UNIVERZITET U BEOGRADU

TEHNOLOŠKO-METALURŠKI FAKULTET

ZAVRŠNI MASTER RAD

IMOBILIZACIJA CELULAZA NA
POLIMETAKRILATNE NOSAČE

Nataša Kneţević

Beograd, jun 2018.

DATUM ODBRANE:__________________________

OCENA RADA:______________________________

OCENA ODBRANE:__________________________

SREDNJA OCENA:___________________________

MENTOR:

Dr Dejan Bezbradica, van. prof.

ČLANOVI KOMISIJE:

KANDIDAT:

_______________________________ __________________

Dr Suzana Dimitrijević, red. prof. Nataša Knežević

________________________________

Dr Maja Vukašinović-Sekulić, van. prof.

1
Zahvalnica

Srdačno zahvaljujem svom mentoru i izvanrednom profesoru dr Dejanu Bezbradici koji mi je

svojim stručnim znanjem i značajnim sugestijama pomogao pri realizaciju ovog rada, kao i na
pruženoj prilici za detaljno usavršavanje i primenu znanja stečenog na master studijama.

Posebnu zahvalnost dugujem dr Mariji Ćorović, dr Ani Milisavljević i dr Milici Carević,

naučnim saradnicima Tehnološko-metalurškog fakulteta Univerziteta u Beogradu, na
nesebičnom trudu i pruženoj pomoći u planiranju i organizaciji eksperimentalnog rada,
kvantifikaciji i diskusiji eksperimentalnih rezultata.

2
 SADRŢAJ

1. UVOD..........................................................................................................................................7
2. TEORIJSKI DEO.........................................................................................................................8
2.1. CELULAZE.........................................................................................................................8
2.1.1. Celuloza........................................................................................................................9
2.1.2. Vrste celulaza i njihove karakteristike........................................................................11
2.1.3.Primena celulaza..........................................................................................................14
2.2. IMOBILIZACIJA ENZIMA..............................................................................................18
2.2.1.Pojam imobilizacija enzima........................................................................................18
2.2.2. Osobine imobilisanih enzima.....................................................................................19
2.2.3.Metode imobilizacije enzima......................................................................................21
2.2.4.Podela metoda imobilizacije enzima...........................................................................22
2.2.4.1. Kovalentna imobilizacija enzima.......................................................................24
2.2.4.1.1. Prednosti i nedostaci kovalentne imobilizacije enzima..............................26
2.2.4.2.Adsorpcija enzima na čvrste nosače....................................................................27
2.2.5. Izbor nosača................................................................................................................28
2.2.6. Imobilizacija celulaza.................................................................................................29
2.3. LIGNOCELULOZNA BIOMASA....................................................................................30
2.3.1.Suncokretova sačma....................................................................................................32
3. EKSPERIMENTALNI DEO.....................................................................................................36
3.1. MATERIJAL, UREĐAJI I PRIBOR..................................................................................36
3.2. METODE...........................................................................................................................37
3.2.1. Imobilizacija celulaze.................................................................................................37
3.2.2. DNS metoda...............................................................................................................38
3.2.3. Bradfordova metoda...................................................................................................39
3.2.4. OdreĎivanje aktivnosti imobilisanog enzima.............................................................41
3.2.5. Hidroliza lignocelulozne frakcije suncokretove sačme..............................................41
3.2.6. HPLC analiza..............................................................................................................42

3
4. REZULTATI EKSPERIMENTA I DISKUSIJA........................................................................43
4.1. Izbor optimalnog nosača za imobilizaciju enzima........................................................43
4.2. Optimizacija uslova imobilizacije celulaze na LifetechTM ECR8409F nosač...............45
4.2.1. OdreĎivanje optimalnog pH imobilizacije.............................................................45
4.2.2. Uticaj početne koncentracije proteina...................................................................46
4.2.3. Uticaj vremena imobilizacije.................................................................................49
4.3.Primena imobilisane celulaze u hidrolizi LF suncokretove sačme................................50
5. ZAKLJUČAK............................................................................................................................53
6. LITERATURA..........................................................................................................................54

4
 SAŢETAK
Celulaze su vrlo značajna grupa industrijskih enzima koja se primenjuje u industriji hrane,
tekstilnoj industriji, proizvodnji papira i deterdženata. U novije vreme mnogobrojna istraživanja
su fokusirana na izolovanje novih celulaza iz mikrobnih producenata i optimizaciju njihove
primene u razgradnji lignocelulozne frakcije biljne biomase, koja je od velikog značaja u
proizvodnji biogoriva. Posle tretmana ovih sirovina celulazama povećava se njihova svarljivost i
fermentabilnost što ih čini pogodnijim za primenu u proizvodnji hrane za životinje.

U ovom radu ispitana je imobilizacija celulaze iz Aspergillus niger na novu seriju

biokompatibilnih polimetakrilatnih nosača za primenu u prehrambenoj i farmaceutskoj industriji.
Primenjeni su nosači sa različitim funkcionalnim grupama i različitim dužinama akrilnih lanaca
koji ih povezuju sa površinom nosača. Najefikasnija imobilizacija celulaze se postigla primenom
umereno poroznog nosača sa amino-grupama - LifetechTM ECR8409F . Nakon izbora nosača,
optimizovani su uslovi imobilizacije. UtvrĎeno je da se pri pH 6 i početnoj koncentraciji proteina
od 23,3 mg/g nosača i 28 mg/g nosača dobija imobilisani enzimski preparat najveće aktivnosti
(400 IU/g nosača i 450 IU/g nosača). Imobilisana i slobodna celulaza primenjene su na hidrolizu
lignocelulozne frakcije suncokretove sačme pri čemu su hidrolizati analizirani tečnom
hromatografijom visokih performansi sa kolonom za razdvajanje sećera. Detektovane su niže
koncentracije redukujućih šećera u reakciji sa imobilisanim enzimom.

5
 ABSTRACT
Cellulases are a very important group of industrial enzymes used in the food industry, the textile
industry, the production of paper and detergents. Recently, numerous studies are focused on
isolating new cellulases from microbial producers and optimizing their usage in the degradation
of the lignocellulosic fraction of plant biomass, which is of great importance in the production of
biofuels. After treating these raw materials with cellulases, their digestibility and fermentability
increases, and this is making them more suitable for use in the production of animal feed.

In this study was reviewed the immobilization of cellulase from Aspergillus niger on a new
series of biocompatible polymethacrylate carriers for usage in the food and pharmaceutical
industries. Carriers with different functional groups and different lengths of acrylic chains which
connect them to the surface of the carriers have been applied. The most effective immobilisation
of cellulase was achieved by using a moderately porous carrier with amino groups - LifetechTM
ECR8409F. After selection of the carrier, the conditions for immobilization have been optimized.
It was found that the immobilized enzyme preparation of the largest activity (400 IU/g carriers
and 450 IU/g carriers) was obtained at pH 6 and the initial protein concentration of 23.3 mg/g of
carrier and 28 mg/g of carrier. Immobilized and free cellulose were applied to the hydrolysis of
the lignocellulosic fraction of sunflower meal, where the hydrolysates were analyzed by high
performance liquid chromatography with the separation column of the sugar. Lower
concentrations of reducing sugars in the reaction with immobilized enzyme were detected.

6
 1. UVOD

Enzimi su biohemijski katalizatori, najčešče proteini velike molekulske mase (15 000 < M <
nekoliko miliona Da), koji ubrzavaju hemijsku reakciju pri čemu sami ne trpe bilo kakve
promene. To su katalizatori sa velikim potencijalom za industriju jer imaju specifična katalitička
svojstva, lako se proizvode i ekološki su prihvatljivi.1 Predstavljaju izvanredne molekule za
upotrebu u bioprocesnoj tehnologiji. MeĎutim, za odreĎene biokatalitičke procese, prirodni
enzimi ne zadovoljavaju zahteve za primenu velikih razmera, pa zbog toga njihova prirodna
svojstva moraju biti modifikovana. Drugo razmatranje je da trenutni globalni zahtevi
biotehnološke industrije zahtevaju povećanje produktivnosti procesa i smanjenje troškova.
Imobilisani enzimi omogućavaju veću stabilnost, osetljivost i katalitičku aktivnost nego slobodni
enzimi, pored olakšanog procesa prečišćavanja i mogućnosti za višekratno korišćenje enzima.
MeĎu različitim grupama enzima, celulaze su važne jer imaju širok spektar primene u različitim
industrijama, kao što su industrija hrane, tekstila i biogoriva. TakoĎe, celuloza je
najrasprostranjeniji polisaharid u biljnom svetu. 2 Celulaze imaju jedinstveni potencijal za
biotehnološke konverzije tako da pružaju mogućnosti za razvoj novih bioprocesa i proizvoda.

Višedecenijsko istraživanje u oblasti imobilizacije enzima pokazalo da je efikasnost imobilizacije

rezultat složene interakcije uticaja površine nosača za imobilizaciju, funkcionalnih grupa na
površini nosača, uslova imobilizacije i strukture enzima. Pošto se industrijski enzimi značajno
razlikuju prema raspodeli funkcionalnih grupa na površini, izbor optimalnog nosača za
imobilizaciju enzima nikako ne može biti opštevažeći, već je vrlo specifičan proces koji se
optimizuje za svaki pojedinačni enzim. Industrijska primena slobodnih celulaza je ograničena jer
su relativno nestabilne i ne mogu se efikasno koristiti u više rekcionih ciklusa, imaju nisku
specifičnu aktivnost, kao i dodatne troškove.3 Osnovni cilj ovog rada je da se izborom
adekvatnog nosača i uslova imobilizacije dobije imobilisani enzimski preparat koji će imati
zadovoljavajuću katalitičku aktivnost, operativnu i termičku stabilnost. Vredan industrijski enzim
- celulaza iz Aspergillus niger biće imobilisan na polimerne čvrste nosače iz Lifetech serije i
primenjen u reakciji hidrolize lignocelulozne frakcije suncokretove sačme, kao važnog
potencijalnog obnovljivog izvora energije.

7
 2. TEORIJSKI DEO

Enzimi imaju sposobnost da katalizuju kompleksne hemijske reakcije sa velikim stepenom

specifičnosti prema supstratu i malim prinosom nus-produkata što je doprinelo njihovoj širokoj
primeni u hemijskoj industriji, i to pre svega u proizvodnji finih hemikalija (hemijska i
farmaceutska industrija), prehrambenoj industriji kao i u analitici. 4 MeĎutim, iako imaju izvrsne
katalitičke osobine oni poseduju i osobine koje ograničavaju njihovu široku primenu u
industrijskim procesima kao što su nestabilnost, slaba rastvorljivost, mogućnost da doĎe do
inhibicije supstratom ili proizvodima, a njihova primena ponekad zahteva fiziološke uslove
tokom industrijskog procesa kao i prisustvo prirodnih supstrata čime je sužen izbor postupaka u
kojima mogu biti primenjeni.5 Tako u većini slučajeva, kako bi se omogućila njihova šira
primena na industrijskom nivou, najpre njihove mehaničke i fizičke osobine moraju biti
poboljšane.

2.1.CELULAZE

Celulaze (EC 3.2.1.) predstavljaju grupu enzima koje katalizuju hidrolizu β-1,4-glikozidne veze
u molekulu celuloze. Spadaju u grupu glikozidnih hidrolaza. Poznato je da se biljna biomasa
sastoji uglavnom od tri biopolimera i to celulaze, hemicelulaze (25-35 %), lignina (15-20 %) i
znatno manje pektinskih materija.

Potencijalne primene celulaza i uopšte lignoceluloznog kompleksa u industriji su enormne. Za

sada se primenjuju u svega nekoliko industrija poput industrije deterdženata, prehrambene,
tekstilne, papirne industrije, ali i u poljoprivredi. Ipak, od najvećeg značaja je primena celulaza u
procesima hidrolize biljne biomase, pri čemu nastaje glukoza koja u tom obliku može biti za
ljudsku i životinjsku upotrebu, ali i repromaterijal, odnosno polazna sirovina za proizvodnju
biogoriva, etanola, aminokiselina, organskih kiselina, butanola, metanola, i drugih proizvoda.

Komercijalne celulaze se u najvećem broju slučajeva proizvode iz plesni Humicola insolens i

Trichoderma reesei i nekih sojeva Bacillus. Ovi proizvodni sojevi za sad ne produkuju dovoljne
količine enzima koje mogu zadovoljiti industrijske potrebe. TakoĎe, specifičnost celulaza je
veoma mala. Problem prinosa enzima je rešen korišćenjem odreĎenih mutiranih sojeva za
proizvodnju celulaza, ali ne i problem male specifičnosti.

Karakteristično za celulaze je inhibicija enzima proizvodima hidrolize. Produkti-inhibitori su

celobioza i drugi celo-oligosaharidi.3

8
2.1.1. Celuloza

Celuloza je nerazgranati, linearni prirodni polimer D-glukoze velike molekulske mase, koji se
nalazi u svim biljkama. Oko 50 % drveta i 90 % biljnih vlakana izgraĎeno je od ovog
polisaharida. Glukozni ostaci, kojih u prosečnom molekulu celuloze može biti i 25 000, su
meĎusobno povezani β-1,4-glikozidnim vezama (slika 1.). Dimeri glukoze čine celobiozu (slika
2.), čiji se ostaci u molekulu celuloze javljaju kao osnovni elementi koji se ponavljaju. Ipak,
potpunom hidrolizom celuloze se dobija D-glukoza:

(C6H10O5)n +nH2O → nC6H12O6

Slika 1: Struktura celuloze

Slika 2: Struktura celobioze

9
Molekuli celuloze, iako su linearni, imaju vlaknastu strukturu (slika 3.) koja je posledica
prostornog rasporeda polimernog lanca i vodoničnih intra- i intermolekulskih veza.
Intramolekulske vodonične veze se obrazuju izmeĎu -OH grupa glukoznih ostataka jednog lanca,
pri čemu se formiraju spiralne strukture, dok su intermolekulske vodonične veze formirane
izmeĎu -OH grupa glukoznih ostataka susednih polisaharidnih lanaca. Efikasno pakovanje
pravilno izgraĎenih spiralnih nizova molekula doprinosi stvaranju karakteristične pravilne
kristalne strukture celuloze, koja je nerastvorna u vodi i veoma rezistentna na dejstvo hemikalija
i enzima.

