dạng mạnh hay yếu tùy vào tình
trạng sinh lý. Tuy nhiên, phương pháp này có một hạn chế là có rất nhiều protein được
phân tách nhưng lại phân biệt rõ. Để khắc phục hạn chế này, người ta kết hợp điện di
hai chiều với kỹ thuật khối phổi.
http://www.hcmbiotech.com.vn/technology detail.php?cateid=4&id=85
Hình 2. Nguyên lí của điện di hai chiều

(http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc462/462a/NOTES/Protein Proper
ties/protein purification.htm)
CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

14
I. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

1. Địa điêm nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Công nghệ Enzyme của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công
Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Cần Thơ.
2. Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 6 năm 2010 đến tháng 11 năm 2010
II. PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU
1. Dụng cụ và hóa chất
1.1. Dụng cụ
• Máy ly tâm, tủ hút, máy vortex, cân điện tử, tủ lạnh (-200C), bình hút ẩm, tủ
sấy, máy đo quang phổ, máy khuấy từ, máy lắc nhuộm màu, máy đo pH, bộ điện di
(gồm khung điện di, khung đổ gel và bộ nguồn), thiết bị điện di hai chiều (Bio- Rad),
thiết bị điện di đứng Protein II (Bio-Rad).
• Bộ micropipette, các loại falcon có nắp, eppendoft, chày và cối, ống nghiệm
thủy tinh, ống đong, cuvette nhựa, tuýp ( xanh và vàng), becher, giấy, găng tay,...
• Kít tinh sạch protein ( 2D-clean up kit (Bio-Rad), IPG Strip 7cm, pH 3-10 (Bio-
Rad), 2D kít (Bio-Rad).
1.2. Hóa chất
• Dung dịch trích ly protein
- Dung dịch 1: 125mmol/l Tris HCl, pH 6,8 có chứa 4mol/l urea; 4% SDS
(Merck) và 5% 2-Mercaptoethanol (Merck)
- Dung dịch 2: 0,5M Tris-HCl, pH 6,8 có chứa 2,5% SDS (Merck), 10%
glycerol (Merck) , 5% 2-Mercaptoethanol (Merck)
- Dung dịch 3: 0,5M Tris-HCl, pH 6,8 có chứa PMSF (Merck) 1mM
• PMSF 1mM, EDTA (Merck) 5mM (pha stock)
• Hòa tan mẫu: Rehydration (Biorad, Mỹ) hoặc Tris-HCl 0,05M pH 7,5
• Dùng trong phương pháp định lượng protein Bradford: Comassie Blue G250
(Merck), cồn tuyệt đối, Acid phosphoric 85% (Merck)
• Các hóa chất trong bộ chạy điện di SDS
15
2. Nguyên liệu
5 giống lúa thơm được đánh giá và chọn lọc từ bộ quan sát, hậu kì và bộ so sánh
năng suất của Viện Nghiên cứu và Phát triển ĐBSCL, Trường Đại học Cần Thơ, dựa
trên sự đánh giá kiểu gen và kiểu hình lúa thơm và thông qua việc đánh giá năng suất
thực tế, các đặc tính về phẩm chất hạt và sâu bệnh hại chính, có mùi thơm tư
đương với giống lúa Jasmine 85, năng suất cao và 2 giống đối chứng âm không thơm.
Một số đặc điểm của các giống lúa được trình bày ở Bảng 1.
Bảng 1. Tổ hợp lai tạo và một số đặc điểm của các giống lúa được sử dụng
TT T ên giống T ên gốc Tổ hợp lai Đ ặc điểm
1 M TL495 L 322-5-3-1-2 N. N huận/M T L 145/M TL23 3 N gắn ngày, năng suất

cao, chịu m ặn
2 M TL513 L 342-9-7-1-1-2 M TL233/A S996 N gắn ngày, gạo ngon,

chịu phèn
3 M T L 549 L318-1-3-2-5-2- M T L 156/K haohom N ăng suất cao, chịu
3-4 phèn, gạo ngon
4 M TL578 L 350-9-9-2-1-1 IR 50404/M T L 14 2 /M T L 2 4 1 N gắn ngày, năng suất

cao, gạo ngon
5 M T L 579 L274-4-5-1-2-7- LTC N /O M 1723 Cực ngắn ngày, năng
1-1-1 suất cao
6 TN1 Đ ối chứng âm
7 IR 50404 C ISA D A N E /IR 26821-200-3- Đ ối chứng âm
1-1-1
III. PHƯƠNG PHÁP
16
1. Quy trình thí nghiệm
Bột nội nhũ
i
Ly trích protein
SDS- PAGE ------- ► Phân tích kết quả
Chọn ra phương
pháp trích ly tốt
nhất để trích ly các Phân tích hệ protein giữa
mẫu lúa Điện di hai chiều các giống để tìm ra
(2-DE) những protein marker
phân tử
Hình 3. Sơ đồ bố trí các bước tiến hành thí nghiệm
2.1. Thí nghiệm 1: Ly trích protein
Mục đích: Tìm ra quy trình trích ly hiệu quả protein từ hạt lúa.
Hình 4. Quy trình trích ly protein từ nội nhũ hạt lúa

Tiến hành
• Hạt lúa sau khi đã bóc vỏ, nghiền mịn
• Cân 1g bột nội nhũ, thêm 5ml dung dịch ly trích
• Lắc ít nhất 1 giờ hoặc để qua đêm, ly tâm 10000 vòng/phút trong 20 phút. Thu
dịch lỏng phía trên
17
Phần dung dịch lỏng thu được tiếp tục:

■ Tủa với Acetone
- Tủa protein với Acetone (100%) lạnh tỉ lệ 1:4. để yên ở -20oC trong 1giờ.
Sau đó tiến hành ly tâm 2500 vòng/phút trong 20 phút thu phần tủa.
- Rửa tủa từ 3-4 lần với Acetone (80%) lạnh
- Để phần tủa vào bình hút ẩm cho thật khô
- Hòa tủa với dung dịch đệm (Tris-HCl 7,5, 50mM), ly tâm 10000 vòng/phút
(10 phút) thu dịch trích protein
■ Tủa với amonium sulfate (AS) 95% bão hòa
- Tủa với AS 95% bão hòa, để lạnh 1 giờ. Sau đó tiến hành li tâm thu phần
tủa
- Hòa tủa với 400pl dung dịch đệm (Tris-HCl 7,5, 50mM) cho đến khi tủa tan
hết, thu dịch trích
■ Thẩm tích đối chiếu nước
Cho dung dịch lỏng vào các túi thẩm tích, ngâm trong nước cất, khuấy đều ở 4oC.
Sau 2 giờ thay nước một lần, nước cất được thay 3-4 lần, thu dịch trích protein.
So sánh nồng độ protein sau các nghiệm thức bằng phương pháp Bradford (1976)
(xem phụ lục 2) kết hợp với quan sát trên gel SDS, từ đó rút ra qui trình trích ly
protein hiệu quả nhất. Tiến hành trích ly protein các mẫu lúa theo qui trình thu được.
2.2. Thí nghiệm 2: SDS-PAGE
Mục đích: Kiểm tra chất lượng và độ tinh sạch của protein sau quá trình ly trích,
đồng thời so sánh đối chiếu giữa giống đối chứng với các giống còn lại và giữa các
giống với nhau để tìm sự khác biệt của các băng protein.
• Tiến hành điện di SDS (xem phụ lục 3)
• Nhận xét kết quả
• Ghi nhận quy trình trích ly tối ưu nhất để sử dụng cho việc ly trích những giống
lúa còn lại
2.3. Thí nghiệm 3: Điện di hai chiều (2-DE)
18
Mục đích: Xác định sự đa dạng của các giống thông qua các hệ protein đặc trưng,
tìm kiếm hệ protein đặc trưng cho sự biểu hiện phần nào của gen thơm fgr.
• Quy trình tinh sạch protein cho điện di hai chiều
Sử dụng kít tinh sạch 2D-Cleanup Kit (Bio-Rad):
- 100pl mẫu (protein 5 mg/ml) vào ống 1,5 ml
- 300 |il chất tạo kết tủa 1 vào mẫu protein và trộn đều bằng vortex. Ủ ở 400C
trong 15 phút
- Thêm vào 300pl tác nhân gây tủa 2 vào dung dịch rồi vortex
- Ly tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút để tủa dính chặt vào thành ống
- Dùng pipet nhẹ nhàng hút bỏ dịch nổi
- Ly tâm giống như lần trước trong vòng 15- 30 giây. Cẩn thận hút bỏ dịch nổi
còn lại bằng pipet
- Thêm 40pl tủa 2, ly tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút
- Lắng cặn, loại bỏ dịch rửa bên trên
- Thêm 25pl nước cất 2 lần. Vortex trong 10 - 20 giây. Cặn phân tán không hòa
tan trong nước
- Thêm 1 ml dung dịch rửa 2 (đã được làm lạnh ở -200C ít nhất một giờ), sau đó
vortex trong 1 phút
- Ủ ở -200C trong 30 phút. Cứ 10 phút vortex 1 lần trong 30 giây
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi. Ly tâm nhẹ trong 15 -
30 phút và hút bỏ dung dịch còn lại. Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng trong 5 phút
- Hòa tan tủa bằng 100pl dung dịch chạy điện di (Rehydration buffer), vortex
trong 30 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng 3 - 5 phút, vortex 1 phút
19
- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, thu dung dịch bên trên,
ta được mẫu tinh sạch dùng điện di protein, giữ lạnh ở -800C
• Điện di chiều thứ nhất IEF (Isoelectric Focusing)

