UNIVERZITET U NIŠU

TEHNOLOŠKI FAKULTET U LESKOVCU

DIPLOMSKI RAD
UKLANJANJE FENOLA IZ VODE POMOĆU
PEROKSIDAZE IZ KROMPIRA

Mentor: Student:
prof. dr Živomir Petronijević Aleksandar Veličković 217/17

Leskovac, 2018.
 SADRŽAJ
1. UVOD ..................................................................................................................................... 3
2. OTPADNE VODE ................................................................................................................ 5
2.1. Komunalne otpadne vode ................................................................................................ 5
2.2. Industrijske otpadne vode ................................................................................................ 5
2.3. Atmosferske otpadne vode ............................................................................................... 6
3. OBRADA INDUSTRIJSKIH OTPADNIH VODA ........................................................... 7
3.1. Obrada industrijskih otpadnih voda zagađenih fenolima................................................. 8
4. FENOLI ............................................................................................................................... 10
4.1. Upotreba fenola .............................................................................................................. 12
4.2. Uticaj fenola na zdravlje ................................................................................................ 12
4.3. Pravna regulativa ........................................................................................................... 13
5. PEROKSIDAZE ................................................................................................................. 14
5.1. Podela i struktura ........................................................................................................... 14
5.2. Peroksidaza iz rena (horseradish peroxidase – HRP) (Armoracia rusticana G. M. Sch.) .
........................................................................................................................................ 16
5.3. Primena peroksidaza u biotehnologiji............................................................................ 19
5.4. Peroksidaza iz rena u tretmanu otpadnih voda .............................................................. 20
5.5. Peroksidaza iz krompira (Solanum tuberosum L.) ........................................................ 21
6. MATERIJALI I METODE ................................................................................................ 23
6.1. Materijal i pribor ............................................................................................................ 23
6.1.1. Rastvori ................................................................................................................... 23
6.2. Metode ........................................................................................................................... 24
6.2.1. Ekstrakcija enzima .................................................................................................. 24
6.2.2. Postupak uklanjanja fenola iz vode pomoću peroksidaze iz krompira ................... 24
6.2.3. Određivanje sadržaja fenola .................................................................................... 25
6.2.4. Određivanje aktivnosti peroksidaze ........................................................................ 25
7. REZULTATI ....................................................................................................................... 26
8. DISKUSIJA ......................................................................................................................... 31
9. ZAKLJUČAK ..................................................................................................................... 34
10. LITERATURA .................................................................................................................... 35
 Eksperimentalni deo ovog diploskog rada je rađen u spektroskopskoj laboratoriji,
Tehnološkog fakulteta u Leskovcu, Univerziteta u Nišu.

Veliku i iskrenu zahvalnost upućujem svom mentoru prof. dr Živomiru Petronijeviću na

prihvatanju saradnje, ukazanom poverenju i razumevanju, izdvojenom vremenu i stručnoj
pomoći tokom izrade i pisanja ovog rada. Takođe se zahvaljujem asistentu Saši Saviću na
pomoći tokom eksperimentalnog rada.
Hvala Vam!