Slika 3: Prostorni aranžmani polisaharidnih nizova celuloze

Mikrovlakna (mikrofibrili) celuloze izgraĎena su od 15-45 polimernih lanaca, dok grupa ovih
mikrovlakana čini makrovlakno (makrofibril), odnosno celulozno vlakno. U prirodnom stanju
celuloza postoji u parakristalnoj formi, u kojoj se smenjuju kristalna i amorfna područja.Upravo
zbog ovih amorfnih područja celuloza bubri u dodiru sa vodom od čega zavisi i mehanička
otpornost celuloze. Što više vode upije, to joj je manja mehanička otpornost. Biljna biomasa je,
kao što je već naglašeno, bogata celulozom, koja se može iskoristiti kao izvor ugljenika u
procesima fermentacije i za proizvodnju brojnih hemikalija. Da bi se koristila u procesima
fermentacije neophodno je sprovesti depolimerizaciju celuloze u molekule glukoze koja se može
izvesti hemijskom ili enzimskom hidrolizom.

10
Hemijska hidroliza celuloze podrazumeva oštre reakcione uslove i neorganske kiseline usled
čega pored glukoznih monomera nastaju i proizvodi šećerne degradacije poput furfurala, koji su
toksični za mikroorganizme, što podrazumeva preduzimanje neophodnih koraka za uklanjanje
ovih nepoželjnih supstanci.

Enzimska hidroliza celulazama odigrava se pod blagim uslovima sredine, pri čemu se ne
formiraju nepoželjni sporedni proizvodi. Enzimska hidroliza se pomoću multienzimskog
celulaznog kompleksa može izvesti do potpune depolimerizacije polisaharidnih lanaca.6

2.1.2. Vrste celulaza i njihove karakteristike

Kada se govori o celulazama, ne treba smatrati da je to samo jedan enzim, već multienzimski
kompleks sastavljen od tri različita enzima:

1. endoglukanaze (endo β-1,4-D-glukan glukanohidrolaza, EC 3.2.1.4) - celulaze u uţem

smislu, prave celulaze koje katalizuju hidrolizu β-1,4-glikozidnih veza koje se nalaze u
unutrašnjosti molekula celuloze nasumično, pri čemu kao proizvodi nastaju molekuli glukoze,
celobioze i celo-oligosaharida. One su veoma efikasne kada je u pitanju razgradnja amorfnih
delova celuloze, dok im je dejstvo u kristalnim područjima znatno manje izraženo.

2. egzoglukanaze (β-1,4-D-glukan celobiohidrolaza, EC 3.2.1.91) - celobiohidrolaze, katalizuju

hidrolizu β-1,4-glikozidnih veza koje se nalaze na krajevima molekula celuloze, pri čemu se
oslobaĎa molekul celobioze, osnovna jedinica celuloze. Za razliku od endoglukanaza,
egzoglukanaze deluju na kristalne delove celuloze tako što mogu efikasno da ih razgrade.

3. β-glukozidaze (β-D-glukozid glukohidrolaza, EC 3.2.1.21) - celobiaze. Delujuna β-1,4-

glikozidne veze molekula manje molekulske mase. Ovde spadaju rastvorni oligosaharidi, ali i
celobioza, produkt hidrolizeceluloze endo- i egzoglukanazama koji inhibitorno deluje na njih. Na
slici 4. dat je šematski prikaz metabolizma delovanja celulaza na celuloznom matriksu.

11
 Slika 4: Mehanizam delovanja celulaza

β-Glukozidaza upotpunjuje dejstvo multienzimskog celulaznog kompleksa i bez njega bi

hidroliza celuloze bila nepotpuna. (Slika 5.)

Slika 5: Princip dejstva multienzimskog celulaznog kompleksa

12
Celulaze su u prirodi veoma zastupljeni enzimi, a sintetišu ih biljke i brojni organizmi, uglavnom
saprofitni mikrobi koji rastu na mrtvim organskim materijama. Mnogi biljni patogeni su
producenti celulaza. Ovi organizmi se najčešće izoluju iz zemlje, toplih vodenih izvora,
komposta, kanalizacije i stajskog Ďubriva. Samo one vrste mikroorganizama koje istovremeno
produkuju sva tri tipa celulaza mogu efikasno da razgraĎuju celulozu. Industrijski su prvenstveno
bile proizvedene pomoću aerobnih mezofilnih plesni poput Trichoderma viride, T. reesei, T.
koningii, Aspergillus niger. Danas se zna da i mnogi drugi mikroorganizmi produkuju ove
enzime u značajnim količinama, kao što su npr. odreĎene termofilne plesni – Humicola insolens,
Sporotrichumthermophile, aerobne i anaerobne bakterijske vrste – Bacillus spp, Celulomonas
fimi, Pseudomonasfluorescens, Clostridium thermocellum, pojedine aktinomicete, ali i mnogi
drugi. Najveću komercijalnu primenu imaju termostabilne celulaze koje su otporne i na
ekstremne pH vrednosti. Široku primenu bakterija za proizvodnju ovih enzima sprečava sklonost
bakterijskih vrsta da sintetišu uglavnom samo endoglukanaze, dok samo mali broj produkuje
egzoglukanaze. Kod bakterija je najreĎi slučaj sinteze celobiaza, koje iako se generišu u
mikroorganizmu predstavljaju intracelularne enzime koji su čvrsto vezani za ćelijske strukture.3

Generalno posmatrano celulaze se sastoje od dve celine: većeg dela u kom je sadržan aktivni
centar i manjeg dela koji je odgovoran za vezivanje supstrata - celuloze. Ukoliko se enzimu
ukloni drugi deo, aktivnost prema kristalnoj celulozi mu drastično opada, dok aktivnost prema
rastvornim supstratima ostaje ista.

Trenutno ne postoji jedan univerzalan i opšte prihvaćen model mehanizma delovanja

multienzimskog celulaznog kompleksa, već nekoliko, ali pretpostavlja se da prvo deluju
endoglukanaze u kristalnim delovima celuloze formirajući amorfnu strukturu, nakon čega
nastavljaju udruženo delovanje sa egzoglukanazama. Ipak, produkt ovakve hidrolize je celobioza
koja inhibira dejstvo ova dva enzima, što celobiazu čini neizostavnim delom enzimskog
preparata ukoliko je krajnji cilj procesa potpuna hidroliza celuloze.3

Pored celobioze, inhibitori celulaza su i lignin i velika koncentracija glukoze.

Karakteristično za celulaze je njihova mala specifična aktivnost. Rešenje za ovaj problem se

traži u divljim sojevima mikrobioloških vrsta koji bi produkovali celulaze boljih svojstava. Za
sad najznačajniji organizmi za industrijsku proizvodnju celulaza su T. reesei i Bacillus spp.
Svojstva celulaza se razlikuju u zavisnosti od porekla, kao i njihova primena.

Celulaze su induktivni enzimi, ali su i male koncentracije celuloze, celobioze, njenih izomera i
strukturno sličnih jedinjenja dovoljne da indukuju njihovo generisanje u organizmu. Sa druge
strane, za kultivaciju proizvodnog mikroorganizma mogu se kao hranljive podloge koristiti
celuloza, poljoprivredni otpad i brojni materijali koji sadrže celulozu.7

13
2.1.3. Primena celulaza

Celulaze su komercijalno dostupne više od 30 godina i predstavljaju bitan predmet za akademsko

i industrijsko istraživanje.8 Primena celulaza u poljoprivredi u velikom obimu je nepraktična
zbog visoke cene ovog enzimskog preparata. Ali, ukoliko se za gajenje proizvodnih
mikroorganizama koriste čvrste podloge, poput poljoprivrednog i lignoceluloznog otpada
različitih industrija, cena proizvodnje celulaza se značajno smanjuje.

Za neke industrije kao što su tekstilna, papirna i neke primene u prehrambenoj industriji,
potrebno je proizvesti relativno čiste celulaze ili specifične komplekse celulaza, dok se za
potrebe poljoprivrede koriste sirovi enzimski preparati koji često sadrže hemicelulaze, amilaze i
pektinaze. Kako se izvori fosilnih goriva iscrpljuju, već sada se stvara potreba njihove zamene
biogorivima koja će se dobijati iz obnovljivih izvora. Stoga se očekuje porast primene celulaza u
biorafinerijama, gde se koriste za proizvodnju fermentabilnih šećera izceluloze, koji se zatim
koriste u proizvodnji biogoriva. (Tabela 1.)

Tabela 1: Komercijalni enzimski preparati, njihovi producenti i oblasti primene 3

14
- U industriji deterdţenata celulaze predstavljaju jednu od četiri enzimske komponente koje
čine sastavni deo svakog deterdženta. Prvi put su u ovoj industrijskoj grani bile primenjene 80-ih
godina XX veka u Japanu. Upotreba celulaza uz proteaze i lipaze u deterdžentima predstavlja
novu inovaciju. Da bi se koristio u deterdžentima, enzim mora da pokazuje aktivnost u
visokoalkalnoj sredini i uprisustvu agresivnih hemikalija koje ulaze u sastav deterdženata
(omekšivači, izbeljivači, površinskiaktivne materije). Celulaze koje se koriste u te svrhe su
izolovane iz alkalofilnih bakterija vrste Bacillusspp. (Celluzyme, Novo Nordisk) i plesni
Humicola insolens (Puradax® HA, Genencor International), čija je optimalna temperatura za rad
40ºC, a pH 9,5. TakoĎe, stabilne su u prisustvu hemijskih agenasa koji su sastavni deo
deterdženta, a mogu narušiti dejstvo enzima, i u opsegu pH vrednosti od 6-11. Njihova primarna
funkcija nije uklanjanje mrlja i fleka, za razliku od drugih enzima koji se koriste u
deterdžentima. Dejstvo celulaza se prvenstveno ispoljava u vraćanju sjaja, poboljšanju boje i
povećanju mekoće tkanine, zatim u uklanjanju nekih mrlja. One deluju na oštećena ili
mikrovlakna koja nastaju u toku nošenja i pranja odeće (čvorići, grudvice, štrčeća vlakna), nakon
čijeg uklanjanja se tkanini vraća boja, mekoća i sjaj. Sa druge strane, ne utiču na čvrsto
formiranu strukturu vlakana od kojih je tkanina izgraĎena.

- U procesima proizvodnje vina i sokova iz juţnog voća celulaze se koriste zajedno sa

pektinazama. Upotreba celulaza pozitivno utiče na prinos, a proizvod koji se dobija je boljeg
kvalitetai stabilnosti. U vinarstvu utiču na povećanje brzine filtracije.

- U pivarstvu se koriste visokoaktivne ekstracelularne celulaze dobijene iz T. reesei i T. viride.

Ove celulaze se pored amilaza i pektinaza koriste u procesu ošećerenja skroba neslaĎenog zrna,
pri čemu se dobijaju veće količine ekstrakta, ubrzava proces proizvodnje piva, a dobijeni
proizvod je stabilniji i bistriji.

- U tekstilnoj industriji celulaze se koriste u procesima proizvodnje tekstilnih materijala

prilikom obrade celuloznog materijala (lan, pamuk, ramija, viskoza). Mogu se primeniti u
prethodnoj obradi materijala pre njegovog štampanja kako bi se uklonila oštećena vlakna,
grudvice i druge nepravilnosti, i unaknadnoj obradi nakon bojenja kako bi se postigli izvesni
specijalni modni efekti (izbeljivanje materijala).

Upotreba enzima za obradu i omekšavanje tekstilnog materijala ima brojne prednosti u odnosuna
tradicionalna hemijska sredstva i metode. Enzimi deluju pod blagim uslovima ne izazivajući
oštećenje materijala, dok tradicionalno izbeljivanje tekstila podrazumeva njegovo tretiranje
natrijum-hipohloritom uprisustvu abrazivnog sredstva – vulkanskog kamena, što može dosta
naštetiti materijalu. Proces se izvodiu velikim mašinama sa rotirajućim bubnjevima u kojima ova
agresivna sredstva mogu izazvati velike kvarove i oštećenja. TakoĎe mogu nastati i ekološki
problemi usled zagaĎenja otpadnih voda. Za istiproces potrebne su mnogo manje količine
enzima u odnosu na abrazivna sredstva što ekonomski opravdava njihovu upotrebu u ovim
postupcima.

15
Korišćenje celulaza u tekstilnoj industriji je naišlo na odreĎene probleme koji su dosad
prevaziĎeni. Kako veliki broj celulaza ima pH optimum u blago kiseloj sredini, bilo je
neophodno dodavati kiseline (sirćetnu, fosfornu) nakon odskrobljavanja u cilju podešavanja
vrednosti pH pre upotrebe celulaza.9 Problem je prevaziĎen upotrebom komercijalnog enzimskog
preparata dobijenog iz nekoliko vrsta plesni Humicola koji zadržava aktivnost i pri malo većim
pH vrednostima od 7 (slika 6.). Ukoliko pH vrednost nastavi dalje da raste doći će do
inaktivacije enzima. Stabilan je i u temperaturnom opsegu od 55ºC do 70ºC u toku dužih
tretmana obrade (45-90 min), a više temperature može da izdrži samo pri kraćim tretmanima. 3

Slika 6: Aktivnost komecijalnih celulaza iz nekih vrsta Trichoderma i Humicola u

zavisnosti od pH sredine

Korišćenjem druge koncentracije enzima, promenom vremena obrade, pH vrednosti i

temperature, kao i dodatkom odgovarajućih površinski aktivnih materija mogu se postići
drugačiji efekti izbeljivanja.