- Sử dụng các thanh điện di (IPG Strip, Bio-Rad) có gradient pH từ 3-10,
- Tiến hành điện di (xem phụ lục 4)
• Điện di chiều thứ hai SDS-PAGE
- Gel phân tích 10% acrylamide để tiến hành SDS-PAGE cho điện di hai
chiều và không cần gel tập trung (xem phụ lục 5)
- Chụp hình gel và phân tích kết quả bằng phần mềm PDQuest
- Nhận xét kết quả
- Dựa vào một phần kết quả của SDS-PAGE để thảo luận kết quả điện di 2
chiều. Trọng lượng phân tử, pI của các protein khác biệt ở các giống. Từ đó,
chọn ra được những protein làm marker phân tử cho giống lúa thơm.
20
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1. Ly trích protein
1g bột nội nhũ của giống lúa MTL513 được sử dụng để nghiên cứu các quy trình
trích ly protein.
Bảng 2. Kết quả ly trích protein của các phương pháp được khảo sát
T ủ a b ằ n g A c e to n e T ủa bằng AS T h ẩ m tích
DD 1 DD 2 DD 3 DD 1 DD 2 DD 3 DD 1 DD 2 DD 3
L ư ợ n g p r o te in 0,284 0,441 2,12 0,903 4,53 2,4 4,006 10,08 4,67
th u đ ư ợ c (m g )
H iệ u su ấ t th u 0,03 0,04 0,21 0,09 0,45 0,24 0,401 1,01 0,47
h ồ i (% )
Lượng protein của các phương pháp trích ly trong khoảng xấp xỉ 0,03% đến 1%
(Bảng 2). So với lượng protein trong gạo 7 - 8% (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,
2000) thì hàm lượng protein thu được vẫn còn thấp vì trong quá trình trích ly, lượng
protein đã mất đi do hao hụt. Bảng 2 cho thấy phương pháp tủa bằng acetone không
cho lượng protein cao, hiệu suất thu hồi chỉ khoảng 0,03 - 0,21%. Phương pháp tủa
bằng amonium sulfate 95% bão hòa cũng cho lượng protein không đáng kể (0,09 -
0,45%). Ngược lại, phương pháp thẩm tích cho hàm lượng protein khá cao đối với cả 3
dung dịch trích ly (0,4 - 1%). Tuy nhiên, để chắc chắn về chất lượng và độ tinh sạch,
protein tiếp tục được kiểm tra bằng điện di SDS.
21
Hình 5. Phô điện di SDS của các phương pháp ly trích được khảo
sát
Chú thích:
1: dung dịch trích ly 1, tủa với acetone.
4: dung dịch trích ly 1, tủa với amonium sulfate.
7: dung dịch trích ly 1, thẩm tích.
Phổ điện di SDS (Hình 5) cho thấy protein sau khi được trích ly bằng dung dịch
trích ly 2 kết hợp với phương pháp thẩm tích đối chiếu nước (giếng 8) mặc dù cho hiệu
suất thu hồi khá cao (1,01%) nhưng trên phổ điện di cho thấy kết quả chưa được tốt,
các băng còn mờ và chưa đa dạng chứng tỏ phương pháp này chỉ cho protein về mặt số
lượng nhưng chất lượng chưa tốt, chưa hiệu quả trong quá trình ly trích protein.
Protein sau khi được trích ly bằng 3 dung dịch 1, 2 và 3 đem tủa với acetone (giếng 1,
2 và 3) cũng cho kết quả không tốt, hàm lượng protein không cao được thể hiện ở các
băng không rõ nét và bị nhòe. Điều này được giải thích do phương pháp tủa bằng
acetone làm mất một lượng lớn protein, điều này cũng đã thể hiện ở hiệu suất t
Các giếng 4, 5, 6 và 9 cũng cho thấy kết quả protein chưa tốt. Riêng chỉ ở giếng số 7
22
các băng protein thể hiện đậm và rõ nét nhất, lượng protein nhiều, độ tinh sạch cao. Vì
thế, dung dịch trích ly 1 kết hợp với phương pháp thẩm tích đối chiếu nước đã được
chọn làm quy trình trích ly protein cho các mẫu lúa trong bài nghiên cứu này.
2. SDS - PAGE
Các giống lúa thơm được lấy từ Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long sau khi
được Nguyễn Thành Tâm (2008) tiến hành thanh lọc trong bộ giống lúa thơm từ vụ Hè
Thu 2006 đến vụ Đông Xuân 2006 - 2007 và được nghiên cứu tính trạng mùi thơm
bằng kĩ thuật PCR kết hợp với các phương pháp đánh giá định tính kiểu hình xác định
đây là những giống lúa có mặt gen thơm fgr, vừa thể hiện tính thơm tương đương với
giống lúa Jasmine 85 vừa cho năng suất cao và có đặc tính về phẩm chất tốt, áp dụng
quy trình trích ly đã được thử nghiệm ở thí nghiệm 1 tiến hành điện di SDS (Laemmli
et al.,1970) để kiểm tra độ tinh sạch và hàm lượng protein.
M
116 kDa .
66,2 kDa-
45 kDa,
35 kDa
25 kDa
18,4 kDa
14,4 kDa ■
Hình 6. Phổ điện di SDS của các giống lúa
Chú thích:
M: protein chuẩn; 1: MTL513; 2: MTL495; 3: MTL578; 4: MTL 579; 5:
MTL549; 6: TN1 (đối chứng âm); 7: IR50404 (đối chứng âm).
Các giống lúa thơm có hàm lượng protein khá cao, các băng hiển thị sáng, đậm và
rõ nét (Hình 6). Hệ protein của các giống lúa thơm đa dạng, có 16 băng có thể quan
sát. Các băng protein nằm trong vùng có trọng lượng phân tử khoảng từ 12kDa đến
gần 100kDa. Bên cạnh đó, phổ điện di của các giống lúa này cũng tương đối đồng đều
về số lượng và độ đậm nhạt của các băng protein. Đối chứng âm - giống lúa TN1
23
(giếng số 6) có sự khác biệt rõ rệt nhất so với các giống lúa khác. Vùng protein của
giống TN1 phân bố trong khoảng từ 12kDa đến 45kDa với 7 băng. Giống lúa IR50404
(giếng số 7) mặc dù cũng là đối chứng âm nhưng hệ protein không có sự khác biệt lớn
so với các giống lúa thơm. Điều này có thể được giải thích như sau, giống lúa IR50404
là giống có năng suất cao, ít nhiễm sâu bệnh nên thường được dùng để lai tạo các
giống lúa có đặc tính mong muốn. Vì vậy, về bản chất di truyền có thể giống nhau
giữa các giống lúa. Tuy nhiên, do một nhược điểm của SDS - PAGE là độ phân giải
thấp và chỉ có thể phân tách dựa trên trọng lượng phân tử của protein nên sự khác biệt
về đặc điểm chi tiết của các protein chưa được thấy rõ ở đây.
Quan sát trên phổ điện di (Hình 6) thấy được sự khác biệt giữa các giống lúa thơm
và hai giống đối chứng âm. 5 giống lúa thơm chứa vùng protein có trọng lượng phân
tử từ 36kDa đến khoảng 100kDa trong khi giống đối chứng âm TN1 không có. Những
protein này có trọng lượng phân tử lần lượt là 100kDa, 80kDa, 63kDa, 57,5kDa,
57kDa, 47 kDa, 44.9kDa và 40kDa. Vùng protein này cũng hiện diện ở phổ điện di
của giống IR50404 nhưng có một số điểm khác biệt, các băng protein ở trọng lượng
phân tử 80kDa, 63kDa, 57,5kDa không tìm thấy ở giống lúa IR50404. Ngoài ra, các
giống lúa thơm còn có một băng protein hiện diện ở trọng lượng phân tử 35kDa rất
đậm mà ở giống TN1 chỉ là một băng mỏng. Băng protein này đậm hơn so với các
băng khác và cũng có ở giống IR50404. có thể đây là loại protein chiếm số lượng lớn
trong tế bào, hoạt động mạnh, cùng có trọng lượng phân tử nhưng khác nhau về pI
(protein đồng đẳng - isoprotein). Tuy nhiên, sự khác biệt về trọng lượng phân tử của
các băng protein thể hiện trên gel không rõ ràng. Các băng có thể chỉ xê xích nhau một
khoảng cách rất nhỏ tương ứng với 5kDa - 10kDa nên việc xác định mối tương quan
cũng khá phức tạp. Hơn nữa, có những loại protein có trọng lượng phân tử bằng nhau
nhưng khác nhau về điện tích hoặc có những protein chưa được phân tách một cách rõ
ràng nên vẫn chưa có thể kết luận được những protein đặc trưng cho tính trạng mùi
thơm ở thí nghiệm này.
24
3. Điện di hai chiều
Các giống lúa sau khi tiến hành điện di SDS chưa thấy những điểm khác biệt đặc
trưng rõ rệt tiếp tục tiến hành điện di hai chiều để tìm ra những protein liên quan đến
khả năng tạo mùi thơm.
• So sánh giữa hai đối chứng âm và các giống lúa thơm
Vùng đánh dấu xanh: vị tríprotein giống nhau (match) của 2 bản gel.
Vùng đánh dấu đỏ: hiển thịprotein có khả năng liên quan đến tính thơm
5 giống lúa thơm được tổng hợp thành một bản gel và được so sánh với gel tổng
hợp của 2 giống đối chứng. 34 protein khác biệt được tìm thấy chỉ xuất hiện ở những
giống lúa thơm nhưng không có ở những giống đối chứng. Những protein này nằm
trong khoảng trọng lượng phân tử 52kDa - 80kDa, 29kDa - 34kDa, 11kDa - 14kDa
và một số protein trong khoảng 25kDa; điểm đẳng điện tập trung chủ yếu ở 5,0 - 9,0
(Hình 7). Tuy nhiên, đáng chú ý hơn cả là 6 protein có pl nằm trong khoảng 6,4 - 7,0
như (11,5;6,7), (30,7;6,7), (52,7;6,9), (33,9;6,8), (34,0;6,9), (66,8;7,0) là những protein
thành phần globulin mà theo Trần Thị Kim Thúy (2002) đã xác định là loại protein thể
hiện tính trạng mùi thơm. Điều này cũng trùng khớp với nghiên cứu của Quan Thị Ái
Liên (2007) cho rằng mùi thơm của lúa liên quan đến protein thành phần globulin.
Những protein này có trọng lượng phân tử nằm trong khoảng 30kDa - 34kDa trên gel
điện di hai chiều. Theo Buttery et al. (1983) lớp aleuron có liên quan đến mùi thơm do
25
albumin và globulin tập trung ở lớp này hay Vương Đình Tuấn (2001) cũng nhận xét
lớp vỏ ngoài của hạt gạo cũng liên quan đến tính thơm.
Theo Nguyễn Thành Tâm (2008), các giống lúa MTL495, MTL513, MTL549,
MTL578 và MTL579 là những giống lúa có khả năng chống chịu tốt với bệnh cháy lá
và rầy nâu, ngoài ra còn có những đặc điểm nổi trội hơn những giống lúa bình thường
như dẻo cơm, chịu mặn, chịu phèn... nên hệ protein đa dạng hơn 2 giống lúa TN1 và
IR50404. Điều này cũng giải thích lí do tại sao trong số 34 protein khác biệt của các
giống lúa thơm chỉ có 6 protein liên quan đến tính thơm, chiếm 17,6%.
Giống MTL513
( 116. 0, 3 . 00) (116.0,3 .00)
____ (11,5;6,7) ,
MTL513 Đối chứng âm
Hình 8. So sánh giữa giống lúa MTL513 và đối chứng âm
Số protein khác biệt giữa giống lúa MTL513 và đối chứng âm tương đối ít, có 14
protein khác biệt so với đối chứng âm (Hình 8). Tuy nhiên, chỉ có 2 protein nằm trong
vùng điểm đẳng điện 6,4 - 7,0. Đó là những protein có trọng luợng phân tử 11,5kDa,
điểm đẳng điện 6,7 và protein có trọng lượng phân tử 33,9kDa, điểm đẳng điện 6,8.
Những protein quy định tính trạng mùi thơm chiếm 14,3% trên tổng số những protein
khác biệt.
26
Giống lúa MTL495
Hệ protein của giống lúa MTL495 tương đối đa dạng với 27 protein khác biệt so
với đối chứng âm (Hình 9). Trong đó, 4 protein nằm trong vùng protein nghi ngờ có
liên quan đến mùi thơm trên lúa, chiếm tỉ lệ 14,8%. Đó là những protein (11,5;6,7),
(30,7;6,7), (34,0;6,9) và (66,8;7,0).
27
• Giống lúa MTL578
(66,8;7,0)
(116.0, 3 .00)
[ j
(52,7;6,9)
(11,5;6,7)
Tương tự như giống lúa MTL495, trên vùng protein khác biệt giữa giống lúa
MTL578 và đối chứng âm chỉ có 3 protein (11,5;6,7), (52,7;6,9), (66,8;7,0) thuộc
nhóm protein đã được xác định, chiếm 11,5% trên tổng số 26 protein khác biệt (Hình
10).
28