2
 1. UVOD

Sve zemlje kao najveći problem navode otpadne vode nastale u industriji. Većinu pretnji
predstavljaju naftna industrija, hemijska industrija i proizvodnja maslinovog i eteričnog ulja.
Efekti industrija zajedno sa urbanizacijom i turizmom dovode do pogoršanja situacije. To bi
moglo podstaknuti razmišljanja da se u budućnosti sve više sprovode brojne politike koje se
temelje na boljem upravljanju vodama s povećanjem njihovog kvaliteta. Najbolje bi bilo sprečiti
nastajanje otpadnih voda brojnim poboljšanim proizvodnim procesima, a neizbežno nastali otpad
zbrinuti na što ekološki prihvatljiviji način. Zbog toga danas postoje mnogi načini obrade tih
voda kako bi one bile pogodne za ponovno korišćenje ili za ispuštanje u prirodne vodotoke tako
da negativno ne utiču na vodeni ekosistem kao i na druge elemente životne sredine
(Ljubisavljević et al., 2004).
Tradicionalni hemijski i biološki tretmani industrijskih otpadnih voda ne daju uvek
zadovoljavajuće rezultate. Zato, u cilju istraživanja nalazi se primena enzima (solubilnih i
imobilizovanih) izolovanih iz biljaka, gljiva i bakterija, kao i rekombinantno proizvedeni enzimi
(Lončar, 2012).
Enzimski tretmani se svrstavaju između dve tradicionalne kategorije: hemijskih i
bioloških procesa, s obzirom na to da uključuju hemijske reakcije koje se odvijaju posredstvom
biokatalizatora. Izolovani enzimi su poželjniji u odnosu na ceo organizam jer se postiže veća
specifičnost, moguće je odrediti aktivnost enzima, olakšano je rukovanje i skladištenje, a
koncentracija enzima ne zavisi od brzine rasta mikroorganizma. Zbog njihove velike
specifičnosti prema pojedinim vrstama ili klasama jedinjenja, enzimski procesi mogu biti
razvijeni specifično ciljajući određena jedinjenja štetna po okolinu (zagađivače). Jedinjenja koja
su kandidati za ovu vrstu tretmana su ona koja obično nije moguće tretirati efikasno ili pouzdano
koristeći tradicionalne tehnike. Pored toga, enzimski tretman može biti korišćen i kao
predtretman da bi se uklonilo jedno ili više jedinjenja koja ometaju korake koji slede u daljoj
obradi otpadne vode. Na primer, ako možemo selektivno da uklonimo inhibitor ili toksično
jedinjenje, onda ostatak organskog materijala može efikasno da bude obrađen biološkim
tretmanom, tako maksimalno smanjujući cenu čitavog postupka. Smatra se da u sledećim
slučajevima enzimski tretman može biti od najveće koristi u tretmanu fenolima ili bojama
zagađene vode (Lončar, 2012):
 Uklanjanje specifičnih, često veoma toksičnih, jedinjenja iz kompleksnih smeša
industrijskog otpada pre biološkog tretmana.
 Uklanjanje specifičnih jedinjenja iz razblaženih smeša, za koje konvencionalni
biološki tretman (mešane kulture) nije isplativ.
 Dodatno prečišćavanje već tretirane otpadne vode, kako bi se ispunili kriterijumi za
ograničenja za određeni kontaminant.

3
  Tretman otpada koji se generiše povremeno ili na izolovanim lokacijama, uključujući
mesta ispuštanja hemikalija ili napuštene deponije, gde nema stalnih instalacija za
prečišćavanje.
 Tretman visokokoncentrovane otpadne vode (male zapremine) na mestu generisanja u
fabričkim postrojenjima sa ciljem da se omogući ponovno korišćenje procesne vode,
da bi se omogućila regeneracija rastvornih produkata ili da bi se uklonili zagađivači
za koje se zna da uzrokuju problem pri mešanju sa ostalim otpadom iz postrojenja.

Trenutna istraživanja primene enzima se fokusiraju na rešavanju ovih problema, posebno

na razvoj tretmana enzimskim sistemima koji ciljano uklanjaju aromatična jedinjenja iz vodenih
rastvora. Halogenovana jedinjenja verovatno predstavljaju grupu najopasnijih zagađivača po
okolinu zbog njihove široke rasprostranjene upotrebe kao biocidnih, fungicidnih, dezinfikujućih
reagenasa, rastvarača i drugih industrijskih hemikalija. Halogenovani fenoli imaju dezaktivirano
aromatično jezgro i čine značajnu kategoriju veoma toksičnih i teško razgradljivih zagađivača u
raznim industrijskim granama (Lončar, 2012).
U ovom radu analiziran je proces uklanjanja fenola iz vodenog rastvora pomoću
peroksidaze iz krompira. Cilj rada je bio da se istraži mogućnost upotrebe peroksidaze koja je
dobijena ekstrakcijom iz krompira za proces uklanjanja fenola iz vodenog rastvora na sobnoj
temperaturi. U okviru optimizacije procesa analiziran je uticaj koncentracije fenola, peroksidaze
i vodonik peroksida, kao i uticaj pH vrednosti i temperature. Pored toga, analiziran je i uticaj
prisustva niskomolekulanog polietilen glikola kao stabilizirajućeg agensa za peroksidazu. Na
osnovu dobijenih rezultata određeni su optimalni parametri za rad, kao i optimalne koncentracije
svih učesnika reakcije.