- U prehrambenoj industriji celulaze imaju malu primenu jer je cena proizvodnje ovih enzima
visoka. Uglavnom se koriste u kombinaciji sa drugim enzimima, poput pektinaza i ksilanaza, koji
zajedno nose naziv enzimi maceracije. Ovi enzimi se koriste za ekstrakciju i bistrenje sokova na
bazi voća i povrća. Oni smanjuju viskoznost, poboljšavaju stabilnost i aromatična svojstva
voćnih sokova injihovih pulpi u toku procesa. Većina niskokvalitetnih prehrambenih proizvoda
sadrži veće koncentracije celuloze, male količine proteina i masti, i relativno visok sadržaj
pepela u poreĎenju sa visokokvalitetnom hranom.10

- U industriji skroba, prilikom njegove proizvodnje iz kukuruza u kom skrob gradi kristalnu
strukturu zajedno sa celulozom, koriste se celulaze i hemicelulaze za razbijanje ove strukture i
oslobaĎanje skroba, što utiče na njegovo povećanje prinosa i kvalitet. U poslednjih nekoliko
godina koriste se i drugi enzimi i to u samom procesu dobijanja skroba iz različitih biljnih vrsta.

16
- U pekarstvu celulaze se zajedno sa ksilanazama koriste u proizvodnji keksa i hleba. Upotreba
karboksimetil-celulaza, egzoglukanaza i ksilanaza poboljšava karakteristike testa i smanjuje
potrebu zavodom koja se korisiti u pripremi testa, povećavajući na taj način kapacitet procesa.

- U industriji stočne hrane celulaze se koriste zajedno sa hemicelulazama. Ukoliko se enzimi

dodaju ukontrolisanim uslovima dolazi do parcijalne hidrolize prisutne celulozne i
hemicelulozne frakcije, što obezbeĎuje potpuniju asimilaciju nutrijenata stočne hrane. Ovim se
povećava težina životinja uz manji utrošak hrane. Komercijalni enzimski preparat koji se koristi
u ove svrhe je cytolase123 (Genencor International) koja se sastoji iz četiri frakcije: A, B, C i D.
Svaka frakcija je razlikuje od ostaih jer je drugačijeg sastava i odnosa celulaznih i
hemicelulaznih enzima.

Frakcija A deluje u unutrašnjosti ugljenohidratnog polimera stvarajući veliku koncentraciju

redukujućih krajeva, koje zatim hidrolizuju bakterije izolovane iz grupa preživara, pri čemu se
dobijaju fermentabilni šećeri sa malim povećanjem toka efluenta. Frakcije B i C mogu delovati
udruženo ili pojedinačno. Rezultati njihovog dejstva su takoĎe fermentabilni šećeri, ali bez
povećanja toka efluenta. Frakcija D ima negativan uticaj na razgradnju ugljenohidratnih polimera
i povećanje toka efluenta.

- U proizvodnji biogoriva primena celulaza za hidrolizu lignoceluloznog materijala iz biljne

biomase je još u fazi ispitivanja na nivou poluindustrijskih postrojenja. Produkt hidrolize je
glukoza, polazna sirovina za proizvodnju biogoriva, koja se podvrgava mikrobnoj fermentaciji,
pri čemu se dobija etanol. Enzimska hidroliza i fermentacija glukoze se mogu odvijati
pojedinačno ili simultano. Istraživanja su pokazala da istovremeno izvoĎenje ova dva procesa
daje bolje rezultate, jer mikroorganizam odgovoran za fermentaciju aktivno koristi glukozu
onemogućavajući njeno nagomilavanje u fermentacionoj podlozi i formiranje celobioze koja
inhibitorno deluje na celulaze. Visoka cena enzima i njegova mala aktivnost čine ove procese
veoma skupim, što predstavlja ograničavajući uslov za njihovu širu primenu u ovoj industrijskoj
grani.7

Pored primene u industriji, enzimi se mogu koristiti i u dijagnostici, bioafinitetnoj hromatografiji

i pri konstukciji biosenzora.

17
 2.2. IMOBILIZACIJA ENZIMA

Imobilizacija enzima predstavlja ograničeno (lokalizovano) kretanje ovih molekula kroz

reakcionu smešu, uz očuvanje njihove katalitičke aktivnosti. Osim dobrih strana, imobilizacija
enzima ima i nedostatke.11

Postoji više načina da se poboljšaju osobine enzima:

1. primenom tehnika molekularne biologije,
2. primenom različitih imobilizacionih ili post-imobilizacionih tehnika o čemu će se pisati u
okviru ovog rada,
3. razvijanjem novih vrsta reaktora koji su u skladu sa potrebama enzimskog procesa.
Kao rezultat primene ovih tehnika dobijaju se efikasniji industrijski procesi sa biokatalizatorima
koji se odigravaju u umerenim uslovima, dobijeni proizvodi su „prirodni“, a sam industrijski
proces je ekonomski opravdan.12 Imobilizacija povećava termičku stabilnost i obezbeĎuje
stabilnost enzima iznad ekstremnih vrednosti pH i temperature jer pruža čvrstu spoljašnju
povratnu vezu izmeĎu enzima.

Kada sumiramo ceo proces imobilizacije enzima možemo reći da razvoj i dizajn jednog
imobilisanog enzimskog sistema podrazumeva izbor nosača i metode imobilizacije, konfiguracije
i operativnog režima rada reaktora, optimizaciju procesnih parametara i drugo.

2.2.1. Pojam "imobilizacija enzima"

Pod imobilizacijom enzima podrazumeva se vezivanje enzima fizičkim ili hemijskim putem na
površinu nosača ili „zarobljavanje“ unutar strukture nosača. 13 Imobilizacijom se često dobija
enzim povećane katalitičke aktivnosti i/ili stabilnosti u odnosu na slobodni enzim, a omogućava
se i olakšano izolovanje enzima iz reakcione smeše i upotreba u više reakcionih ciklusa čime se
direktno smanjuje cena enzimskih procesa na industrijskom nivou. Dakle, imobilizacija enzima
predstavlja uključivanje enzima u bilo koju izolovanu fazu, koja je odvojena od faze slobodnog
rastvora, pri čemu molekuli supstrata i proizvoda reakcije mogu da se razmenjuju izmeĎu faza.
Imobilizacija enzima može i treba da ima šire značenje kao svako ograničavanje slobode kretanja
molekula enzima u prostoru.3

Na svojoj površini molekuli enzima imaju različite funkcionalne grupe kao što su nukleofilni
aminokiselinski ostaci, hidrofobne oblasti, karboksilne grupe, oblasti sa pozitivnim ili
negativnim naelektrisanjem koje mogu da reaguju sa funkcionalnim grupama različitih materijala
pri čemu ostvarene interakcije ili formirane hemijske veze dovode do vezivanja enzima.14 Reklo
bi se da je imobilizacija jednostavan proces, ali se pokazalo da, iako postoji puno opisanih
metoda imobilizacije, još uvek odreĎeni fenomeni koji se pri samom procesu dešavaju, nisu do
kraja razjašnjeni. Zbog toga je imobilizacija i dalje izazov i aktuelna tema u mnogim
istraživanjima.

18
Često prilikom imobilizacije dolazi do promene konformacije enzima ili promene uslova u
okolini aktivnog centra. Imobilizacija enzima se ponekad koristi kao efikasno sredstvo za
promenu specifičnosti enzima, naročito kada se radi o sintezi željenog optičkog izomera sa
fiziološkim dejstvom. Neophodno je definisati parametre na osnovu kojih se može proceniti
uspešnost primenjene tehnike imobilizacije. Potrebno je pratiti kako se karakteristike enzima
menjaju tokom imobilizacije jer se denaturacija enzima može jako brzo dogoditi što utiče na
krajnji ishod celog procesa imobilizacije.

Do promene aktivnosti enzima u toku imobilizacije dolazi iz sledećih razloga:

1. pretrpljenog hemijskog tretmana,
2. uticaja površine nosača,
3. efekata raspodele supstrata i ostalih komponenti u sistemu (inhibittora, aktivatora,
vodonikovih jona),
4. sternih smetnji,
5. konformacionih promena i promena konformacione fleksibilnosti enzima.
Poboljšanje postojećih metoda i rešavanje problema koji se javljaju tokom imobilizacije moguće
je udruživanjem više naučnih disciplina kao što su molekularna biologija, hemija proteina, nauka
o materijalima i hemijsko inženjerstvo. U dosadašnjoj praksi za imobilizaciju enzima
upotrebljavani su prvenstveno različiti konvencionalni nosači čije su dimenzije veće od 300 µm.
Poslednjih godina sve više se kao nosači za imobilizaciju enzima koriste prirodni ili sintetski
nanomaterijali.

2.2.2. Osobine imobilisanih enzima

Osnovne osobine koje karakterišu enzime (slobodni i imobilisani) su aktivnost, specifičnost

(selektivnost) i stabilnost. OdreĎivanje efikasnosti i relativne količina enzima u enzimskim
preparatima vrši se merenjem aktivnosti enzima, odnosno brzine reakcije koju katalizuju.
Katalitička aktivnost ustvari obezbeĎuje efikasan način da se dati enzim kvantitativno i
kvalitativno odredi. Kako bi rezultati bili validni moraju se ispoštovati odreĎena pravila i
obezbediti odgovarajući uslovi tj. da se održavaju konstantni uslovi izvoĎenja reakcije kao što su
pH i temperatura. Pod tim uslovima izmerena aktivnost je proporcionalna količini datog enzima.

- Za odreĎivanje aktivnosti enzima koriste se različite metode: spektrofotometrijske koju smo mi

primenjivali tokom izvoĎenja eksperimenta, hemijske, polarimetrijske, gasometrijske,
viskozimetrijske, radiohemijske, fluorimetrijske i dr. Koja će metoda za odreĎivanje aktivnosti
enzima biti primenjena direktno zavisi od fizičko-hemijske promene koja se odigrava u toku
izvoĎenja reakcije. Vrednosti za aktivnost enzima se izražavaju u enzimskim jedinicama (na
engl. Unit (U)). Pod jednom internacionalnom jedinicom podrazumeva se ona količina enzima
koja pod odreĎenim uslovima (pH i temperatura) za vreme od jednog minuta katalizuje
transformaciju jednog mikromola supstrata.2

19
Aktivnost enzima se može izražavati kao ukupna aktivnost (U), aktivnost po jedinici mase
enzimskog preparata (U/mg) ili aktivnost po jedinici zapremine (U/ml). Često se u praksi
odreĎuje i specifična aktivnost koja predstavlja broj jedinica aktivnosti po jednom miligramu
proteina u enzimskom preparatu.

- Specifičnost enzima podrazumeva da od velikog broja mogućih reakcija katalizuju samo jednu
od njih. Pa tako jedan enzim može da deluje na više različitih supstrata, ali je neophodno da se u
njima nalaze ili odgovarajuće atomske grupe ili veze. Neki enzimi katalizuju u odreĎene tipove
reakcija bez obzira na strukturu supstrata. Primer su lipaze koje katalizuju hidrolizu estarskih
veza u velikom broju supstrata čija se struktura razlikuje. TakoĎe, postoje i enzimi čija se
specifičnost ogleda u činjenici da isključivo deluju samo na jedan od dva moguća stereohemijska
oblika supstrata. U industriji se susreću i osobine enzima kao što su regiospecifičnost i
enantiospecifičnost koje se odnose na sposobnost enzima da deluje na samo u jednom regionu
supstrata odnosno da deluje samo na jedan optički izomer supstrata.

Postoji više teorija koje objašnjavaju specifičnost enzima. Po Fišeru specifičnost enzima ka
odreĎenom supstratu se može objasniti geometrijskom komplementarnošću koja postoji izmeĎu
molekula enzima i molekula supstrata. Košland je dopunio Fišerovu teoriju tvrdeći da
komplementarnost izmeĎu aktivnog mesta enzima i supstrata nije maksimalna, već da pri
vezivanju supstrata dolazi do konformacionih promena unutar molekula enzima nakon čega
njihova komplementarnost postaje potpuna. Ova teorija objašnjava specifičnost dejstva enzima,
ali ne i sam mehanizam enzimske reakcije. Savremene teorije koje se bave objašnjavanjem
mehanizma reakcije počivaju na činjenici da pored konformacionih promena u molekulu enzima
dolazi i do konformacionih promena i u molekulu supstrata. Stabilnost enzima je veoma važna
osobina i odnosi se na činjenicu da enzim ispoljava svoju optimalnu aktivnost samo kada se
nalazi u svojoj nativnoj konformaciji odnosno onda kada se nalazi u svom prirodnom okruženju.
Delovanjem nekih rastvarača ili denaturanata kao i promenom fizičkih uslova može da doĎe do
denaturacije enzima što direktno dovodi do gubitka aktivnosti enzima. Denaturacija
podrazumeva promenu konformacije molekula enzima usled raskidanja veza koje odreĎuju
njegovu sekundarnu i tercijarnu strukturu. Nativna konformacija enzima pri kojoj on ispoljava
svoju aktivnost je jedinstvena, dok denaturisan enzim, pored toga što je neaktivan, može
zauzimati više različitih konformacija. Pod ograničenim uslovima (mali interval pH i
temperature) favorizovana je nativna konformacija.15 U industrijskim procesima enzim je
podložan dejstvu povišenog pritiska, mehaničkih sila smicanja i hemijskih faktora (organski
rastvarači, deterdženti i dr.) koje mogu dovesti do njegove denaturacije, a time i do gubitka
aktivnosti. Imobilizacijom enzima navedene ključne osobine molekula enzima mogu biti
promenjene što u većini slučajeva dovodi do povećanja katalitičke aktivnosti i stabilnosti
(temperaturni i pH profil).2

20
Tabela 2: Prednosti i mane imobilisanih enzima u odnosu na nativne

PREDNOSTI MANE

1. Višekratna upotreba katalizatora, smanjena 1. Troškovi nosača i imobilizacije;

cena; 2. Gubitak aktivnosti enzima u toku
2. Biokatalizator se lako izdvaja iz reakcione imobilizacije;
smeše i od proizvoda reakcije; 3. Promena svojstava biokatalizatora (promena
3. Reakcije se mogu izvoditi kontinualno; specifičnosti enzima);
4. Automatizacija procesa, lakša kontrola; 4. Difuzione limitacije;
5. Veća stabilnost biokatalizatora;
6. Veća produktivnost procesa;

IMOBILISANI ENZIMI

INKAPSULIRANI ADSORBOVANI NA
NOSAČ

Slika 7: Podela imobilisanih enzima naosnovu vrste imobilizacije

2.2.3. Metode imobilizacije enzima

Sa industrijske tačke gledišta, kako bi imobilisani enzim bio uspešno primenjen u nekom
industrijskom procesu primenjena metoda imobilizacije enzima mora imati sledeće osobine:

 mora omogućiti da enzim postane stabilniji i otporniji prema ekstremnim uslovima, kao
što su pH, temperatura i organski rastvarači,
 mora omogućiti da enzim može biti upotrebljen u više ciklusa,
 mora biti jednostavna i ekonomski opravdana,
 ne sme dovesti do značajno smanjene aktivnosti i selektivnosti imobilisanog enzima u
odnosu na slobodni enzim.