22 protein khác biệt của giống lúa MTL579 tập trung chủ yếu ở vùng trọng lượng
phân tử 52kDa - 80kDa (Hình 11). Trong đó, 4 protein quy định tính trạng mùi thơm
chiếm 18,1% trên tổng số protein khác biệt đó là những protein (34,0;6,9), (30,7;6,8),
(52,7;6,9) và (66,8;7,0).
29
Hệ protein của giống lúa MTL549 đa dạng nhất trong số 5 giống lúa thơm khảo sát
với 32 protein chỉ xuất hiện ở giống MTL549 mà 2 giống đối chứng âm không có
(Hình 12). Theo như nghiên cứu của Nguyễn Thành Tâm (2008) thì giống lúa
MTL549 là một giống lúa có rất nhiều ưu điểm nổi trội như có mùi thơm tương đương
với giống Jasmine85, cho tỉ lệ gạo nguyên cao, chống chịu tốt với rầy nâu và b
cháy lá cho nên so với những giống lúa bình thường hệ protein có phần đa dạng hơn.
Những protein liên quan đến mùi thơm có trọng lượng phân tử 11,5kDa, 52,7kDa,
66,8kDa và điểm đẳng điện tương ứng lần lượt là 6,7, 6,9 và 7,0, chiếm 9,4% trong
tổng số protein khác biệt.
Dựa vào các điểm (spots) tương thích và không tương thích giữa các giống với
nhau trên gel hai chiều lập ma trận nhị phân (xem phụ lục 7), vẽ được giản đồ thể hiện
mối tương quan của các giống lúa thơm bằng phần mềm NTSYSpc21:
30
------------------------------------------------------- MTL495
__________________________ MTL549
___________________________ MTL578
------------ MTL579
----------------------------------------------------------------------------------------------- MTL513
I---------- T---------- T----------T---------- T----------1---------- T---------- T----------T----------T-----------1---------- T----------T----------T---------- T----------1---------- T---------- T----------T---------- T---------- 1
ũjfiũ 0.66 Ũ.72 Ũ.77 0£3
Hệ số tương quan
Hình 13. Giản đồ tương quan giữa các giống lúa thơm thông qua 2DE
Giống lúa MTL578 và MTL549 có tỉ lệ tương quan khá cao (0,83) (phụ lục 8), thể
hiện trên giản đồ là nằm trên cùng một nhánh (hình 13). Điều này đúng với đặc điểm
của 2 giống lúa này khi khảo sát trên gel điện di hai chiều, có cùng những protein quy
định tính trạng mùi thơm ở trọng lượng phân tử 11,5kDa, 52,7kDa, 66,8kDa và điểm
đẳng điện tương ứng lần lượt là 6,7, 6,9 và 7,0, Giống lúa MTL513 thể hiện sự khác
biệt nhiều nhất so với các giống lúa còn lại, cụ thể trên gel điện di hai c
protein đặc trưng chỉ tìm thấy ở giống MTL513 ít hơn so với các giống lúa thơm khác.
Tuy nhiên, các giống lúa thơm có tỉ lệ tương quan khá cao chứng tỏ các giống lúa khá
giống nhau về đặc điểm di truyền, cùng mang gen thơm fg r và những đặc điểm nổi trội
đã được lai tạo và chọn lọc.
31
CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
I. KẾT LUẬN
Quy trình trích ly protein từ hạt lúa sử dụng dung dịch trích ly 1 và phương pháp
thẩm tích đối chiếu nước có hiệu quả trong việc trích ly protein từ hạt.
Phương pháp điện di SDS cho phép kiểm tra sơ bộ đặc điểm và sự khác biệt của
các giống lúa thơm với giống đối chứng âm. Tuy nhiên do độ phân giải của phương
pháp SDS còn thấp, các băng protein chưa phân tách rõ rệt nên chưa thể kết luận
protein nào quy định tính trạng mùi thơm trong thí nghiệm này.
Áp dụng kĩ thuật điện di hai chiều trong việc khảo sát hệ protein của các giống lúa
thơm cho kết quả khá chính xác.
Protein quy định tính trạng mùi thơm thành phần globulin có điểm đẳng điện nằm
trong khoảng 6,4 - 7,0, trọng lượng phân tử được tìm thấy trên gel điện của di hai
chiều là 11,5kDa, 30,7kDa, 33,9kDa, 34,0kDa và 66,8kDa. Những protein này chiếm
tỉ lệ 9,4% - 18% trên tổng số protein khác biệt chỉ tìm thấy ở những giống lúa thơm.
Những protein còn lại có khả năng liên quan đến các đặc điểm như chịu mặn, chịu
phèn, năng suất cao, khả năng chống chịu với bệnh cháy lá và rầy nâu...
Những protein khác biệt cụ thể của từng giống lúa thơm được trình bày trong Bảng
3.
32
Bảng 3. Tóm tắt những protein khác biệt của từng giống lúa thơm
Những protein liên quan đến tính thơm