4
 2. OTPADNE VODE

Otpadne vode nastaju upotrebom vode iz raznovrsnih vodovodnih sistema za određene

namene, pri čemu dolazi do promena njenih prvobitnih karakteristika: fizičkih, hemijskih i
mikrobioloških. Prema svom poreklu mogu se podeliti na (Perušina, 2010):
 Komunalne otpadne vode - upotrebljene otpadne vode iz domaćinstva, ustanova,
škola, bolnica, ugostiteljstva,
 Industrijske otpadne vode - upotrebljene vode iz industrijskih pogona,
 Atmosferske otpadne vode - nastale od padavina koje se više ili manje zagađuju u
kontaktu s nižim slojevima atmosfere, površinama tla, krovovima.

2.1. Komunalne otpadne vode

Komunalne otpadne vode podrazumevaju sve otpadne vode koje nastaju zbog kućnih
aktivnosti, za zadovoljavanje životnih funkcija, sanitarnih potreba i čišćenja saobraćajnih puteva.
Kada govorimo o podeli otpadnih voda iz domaćinstva, razlikujemo (Ljubisavljević et al., 2004).
 Sive vode - predstavljaju otpadne vode iz kupatila, perionica veša i bazena; ne sadrže
puno čvrstih materija i postoji mogućnost prenamene, ako postoji razvodni system za
odvod otpadnih voda iz domaćinstva, mogu se koristiti za zalivanje vrtova.
 Crne vode - predstavljaju otpadne vode iz kuhinja i sanitarnih čvorova.

Temperatura otpadnih voda iz domaćinstva povišena je u poređenju sa vodom iz sistema

vodosnabdevanja zbog upotrebe tople vode u kuhinjama i kupatilima, i u kanalizacijskom
sistemu zbog popratnog procesa biorazgradnje. Gradske vode neprijatnog su izgleda, boje i
mirisa, što uzrokuje dodatno zagađenje prijemnika u estetskom smislu. Bez obzira na to,
odgovarajućim postupcima za obradu otpadnih voda, taj problem se može rešiti (Ljubisavljević et
al., 2004).

2.2. Industrijske otpadne vode

Generalno, industrijske otpadne vode predstavljaju sve veći problem u svetu. Različiti
tehnološki procesi u industrijama uslovljavaju i različite sastave otpadnih voda pa prema
tomepostoje dve osnovne grupe (Tušar, 2004):
 biološki razgradive - one koje se mogu mešati sa gradskim otpadnim vodama,
odnosno odvoditi zajedničkom kanalizacijom (npr. iz nekih prehrambenih industrija).

5
  biološki nerazgradive - one koje se moraju podvrgnuti prethodnom postupku obrade
pre mešanja sa gradskom otpadnom vodom (npr. iz hemijske, metalne industrije).