21
Svaki industrijski proces zaheva specifične radne uslove kako bi se dobio željeni proizvod.
Dakle, izbor tehnike imobilizacije je vrlo važan korak u celokupnom procesu i može dovesti do
smanjenja vremena i troškova, kao što smo već napomenuli. Ključni koraci u dizajniranju
imobilisanog enzima su izbor nosača za imobilizaciju i metode imobilizacije, koja zavisi od
karakteistika enzima i nosača.

U okviru ovog rada biće praćeni parametri koji će se koristiti za procenjivanje kvaliteta
imobilisanih enzima:

1. Koncentracija imobilisanih proteina (mg/g) - Aktivnost i stabilnost imobilisanog enzima

zavise od količine imobilisanog enzima, naročito ako je koncentracija imobilisanog enzima
manja od one koja je potrebna za formiranje monosloja na površini nosača. Dokazano je da se
maksimalna aktivnost imobilisanog enzima adsorpcijom postiže pri onoj koncentraciji
imobilisanog enzima koja odgovara monosloju. Treba napomenuti i da je koncentracija
imobilisanog enzima proporcionalna specifičnoj površini neporoznih nosača.

2. Prinos imobilizacije proteina (%) - parametar koji predstavlja odnos mase imobilisanog
enzima i mase slobodnog enzima na početku imobilizacije. Koncentracija enzima u rastvoru na
početku imobilizacije ima veliki uticaj na obim imobilizacije enzima pa samim tim i na aktivnost
imobilisanog enzima.

3. Koncentracija imobilisane aktivnosti (IU/g nosača) - ukupna aktivnost imobilisanog enzima

po jedinici mase suvog nosača unetog u imobilizaciju.

4. Prinos imobilizacije aktivnosti (%) - predstavlja odnos imobilisane aktivnosti i aktivnosti

slobodnog enzima na početku imobilizacije. Ovaj parametar kvantativno pokazuje koliko je
aktivnosti enzim zadržao od početne aktivnosti u toku samog postupka imobilizacije. 2

2.2.4. Podela metoda imobilizacije enzima

Prilikom odabira metode imobilizacije treba obratiti pažnju na tri najvažnije komponente
„imobilisanog sistema“, a to su enzim, nosač i interakcije formirane između nosača i enzima.
Izbor metode će zavisiti od strukture i primene enzima, karakteristika nosača kao što su inertnost
i biokompatibilnost, tj. nosač ne sme uticati na nativnu strukturu enzima.

Na osnovu tipa veza koje se javljaju izmeĎu nosača i enzima metode za imobilizaciju enzima
možemo poseliti u dve kategorije: hemijske i fizičke metode. Podela imobilisanih enzima mogla
se videti na slici 7. TakoĎe, nosači se na osnovu hemijskog sastava mogu podeliti na organske i
neorganske.

Hemijske metode se zasnivaju na stvaranju bar jedne hemijske veze izmeĎu molekula enzima i
nosača. U najvećem broju slučajeva one su irevezibilne. Irevezibilno vezivanje enzima na nosač
znači da on ne može da se „skine“ sa nosača, a da ne doĎe do narušavanja njegove strukture,
time i njegove biološke aktivnosti.

22
Fizičke metode se zasnivaju na nekovalentnim interakcijama izmeĎu molekula enzima i nosača
ili na mehaničkom smeštanju enzima u odreĎeni deo prostora. Za ove metode imobilizacije je
karakteristično da enzimi nakon vezivanja na nosače mogu da se veoma jednostavno uklone sa
nosača i ponovo koriste. Atraktivnost ovih metoda je u tome što se, kada opadne aktivnost
imobilisanih enzima, na nosač mogu ponovo imobilisati „sveži“ enzimi nakon uklanjanja enzima
koji je izgubio aktivnost. Sa ekonomskog stanovišta ovo je jako povoljno jer se često dešava da u
ukupnoj ceni imobilisanog sistema najveću stavku predstavlja upravo nosač. TakoĎe, ove metode
su pogodne za vezivanje enzima koji su veoma nestabilni i osetljivi, čime se proširuje njihova
primena kao biokatalizatora.

Uža podela metoda imobilizacije bi bila sledeća (slika 8):

1. kovalentna imobilizacija enzima,
2. adsorpcija enzima na čvrste nosače,
3. zarobljavanje enzima,
4. mikroinkapsulacija,
5. "Cross-linking".

Slika 8: Šematski prikaz svih metoda imobilizacije enzima

23
S obzirom na to da su u okviru ovog master rada korišćeni nosači različitih karakteristika
(funkcionalne grupe, hidrofobnost, veličina pora), pri čemu su očekivani različiti mehanizmi
vezivanja enzima (formiranje kovalentnih veza, jonska i hidrofobna adsorpcija), u daljem tekstu
biće ukratko opisane primenjene imobilizacione tehnike.

2.2.4.1. Kovalentna imobilizacija

Imobilizacija enzima ovom metodom zasniva se na stvaranju pravih kovalentnih veza izmeĎu
funkcionalnih grupa prisutnih na površini molekula enzima i funkcionalnih grupa prisutnih na
površini nosača. Kao čvrsti nosači koriste se veliki broj neorganskih materijala, prirodnih i
sintetskih polimera. Enzimi se obično hemijski vazuju za nosač preko smojih amino-grupa,
karboksilnih grupa, sulfidrilnih grupa ostataka cisteina, imidazolnih grupa, hidroksilnih grupa ili
fenolnog jezgra tirozina.3 Ove grupe u većini slučajeva nisu dovoljno aktivne kako bi se odmah
moglo pristupiti njihovom vezivanju za nosač, tako da je prvo potrebno aktivirati enzim ili nosač.
U retkim slučajevim se pristupa aktivaciji enzima jer ovi postupci mogu dovesti do njegove
denaturacije. Aktivacija nosača se može izvesti primenom različitih metoda i upotrebom
različitih aktivatora. Od osobina i strukture samog nosača zavisi koji aktivator i metodu možemo
primeniti. U okviru ovog rada, ispitivano je osam vrsta nosača, njihovu strukturu i veze koje se
uspostavljaju izmeĎu njih i enzima.

Slika 9: Imobilizacija enzima za nosač preko bifunkcionalnog agensa koji može biti različite
strukture i dužine niza što značajno utiče na aktivnost i stabilnost imobilisanog enzima. 1-
direktno vezivanje enzima za nosač bez bifunkcionalnog agensa, 2-vezivanje enzima preko
"kraće nožice", 3-vezivanje enzima peko suviše "duge nožice"3

Ovo je jedna od najviše korišćenih metoda za imobilizaciju enzima. Njena prednost je u činjenici
da su kovalentne veze koje se formiraju stabilne i jake čime je onemogućeno „spiranje“ enzima
sa površine nosača. Prilikom imobilizacije enzima ovom metodom mora se voditi računa da u
stvaranju kovalentnih veza ne učestvuju aminokiselinski ostaci koji se nalaze u sklopu aktivnog
centra enzima jer time može doći do smanjene aktivnosti enzima. Postupci kovalentne
imobilizacije enzima su obično složeni, zametni, skupi i sastoje se iz faza.

24
Postoje dva načina da se pospeši stvaranje kovalentnih veza izmeĎu nosača i enzima. Prvi način
je da se površina nosača modifikuje kako bi se uvele funkcionalne grupe koje mogu da grade
kovalentnu vezu sa aminokiselinskim ostacima enzima. Proces modifikacije površine nosača
sastoji se najčešće od uvoĎenja elektrofilnih grupa na površinu nosača koje onda mogu da
reaguju sa jakim nukleofilnim grupama enzima, kao što su amino- ili sulfhidrilna grupa.
Najčešće korišćeni agensi za modifikaciju površine nosača su: epihlorhidrin, glutaraldehid,
cijanogen-bromid, sulfonil-hlorid, epoksidi i dr.16 Aminokiselinski ostaci enzima koji najčešće
učestvuju u graĎenju kovalentnih veza su ostaci lizina (ε-amino grupe), cisteina (tiolne grupe),
asparaginske i glutaminske kiseline (karboksilna grupa).

Već je rečeno kako se nosači mogu podeliti, ali nije spomenuto da neorganski nosači imaju
pednost u odnosu na druge materijale kada se koriste kao nosači za imobilizacije enzima jer se
odlikuju velikom mehaničkom čvrstoćom, pristupačnom cenom, termičkom i hemijskom
stabilnošću, rezistentnošću na dejstvo mikroorganizama, dobrim hidrodinamičkim osobinama i
lako se regenerišu nakon upotrebe. MeĎutim, njihova primena za kovalentnu imobilizaciju
enzima je ograničena zbog malog broja postupaka njihove hemijske aktivacije. Jedan od
najčešćih postupaka hemijske aktivacije neorgankih nosača je tretiranje sa trialkoksisilanima,
koji sadrže amino-grupu kao funkcionalnu grupu. Ova grupa se naknadno može modifikovati
glutaraldehidom (aldehid glutarne kiseline), pri čemu nastaju aktivni intermedijari, koji se dalje
hemijski vazuju sa molekulima enzima (slika 10.).3 U industriji se enzimi najčešće imobilizuju
vezivanjem za nosač prethodno aktivan glutaraldehidom.

Slika 10: Aktivacija nosača sa amino-grupama glutaraldehidom17

25
Polimeri koji sadrže amino-grupe na aromatičnom prstenu mogu se aktivirati diazotovanjem,
odnosno uvoĎenjem diazo grupe. Na tako dobijeni diazonijumov derivat nosača enzim se lako
kovalentno vezuje preko α- ili ε-amino grupa i reĎe preko hidroksilne, sulfhidrilne, imidazolne ili
karbiksilne grupe.

Drugi način je da se modifikuje površina enzima kako bi se odgovarajuće grupe aktivirale pri
čemu bi bilo omogućeno stvaranje kovalentnih veza sa nosačem. Često se primenjuje oksidacija
ugljenohidratne frakcije perjodatom kojom se stvaraju karbonilne grupe ili akivacija amino-
grupa lizina karbodiimidom. Za enzime koji u svojoj strukturi sadrže puno cisteina, a samim tim
i tiolnih grupa u bočnim ostacima, karakteristično je da se mogu imobilisati na nosače bogate
tiolnim ili tiosulfatnim grupama obrazujući takozvane disulfidne mostove.13 Iako je formirana
veza izmeĎu enzima i nosača stabilna i kovalentna ona se može lako raskinuti tretiranjem
imobilisanog enzima sa ditiotreitolom (DTT) ili nekim drugim kompetitivnim agensom male
molekulske mase koji poseduje tiolnu grupu.3

2.2.4.1.1. Prednosti i nedostaci kovalentne imobilizacije enzima

+ Ova metoda ima veliku primenu u medicini, farmaceutskoj i prehrambenoj industriji u kojima
ne sme doći do kontaminacije proizvoda proteinima. To je zbog stabilnosti kovalentno
imobilisanih enzima u širokom opsegu spoljnih uslova usled stvaranja hemijskih veza enzima sa
nosačem, pa ne dolazi do spiranja enzima sa nosača.

+ Ova metoda je najraznovrsnija od svih metoda jer se koristi veliki broj postupaka i specifičnih
agenasa u toku procesa imobilizacije.

+ Kako su molekuli enzima vezani za spoljašnju površinu nosača i često su udaljeni od nje
pomoću nekog agensa, gubici aktivnosti enzima usled difuzionih limitacija u ovim sistemima su
znatno manji. Ova metoda imobilizacije je podesna za sve vrste reakcija, pa i one u kojima su
supstrati jedinjenja velike molekulske mase, jer je zbog načina vezivanja enzima za nosač za
spoljašnju površinu omogućen njegov kontakt sa supstratom.

- Glavni nedostaci ovog modela imobilizacije su velika potrošnja skupih reagenasa, zametni
postupci aktivacije nosača i veliki gubitak aktivnosti enzima u samom postupku imobilizacije.
Osim toga, postupci regenerisanja nosača su dosta složeni i skupi. Da bi se smanjili gubici
aktivnosti enzima veoma je važno pri njihovom hemijskom vezivanju za nosač da učestvuju
samo one funkcionalne grupe koje nisu nosioci katalitičke aktivnosti. Isto tako, bitno je da te
funkcionalne grupe budu dovoljno reaktivne kako bi imobilizacija bila selektivna i da bi se
odvijala pod blagim uslovima pri kojima neće doći do denaturacije enzima. 3

26
Najveći broj postupaka kovalentne imobilizacije enzima zasniva se na vezivanju enzima preko
amino-grupa jer je njihov broj u molekulu enzima veliki, lako stupaju u veliki broj reakcija i nisu
od primarne važnosti za održavanje strukture i funkcije enzima.

U nekim slučajevima suviše čvrst kontakt enzima sa nosačem je razlog gubitka aktivnosti enzima
zbog negativne promene mikrookoline enzima, stvaranja prenapetosti u molekulu enzima i
zauzimanja nepovoljne konformacije. Tad je izlaz udaljavanje molekula enzima od površine
nosača preko duge nožice na neko rastojanje.

2.2.4.2. Adsorpcija enzima na čvrste nosače

Adsorpcija je najstarija i najjednostavnija metoda imobilizacije enzima za nerastvorni matriks.

Enzim i matriks u ovim imobilizatima povezuju različite nespecifične interakcije: van der Waals-
ove, hidrofobne interakcije, vodonične veze i elektrostatičke sile. Osnovni činioci koji utiču na
adsorpciju enzima jesu specifična površina i fizičko-hemijska svojstva nosača, pH vrednost i
jonska jačina rastvora u kome se odvija adsorpcija, početna koncentracija enzima i temperatura.
O ovim parametrima je neophodno voditi računa kako tokom samog postupka imobilizacije, tako
i tokom upotrebe ovih imobilizata.