Số protein
Giống lúa
khác biệt Trọng lượng phân tử, % protein trong tổng số
pI protein khác biệt
M TL513 14 (11,5;6,7), (33,9;6,8) 14,3%
(11,5;6,7), (30,7;6,7),
M TL495 27 14,8%
(34,0;6,9), (66,8;7,0)
M TL578 26 (11,5;6,7), (52,7;6,9), 11,5%

(66,8;7,0)
M T L 579 22 (34,0;6,9),(30,7 ;6,8), 18,1%

(52,7;6,9), (66,8;7,0)
M T L 549 32 (11,5;6,7), (52,7;6,9), 9,4%

(66,8;7,0)
II. ĐỀ NGHỊ
Hiệu chỉnh quy trình trích ly protein từ hạt theo mục đích trích ly loại protein mong
muốn để dễ dàng hơn cho việc nghiên cứu.
Tách phân đoạn các protein sau đó sử dụng các thang pH ngắn hơn (3-7, 4-7) để
nghiên cứu protein ở những vùng còn dày đặc cho độ phân tách tốt hơn.
Nghiên cứu các protein đặc trưng cho tính trạng mùi thơm bằng phương pháp khối
phổ giải trình tự để tìm hiểu sâu hơn cơ chế biểu hiện của gen fgr.
Nghiên cứu đặc điểm của các loại protein khác biệt ngoài những protein đã được
xác định là protein đặc trưng cho tính trạng mùi thơm phục vụ cho công tác lai tạo và
chọn lọc những giống lúa vừa có năng suất cao vừa chống chịu sâu bệnh.
33
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang. 2000, Một số vấn đề cần biết về gạo xuất khẩu.
Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. HCM.
Dương Xuân Tú, Phạm Quang Duy, Tăng Thị Diệp và Tống Thị Huyền. 2010, Ứng
dụng chỉ thị phân tử ADN xác định gen phục vụ chọn tạo giống lúa thơm. Tạp chí
hoạt động khoa học số 3.
Lâm Quang Dụ, Đào Thị Thanh Bằng, Nguyễn Hữu Đống, Tô Anh Tuấn, Lê Thị Liễu
và cộng sự. 2004. Nghiên cứu bản chất di truyền của tính trạng mùi thơm của một
số giống lúa. Tạp chí Di truyền học và Ứng dụng số 2.
Lê Nguyệt Ánh. 2005. Đánh giá chất lượng gạo thơm tại vùng Đồng Bằng Sông Cửu
Long. Luận văn tốt nghiệp cử nhân Công Nghệ Sinh Học K27. trường Đại học Cần
Thơ.
Nguyễn Bích Hà Vũ. 2006. Tuyển chọn 4 giống lúa quốc gia MTL250, MTL241,
MTL233, ST3, dựa trên hai tính trạng năng suất và mùi thơm thông qua kĩ thuật
điện di SDS - PAGE và DNA. Luận văn thạc sĩ Trồng trọt, trường Đại học Cần
Thơ.
Nguyễn Thành Tâm. 2008. Ứng dụng kỹ thuật PCR (Polymerase chain
reaction) xác định tính trạng mùi thơm và so sánh 11 giống lúa thơm,
chất lượng cao. Luận văn Cao học Trồng Trọt, trường Đại học Cần Thơ.
Nguyễn Thị Mỹ Phương, Võ Công Thành và Phạm Văn Phượng. 2005. So sánh năng
suất và phẩm chất gạo của 10 giống, dòng lúa thơm tại huyện Chợ Mới, tỉnh An
Giang vụ Thu Đông 2004. Tạp chí Nghiên cứu khoa học, trường Đại học Cần Thơ
2005 số 4.
Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu. 2004b. Xác định gen fg r điều khiển tính trạng mùi
thơm bằng phương pháp Fine Mapping với microsateUites. Hội nghị quốc gia về
chọn tạo giống lúa. Nhà xuất bản Nông nghiệp TP. HCM, trang 192-199.
Phạm Văn Phượng và Yutaka Hirata. 2004. Quy luật di truyền glutelin trong hạt lúa
trồng (Oryza sativa L.). Tạp chí khoa học, trường Đại học Cần Thơ 1. trang 56-61.
34
Phạm Văn Phượng. 2006. Ứng dụng kĩ thuật điện di protein SDS-PAGE để nghiên cứu
đặc điểm di truyền và chọn giống lúa, Tóm tắt luận án Tiến sĩ Nông nghiệp.
Quan Thị Ái Liên. 2007. Xác định dấu phân tửprotein tương quan đến mùi thơm của
các dòng/giống lúa thơm bằng kĩ thuật điện di protein SDS-PAGE”. Luận văn tốt
nghiệp đại học ngành Trồng trọt K28. trường Đại học Cần Thơ.
Trần Thị Kim Thúy. 2002. Đánh giá phẩm chất dinh dưỡng và cơm nấu của 33
giống/dòng lúa thơm và 15 giống/dòng lúa không thơm của trường Đại Học Cần
Thơ bằng phương pháp điện di protein (SDS-PAGE) và DNA (CAP-PCR). Luận
văn tốt nghiệp kỹ sư Trồng trọt K23. trường Đại học Cần Thơ.
Trần Tố. 2008. Giáo trình sinh hóa động vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
Trịnh Khắc Quang. 2004. Phát biểu khai mạc hội nghị quốc gia về chọn tạo giống lúa
tại Viện lúa ĐBSCL. Hội nghị quốc gia về chọn tạo giống lúa. Nhà xuất bản Nông
nghiệp TP. HCM, trang vii-ix.
Võ Công Thành và Phạm Văn Phượng. 2004. Một số kết quả ứng dụng kĩ thuật điện di
protein SDS-PAGE trong công tác chọn tạo giống lúa chất lượng cao. Hội nghị
Quốc gia chọn tạo giống lúa, Cần Thơ, tháng 7.
Tiếng Anh
Ali, A., M.A. Karim, S.S. Ali, L. Ali, G. Hassan, and A. Mazid. 1991. Relationship of
transplanting time to grain quality in Basmati 385. Intl. Rice Res. Newsl. 17: 3-7.
Ahn, S.W., C.N. Bollich and S.D. Tanksley. 1992. RFLP tagging of a gene for aroma
in rice. TheorAppl. Genet. 87: 27-32.
Bergman, C.J., T. Delgado, R. Bryant, C. Grimm, K.R. Cadwallader, and B.D. Webb.
2000, Rapid gas chromatographic technique for quantifying 2-acetyl-1pyrroline
and hexanal in rice (Oryza sativa, L.). Cereal Chem. 77 (4): 454-458.
Berner, DK., BJ. Hoft. 1986. Inheritance of scent in America long grain rices. Crop
Sci. 26: 157-159.
Bradbury, L.M.T., T.L. Fitzgerald, R.J. Henry, Q. Lin, and D.L.E. Waters. 2005. The
gene for fragrance in rice. Plant Biol. J. 3: 363-370.
35
Bradford, M. 1976. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram
Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal.
Biochem. 72: 248-254.
Buu, B.C. 2000, Aromatic rices of Vietnam. Aromatic rice 10: 188-190,
Chandra, D., S.B. Lodh, S.A. Sahu, K.M. Sahoo, and B.B. Nanda. 1997. Effect of date
of planting and spacing on grain yield and quality of scented rice (Oryza sativa)
varieties in wet season in coastal Orissa’. Indian J. Agric. Sci. 67: 93-97.
Chang, T.T., and B. Somrith. 1979. Genetic studies on the grain quality of rice. In
Proceedings o f Workshop on the Chemical and Aspects o f Rice Grain Quality.
IRRI (Eds.), pp. 49-58.
Chen, L.I., and X.M. Fan. 1997. Grain quality reponse to phosphorus and zine
fertilizer in rice phenotype. Chinese Rice Res. Newslt. 5: 9-10.
Daniel Figey. 2005. Protemomics-the basic overview. John Wiley & Sons, Inc, pp.12-
19.
Dumont, R. 1995. La culture du riz dans le delta du Tonkin. Printing House in

Bangkok, Thailand, pp. 592.
Dung, V.N. 2004. Planning for rice production in Vietnam; Intensive cultivation,
export, aromatic rice production, special rice, etc. Mekong rice conference, pp. 8.
Gomez, K.A. 1979. Effect of environment on protein and amylose content of rice in:
Workshop on chemical aspects o f rice grain quality. IRRI. Los Banos, Laguma,
Philippines. pp. 59-68.
Gorg, A., W. Postel, S. Gunther. 1988. The current state of two-dimensional

electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis 9: 531-546.
Hibino, T., K. Kidzu, T. Masumura, K. Ohtsuki, K. Tanaka, M. Kawabata, and S.