Industrijske otpadne vode se mogu podeliti na zagađene vode i uslovno čiste, pri čemu se
u uslovno čiste vode ubrajaju one vode koje upotrebom nisu pretrpele značajne fizičke i hemijske
promene pa se mogu bez prethodne obrade ispustiti u kanalizaciju ili prijemnik. Većina industrija
upotrebljava znatne količine vode koje na ispustu imaju povišenu temperaturu, što za posledicu
ima toplotno zagađenje prirodnih prijemnika. Različite industrije imaju problem zbog sastava
otpadne vode, jer mogu sadržati sastojke koji su toksični ili teško razgradivi te ugroziti životnu
sredinu. Tu spadaju teški metali, kiseline, baze, nafta i naftni derivati, masti i mineralna ulja,
radioaktivni izotopi, sintetska hemijska jedinjenja, odnosno sastojci koje ne sadrže prirodne
vode. Industrijska otpadna voda je u većini slučajeva opterećena visokim sadržajem materija
organskog i/ili neorganskog porekla, visokim ili niskim pH-vrednostima, policikličkim
aromatičnim jedinjenjima, fenolima, organometalnim jedinjenjima i pesticidima koji
predstavljaju sve veću opasnost i veliki problem. Potrebno je naći odgovarajući način obrade
otpadne vode kako bi se koncentracije zagađujućih materija spustile na maksimalno dozvoljene
vrednosti (Tušar, 2004).

2.3. Atmosferske otpadne vode

Atmosferske otpadne vode smatraju se uslovno čistim vodama, jer ispiraju atmosferu i
otapaju ili prema površini Zemlje prenose sve sastojke koji se na određenom području ispuštaju u
atmosferu ili pak pod uticajem vetrova dolaze iz drugih, znatno udaljenijih krajeva. Primer za to
su kisele kiše koje ugrožavaju šume, građevine i slično, crvene ili žute kiše koje nastaju kao
posledica ispiranja pustinjske prašine koja dopire čak iz Afrike (Perušina, 2010).
U grupu atmosferskih otpadnih voda mogu se svrstati i vode koje nastaju topljenjem
snega. Posebno su zagađeni oni dotoci koji se javljaju pri naglom zagrevanju, i to u fazama
završnog topljenja snega kada sva nečistoća prikupljena tokom perioda niskih temperatura
dospeva u kanalizaciju (Perušina, 2010).

6
 3. OBRADA INDUSTRIJSKIH OTPADNIH VODA

Izbor postupka obrade otpadne vode, pre nego što se ispusti u prirodni recipijent, zavisi
prvenstveno od količine i sastava otpadne vode, kao i od zahtevanog kvaliteta vode na mestu
ispuštanja. Obično je reč o kombinaciji niza postupaka kako bi efekat svakog od pojedinih
postupaka i njihova kombinacija dali što bolje krajnje rezultate. Postupci obrade otpadne vode
mogu biti fizički, hemijski i biološki, a dele se najčešće na sledeće faze (Perušina, 2010):
 Mehanička ili primarna obrada;
 Biološka ili sekundarna obrada;
 Fizičko-hemijska ili tercijarna obrada.

Mehanička obrada podrazumeva obradu sa ciljem uklanjanja grubih i plivajućih materija

koje bi mogle smetati u daljim procesima obrade. Zato se i ovi postupci nazivaju primarnim
(Mantzavinos and Kalogerakis, 2005).
Sekundarna obrada iskorišćava aktivnost mikroorganizama, najčešće bakterija u
razgradnji organske materije. Procesi se mogu podeliti na aerobne i anaerobne. Aerobni proces
odvija se uz prisustvo kiseonika, a efektivniji je kada su koncentracije hranjivih materija niže,
odnosno kada vrednost hemijske potrošnje kiseonika, HPK, iznosi do 1,0 g dm-3. Obradom
otpadnih voda koje imaju visoke vrednosti HPK nastaju velike količine aktivnog mulja, koji se
mora izdvojiti iz sistema obrade otpadne vode u svrhu uklanjanja viška žive i mrtve organske i
neorganske materije, kako bi se proces mogao kontinuirano izvoditi i održavati. Nakon što se
izdvoji iz sistema, mulj se mora stabilizirati pri čemu se uništavaju patogeni mikroorganizmi.
Najčešće upotrebljavani proces stabilizacije je anaerobna digestija tokom kojeg se stvaraju
mehurići metana i ugljen dioksida, pa se nakon toga vrši ovlaživanje mulja kako bi se on dalje
mogao pravilno zbrinuti. Dalje zbrinjavanje aktivnog mulja je poseban problem na čijem se
rešenju radi. Takav mulj opet s druge strane pokazuje veliku adsorpcijsku moć i na njega se
mogu adsorbirati biološki teško razgradive i toksične materije pa sa njime zajedno izdvojiti iz
sistema obrade (Ljubisavljević et al., 2004). Anaerobni procesi se sastoje od niza mikrobioloških
procesa, koji razgrađuju organska jedinjenja sve do metana i ugljenik dioksida bez prisustva
kiseonika. U prvom stadijumu razgrađuju se veliki organski molekuli hidrolizom, kao što su
polisaharidi i polifenoli, do njihovih monomera. Zatim se ti molekuli dalje razgrađuju do
organskih kiselina acetogenim bakterijama, i na kraju uz metanogene bakterije, kiseline prelaze u
metan i ugljenik dioksid. Oba navedena procesa mogu biti i individualna, ali mogu biti i deo
sistema obrade (Slika 1). Nakon bioloških procesa potrebna je još dodatna obrada industrijskih
otpadnih voda (Mantzavinos and Kalogerakis, 2005).