Sa aspekta imobilizacije enzima, adsorpcija se može uže klasifikovati na osnovu jačine i prirode
interakcija enzima i nosača na sledeće grupe:

1. Nespecifična adsorpija - najednostavniji način vezivanja enzima koji se bazira na stvaranju

slabih veza i to vodoničnih veza, van der Waals-ovih sila i hidrofobnih interakcija. Ovako vezan
enzim se lako može desorbovati sa nosača promenom uslova imobilizacije kao što su jonska
jačina ili polarnost rastvora, pH ili temperatura.

2. Stvaranje jonskih veza - enzim se vezuje za nosač stvaranjem jonskih veza. Najčešće se
dešava u uslovima kada su enzim i nosač suprotno naelektrisani. Problem se može javiti u
slučajevima kada su supstrat ili proizvod naelektrisani usled interakcija sa naelektrisanim
nosačem.

3. Hidrofobna adsorpcija - vezivanje enzima stvaranjem hidrofobnih interakcija izmeĎu

hidrofobnih oblasti molekula enzima i hidrofobnog nosača. Zavisi od stepena hidrofobnosti kako
enzima tako i nosača. Na formiranje hidrofobnih interakcija može se uticati podešavanjem pH,
jonske jačine i temperature.

4. Afinitetna adsorpcija - zasniva se na vezivanju molekula na osnovu biokompatibilnosti. Ovo

je veoma selektivna metoda koja se prvenstveno koristi u bioseparacionom inženjerstvu za
izolovanje proteina. MeĎutim, ona je jako skupa jer se na nosač prvo mora vezati afinitetni
ligand (kao što su npr. antitela, koenzim, analog supstrata ili lektin) za koji se specifično može
vezati odgovarajući enzim.

27
Prednosti ove metode nad ostalim su:
1. Brzina, sama imobilizacija traje kratko.
2. Reverzibilnost, enzim se sa nosača može desorbovati promenom nekog od gore pomenutih
parametara i na nosač se može imobilizovati nova količina enzima.
3. Jednostavnost, imobilizacija se izvodi u blagim reakcionim uslovima, najpovoljnijim za
stabilnost enzima.
4. Mogućnost dodatnog umrežavanja, stvaranjem kovalentnih veza izneĎu nosača i enzima
nakon njegove adsorpcije na nosač.18

2.2.5. Izbor nosača

Na osnovu strukture molekula enzima potrebno je prvo izabrati odgovarajući nosač. Osim načina
vezivanja, za uspešnu imobilizaciju važne su fizičke i hemijske karakteristike nosača. Ove čvrste
faze moraju da imaju odgovarajuću mehaničku i biološku stabilnost, tako da se ne menjaju
tokom reakcije.19 Idealan nosač treba da ima osobine kao što su mehanička otpornost,
hidrofobnost, biokompatibilnost, otpornost prema mikrobiološkoj kontaminaciji, dostupnost i
nisku cenu. Nosače možemo klasifikovati kao neorganske (bentonit, silika, staklo, oksidi metala
i metali) i organskena osnovu njihovog prirode. Organske nosače možemo podeliti na prirodne,
kao što su polisaharidi (celuloza, dekstran, agar, agaroza, hitin i alginat), proteini (kolagen,
albumin, kazein) i ugljenik i sintetske polimere (polistiren, polimetilakrilat, poliakrilamid,
poliamidi, vinil- i alil-polimeri).20 Nosači mogu biti sintetisani u obliku zrna, membrana, vlakana,
cevi ili kapsula različitih veličina. Fizičke osobine nosača kao što su prečnik čestica, prečnik
pora, sposobnost bubrenja, mehanička jačina i otpornost prema visokim pritiscima će odrediti
uslove pod kojima se imobilisan sistem može primeniti, tj. diktiraće izbor reaktora kao i
operativne uslove samog procesa. Konkretno veličina čestica i pora odreĎuju ukupnu površinu
koja je dostupna enzimu za vezivanje. Nosač ne sme imati nikakve reaktivne grupe koje bi bile u
stanju da vežu molekul supstrata ili druga jedinjenja iz rastvora. Na njemu ne sme biti fizičke
adsorpcije enzima jer bi se adsorbovam enzim mogao osloboditi u toku katalitičke reakcije sa
imobilisanim enzimom, kao i adsorpcije neke druge supstance iz rastvora.

Danas se za imobilizciju koriste neporozni i porozni nosači. Neporozni nosači imaju manju
površinu za vezivanje enzima, ali je zato smanjena mogućnost pojave difuzionih limitacija.
Sastoje se od sitnih čestica, prečnika nekoliko mikrmetara, tako da imaju veliku aktivnu površinu
po jedinici mase. Porozni nosači imaju daleko veću površinu za vezivanje enzima, pored toga
pore štite enzim od spoljašnjih uticaja, meĎutim mora se imati na umu da to ostavlja mogućnost
pojave difuzionih limitacija.2 Kako bi se svela na minimum mogućnost pojave difuzionih
limitacija nosač mora imati kontrolisanu raspodelu veličine pora.16 Iz svega navedenog može se
zaključiti da ne postoji univerzalni nosač koji će odgovarati svim enzimima i reaktorskim
sistemima.

28
2.2.6. Imobilizacija celulaza

Različiti pristupi i nosači su do sada korišćeni za imobilizaciju celulaze. U većini slučajeva ovi
postupci doveli su do optimizacije karakteristika enzima, kao što su termostabilnost, mogućnost
ponovne upotrebe i povećanje aktivnosti. Jedno od prvih istraživanja u ovoj oblasti bilo je
posvećeno imobilizaciji β-glukozidaze iz Aspergillus nigeri celulaze iz Trichoderma reesei. Ti su
enzimi kovalentno ko-imobilisani na hidrofilni poliuretanski matriks i primenjeni u hidrolizi
rastvorljive i nerastvorljive celuloze. Pokazali su povećanje od 2,5 i 4 puta u proizvodnji
glukoze, u odnosu na odgovarajući slobodan enzim. Pored toga, imobilisana β-glukozidaza bila
je izuzetno stabilna, s obzirom na to da je nakon 1000 sati kontinuirane upotrebe zadržala čak 95
% početne aktivnosti.

Ostale osobine enzima koje se obično optimizuju imobilizacijom su temperaturna i pH stabilnost.

Celulaza iz T. reesei uspešno je imobilisana zarobljavanjem u matricu kalcijum-alginata, pri
čemu je ostvaren stepen imobilizacije (odnose razlike izmeĎu početnih i konačnih proteina u
supernatantu, nakon procesa imobilizacije i i početnih proteina u supernatantu) od približno 84%.
Ovaj imobilisani enzim imao je za 5°C viši temperaturni optimum u odnosu na slobodan enzim,
kao i veću aktivnost u kiseloj sredini (pH 4,5).

Komercijalne celulaze su takoĎe imobilisane kovalentnim i nekovalentnim metodama na

rastvorljivom matriksu, Eudragit-u L-100, i primenjene su u hidrolizi slame nakon predtretmana
vodenom parom. Optimalna temperaturaje ostala nepromenjena u poreĎenju sa slobodnim
enzimom meĎutim, imobilisani enzimi su više stabilisani na 4°C, nego što su bili slobodni
enzimi i zadržali su 50 % svoje aktivnosti nakon 5 ciklusa hidrolize.1

29
 Tabela 3: Imobilizacija celulaza različitim pristupima i vrste industrijske primene

MATERIJAL I INDUSTRIJSKA
ENZIM
TEHNIKA PRIMENA

CLEA implantacija
Celullase (komercijalna) Hrana, pivo, tekstil, pulpa i
po plazma potopljenom
papirna industrija
jonu

Meicelase (komercijalna Aminosilil-1 (adsorpcija)

Hidroliza celuloze
celulaza izT. reesei)
Celluclast (comercijalna
celulaza iz T. reesei) i Poliuretanska pena Hidroliza celuloze i
Novozymes (adsorpcija) Industrija etanola
(comercijalna glukozidaza
izA. niger)
Silicijumski oblici i
Celullase (iz T. reesei) površine sa završetkom Industrija etanola
aminokiseline (adsorpcija)
DEAE-Makrosorb
C30 (comercijalna Celulozna i lignocelulozna
(adsorpcija)
celulaza izT. reesei) hidroliza
Mesoporozni silicijum
dioksid i mezoporozni
Cellulase (comercijalna iz
silicijum nanopartik Industrija etanola
T. reesei)
(adsorpcija)

2.3. LIGNOCELULOZNA BIOMASA

Lignocelulozna biomasa je veoma važan obnovljivi izvor energije i jedini je obnovljivi izvor
ugljenika. Sastoji se od lignina (aromatičnog polimera) i polisaharida (hemiceluloze i celuloze).
Hemijske karakteristike strukturnih komponenata čine je veoma vrednim biotehnološkim
supstratom, ali njena primena zahteva uklanjanje lignina i oslobaĎanje fermentabilnih šećera iz
polisaharida, zbog čega su savremena istraživanja usmerena ka pronalaženju efektivne metode
kojom se može dobiti visok prinos šećera.21

Celuloza je linearni homopolimer sastavljen od glukoznih ostataka D-konfiguracije meĎusobno

povezanih β-(1→4)-glikozidnim vezama (slika 11, B1). Uspostavljanjem vodoničnih veza,
nekoliko celuloznih lanaca srasta gradeći mikrofibrile koji se ujedinjuju i formiraju vlakna (slika
11, M, F i V). Rezultat brojnih inter- i intrapolimernih vodoničnih veza je kristalno ureĎenje
celuloze (sekundarna struktura, slika 11, B2).

30
Za razliku od celuloze, hemiceluloza (slika 11, C) nema kristalno ureĎenje, veoma je razgranate
strukture i poseduje acetil grupe vezane za polimerni lanac. Na slici 11. (C) prikazan jedeo
molekula ksilana, najčešćeg polimera iz familije hemiceluloza.

Lignin je najkompleksniji biopolimer u prirodi i jedini konstituent biomase baziran na

aromatičnim jedinicama (slika 11, A). On čini 15–25 % suve mase drvenastih biljaka i 40%
energije sadržane u lignoceluloznoj biomasi. Struktura lignina još uvek nije u potpunosti
razjašnjena, ali je utvrĎeno da su primarni prekursori njegove sinteze (tj. reakcije sparivanja
radikala) tri monolignola: p-kumaril, koniferil i sinapil alkohol (slika 11, A pod 1), 2) i 3),
redom), koji nastaju od fenilalanina (Phe) u opštem fenilpropanoidnom i specifičnom
monolignolnom putu.21

Slika 11.Struktura lignocelulozne biomase; A) deo polimera lignina, 1) p-kumaril, 2) koniferil i

3) sinapil alkohol; B1) linearni polimer celuloze; B2) kristalna struktura celuloze; C) deo
polimera hemiceluloze; M) mikrofibril; F) fibril; V) celulozno vlakno.

31
Tri glavne komponente lignoceluloze su polimeri celuloza, hemicelulozai lignin (slika 11). Osim
njih, mogu se naći i neke nestrukturne komponente poput vode, proteina, minerala, nestrukturnih
saharida i nekih drugih, koje se mogu izdvojiti ekstrakcijom. Sastav lignoceluloze u velikoj meri
zavisi od izvora biomase: postoje značajne razlike u udelu strukturnih komponenti – kao i u
hemijskom sastavu hemiceluloze i lignina (tabela 4.).

Tabela 4: Udeo osnovnih komponenti lignoceluloze u zavisnosti od porekla biomase

2.3.1. Suncokretova sačma

Smanjenje prirodnih resursa za ishranu, a sve veći porast ljudske populacije doveo je do
usmeravanja istraživanja ka upotrebi novih resursa za ljudsku ishranu kao što su npr. otpadne
sirovine nastale prilikom prerade žitarica u industrijskim postupcima.

Suncokret je najznačajnija uljarica koja se koristi kao sirovina za proizvodnju jestivog ulja. Njeni
najveći proizvoĎači su Rusija, Argentina, Francuska, SAD, Kina i Španija. Suncokretova sačma
konkretno predstavlja ljuske koje oblažu seme suncokreta (slika 12). Semesuncokreta je glavni
materijal procesa prerade i proizvodnje jestivog ulja, što suncokretovu sačmu karakteriše kao
nužan sporedni proizvod tog postupka. Ova sirovina je našla namenu u industrijistočne hrane kao
komponenta hraniva niske nutritivne vrednosti. Koristi se za ishranu brojlera, živine i preživara.

32
 Slika 12: Prerada suncokreta od suncokretovog cveta (glavice) do suncokretove sačme
Boja suncokretove sačme je smeĎa do sivo-smeĎa, a njen hemijski sastav je konstantan, sa
udelima komponenata koje variraju u odgovarajućim opsezima koji zavise od vrste suncokreta,
podneblja i uslova pod kojima je rastao.
Suncokretova sačma je glavni nus-produkt koji nastaje prilikom industrijskog postupka
ekstrakcije ulja iz suncokretovog semena. Sama po sebi predstavlja jeftinu sirovinu visokog
sadržaja sirovih proteina (25-40 %), ali zbog visokog sadržaja vlaknastih materija (12-25 %)
male je nutritivne vrednosti. To ima za posledicu ograničenu industrijsku primenu sačme. Zbog
visokog sadržaja proteina može predstavljati dobar izvor proteina za ishranu ljudi. Kako bi mogli
da se koriste proteini suncokretove sačme za ishranu potrebno je frakcionisati suncokretovu
sačmu radi smanjenja sadržaja nepoželjnih komponenata (rastvorni šećeri, polifenoli, i masti)
koje smanjuju hemijsku i nutritivnu vrednost proteina. Prisustvo rastvorljivih šećera i masti je
nepoželjno jer oni mogu da reaguju sa proteinima (Majlardova reakcija) što dovodi do smanjenja
sadržaja esencijalnih aminokiselina (lizin, triptofan i metionin). Fenoli lako podležu oksidaciji do
hinona koji opet podležu transformaciji do polimera koji daju braon boju finalnom proizvodu.
TakoĎe, lignocelulozna vlakna koja predstavljaju glavnu komponentu suncokretove sačme pored
proteina moraju biti uklonjeni kako bi se obogatio finalni proteinski proizvod.