Fujii. 1989. Amino acid composition of rice prolamin polypeptides. Agric. Biol.
Chem. 53: 523-518.
Higgins, T.J.V. 1984. Synthesis and regulation of major proteins in seeds. Anu. Rev.
Plant Physiol. 35: 191-221.
36
Juliano, B.O. 1972. The rice caryopsis and its composition. In: Rice chemistry and
technology. (Ed.): D.F. Houston. Ameri. Assoc. Cereal Chemists. Inc., pp. 16-74.
Kibria, K., M. M. Islami, and S. N. Begumi. 2008. Screening of aromatic rice lines by
phenotypic and molecular markers. Bangladesh J. Bot. 37(2): 141-147.
Khush, G.S. 2001. New plant type of rice for increasing the genetic yield potential.
Rice breed. Andgenet., pp. 99-108.
Komatsu, S., H. Kajiwara, and H. Hirano. 1993. A rice protein library: a data-file of
rice proteins separated by two-dimensional electrophoresis. Theor Appl Genet 86:
935-942.
Komatsu, S., and H. Hirano. 1992. Rice seed globulin: A protein similar to wheat seed
glutenin. Phytochemistry 31 (10): 3455-3459.
Laksanalamai, V., and S. Ilangantileke. 1993. Comparison of aroma compound (2-

acetyl-1pyrroline) in leaves from Padan (Padanus amaryllifolius) and Thai Fragrant
rice (Khao Dawk Mali 105). Ceral Chem. 70(4): 381-384.
Lorieux, M., M. Petrov, M. Huang, E. Guiderdoni, and A. Ghesquière. 1996. Aroma in

rice: genetic analysis of a quantitatice trait. Theor. Appl. Genet. 93: 1145-1151.
Mark A.S., A. Claudio, D. Eric, S.C. Ruth, and A.L. Brian. 1988. Molecular
Characterization of Oat Seed Globulins. Plant Physiol. 87: 698-704.
Masumura, T., D. Shlbata, T. Hlblno, T. Kato, K. Kawabe, G. Takeba, K. Tanaka, and

S. Fugll. 1989. cDNA cloning of an mRNA encoding a sulfur-rich 10kDa prolamin
polypeptide in rice seeds. PlantMOI. Biol. 12. 123-130.
Matsuda, T., R. Nomura, M. Sugiyama, and R. Nakamura. 1991. Imunochemical

Studies on Rice Allergenic Proteins. Agric. Biol. Chem. 55 (2): 509-513.
Nadar, K., A. Naushad, A.R. Malik, and S.M. Muhammad. 2010, Diversity of Glutelin
alpha subunits in rice varieties from Pakistan. Pak. J. Bot., 42 (3): 2051-2057.
Nagarju, M., D. Chaudhary, and M.I.B. Rao. 1975. A simple technique to indentify
scent in rice and inheritance pattern of scent. Curr. Sci. 44: 599.
37
Nematzadeh Gh. A., N. Huang, and G. S. Khush. 2004. Mapping the gene for aroma in
rice (Oryza sativa L.) by bulk segregant analysis via RAPD markers. J. Agric. Sci.
Technol. 6: 129-137.
Nguyen Thi Lang and Bui Chi Buu. 2002. Identification and fine mapping of SSR
marker linked to fg r gene of rice. Omonrice 10: 16-22.
Ogawa, M., T. Kumamaru, H. Satoh, N. Iwata, T. Omura, Z. Kasai, and K. Tanaka.

1987. Purification of protein-I of rice seed and its polypeptide composition. Plant
cellPhysiol. 28: 1517-1527.
Ohkmae K. P. 2004. Proteomic Studies in Plants. Journal o f Biochemistry and

Molecular Biology 37 (1): 133-138.
Patrick, H., O’Farrell. 1975. High resolution of two-dimensional electrophoresis of

proteins. The journal o f biological chemistry 250 (10): 4007-4021.
Rao, K.S., B.T.S. Moorthy, A.B. Dash, and S.B. Lodh. 1996. Effect of time of
transplating on grain yield and quality traits of Basmati types scented rice (Oryza
sativa) varieties in coastal Orissa. Indian J. Agric. Sci. 66: 333-337.
Sano, Y. 1984. Differential regulation of waxy gene expression in rice endosperm.

Theor Appl Genet 68: 467-473.
Komatsu, S., K. Kojima, K. Suzuki, K. Ozaki and K. Higo. 2004. Rice proteome
database based on two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis: its status in
2003. Nucleic Acids Research 32: 388-392.
Sangtong, V., E.C. Mottl, M.J Long, M. Lee, and M. P. Scott. 2001. Serial extraction
of endosperm drillings (SEED) - A method for detecting transgenes and proteins in
single viable maize kernels. Plant Molecular Biology Reporter 19: 151-158.
Shewry, P.R., R. Casey. 1999. Seedproteins. Dordrecht: Kluwer Academic Pulishers.
Sun, S.X., , F.Y. Gao, X.J. Lu, X.J. Wu, X.D. Wang, G.J. Ren, and H. Luo. 2008.
Genetic analysis and gene fine mapping of aroma in rice (Oryza sativa L.
Cypereals, Poaceaẹ). Genetics andMolecular Biology, 31 (2): 532-538.
Singh, R.K., U.S. Singh, G.S. Khush, and R. Rohilla. 2000, Genetics and
biotechnology of quality traits in aromatic rice. Aromatic rice. 5: 47-69.
38
Singh, R.K., U.S. Singh, and G.S. Khush. 1998. Indian indigenous aromatic rices.
Indian Farming XX1: 1-6.
Singh, M.V., H.N. Tripathi, and H.P. Tripathi. 1997. Effect of nitrogen and planting
date on yield and quality of scented rice (Oryza sativa). Indian J. Agron. 42: 602-
606
Sood, B.G., and E.A. Siddiq. 1978. A rapiq technique for scent determination in rice.
Indian J. Genet. Plant Breed. 38: 268-271.
Susamma P. George, Dijee Bastian, N.V. Radhakrishan and K.C. Aipe. 2005.
Evaluation of aromatic rice varieties in Wayanad, Kerala. Journal o f Tropical
Agriculture 43 (1-2): 67-69.
Suwanarit, A., S. Kreetapirom, S. Buranakam, W. Varanyanond, P. Tungtrakul, S.

Somboonpong, S. Rattapat, S. Ratanasupa, P. Romyen, S. Wattanapryapkul, K.
Naklang, S. Rotjanakusal, and P. Pornurisnit. 1996. Effect of nitrogen fertilizer on
grain qualities of Khao Dawk Mali-105. Kasetsart J. Nat. Sci. 30: 458-474.
Suwanarit, A., S. Kreetapirom, S. Buranakam, P. Suriyapromchoi, W. Varanyanond,

and P. Tungtrakul. 1997a. Effect of sulphur fertilizer on grain qualities of Khao
Dawk Mali-105 rice. Kasetsart J. Nat. Sci. 31: 305-316.
Tanaka Y., S. Hayashida, and M. Hongo, 1975. The relationship of the feces protein
particles to rice protein bodies. Agric. Biol. Chem. 39: 515-518.
Tanaka Y., T. Sugimoto, W. Ogawa, and I. Kasai, 1980, Isolation and characterization
of protein bodies in the rice endosperm. Agric. Biol. Chem. 44: 1633-1639.
Tanchotikul, U., and T.C.Y. Hsieh. 1991. An improved method for quantiíícation of 2-
acetyl-1-pyrroline, a “popcorn”-like aroma, in aromatic rice by high-resolution gas
chromatography/mass spectrometry/selective ion monitoring. J. Agric. Food Chem.
39:944-947.
Usman, L. A, O.M Ameen, S.A Ibiyemi, and N.O Muhammad. 2005. The extraction
of proteins írom the neem seed (Indica azadirachta A. Juss). African Journal o f
Biotechnology 4 (10): 1142-1144.
39
Widjaja, R., J.D. Craske, and M. Wootton. (1996). Comparative studies on volatile
components of non-fragrant and fragrant rices. J. Sci. Food Agric. 70, 151-161.
Yajima, I., T. Yanai, M. Nakamura, H. Sakakibara, and T. Habu. 1978. Volatile flavor
components of cooked rice. Agric. Biol. Chem. 42: 122-123.
Yamagata, H., T. Sugimoto, K. Tanaka, Z. Kasai. 1982. Biosynthesisof storage