7
 Slika 1 Proces obrade industrijskih otpadnih voda (Tušar, 2004)
Tercijarna obrada (Slika 1) uključuje fizičke (adsorpcija na čvrsti adsorbens, ozračivanje,
reverzna osmoza i destilacija) i hemijske procese (neutralizacija, flokulacija, koagulacija,
hemijska precipitacija, jonska izmena i oksidacija). Navedeni procesi mogu se takođe
kombinovati u proces za obradu otpadnih voda (Tušar, 2004).

3.1. Obrada industrijskih otpadnih voda zagađenih fenolima

Potrebno je naći alternativne postupke koji bi bili delotvorni pri obradi voda zagađenih
koncentrovanim i/ili toksičnim i biološki nerazgradivim organskim materijama poput fenola.
Najbolji primer za takve zagađene vode su industrijske otpadne vode nastale u proizvodnji
maslinovog ulja. Toksičnost ovakvih otpadnih voda potiče upravo od fenolnih jedinjenja.
Identifikovano je trideset različitih vrsta fenola prisutnih u vegetativnim vodama kao što su:
monociklični aromatični molekuli - hidroksitirosol, tirosol, katehol, metilkatehol i jedinjenja sa
većim molekulskim masama dobijeni polimerizacijom jednostavnijih jedinjenja. Efluenti iz
drugih industrijskih pogona takođe mogu sadržati fenole u svom sastavu, ali ipak ne u tolikim
količinama kao vegetativne vode (Tabela 1) (Dragičević et al., 2010).
Tabela 1 Koncentracija fenola u otpadnim vodama nekih industrijskih procesa (Dragičević et al.,
2010)
Industrijski procesi γ (fenoli) / g dm-3

Proizvodnja plastičnih masa 0,6 - 2

Petrohemijska industrija 0,05 - 0,6
Industrija papira i celuloze 0,01
Pogoni za obradu drveta 0,15
Proizvodnja maslinovog ulja 0,15

8
 Poslednjih godina predložen je niz načina obrade ovakvih otpadnih voda pomoću fizičko-
hemijskih procesa (ultrafiltracija, reverzna osmoza, adsorpcija, flokulacija), procesa ekstrakcije,
naprednih procesa oksidacije, kompostiranje (Dermeche et al., 2013). Do sada se najefikasnije
pokazala biološka obrada. Razlog tome je što ovakav način obrade ne zahteva velika financijska
ulaganja i ne utiče štetno na okolinu i ne zahteva dodatna ulaganja oko zbrinjavanja nastalog
otpada (Paraskeva and Diamadopoulos, 2006).