33
Suva materija suncokretove sačme, generalno posmatrano, u značajnoj količini sadrži: sirove
proteine, vlaknaste materije (lignin, celulozu, hemicelulozu), pepeo, masti, rastvorljive i
nerastvorljive šećere, fosfor i kalcijum. Konkretni udeli ovih supstanci dobijeni ekstrakcijama
koje su sprovedene upomenutom istraživanju dati su u tabeli 5.6
Tabela 5: Sastav suncokretove sačme dve različite ekstrakcije

Odgovarajućom biotehnološkom obradom i primenom različitih tehnika izdvajanja proizvoda iz

suncokretove sačme se dobijaju tri bitne frakcije:
1. proteinski izolat (PI), tj. koncentrat proteina, sa sadržajem proteina većim od 80 %,
2. lignocelulozna frakcija (LF), koja sadrži celulozu, hemicelulozu i lignin, ali i malim
udelom zaostale molekule šećera, proteina, kao i ostala jedinjenja koja se prirodno nalaze u
sačmi;
3. tečnu frakciju (TF), koja sadrži sve rastvorljive molekule sačme.
Do sada je publikovano nekoliko metoda za frakcionisanje suncokretove sačme i dobijanje
koncentrovanih proteinskih izolata. Većina njih uključuje korišćenje organskih rastvarača
(etanol), soli i/ili redukujućih reagenasa i izoelektrične precipitacije. MeĎutim, najčešće se koristi
postupak koji su razvili Parado i sar, a koji se sastoji od sedimentacije/flotacije i izolektrične
percipitacije. Ovaj postupak ne zahteva upotrebu organskih rastvarača već se suncokretova
sačma disperguje u vodi. Nakon frakcionisanja suncokretove sačme ovim postupkom dobijen
proteinski izolat je bogat proteinima (iznad 90 %) i ima mali sadržaj rastvorljivih šećera, masti,
fenola i lignoceluloznih vlakana. Pri čemu dolazi do odvajanja tri frakcije: lignocelulozne (LF),
tečne frakcije (TF) i taloga.

34
Procesom sedimentacije dolazi do formiranja taloga, dok LF isplivava na površinu TF frakcije
kao najlakša komponenta. Potom je mehanički odvojena LF frakcija. Razdvajanje TF frakcije i
taloga je uraĎeno dekantovanjem. Dobijen talog je frakcija bogata proteinima i nekim
nerastvornim komponentama suncokretove sačme. Odvojena LF je korišćena u
eksperimentalnom delu ovog rada kako bi se ispitalo dejstvo imobilisane celulaze.

Slika 11: Postupak dobijanja proteinskog izolata suncokretove sačme

35
 3. EKSPERIMENTALNI DEO

Tokom višednevnog rada u laboratoriji na Katedri za BIB ispitivana je mogućnost korišćenja

osam vrsta nosača za imobilizaciju enzima celulaze iz gljivice Aspergillus niger (slika 12.).
Nakon odabira najpogodnijeg nosača, odreĎenesu optimalne vrednosti za parametre imobilizacije
(pH vrednost sredine, koncentracija enzima i vreme imobilizacije) korišćenjem čiste karboksi
metil celuloze (CMC) kao supstrata i primenjujući DNS metodu za praćenje reakcionog toka i
Bradfordovu metodu za praćenje koncentracije proteina. Potom je eksperiment vršen sa
prirodnim supstratom - lignoceluloznom frakcijom suncokretove sačme kako bismo videli kako
enzim deluje na nju i uporedili njegovo katalitičko dejstvo sa slobodnim enzimom.

Slika 12: Aspergillus niger

3.1. MATERIJALI, UREĐAJI I PRIBOR

Materijali korišćeni tokom eksperimentalog rada su:

 Biokatalizator: čvrsta celulaza iz gljivice Aspergillus niger

 LifetechTM nosači (Purolite Corporation, Bala Cynwyd, PA, SAD)
 0,5M NaOH, NRK Inženjering, Beograd, Srbija
 HCl, Lach-Ner, Neratovice, Češka Republika
 DNS (98%), Acros Organic, Velika Britanija
 Na2CO3, Zorka Pharma, Šabac, Srbija
 3-Na-citrat x 2H2O, Alkaloid, Skoplje, Makedonija
 Etanol (98%), Sani-Hem, Novi Bečej, Srbija
 H2SO4, Zorka Pharma, Šabac, Srbija
 NaH2PO4, Centrohem, Stara Pazova, Srbija
 Na2HPO4, Superlab, Beograd, Srbija
 Voda HPLC čistoće, Acros Organic, Velika Britanija

36
  Natrijumova so karboksi metil celuloze niskog viskoziteta (Sigma Aldrich
Chemie GmbH, Štajnhajm, Nemačka)
 Puferi: *Za pripremu rastvora celulaze korišćen je 0,05 M Na-fosfatni pufer pH 6.
Pufer je pripremljen mešanjem soli Na2HPO4, NaH2PO4 i destilovane vode u odgovarajućoj
razmeri.
*Za pripremu rastvora supstrata korišćen je 0,05 M Na-citratni pufer pH 4,8 koji je pripremljen
mešanjem limunske kiseline i destilovane vode u odgovarajućoj razmeri.

UreĎaji korišćeni u radu su:

 Analitička vaga, Mettler Toledo AJ 100, Grajfenze, Švajcarska

 Tehnička vaga, Mettler AJ 100, Grajfenze, Švajcarska
 Magnetna mešalica, IKA, SAD
 Ultrazvučno vodeno kupatilo, RO-VEP, Niš, Srbija
 Vodeno kupatilo, Memmert, Švabah, Nemačka
 Tresilica, Memmert, Švabah, Nemačka
 UV-spektrofotometar, UltrospecTM 3300pro, Biochrom Ltd, Kamburn, Velika
Britanija
 Mikropipete, Brand, Verthajm, Nemačka
 Ultimate 3000 Thermo Scientific HPLC ureĎaj, Dionex, SAD
 Vorteks, REAKS 7000 (Heidolph, Nemačka)
 pH metar (inoLab pH 720, WTW, Nemačka)
 Roler mikser, Stuart, Pariz, Francuska

Laboratorijski pribor korišćen u radu:

 čaše, menzure, erlenmajeri, stakleni štapići, epruvete, kivete, staklene pipete,
folija,kašičice, sterilne plastične čašice.

3.2. METODE

3.2.1. Imobilizacija celulaze

Imobilizacija enzima izvoĎena je na sobnoj temperaturi, u ependorfima zapremine 2 ml, uz

mešanje na roler mikseru, na sledeći način: odmeravana je masa od 25 ili 50 mg nosača, nakon
čega je dodavano 0,5 (ili 1) ml rastvora enzima definisane koncentracije u odgovarajućem
puferu. Nakon odreĎenog vremena, supernatant je odvajan od čestica nosača i korišćen u cilju
analiziranja sadržaja proteina, dok su čestice sa imobilisanim enzimom tri puta ispirane sa po 0,5
(ili 1) ml destilovane vode.

37
Nakon toga, aktivnost imobilisanog enzima odreĎivana je na 50°C uz mešanje, korišćenjem 2 %
rastvora karboksi metil celuloze u citratnom puferu (50 mM, pH 4,8) kao supstrata, pri čemu je
sadržaj osloboĎenih redukujućih šećera odreĎivan DNS metodom.

U cilju dobijanja imobilisanog enzimskog preparata najboljih karakteristika, otpimizovani su

sledeći parametri: pH imobilizacije, koncentracija unetih proteina i vreme imobilizacije. Prilikom
ispitivanja uticaja pH, imobilizacija je izvoĎena u 50 mM Na-citratnom puferu (pH 3, 4 i 4,8) i
50 mM Na-fosfatnom puferu (pH 6 i 7). Kada je imobilizacija izvoĎena pri različitim početnim
koncentracijama proteina, ovaj parameter variran je u opsegu 1,4-23,3 mg proteina po gramu
nosača. Uticaj vremena imobilizacije na aktivnost imobilisane celulaze, praćen je u toku 24 h.

3.2.2. DNS metoda

DNS metoda predstavlja spektrofotometrijsku metodu, koja je dobila naziv po DNS rastvoru koji
se koristi u metodi. Ova metoda se koristi za odreĎivanje koncentracije redukujućih šećera u
uzorku.
Redukujući šećeri su oni koji sadrže aldehidnu grupu ili se spontanom izomerizacijom mogu
prevesti u oblik koji sadrži aldehidnu grupu. Naziv su dobili po veoma izraženim redukujućim
sposobnostima, jer redukuju i vrlo blaga oksidaciona sredstva, poput Cu 2+ ili Fe3+. UtvrĎivanje
koncentracije redukujućih šećera se uvek izvodi u alkalnoj sredini, tako da svi monosaharidi
(aldoze i ketoze) predstavljaju redukujuće šećere, jer ketoze u baznim rastvorima izomerizuju u
forme koje sadrže aldehidnu grupu. Da li će di-, tri-, oligo- ili polisaharidi biti redukujući šećeri
zavisi od toga da li se na jednom od krajeva lanca nalazi slobodna poluacetalna grupa. Ukoliko
se nalazi, onda takvi saharidi predstavljaju redukujuće šećere, a ukoliko poluacetalne grupe
monomernih jedinica koje se nalaze na krajevima polimernih lanaca učestvuju u formiranju
glikozidne veze, tj. ,,blokirane su’’, onda su takvi šećeri neredukujući.
Zasniva se na reakciji koja se odigrava izmeĎu redukujućih šećera i 3,5-dinitrosalicilnekiseline,
pri čemu dolazi do redukovanja nitro-grupe na trećem C-atomu do amino-grupe i oksidovanja
aldehidne grupe šećera do karboksilne (slika 13). Kao proizvod se dobijaju oksidovani šećer i 3-
amino-5-nitrosalicilna kiselina, jedinjenje crvene boje koje ima apsorbcioni maksimum na 540
nm. Merenjem apsorbance na ovoj talasnoj dužini može se odrediti koncentracija redukujućih
šećera.22

Slika 13: Prikaz redukcije 3,5-dinitrosalicilne kiseline

38
Reagensi:
DNS reagens: 16 g NaOH i 10 g dinitrosalicilne kiseline se rastvori u 300 ml vode, a
300 g K, Na-tartarata u 200 ml vode. Posle rastvaranja, rastvori se pomešaju i
razblaže vodom do 1 l.23

Postupak izvoĎenja metode:

U isto vreme se pravi slepa proba (referentna tačka, A=0, za apsorbancu rastvora) i radi analiza
uzoraka. Slepa proba se pravi tako što se 0,125 ml destilovane vode pomeša sa 0,250 ml DNS
rastvora, kuva 5 min u ključalom vodenom kupatilu, a zatim razblaži sa 4 ml destilovane vode i
vorteksira. Uzorak koji se analizira sepriprema tako što se 0,125 ml uzorka prenese u epruvetu u
koju se doda 0,250 ml DNS rastvora. Sadržaj epruvete se kuva 5 min u ključalom vodenom
kupatilu, nakon čega se razblaži sa 4 ml destilovane vode, vorteksira i na spektrofotometru se
izmeri apsorbanca rastvora na 540 nm u odnosu na SP.
Koncentracija redukujućih šećera u uzorku (c, mM) se računa na osnovu prethodno odreĎene
standardne prave pomoću rastvora glukoze i proračunatog nagiba (A=0,12*c).
Ukoliko je sadržaj redukujućih šećera u uzorku visok, prave se odgovarajuća razblaženja. Ako je,
na primer, potrebno razblažiti uzorak 5x, onda se 0,025 ml uzorka pomeša sa 0,100 ml
destilovane vode, a zatim doda 0,250 ml DNS rastvora. Ostatak procedure je isti.

3.2.3. Bradfordova metoda

Za odreĎivanje proteina metodom po Bradfordu, koncentrovana boja je pripremljena tako što je

100 mg Coomassie brilliant blue G-250 (CBB G-250) rastvoreno u 50 ml 95 % etanola, a zatim
je dodato 100 ml fosforne kiseline i voda do ukupne zapremine od 200 ml.
Metoda se bazira na reakciji proteina sa CBB u kiseloj sredini pri čemu dolazi do vezanja
anjonske boje za NH3 delove proteina (slika 15). CBB reaguje prvenstveno sabočnim grupama
Arg, a u manjoj meri i sabočnim grupama His, Lys, Tyr, Trp i Phe. Boja se na proteine veže
hidrofobnim interakcijama i jonskim vezama što stabilizuje boju u anjonskom obliku i dovodi do
vidljive promene boje iz smeĎe u plavu. Pri tome se apsorpcijski maksimum boje pomera sa 470
nm na 595 nm što se prati spektrofotometrijski (slika 14). Ova metoda je u širokoj upotrebi zbog
svoje jednostavnosti, brzine i širokog opsega proprocionalnosti intenziteta obojenja i
koncentracije proteina.

Slika 14: Promena boje apsorpciskog maksimuma u zavisnosti od apsorbance

39
 Slika 15: Šematski prikaz vezivanja boje za protein
Reagensi:

Bradfordov reagens: u 100 ml koncentrovane boje se dodaje 400 ml destilovane vode.

Ovako pripremljen Bredfordov reagens neophodno je profiltrirati tri puta i čuvati u tamnoj boci,
pri čemu se ostaje stabilan 2-3 nedelje.

Kako bi se odredila koncentracija proteina u uzorku, 100 μl rastvora (početnog rastvora enzima
ili supernatanta) je odmereno u plastičnu kivetu, a tome je dodat 1ml Bredfordovog reagensa.
Nakon 5min spektrofotometrijski se odreĎuje apsorbanca na 595 nm. Koncentracija proteina se
preračunava pomoću standardne krive, koja je pre prvog merenja dobijena sa rastvorom BSA
definisane koncentracije.