proteins in developing rice seeds. Plant Physiol 70: 1094-1100.
Yoshihashi, T. 2002. Quantitative analysis on 2-acetyl-1-pyrroline of an aromatic rice

by stable isotope dilution method and model studies on its formation during
cooking. JFS. 67 (2).
Yoshihashi, T., N.T.T. Huong, and N. Kabaki. 2004. Area dependency of 2-acetyl-
1pyrroline content in an aromatic rice variety, Khao Dawk Mali 105. JARQ 38(2):
105-109.
Zhu, X.Z, Y. Shimoni, H. Levanony, G. Segal, and G. Galili. 1995. Purification,

characterization, and intracellular localization of glycosylated protein disulfide
isomerase from wheat grains. Plant Physiol. 108 (1): 327-335.
Trang web
http://vneconomy.vn/20090511112747952P0C19/lua-thom-ma-van-thua.htm (ngày
25/4/2010)
www.molecularstation.com/images/protein-gel-electrophoresis.ipg (ngày
25/4/2010)
http://www.hcmbiotech.com.vn/technology detail.php?cateid=4&id=85 (ngày
26/4/2010)
www.molecularstation.com/images/protein-gel-electrophoresis.ipg (ngày
25/4/2010)
40
PHẦN PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1: HÌNH GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU
Hình 14: Hình gel điện di hai chiều của các giống lúa
PHỤ LỤC 2. XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
BRADFORD
1. Nguyên tắc
Phương pháp Bradford dựa trên sự liên kết giữa chất nhuộm Coomassie Brilliant
Blue G250 và protein. Trong môi trường mang tính acid trong dung dịch, khi chưa gắn
với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sóng hấp thụ cực đại 465 nm và
khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thụ
cực đại ở bước sóng 595 nm. Vì vậy lượng protein có thể được biết bằng cách xác định
lượng thuốc nhuộm ở dạng tích điện âm màu xanh dương khi đo độ hấp thụ của dung
dịch ở bước sóng 595 nm.
• Chuẩn bị thuốc thử Bradford
Hòa tan 100mg Coomassie Brilliant Blue G250 trong 50 ml ethanol 95%. Sau đó
cho thêm 100 ml acid phosphoric 85% khuấy đều. Bổ sung thêm nước cất cho đến 1L.
Sau đó lọc bằng giấy lọc Whatman No.1 và trữ trong chai tối ở nhiệt độ phòng. Có thể
giữ để sử dụng 2 tuần nhưng trong thời gian này chất màu có thể bị tủa nên khi sử
dụng cần phải lọc lại.
• Dung dịch protein chuẩn nồng độ 3mg/ml
- Cân 3mg BSA, hòa tan trong 1 ml nước cất, bảo quản ở -200C.
- Xây dựng đường chuẩn BSA
- Chuẩn bị dãy protein BSA chuẩn với nồng độ tăng dần từ 0, 30, 60, 120,
180, 240, 300 g/ml. Thí nghiệm lặp lại 3 lần.
Chuẩn bị các ống nghiệm và thêm vào các chất theo Bảng sau:
Bảng 4: Dựng đường chuân BSA
Ống 1 2 3 4 5 6 7
[BSA](|ig/ml) 0 30 60 120 180 240 300
Vb s a (Pl) 0 1 2 4 6 8 10
Vdd đệm (pl) 100 99 98 96 94 92 90
V thuốc thử Bradford (ml) 2 2 2 2 2 2 2
Lắc đều các ống bằng máy vortex, tránh để có bọt. Sau 10 phút tiến hành đo OD.
Chuẩn máy đo quang phổ với dung dịch chỉ chứa dung dịch đệm (ống 1) ở bước
sóng 595nm. Chỉnh về giá trị 0, Tiến hành đo các ống còn lại.
Mẫu protein cũng được tiến hành đo đồng thời với việc dựng đường chuẩn, mẫu
pha loãng ở các mức: không pha loãng, pha loãng 2, 5, 10 lần (đo lặp lại 2 lần). Cũng
lấy 100pl và cho vào 2ml dung dịch thuốc thử Bradford.
Ghi nhận kết quả, lấy giá trị trung bình .
Từ phương trình đường chuẩn ta suy ra được hàm lượng protein trong mẫu.
PHỤ LỤC 3. ĐIỆN DI SDS
1. Nguyên tắc
Kỹ thuật điện di dựa trên nguyên tắc trong một điện trường các phân tử tích điện
âm sẽ di chuyển về cực dương của điện trường và ngược lại. Tốc độ di chuyển của các
phân tử này tùy thuộc vào kích thước, Hình dạng, điện tích, và lực điện trường.
2. Tiến hành
Chuẩn bị hoá chất
• Dung dịch Acrylamide 30%
Dung dịch đệm

1,5 M Tris-HCl, pH=8,8
- 1.0 M Tris-HCl, pH=6,8
• Amonium persulphat (APS) 10%.
• SDS 10% (Sodium dodecyl sulfat)
• Dung dịch Tetramethyl-ethylenediamine (TEMED)
• 1 lít dung dịch chạy điện di có chứa:
- 3g Tris
- 14,4g Glycerin
- 1g SDS
• 100ml dung dịch nhuộm gel:
- 0,1 g Coomassie R-250
- 50 ml methanol
- 40 ml nước cất
- 10 ml acid acetic 100%
• 1 lít dung dịch rửa gel:
- 100 ml methanol
- 70 ml acid acetic 100%
- 830 ml nước cất
Các bước chạy điện di
1. Chuẩn bị mẫu
- Mẫu có nồng độ protein 1mg/ml, pha theo tỷ lệ 1:1. Cho vào ống eppendorf
20pl mẫu protein và 20 |il dung dịch đệm pha mẫu (Glycine sample buffer).
- Lắc đều và đun cách thủy ở 950C, 5 phút. Để nguội.
3. Chuẩn bị hộp điện di
Khuôn kính để đổ gel, lược cài và hộp điện di phải được rửa sạch và lau khô bằng
cồn. Sau đó ráp thành khuôn để chuẩn bị đổ gel.
3. Chuẩn bị gelphân tích polyarcrylamide 10 %
Chuẩn bị gel có tổng thể tích: 10ml/ 2 gel
- Nước cất: 4,0 ml (4000 |il)
- Dung dịch Acrylamide 30%: 3,3 ml (3300 |il)
- 1,5M Tris-HCl (pH=8,8): 2,5 ml (2500 |il)
- SDS 10%: 0,1 ml (100 |il)
- APS: 0,1 ml (100 |il)
- TEMED: 0,004ml (4|il)
Dung dịch được trộn lẫn bằng máy khuấy từ. Sau đó cho 4 pl TEMED vào dung
dịch, khuấy đều và nhanh chóng dùng pipette 1000 pl cho vào khung kính đổ gel. Gel
sẽ được bơm đến vạch cách lượt là 0,5 cm. Chú ý không bơm quá nhanh sẽ tạo bọt
trong gel.
Cẩn thận bơm tiếp một lớp nước cất lên trên bề mặt gel để tạo cho bề mặt
phẳng. Gel sẽ đông lại sau 20-30 phút.
4. Đổ gel tập trung
Gel tập trung có thành phần như sau:
- Nước cất: 2,7 ml (2700pl)
- Acrylamide 30%: 0,67 ml (670pl)
- 1,0M Tris-HCl pH 6,8: 0,5 ml (500|il)
SDS 10%: 0,04 ml (40|il)