9
 4. FENOLI

Fenoli su grupa jedinjenja koji se sastoje od hidroksilne grupe (-OH) vezane direktno na
aromatični ugljovodonik. Iako se fenoli najčešće spominju kao grupe sa fenolnim prstenom oni
su zapravo veoma različita grupa sekundarnih metabolita zbog čega su u literaturi prisutni mnogi
načini njihove klasifikacije: prema strukturi, na osnovu broja ugljenikovih atoma u molekulu i
biološke aktivnosti, biosintetskog puta i sl. Jedna su od osnovnih strukturnih jedinica za različite
sinteze organskih jedinjenja uključujući poljoprivredne hemikalije i pesticide. Prirodno se nalaze
u raspadajućim organskim materijama kao što je trulo povrće i ugalj. Na sobnoj temperaturi,
fenol je providna, bezbojna kristalna masa, beli prah ili sirupasta tečnost nakon mešanja sa
vodom. Kristali su higroskopnih svojstava, a na vazduhu mogu promeniti boju od roze do
crvene. Prepoznatljiv je po intenzivnom katranastom mirisu, topljiv je u alkoholu, glicerolu, nafti
i vodi. Fenol se može dobiti frakcijskom destilacijom ugljenih katrana, oksidacijom toluena,
fuzijom natrijumovog benzensulfonata sa natrijumovim hidroksidom ili grejanjem
monohlorbenzena sa natrijumovim hidroksidom pod visokim pritiskom (Basha et al., 2010).
Fenoli zagađuju vazduh, vodu i zemlju na način da dovode do promena hemijskih i
bioloških svojstava, ciklusa hrane, i mikrobiološke i enzimske aktivnosti u vodi i zemljištu.
Jednom ispušteni u prirodne prijemnike mogu biti biorazgrađeni, bioakumulirani,
netransformisani i blokirani na način da se vežu u tlu i učestvuju u nekim nebiološkim
transformacijama ili fizičkim procesima. Ako su u životnoj sredini prisutni Fe2O3, MnO2 i glina
kao abiotički katalizatori, ili enzim fenoloksidaza kao biotički katalizator proizveden od biljaka,
bakterija i gljiva, fenoli se mogu pretvoriti u polimerna ili jednostavnija jedinjenja (Slika 2).
Tačnije, transformišu se u benzoevu kiselinu, hidrokinon ili katehol. Katehol se dalje prevodi do
4-furanoktene kiseline ili 2-hidroksi-cis,cis-mukonske kiseline pa sve do krajnjih produkata:
vode, ugljen dioksida, metana i amonijaka (Slika 3) (Michalowicz and Duda, 2007).

Slika 2 Biotičke i abiotičke katalitičke transformacije fenolnih jedinjenja u okolinu (Michalowicz

and Duda, 2007)
10
 Na oba procesa, biotički i abiotički, mogu dodatno uticati pH-vrednost, temperatura,
prisustvo drugih katalizatora, vreme zadržavanja i koncentracija katalizatora. Tako razgrađena
fenolna jedinjenja mnogim kvascima, bakterijama i plesnima služe kao bogat izvor ugljenika i
energije. Okolina je, dakle, sama sposobna razgraditi fenole, nego za to je potrebno preklapanje
više uslova kako bi do te transformacije uopšte došlo i ona je moguća kod niskih koncentracija
fenola (Michalowicz and Duda, 2007).

Slika 3 Razgradnja fenola u okolinu do krajnjih produkata (Michalowicz and Duda, 2007)