Koncentracija imobilisanih proteina načestice nosača (mg/g nosača) i prinos imobilizacije

proteina (%) su računati po formulama:

𝐶0 − 𝐶
𝐶 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑠𝑎𝑛𝑖𝑕 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 (𝑚𝑔 𝑔 𝑛𝑜𝑠𝑎č𝑎) =
𝑚𝑛𝑜𝑠𝑎 č𝑎

𝐶 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑠𝑎𝑛𝑖𝑕 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎
𝑃𝑟𝑖𝑛𝑜𝑠 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑧𝑎𝑐𝑖𝑗𝑒 % = ∙ 100
𝐶0

Gde su C0 i C koncentracije proteina u supernatantu na početku i kraju imobilizacije, redom.

40
3.2.3. OdreĎivanje aktivnosti imobilisanog enzima

Aktivnost imobilisane celulaze odreĎivana je pod prethodno optimizovanim uslovima (50 °C, pH
4,8), inkubiranjem odreĎene mase imobilisanog enzima (25 ili 50 mg) i rastvora supstrata (2 ml
2% karboksi metil celuloze) uz mešanje. U odreĎenim vremenskim intervalima, uzorkovano je
50-125 µl uzorka u prethodno pripremljeni rastvor DNS reagensa (250 µl) koji je, u zavisnosti od
željenog razblaženja uzorka, bio dopunjen odreĎenom zapreminom destilovane vode, tako da
ukupna zapremina uzorka i vode bude 250 µl. DNS metoda je dalje izvoĎena na već opisan
način. Iz nagiba početnih (linearnih) delova krivih koje prikazuju zavisnost apsorbance od
vremena, izračunavana je aktivnost imobilisanog enzimskog preparata (IU/g nosača) na sledeći
način:

𝑑𝐴 𝑑𝑡 ∙ 𝑉𝑠𝑚 ∙ 𝑅
𝐴𝑘𝑡(𝐼𝑈 𝑔) =
0.12 ∙ 𝑚𝑛𝑜𝑠𝑎 č𝑎

Gde je dA/dt nagib lineranog dela krive koja predstavlja promenu apsorbance uzorka nakon DNS
metode na 540 nm u toku vremena (min), Vsm(ml) zapremina reakcione smeše, R razblaženje
uzorka, 0,12 je koeficijent proporcionalnosti izmeĎu apsorbance i koncentracije redukujućih
šećera (ekvivalent glukoze) izražene u mM i mnosača (g) masa nosača u reakcionoj smeši.

Korišćenjem podatka za početnu aktivnost u supernatantu (Aktpoč.) izračunavan je prinos

aktivnosti (%):

𝐴𝑘𝑡 ∙ 𝑚𝑛𝑜𝑠𝑎 č𝑎
𝑃𝑟𝑖𝑛𝑜𝑠 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡𝑖 % = ∙ 100
𝐴𝑘𝑡𝑝𝑜 č.

Dok je specifična aktivnost (IU/mg vezanih proteina) odreĎivana korišćenjem podatka za

aktivnost (IU/g nosača) i masu vezanih proteina (mg/g nosača):

𝐴𝑘𝑡
𝑆𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖č𝑛𝑎 𝑎𝑘𝑡𝑖𝑣𝑛𝑜𝑠𝑡 𝐼𝑈 𝑚𝑔 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 =
𝐶 𝑖𝑚𝑜𝑏𝑖𝑙𝑖𝑠𝑎𝑛𝑖𝑕 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎

3.2.4. Hidroliza lignocelulozne frakcije suncokretove sačme

Mešanjem 50 g suncokretove sačme i 500 ml destilovane vode dobijene su tri frakcije (čvrsti
talogna dnu, tečna frakcija i lignoclulozna frakcijana površini). Lignocelulozna frakcija je zatim
odvojena, osušena u mikrotalasnoj pećnici i usitnjena u avanu. Tako dobijeni materijal korišćen
je kao supstrat u reakciji hidrolize katalizovanoj slobodnom i imobilisanom celulazom.
Reakciona smeša bila je sastavljena od 1 g supstrata i 10 ml pufera (50 mM citratni pufer pH
4,8), a reakcija je izvoĎena u vodenom kupatilu na 50 °C uz mešanje.

41
Aktivnost enzima u reakcionim smešama definisana je za svaki eksperiment pojedinačno, u
okviru rezultata i diskusije, a izražena je kao broj IU (odreĎeno sa CMC-om kao supstratom) po
gramu LF. Uzorkovanje je vršeno u vremenskom intervalu od nekoliko sati. Dalja analiza je
vršena prema DNS metodi na već opisan način. Krajnji uzorci i kontrolni uzorak (koji je bio
izložen istom tretmanu ali bez enzima) bili su analizirani i primenom HPLC metode. Ovi uzorci
su pre analize bili centrifugirani (5 minuta na 12000 rpm), a zatim profiltrirani kroz filter sa
porama veličine 0,45 µm.

3.2.5. HPLC analiza

Tečna hromatografija visokih performansi (High-performance liquid chromatography, HPLC) je

oblik hromatografije na koloni, koja se koristi za razdvajanje komponenti iz smeše na osnovu
hemijskih interakcija izmeĎu supstance koja se analizira i stacionarne faze u koloni. Ona pruža
pouzdane rezultate u kratkom vremenskom periodu.

U ovom radu vršiće se analiza prethodno pripremljenih uzoraka na Dionex Ultimate 3000
Thermo Scientific HPLC ureĎaju. Hidrolizati lignocelulozne frakcije suncokretove sačme biće
analiziranina koloni za šećere (Hyper REZ XP Carbohydrate Ca2+, 300 mm × 7.7 mm, 8 μm) na
80°C. Kao mobilna faza koristiće se voda sa protokom od 0,6 ml/min. Detekcija proizvoda će se
vršiti pomoću RI detektora (Refracto Max 520).

Slkaa 16: Moderni ureĎaj za HPLC analize (levo) i šematski prikaz sistema (desno)

42
 4. REZULTATI I DISKUSIJA

4.1. Izbor optimalnog nosača za imobilizaciju enzima

U okviru ovog master rada za imobilizaciju celulaze iz A. niger korišćeni su polimerni nosači,
čije su karakteristike prikazane u tabeli 6. Testirana su četiri metakrilatna nosača sa primarnim
amino-grupama koji se razlikuju po veličini pora i dužini “nožice” (C2 i C6), zatim dva nosača
na bazi kopolimera divinilbenzena i stirena (jedan sa tercijarnim, a drugi sa kvaternarnim amino-
grupama), hidrofoban metakrilatni nosač sa oktadecil grupama i nosač koji predstavlja
epoksi/butil metakrilat namenjen kovalentnoj imobilizaciji enzima. Na slici 17. na kojoj su
prikazane aktivnosti dobijenih imobilisanih enzimskih preparata može se uočiti da su najbolji
rezultati ostvareni sahidrofilnim nosačima koji imaju primarnu amino-grupu, pri čemu je
evidentan uticaj veličine pora i dužine “nožice”. Pokazalo se da je enzim imobilisan na nosač
preko duže nožice aktivniji, što se može pripisati optimalnoj udaljenosti molekula enzima od
površine nosača koja omogućava njegovo neometano katalitičko delovanje. Što se tiče uticaja
veličine pora, uočeno je da se primenom nosača sa većim porama dobija preparat veće aktivnosti.
Može se pretpostaviti da se enzim vezuje i na površini nosača i u porama unutar čestice i da je u
slučaju manjih pora pristup molekula supstrata aktivnom centru celulaze imobilisane u porama u
dubljim slojevima čestice značajno otežan, naročito kada se ima u vidu da je CMC supstrat
velike molekulske mase. Nešto manju aktivnost imao je enzim vezan za umereno hidrofobne
nosače sa tercijarnim i kvaternarnim amino-grupama, dok je izrazito hidrofoban nosač bio
najmanje pogodan za imobilizaciju celulaze, sa aspekta pokazane aktivnosti. Relativno malu
aktivnost imao je i enzim imobilisan na nosač sa epoksidnim grupama pa, iako mogućnost
kovalentne imobilizacije pruža mogućnost dobijanja izrazito stabilnih biokatalizatora, ovaj
preparat nije dalje razmatran. Za dalji rad odabran je nosač koji je pokazao največi potencijal u
preliminarnom eksperimentu - LifetechTM ECR8409F. Na ovaj nosač se celulaza, pri
odgovarajućem pH sredine, može uspešno imobilisani posredstvom jonskih interakcija, a
očigledno je da fizičke karakteristike nosača (u vidu velikih pora i odgovarajuće dužine
“nožice”) pružaju mogućnost da celulaza zadrži veliki deo svoj katalitičkog kapaciteta.

43
 Tabela 6: Spisak svih korišćenih nosača sa različitim funkcionalnim grupama

amino C2 metakrilat hidrofilan

LifetechTM ECR8305F
manje pore umereno porozan
amino C2 metakrilat hidrofilan
LifetechTM ECR8309F
veće pore umereno porozan
amino C6 metakrilat hidrofilan
LifetechTM ECR8404F
manje pore umereno porozan
amino C6 metakrilat hidrofilan
LifetechTM ECR8409F
veće pore umereno porozan
LifetechTM ECR1508 stiren/DVB sa tercijarnim amino-grupama umereno hidrofoban

LifetechTM ECR1604 stiren/DVB sa kvaternarnim amino-grupama umereno hidrofoban

hidrofoban
LifetechTM ECR8806M oktadecil akrilat
umereno porozan
LifetechTM ECR8285 epoksi/butil metakrilat umereno hidrofoban

35
Aktivnost, IU/g nosača

30
25
20
15
10
5
0

Slika 17: Aktivnosti imobilisanih enzimskih preparata dobijenih vezivanjem za nosače različitih
funkcionalnih grupa

44
4.2. Optimizacija uslova imobilizacije celulaze naLifetechTM ECR8409F nosač

S obzirom nato da se meĎu testiranim nosačima LifetechTM ECR8409F pokazao kao nosač sa najvećim
potencijalom za dalju primenu, naredni eksperimenti bili su usmereni na optimizaciju najznačajnijih
uslova imobilizacije (pH sredine, koncentracija enzima, vreme imobilizacije).

4.2.1. OdreĎivanje optimalnog pH imobilizacije

U cilju utvrĎivanja pH vrednosti medijuma u kome se dobija imobilisani enzimski preparat

najveće aktivnosti, imobilizacija je izvoĎena u različitim puferima – pH od 3 do 7. Dobijeni
rezultati prikazani su u tabeli 7. Kao što se može uočiti, najveća aktivnost imobilisane celulaze
ostvarena je imobilizacijom pri pH 6. Smanjenjem pH vrednosti do 4, dolazi do postepenog pada
aktivnosti, dok dalje smanjenje dovodi do naglog pada, kako aktivnosti, tako i koncentracije
vezanih proteina. Sa druge strane, pri pH vrednosti 7 dobijen je preparat veoma niske aktivnosti
(11 IU/g), iako je koncentracija vezanih proteina bila tek neznatno niža u odnosu na pH 6. S
obzirom na to da je izoelektrična tačka celulaze iz A. niger 3,67, a da je očekivano uspostavljanje
elektrostatičkih interakcija izmeĎu naelektrisanih grupa na površini molekula enzima i primarnih
amino grupa sa površine nosača, očekivano je da pri pH vrednostima nižim od 3,67 dolazi do
odbijanja izmeĎu enzima koji pod takvim uslovima poseduje sumarno pozitivno naelektrisanje i
pozitivno naelektrisanih amino grupa. Sa porastom pH vrednosti sredine tj. udaljavanjem od pI
enzima, veći broj aminokiselinskih ostataka dobija negativno naelektrisanje, što omogućava
ostvarivanje većih stepena imobilizacije i dobijanje preparata sa većom aktivnošću. Ipak,
pokazalo se da se pri pH vrednosti 7 dobija preparat značajno niže aktivnosti, što ukazuje na
činjenicu da je pod takvim uslovima sredine verovatno došlo do delimične inaktivacije enzima.

Tabela 7: Aktivnost i specifična aktivnost imobilizane celulaze nakon izvoĎenja imobilizacije u

puferima različite pH

pH 3 4 4,8 6 7
Aktivnost, IU/g nosača 3,61 22,01 30,24 46,13 11,07

Specifična aktivnost, IU/mg vezanih proteina 30,4 50,71 47,47 43,3 12,27

45
4.2.2. Uticaj početne koncentracije proteina

U zavisnosti od karakteristika enzima i kapaciteta nosača za vezivanje proteina, različite početne

koncentracije enzima mogu biti optimalne sa aspekta dobijanja imobilisanog preparata najveće
aktivnosti i/ili ostvarivanja visokih prinosa imobilizacije. U okviru optimizacije ovog parametra,
početna koncentracija preparata je varirana u širokom opsegu, tako da je masa proteina
ponuĎenih za imobilizaciju bila izmeĎu 1,4-23,3 mg po gramu nosača. Kao što se može uočiti na
slici 18, u čitavom ispitivanom opsegu povećanje koncentracije proteina dovodi do porasta mase
vezanih proteina po gramu nosača, što ukazuje na činjenicu da kapacitet nosača za vezivanje
proteina nije dostignut. Stepen imobilizacije je gotovo konstantan (oko 80%). MeĎutim, kada se
u obzir uzme aktivnost imobilisanog enzimskog preparata, kao njegova najznačanija
karakteristika (slika 19.) očigledno je da pri malim koncentracijama vezanih proteina (do 3mg )
dolazi do proporcionalnog rasta aktivnosti, dok dalje povećanje dovodi do blagog porasta, da bi
se pri najvećim testiranim koncentracijama došlo do platoa.