APS 10%: 0,04 ml (40|il)
- TEMED: 0,004ml (4|il)
Khuấy đều dung dịch trên máy khuấy từ. Trước khi đổ gel tập trung phải đổ bỏ
phần nước phía trên gel phân tích bằng cách nghiên và dùng giấy thấm.
Tương tự gel phân tích, sau khi cho 4pl TEMED vào, dung dịch phải được đưa
nhanh vào khung đổ gel. Dùng giấy thấm để loại hết nước trên bề mặt gel phân tích.
Cho gel tập trung vào, đưa lược vào lớp gel. Chú ý, lược được đưa vào cẩn thận để
tránh tạo lớp bọt dưới phía chân lược. Gel tập trung sẽ đông tụ lại khoảng sau 20 phút.
Đánh dấu lại các vị trí lỗ giếng.
5. Đưa mẫu vào các giếng
- Sau khi gel tập trung đông, lắp bộ khung đổ gel vào khung chạy điện di.
- Đổ đầy dung dịch chạy điện di vào phía bên dưới và bên trên bộ chạy điện di.
- Cẩn thận lấy lược ra và cho mẫu vào các giếng.
- Đưa 10 pl mẫu vào các lỗ giếng. Chú ý không để mẫu tràn qua các giếng bên
cạnh.
- Ghi chép lại vị trí các mẫu đưa vào giếng.
6. Chạy điện di
Sau khi hoàn tất việc đưa mẫu vào, đậy nắp hộp điện di lại và cho dòng điện đi
qua.
Dòng điện chạy điện di là 25mA/40V.
Thông thường, thời gian để chạy điện di vào khoảng 2-3 giờ. Ta có thể quan sát
quá trình dịch chuyển của protein nhờ vào dãy băng màu xanh của Bromophenol Blue
R-250,
7. Nhuộm gel
Gel được lấy ra khỏi hộp gel cẩn thận và cho vào dung dịch nhuộm đã pha. Để làm
nhanh quá trình nhuộm màu, hệ thống sẽ được đặt trên máy lắc. Thông thường, thời
gian nhuộm trong vòng 1giờ.
8. Tẩy màu
Tẩy gel bằng dung dịch tẩy. Ngâm gel trong dung dịch tẩy và đặt trên máy lắc từ
2-3 giờ. Kết thúc quá trình tẩy gel khi nhận thấy gel đã sạch lớp màu nền và các băng
protein hiện rõ trên gel.
Ngoài ra gel cũng có thể được tấy sạch lớp màu nền bằng cách cho gel vào trong
nước cất và đun trong lò vi sóng trong thời gian 15 phút.
9. Sấy gel
Để giữ gel được lâu, người ta có thể sấy gel. Gel được sấy bằng thiết bị sấy hút
chân không ở nhiệt độ 550C, thời gian khoảng 4 giờ.
Scan phổ diện điện di bằng phần mềm Quantity One.
PHỤ LỤC 4. ĐIỆN DI CHIỀU THỨ NHẤT IEF (ISOELECTRIC FOCUSING)
• Đưa thanh điện di IEF (IPG Strip) có gradient pH từ 3 - 10 về nhiệt độ phòng.
• Hút 125pl (~100pg protein) mẫu protein đã tách chiết cho vào các rãnh của
khay điện di cách hai đầu rãnh 1cm, tránh để bọt khí.
• Dùng kẹp tách cẩn thận lớp nhựa plastic bao thanh IPG từ đầu có ghi pH 3 - 10,
Hình 15: Các bước tiến hành điện di chiều thứ nhất
• Nhẹ nhàng đặt thanh IPG Strip lên dung dịch protein. Dấu “+” và “pH 3 - 10”
nằm về phía tên trái của khay. Tránh không để mẫu dính lên bề mặt lớp nhựa
của thanh IPG Strip vì như thế mẫu sẽ không hấp thụ lên gel. Chắc chắn rằng
không có bọt khí nằm dưới Strip. Nếu có, cẩn thận dùng kẹp nhấc Strip lên
xuống 1 - 2 lần cho bọt khí ra khỏi Strip.
• Phủ lên thanh IPG Strip dầu khoáng nhằm ngăn chặn sự bay hơi trong quá trình
điện di. Thêm dầu khoáng chầm chậm bằng cách di chuyển pipet dọc theo chiều
dài của Strip.
Chú ý: Hyrat hóa IPG Strip là bước quan trọng trong quá trình chạy điện di 2D.
Nếu mẫu phân bố không đều theo Strip, cẩn thận giữ một đầu Strip b
nhàng đặt đầu còn lại dọc theo khe trên khay.
• Chương trình của PROTEAN IEF sử dụng thích hợp đối với tất cả chiều dài thanh
IPG Strip, sử dụng nhiệt độ mặc định 200C , với cường độ tối đa 50pA/Strip.
- Chọn New Method ở màn hình đầu tiên bằng cách nhấn phím màu xanh.
- Ở màn hình kế tiếp, nhấn vào Name. Đặt tên bằng những phím ký tự.
- Ở màn hình Rehydration, nhấn vào phím để chuyển sang màn hình có chữ
Yes.
- Dòng Focus Temp sẽ hiện nhiệt độ mặc định là 200C.
- Nhấn phím Next để chuyển sang màn hình kế tiếp.
- Ở màn hình kế tiếp, chọn Rehydration Step và Passive.
- Ở dòng Enter Temp nhiệt độ mặc định là 200C và không cần thay đổi.
- Dòng Enter Time sẽ mặc định là 12 giờ và không cần thay đổi.
- Ở dòng The Insert pause after Rehydration, chọn No.
- Nhập vào những tham số bằng cách nhấn những phím dưới đây. Cài đặt
chương trình chạy ở 200C như sau:
Bảng 5: Giá trị dòng điện và thời gian
Bước H iệ u đ iệ n th ế T h ờ i g ia n V o lt-H o u r s V o lta g e S to p e
(V ) (p h ú t)
1 250 20 L inear
2 4000 2 L inear
3 4000 8000 R apid
4 1000 8000 R apid
> Nhấn nút Start để bắt đầu.
Điện thế cuối cùng cho mỗi dãy pH có thể không đạt tới, nhưng tổng volt hours
ghi ở trên cũng đủ để cho mẫu tập trung với điện thế thấp cỡ 3000V.
Sau khi điện di xong, lấy các Strip và loại bỏ dầu khoáng như trên, sau đó đặt các
Strip vào khay sạch mặt gel quay lên trên (giữ nguyên vị trí mẫu). Nếu chưa điện di
SDS-PAGE, các Strip nên được bao phủ bởi plastic và giữ ở -70 0C.
PHỤ LỤC 5. ĐIỆN DI CHIỀU THỨ HAI SDS-PAGE CHO 2D
1. Chuẩn bị gel
Đổ gel phân tích 10% acrylamide để chạy điện di SDS-PAGE cho điện di hai chiều
thì không cần gel tập trung.
2. Cân bằng thanh IPG Strip
Đặt miếng giấy lọc lên mặt phẳng khô và sạch, làm ẩm 1miếng giấy lọc bằng nước
cất 2 lần, đặt thanh IPF Strip lên miếng giấy lọc khô (bề có lớp nhựa úp xuống dưới)
và úp miếng giấy lọc khô lên, quá trình này nhằm loại bỏ dầu khoáng còn dư. Cân
bằng thanh IPG Strip trong dung dịch I và II.
3. Loading gel
• Làm tan agarose trong microwave khoảng 25-30 giây chuẩn bị load gel.
• Đặt Strip lên mặt của phiến kính điện di lớn và bề mặt Strip hướng lên (hay về
phía phiến kính nhỏ).
Dùng pipet cho lên trên của bản gel.
• Đưa Strip vào bên trong phần của lược IPG sát với bề mặt gel (bước này có thể
làm trước khi cho).
• Để thẳng đứng cho agarose đông.
• Đặt vào hộp điện di đứng.
4. Tiến hành điện di
• Cho dung dịch đệm điện di 1x Tris/glycine/SDS và bắt đầu điện di. Sự di
chuyển của Bromophenol Blue, hiện diện trong gel agarose, được dùng để chỉ
thị quá trình điện di.
• Điều kiện điện di: 100V, thời gian chạy khoảng 90 phút.
5. Nhuộm gel bằng BioSafe Coomassie Blue
• Cho nước cất tinh khiết vào khay nhuộm (150 - 200ml cho mỗi gel riêng biệt)
• Mở gel đã điện di cho vào khay nước
• Rửa bằng nước 3 lần, mỗi lần 5 phút
• Đổ vừa đủ thuốc nhuộc BioSafe Coomassie Blue ngập gel
• Lắc khoảng 1 giờ, gel có thể nhuộm qua đêm nếu cần.
6. Rửa gel
Bỏ dung dịch nhuộm và rửa gel bằng dung dịch tẩy (acide acetic:metanol:nước) 2
lần.
Ngoài ra gel cũng có thể được tấy sạch lớp màu nền bằng cách cho gel vào trong
nước cất và đun trong lò vi sóng trong thời gian 15 phút
Scan gel (sử dụng thiết bị Scan Gel-Doc Bio-Rad) và dùng phần mềm PDQuest để
phân tích kết quả.
PHỤ LỤC 6. PHƯƠNG PHÁP TÍNH TRỌNG LƯỢNG PHÂN TỬ TRÊN
GEL SDS
Bảng 6: Số liệu vẽ đường logM của protein chuẩn
R p (cm ) R B (cm ) Rf M (k D a ) lo g M
1,5 9,5 0,16 116 2,065
2,5 9,5 0,263 66,2 1,821
4,45 9,5 0,468 45 1,653
5,3 9,5 0,558 35,5 1,550
7,1 9,5 0,747 25 1,398
8,65 9,5 0,911 18,4 1,265
9,5 9,5 1 14,4 1,158
Trong đó:
Rp: Khoảng cách từ gel phân tích đến các protein chuẩn.
RB: Khoảng cách từ gel phân tích đến protein chuẩn cuối cùng.
Rf = Rp/RB
M: Trọng lượng phân tử của protein chuẩn
Hình 16: Đồ thị biếu diễn logM của protein chuẩn
Từ phương trình đường chuẩn y= -0,986x + 2,124 có thể tính được logM của
protein cần xác định.
PHỤ LỤC 7: MA TRẬN NHỊ PHÂN THÔNG QUA 2-DE
Peak MTL495 MTL513 MTL578 MTL579 MTL549