Otpadna voda se ne sme bez prethodne obrade ispustiti, jer nekontrolisano ispuštanje
može uzrokovati velike probleme u okolinu i na ljudsko zdravlje. Zato je kvalitet obrađene
industrijske otpadne vode u odnosu na maksimalno dozvoljenu količinu zagađujućih materija u
vodama regulisan zakonskim propisima. Tako se Pravilnikom o graničnim vrednostima emisija
otpadnih voda propisuju granične vrednosti emisija u otpadnim vodama pre njihovog ispuštanja
u javne odvode ili u septičke ili sabirne jame i u svim obrađenim ili neobrađenim otpadnim
vodama koje se ispuštaju. Granične vrednosti emisija otpadnih voda koje se ispuštaju u
površinske vode ili u sistem javnih odvoda, utvrđuju se dozvoljenim koncentracijama
zagađujućih materija i/ili opterećenjima u otpadnim vodama. Kako bi se voda mogla ispustiti u
javni drenažni sistem mora se zadovoljiti granična vrednost koncentracije fenola od 10 mg dm-3,
a za ispuštanje u površinske vode propisana je granična vrednost od 0,1 mg dm-3 (Janton, 2015).
Fenoli su prisutni u otpadnoj vodi različitih industrija, poput rafinerija (6-500 mg/L),
proizvodnji koksa (28-3900 mg/L), obradi uglja (9-6800 mg/L) i u petrohemijskoj industriji (2,8-
1220 mg/L) (Berardinelli et al., 2008). Drugi izvori fenolnih zagađivača su farmaceutska

11
industrija, industrija plastike, drvnih proizvoda, boja i papirna industrija (0,1-1600 mg/L)
(Contreras et al., 2003).

4.1. Upotreba fenola

Pred kraj 19. veka fenoli su se primenjivali u sintezi boja, aspirina, a jedno od najvećih
otkrića je pikrinska kiselina. Njene soli sa metalima, pikrati, vrlo su osetljive na udarce i koriste
se kao eksplozivi. Pikratima se nazivaju i molekularni kompleksi pikrinske kiseline sa
aromatičnim ugljovodonicima, koji se koriste u pročišćavanju i identifikaciji aromatičnih
ugljovodonika. Takođe je otkriveno da se fenoli mogu kondenzovati sa aldehidima za dobijanje
smolastih jedinjenja pa se taj proces još i danas koristi. Formaldehidne smole su temelj
najstarijih plastika i dalje su u upotrebi za izradu jeftinih duromera koji se koriste u izradi
električne opreme. Ove smole se takođe mogu pronaći u izradi proizvoda od drva (Basha et al.,
2010).
Kao čista supstanca, fenol se koristi kao dezinfekciono sredstvo, za pripremu krema, pena
za brijanje (zbog svojih germicidnih osobina i kao lokalni anestetik), u veterini kao želudačni
anestetik, kao ekstrakciono sredstvo u rafinerijama i proizvodnji lubrikanata, kao reagens u
hemijskim analizama itd. Najviše se koristi (35%) za proizvodnju fenolnih smola poput fenol-
formaldehidnih smola (bakelit) koje se koriste kao jeftini termoizolatori u građevini,
automobilskoj i industriji kućnih aparata. Reakcijom sa acetonom može da se prevede u bisfenol
A, koji je monomer za proizvodnju epoksi-materijala (28%). Takođe, selektivnom katalitičkom
hidrogenizacijom se dobijaju cikloheksanon i cikloheksanon-cikloheksanol smeše.
Cikloheksanon se kasnije prevodi u oksim i dalje u ɛ-kaprolaktam, monomer za dobijanje
najlona 6 (16% od proizvodenog fenola). Smeša cikloheksanon-cikloheksanol se oksiduje
azotnom kiselinom do adipinske kiseline, jednog od monomera za proizvodnju najlona 6,6.
Fenol se takođe koristi za dobijanje polifenoksi i polisulfonskih polimera, poliestera otpornog na
koroziju i poliester poliola. Može biti preveden u ksilenole, alkilfenole, hlorfenole, aniline i
druge intermedijere u procesima proizvodnje surfaktanata, đubriva, eksploziva, tekstila, gume,
plastike i antioksidanasa, lekova itd (Lončar, 2012).