Ovakav trend najbolje se opisuje preko specifične aktivnosti (slika 20.), koja pokazuje pad u
okviru variranog opsega. Ovakvi rezultati verovatno su uzrokovani pojavom difuzionih
limitacija, jer pri imobilizaciji enzima na porozne nosače uglavnom prvo dolazi do vezivanja na
samoj površini, zatim u porama bliže površini, a tek pri većim koncentracijama proteina u
porama u dubljim slojevima čestice koje su i najteže dostupne molekulima supstrata. U ovoj fazi
rada, dobijeni su imobilisani enzimski preparati maksimalnih aktivnosti do 100 IU/g nosača.
Odgovarajući prinosi aktivnosti u odnosu na početnu aktivnost u supernatantu su relativno niski,
naročito pri većim početnim koncentracijama enzima, navodeći na zaključak da odabir optimalne
koncentracije mora predstavljati kompromis izmeĎu zahteva za dobijanjem preparata najveće
katalitičke aktivnosti i ekonomske opravdanosti postupka (slika 21.). Iz tog razloga, naredni
korak optimizacije, koji je podrazumevao ispitivanje uticaja vremena imobilizacije, uključivao je
širok opseg početnih koncentracija proteina.

25
Vezani proteini, mg/g nosača

20

15

10

0
0 5 10 15 20 25

Koncentracija proteina, mg/g nosača

Slika 18: Uticaj ispitivanih koncentracija proteina na masu vezanih proteina

46
 120

Aktivnost, IU/g nosača

100

80

60

40

20

0
0 5 10 15 20 25

Koncentracija proteina, mg/g nosača

Slika 19: Grafik zavisnosti aktivnosti imobilisanog enzimskog preparata od koncentracije

proteina

50
45
40
Specifična aktivnost, IU/mg

35
vezanih proteina

30
25
20
15
10
5
0
0 5 10 15 20 25

Koncentracija proteina, mg/g nosača

Slika 20: Zavisnost specifične aktivnosti od koncentracije proteina

47
 30

25

Prinos aktivnosti, %
20

15

10

0
0 5 10 15 20 25

Koncentracija proteina, mg/g nosača

Slika 21: Ispitivanje prinosa aktivnosti u odnosu na početnu aktivnost u supernatantu

48
4.2.3. Uticaj vremena imobilizacije

Svi eksperimenti izvedeni u prethodnom delu rada podrazumevali su dvadesetčetvoročasovnu

inkubaciju enzima i nosača na sobnoj temperaturi. S obzirom na to da je adsorpcija posredstvom
elektrostatičkih interakcija brz proces, finalni korak optimizacije uslova imobilizacije bio
usmeren na praćenje imobilisane aktivnosti dobijenih preparata u toku vremena. Na slici 22. se
može uočiti da pri svim analiziranim koncentracijama proteina, aktivnost imobilizata raste u toku
prva tri sata, nakon čega dolazi do njenog naglog pada. Može se primetiti da je ovaj pad
izraženiji kod većih početnih koncentracija proteina pri kojima su dobijeni i preperati veće
aktivnosti i da je razlika u vezanim aktivnostima, koja je detektovana i u prethodnom
eksperimentu nakon 24 h, još izraženija pri kraćim vremenima trajanja imobilizacije. Na taj
način, pri početnim koncentracijama proteina većim od 20 mg/g nosača, dobijeni su preparati sa
aktivnošću od preko 400 IU/g nosača, što se može smatrati zadovoljavajućim rezultatom.

450

400
Aktivnost, IU/g nosača

350 1,4 mg/g

300
9,3 mg/g
250
14 mg/g
200
18,7 mg/g
150
23,3 mg/g
100
28 mg/g
50

0
0 5 10 15 20 25

Vreme, h

Slika 22: Uticaj vremena imobilizacije na aktivnost imobilisane celulaze pri različitim
koncentracijama proteina

49
4.3. Primena imobilisane celulaze u hidrolizi lignocelulozne frakcije suncokretove sačme

Nakon ispitivanog uticaja najznačajnijih parametara imobilizacije usledila je primena u hidrolizi

LF katalizovanoj slobodnom i imobilisanom celulazom. Za svaki eksperiment pojedinačno je
definisana aktivnost enzima u reakcionim smešama izražena kao broj IU (odreĎeno sa CMC-om
kao supstratom) po gramu LF. Na slici 23. se može uočiti da je hidroliza sa slobodnim enzimom
išla brže od hidrolize sa imobilisanim jer se u prvom satu uočava nagli skok koncentracije
redukujućih šećera (izražen preko ekvivalenta glukoze), nakon čega se postepeno povećava.
Može se primetiti da se pri većim aktivnostima slobodnog enzima ostvaruju veće početne brzine
i veći stepeni hidrolize u vremenima do tri sata, ali da se postepenim rastom udela redukujućih
šećera tokom vremena, nakon 4-6h, učinak enzima pri 180 IU/g LF i 270 IU/g LF izjedanačava.
Na slici 24. se može videti razlika u HPLC-profilima uzorka dobijenog nakon hidrolize i
kontrolnog uzorka (bez enzima), pri čemu se najuočljiviji uticaj enzima ogleda u većem sadržaju
monosaharida (retenciona vremena 11-12 minuta), u skladu sa rezultatima DNS analiza.

80

70
Ekvivalent glukoze, mM

60

50 90 IU/g
40 180 IU/g

30 270 IU/g
kontrola
20

10

0
0 2 4 6
Vreme, h

Slika 23: Hidroliza lignocelulozne frakcije suncokretove sačme katalizovane slobodnom

celulazom

50
Slika 24: Hromatogrami sadržaja rastvornih šećera u reakcionoj smeši nakon hidrolize LF
slobodnom celulazom (plava linija) i kontrolnog uzorka - bez enzima (crna linija)

Na slici 25. može se uočiti sporiji proces hidrolize na osnovu rasta koncentracije redukujućih
šećera tokom vremena, što se može pripisati otežanom pristupu supstrata aktivnim centrima
molekula enzima imobilisanim u porama čestica nosača. Za razliku od hidrolize sa slobodnim
enzimom, sada je korišćeno više različitih aktivnosti enzima pri ispitivanju efekata hidrolize LF.
Kao i kod hidrolize sa slobodnim enzimom, nakon 3 h hidrolize, pri aktivnosti slobodnog enzima
270 IU/g LF postignuta je najveća vrednost ekvivalenta glukoze (≈ 40 mM). U poreĎenju
saprethodnim eksperimentom, proces hidrolize za aktivnost 180 IU/ g LF pokazuje bolje
rezultate za razliku od aktivnosti 270 IU/ g LF. Interesantno je da se i sa 90 IU/g ostvaruje sličan
rezultat, pa dalje povećanje koncentracije imobilisanog biokatalizatora nije ekonomski
opravdano. PoreĎenjem HPLC-profila uzorka dobijenog nakon hidrolize imobilisanom
celulazom i kontrolnog uzorka - bez enzima (slika 26.), može se uočiti da je sadržaj
monosaharida (retenciona vremena 11-12 minuta) u reakcionoj smeši značajno veći nakon
dejstva enzima, što potvrĎuje rezultate dobijene DNS metodom.

51
 50
45

Ekvivalent glukoze, mM
40
35 10 IU/g
30
45 IU/g
25
90 IU/g
20
180 IU/g
15
10 270 IU/g
5 kontrola
0
0 1 2 3 4 5

Vreme, h

Slika 25: Hidroliza lignocelulozne frakcije suncokretove sačme katalizovane imobilisanom

celulazom

Slika 26: Hromatogrami sadržaja šećera u reakcionoj smeši nakon hidrolize LF imobilisanom
celulazom (plava linija) i kontrolnog uzorka - bez enzima (crna linija)

52
 5. ZAKLJUČAK

Na osnovu rezultata eksperimenata izvedenih u okviru ovog master rada mogu se izvesti sledeći
zaključci:

 U imobilizaciji celulaze iz A. niger je dokazano da se najefikasnija imobilizacija odigrava

posredstvom jonskih interakcija izmeĎu enzima i primarnih amino-grupa prisutnih na
hidrofilnom, umereno poroznom nosaču - LifetechTM ECR8409F pri čemu je evidentan uticaj
veličine pora i dužine “nožice”. Duže nožice omogućuju optimalnu udaljenost molekula
enzima od površine nosača i njegovo neometano katalitičko delovanje. TakoĎe, uočeno je da
se primenom nosača sa većim porama dobija preparat veće aktivnosti.

 Optimizacijom uslova imobilizacije celulaze na LifetechTM ECR8409F nosaču utvrĎeno je da

se pri pH 6 dobija imobilisani enzimski preparat najveće aktivnosti.

 Imobilisani enzimski preparat visoke aktivnosti dobijen je nakon 3 sata imobilizacije pri
početnoj koncentraciji proteina od 23,3 mg/g nosača (400 IU/g) i 28 mg/g nosača (450 IU/g).

 Korišćenjem slobodne i imobilisane celulaze u reakciji hidrolize lignocelulozne frakcije

suncokretove sačme utvrĎeno je da je hidroliza sa slobodnim enzimom tekla brže gde se već u
prvom satu uočava nagli skok koncentracije redukujućih šećera (izražen preko ekvivalenta
glukoze) i DNS metodom detektuju koncentracije od oko 70 mM, ali da je i imobilisani enzim
efikasan katalizator procesa, pri čemu se oslobaĎa oko 45 mM redukujućih šećera. Iako su
korišćenjem imobilisane celulaze u poreĎenju sa slobodnim enzimom detektovane niže
koncentracije redukujućih šećera, mogućnost višekratne upotrebe imobilisani preparat čini
konkurentnim za primenu u hidrolizi LF suncokretove sačme, ali i drugih sličnih supstrata.

53
 6. LITERATURA

1. Raissa Pieroni Vaz, Leonora Rios de Souza Moreira, Edivaldo Ximenes Ferreira Filho: An
overview of holocellulose-degrading enzyme immobilization foruse in bioethanol production,
Laboratory of Enzymology, Department of Cellular Biology, University of Brasilia, Brasilia
(2016);

2. Katarina Banjanac: Imobilizacija enzima na nanočestice SiO2 modifikovane organosilanima,

Doktorska disertacija, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd (2017);

3. Zorica Knežević-Jugović: Enzimsko inženjerstvo, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-

metalurški fakultet, Beograd (2008);

4. Liang JF, Li YT, Yang VC: Biomedical application of immobilized enzymes, Journal of
Pharmaceutical Sciences, (2000); 89(8):979-990;

5. Guisán JM: Immobilization of Enzymes and Cells, Humana Press, (2006);

6. Marijana Pešić: Biotehnološka obrada proteinskog izolata suncokretove sačme i sporednih

proizvoda, Završni rad, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd
(2016);

7. V. Juturu, J.C. Wu: Microbial cellulases: Engineering production and

applications,Renewable andSustainable Energy Reviews, 33/2014, 188-203;

8. A. Singh, R. C. Kuhad, O. P. Ward: Industrial application of microbial cellulases, in

Lignocellulose Biotechnologgy: Future Prospects, R. C. Kuhad and A. Singh, Eds., pp. 345–358,
I.K.International Publishing House, New Delhi, India, (2007);

9. H. K. Sreenath, A. B. Shah, V. W. Yang, M. M. Gharia, T. W. Jeffries: Enzymatic polishing of

jute/cotton blended fabrics, Journal of Fermentation and Bioengineering, vol. 81, no. 1, pp. 18–
20, (1996);

10. H. Graham, D. Balnave: Dietary enzymes for increasing energy availability, in

Biotechnology in Animal Feeds andAnimal Feedings, R. J.Wallace, A. Chesson, Eds., pp. 296-
309, VHC,Weinheim, Germany, (1995);

11. Weetall HH: Applications of immobilized enzymes, Academic Press New York, (1975);

12. Liang JF, Li YT, Yang VC: Biomedical application of immobilized enzymes, Journal of
Pharmaceutical Sciences, (2000); 89(8):979-990;

13. Mohamad NR, Marzuki NHC, Buang NA, Huyop F, Wahab RA: An overview of technologies
for immobilization of enzymes and surface analysis techniques for immobilized enzymes,
Biotechnology, Biotechnological Equipment, (2015), 29(2):205-220;

54
14. Demetrius L. Thermodynamics, Kinetics of Protein Folding: An Evolutionary Perspective,
Journal of Theoretical Biology, (2002), 217(3):397-411;

15. Zorica Knežević-Jugović: Enzimologija, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd (2007);

16. Mateo C, Grazú V, Pessela BCC, Montes T, Palomo JM, Torres R, LópezGallego F,
Fernández-Lafuente R, Guisán JM: Advances in the design of new epoxy supports for enzyme
immobilization–stabilization, Biochemical Society Transactions, (2007), 35(6):1593-1601;

17. https://www.slideshare.net/EssamYahya2/enzyme-immobilization-2-68372448

18. Radivoje Prodanović, Nenad Milosavić, Slobodan Jovanović, Zoran Vujčić: Imobilizacija
invertaze i glukoamilaze na makroporoznom kopolimeru glicidilmetakrilata i
etilenglikoldimetakrilata i njihova potencijalna primena u biotehnologiji, Naučni rad,
Univerzitet u Beogradu, Hemijski fakultet, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd (2003);

19. Aleksandra Milovanović: Primena imobilizovanog ćelijskog zida kvasca Saccharomyces

cerevisiae u proizvodnji invertnog šećera, Doktorska disertacija, Univerzitet u Beogradu,
Hemijski fakultet, Beograd (2011);

20.Tischer W, Wedekind F: Immobilized Enzymes: Methods and Applications, In: Biocatalysis -

From Discovery to Application. Edited: Fessner W-D, Archelas A, Demirjian DC, Furstoss R,
Griengl H, Jaeger KE, Morís-Varas E, Öhrlein R, Reetz MT, Reymond JL et al. Berlin,
Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg, (1999): 95-126;

21. Jelena M. Jović, Jelena D. Pejin, Sunčica D. Kocić-Tanackov, Ljiljana V. Mojović: Primena
gljiva koje razgrađuju lignocelulozu za proizvodnju bioetanola iz obnovljive biomase, Naučni
rad, Univerzitet u Beogradu, Tehnološko–metalurški fakultet, Beograd (2015);

22. Grupa autora: Biotehnološki praktikum I, 4. vežba: Određivanje koncentracije redukujućih

šećera DNS metodom, Tehnološko-metalurški fakultet, Beograd, (neobjavljena skripta);

23. Grupa autora: Biotehnološki praktikum I, 2. vežba: Bojene reakcije za proteine, Tehnološko-
metalurški fakultet, Beograd, (neobjavljena skripta);

55