SSP 0001 1 1 1 1 1
SSP 0102 1 1 1 1 1
SSP 0301 0 1 1 1 1
SSP 0302 1 1 1 1 1
SSP 0401 1 1 1 1 1
SSP 0402 1 1 1 1 1
SSP 0403 1 1 1 1 1
SSP 0404 1 0 1 1 1
SSP 0501 1 1 1 1 1
SSP 0801 1 1 0 1 1
SSP 0903 1 0 1 1 1
SSP 0904 1 0 1 1 1
SSP 0905 1 0 1 1 1
SSP 0906 1 1 1 0 1
SSP 0907 1 0 0 0 1
SSP 0909 0 0 0 0 1
SSP 0912 0 0 1 1 1
SSP 0913 0 0 0 0 1
SSP 1001 1 1 0 1 0
SSP 1101 1 0 1 1 1
SSP 1201 0 1 1 1 1
SSP 1204 1 1 0 0 0
SSP 1606 1 1 1 1 1
SSP 1607 0 0 1 1 1
SSP 1703 1 0 0 0 0
SSP 1704 1 0 1 1 1
SSP 1804 1 0 1 1 1
SSP 1901 1 1 0 1 1
SSP 1902 1 0 0 1 0
SSP 2201 1 1 1 1 1
SSP 2501 1 1 1 1 1
SSP 2502 1 0 0 1 0
SSP 2503 0 0 0 1 0
SSP 2704 0 1 0 0 0
SSP 2801 0 0 1 0 1
SSP 2802 0 0 0 1 0
SSP 2907 1 1 1 1 1
SSP 2908 1 1 1 1 1
SSP 2910 1 0 1 1 1
SSP 2911 1 0 1 1 1
SSP 2912 1 1 1 1 1
SSP 3002 0 0 1 0 0
SSP 3003 0 0 1 0 0
SSP 3201 1 0 1 1 1
SSP 3401 1 1 1 1 1
SSP 3604 1 1 0 1 0
SSP 3607 1 0 0 0 1
SSP 3608 0 0 0 0 1
SSP 3701 0 0 1 0 1
SSP 3901 1 0 1 1 1
SSP 3903 1 1 1 1 1
SSP 3904 0 0 1 0 1
SSP 4001 0 0 1 0 0
SSP 4601 0 1 1 1 1
SSP 4901 1 1 1 1 1
SSP 4903 1 0 1 1 1
SSP 4904 1 0 1 0 0
SSP 4905 0 0 1 1 1
SSP 4906 1 1 1 1 1
SSP 4907 1 0 0 1 1
SSP 5902 0 0 1 1 1
SSP 6201 1 1 1 1 1
SSP 6203 0 0 0 0 1
SSP 6401 1 1 1 1 1
SSP 6602 1 1 1 1 1
SSP 6701 0 1 0 0 0
SSP 6704 1 0 1 1 1
SSP 6902 1 1 1 1 1
SSP 6903 1 0 0 1 0
SSP 6904 0 0 0 1 1
SSP 6906 1 0 1 1 1
SSP 7201 1 1 1 1 1
SSP 7402 0 1 0 0 1
SSP 7503 1 1 1 1 1
SSP 7504 1 1 0 0 0
SSP 7702 0 0 1 0 0
SSP 7901 0 0 1 1 1
SSP 8001 1 0 1 1 0
SSP 8301 1 0 0 0 0
SSP 8402 1 1 1 1 1
SSP 8404 1 0 1 1 1
SSP 8406 1 0 0 1 0
SSP 8408 1 1 0 0 0
SSP 8501 1 0 1 1 1
SSP 8601 0 1 0 0 0
SSP 9102 1 0 1 1 1
SSP 9201 1 1 0 0 0
SSP 9301 1 0 0 0 0
SSP 9403 1 0 0 0 0
SSP 9501 1 1 0 0 0
SSP 9503 1 1 1 1 1
SSP 9504 0 1 0 0 0
SSP 9901 1 1 1 1 1
SSP 9902 1 1 1 1 1
SSP 9903 1 1 1 1 1
SSP 9904 1 1 1 1 1
SSP 9905 1 1 1 1 1
SSP 9907 1 1 1 1 1
SSP 9908 1 1 1 1 0
SSP 9909 1 1 0 0 1
SSP 9915 1 1 1 1 1
SSP 9916 1 1 1 1 1
SSP 9917 1 1 1 1 1
SSP 9919 1 1 1 0 1
SSP 9921 1 0 0 0 0
SSP 9924 1 1 1 1 1
SSP 9925 1 1 1 1 1
SSP 9926 1 1 1 1 1
SSP 9927 1 1 1 1 1
SSP 9930 1 1 1 1 1
SSP 9931 1 0 1 1 1
SSP 9932 1 0 1 1 1
SSP 9933 1 1 1 1 1
SSP 9937 1 0 0 0 0
PHỤ LỤC 8: SO SÁNH ĐỘ KHÁC BIỆT GIỮA CÁC GIÓNG LÚA THƠM
Ở ĐIỆN DI HAI CHIỀU
Bảng 7: So sánh độ khác biệt giữa các giống lúa thơm ở điện di hai chiều
M T L 495 M T L 513 M T L 549 M T L 578 M T L 579
M T L 495 1,00
M T L 513 0,63 1,00
M T L 549 0,68 0,59 1,00
M T L 578 0,67 0,58 0,83 1,00
M T L 579 0,75 0,6 0,8 0,81 1,00

Luan Van Tot Nghiep Dien Di PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Luan Van Tot Nghiep Dien Di PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHẢO SÁT SỰ BIỂU HIỆN HỆ PROTEIN CỦA MỘT SỐ

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

TS. TRẦN NHÂN DŨNG NHÂM THỊ THU THỦY

LỚP: CNSH TIÊN TIÉN K32

Cần Thơ, tháng 11/2010

. CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN

Trần Nhân Dũng Nhâm Thị Thu Thủy

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN

Cần Thơ, ngày tháng 11 năm 2010

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

TS. TRƯƠNG TRỌNG NGÔN

KÍ TÊN HỘI ĐỒNG

DANH SÁCH HÌNH.................................................................................................vi

CÁC TỪ VIÉT TẮT.................................................................................................vii

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU..................................................................................... 1

1. Các giống lúa thơm trên thế giới................................................................. 2

3.1. Protein dự trữ trong hạt...............................................................................3

4. Mùi thơm trên cây lúa..................................................................................6

6.2. Những nghiên cứu cơ bản về lúa thơm ở Việt Nam................................... 10

II. KĨ THUẬT ĐIỆN HAI CHIỀU TRONG PHÂN TÍCH PROTEIN.......11

1. Điện di một chiều (SDS-PAGE)..................................................................... 11

CHƯƠNG III: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU............. 15

I. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU...............................................15

II. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...................................................................15

III. PHƯƠNG PHÁP.............................................................................................. 17

2. Tiến hành thí nghiệm.................................................................................... 17

2.3. Thí nghiệm 3: Điện di hai chiều (2-DE).................................................... 19

CHƯƠNG IV: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN....................................................... 21

3. Điện di hai chiều.............................................................................................. 25

TÀI LIỆU THAM KHẢO........................................................................................34

PHẦN PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Hình gel của điện di hai chiều

Phụ lục 7: Ma trận nhị phân thông qua 2-DE

Bảng Tên Bảng Trang

[ình Tên Hình

1 Nguyên lí điện di SDS 13

2 Nguyên lí của điện di hai chiều 14

3 Sơ đồ bố trí các bước tiến hành thí nghiệm 17

4 Quy trình trích ly protein từ hạt lúa 17

6 Phổ điện di SDS của các giống lúa 23

7 So sánh giữa đối chứng âm và lúa thơm 25

8 So sánh giữa giống lúa MTL513 và đối chứng âm 26

9 So sánh giữa giống lúa MTL495 và đối chứng âm 27

10 So sánh giữa giống lúa MTL578 và đối chứng âm 28

11 So sánh giữa giống lúa MTL579 và đối chứng âm 29

12 So sánh giữa giống lúa MTL549 và đối chứng âm 30

KDM Khao Dawk Mali

kDa Kilo Dalton

RNA Ribonucleic Acid

INSP Internal Non-fragrant Sense Primer

SSR Simple Sequence Repeat

PCR Polymerase Chain Reaction

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulphate - Polyacrylamide Gel Electrophoresis

CHƯƠNG I: GIỚI THIỆU

CHƯƠNG II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

I. SƠ LƯỢC VỀ CÁC GIÓNG LÚA THƠM HIỆN NAY

2. Các giống lúa thơm trong nước

3. Protein dự trữ trong hạt lúa