4.2. Uticaj fenola na zdravlje

Sterilišuće dejstvo fenola je otkrio engleski hirurg Džozef Lister 1865. godine.
Germicidna aktivnost fenola je posledica njegove sposobnosti da denaturiše proteine. Sa druge
strane, ima značajan uticaj na zdravlje ljudi (Zuzana et al.,2009). Fenoli štetno deluju na ljudsko
zdravlje. Toksični su i uzrokuju razne zdravstvene tegobe. Izloženost fenolima na bilo koji način
može uzrokovati sistematsko trovanje. Deluju nagrizajuće i uzrokuju hemijske opekotine u
kontaktu sa ćelijama, a svojom izloženošću koži uzrokuju nekrozu. Simptomi sistematskog
trovanja uključuju prolazne CNS (centralni nervni sistem) stimulacije, a zatim se brzo može
pojaviti i CNS depresija. Napadi se mogu pojaviti u roku od nekoliko minuta ili mogu biti
odloženi do 18 sati nakon izlaganja. Ostali simptomi uključuju mučninu, methemoglobinemiju,

12
hemolitičku anemiju, obilno znojenje, aritmiju, plućni edem i tahikardiju. Osim što štetno deluju
na ljudsko zdravlje nakupljanjem u okolinu mogu takođe izazvati niz problema za sve ekološke
komponente (Basha et al., 2010). Proizvodnja i transport fenola, kao i njegova mnogostruka
upotreba može da dovede do kontakta radnika sa ovim jedinjenjem putem udisanja, ingestije,
kontakta sa kožom ili očima i apsorpcijom preko kože. Koma, konvulzije, cijanoza i smrt su
rezultati prekomernog izlaganja fenolu. Od unutrašnjih organa, fenol pogađa jetru, bubrege,
pluća i vaskularni sistem. Unošenje 1 g fenola je smrtonosno za ljude (Zuzana et al., 2009).

4.3. Pravna regulativa

Otpadne fenolne vode se ne smeju ispuštati u otvorene tokove pre predtretmana zbog
toksičnosti fenola i njegovih derivata. Zbog toksičnih efekata ovih jedinjenja američka Agencija
za zaštitu okoline (Environmental Protection Agency, EPA) je postavila standard za
prečišćavanje vode na 1 µg/L fenola u vodi za piće. Šta više, studija ove agencije je pokazala da
korišćenje hlora za dezinfekciju fenolne vode može da dovede do stvaranja toksičnog 2-
hlorfenola. Gornja granica određena regulativama za ispuštanje fenolne otpadne vode u otvorene
tokove se razlikuje od zemlje do zemlje, ali se uglavnom kreće oko 10 mg/L (Yamada et al.,
2005). U Republici Srbiji ispuštanje otpadne vode je regulisano brojnim zakonima i pravilnicima
koji se većim delom slažu sa međunarodnim zakonima, poput pravila EPA da se fenol u vodi za
piće ne sme nalaziti u koncentraciji većoj od 1 µg/L.
Uredbom o klasifikaciji voda (Službeni glasnik SRS, br. 5/68) vode su podeljene u četiri
klase i to:
1. klasa I – vode koje se u prirodnom stanju ili posle dezinfekcije mogu upotrebljavati ili
iskorišćavati za snadbevanje naselja vodom za piće, u prehrambenoj industriji i za gajenje
plemenitih vrsta riba (salmonida;
2. klasa II – vode koje su pogodne za kupanje, rekreaciju i sportove na vodi, za gajenje
manje plemenitih vrsta riba (ciprinida), kao i vode koje se uz normalne metode obrade
(kaogulacija, filtracija i dezinfekcija) mogu upotrebljavati za snadbevanje naselja vodom
za piće i u prehrambenoj industriji;
3. klasa III – vode koje se mogu upotrebljavati i iskorišćavati za navodnjavanje i u
industriji, osim prehrambene industrije;
4. klasa IV – vode koje se mogu upotrebljavati ili iskorišćavati samo posle posebne
obrade;
Po Pravilniku o opasnim materijama u vodama (Službeni glasnik SRS, br. 31/82)
maksimalni sadržaj fenola u vodama kategorija I i II je 1 µg/L, dok je za vode kategorija III i IV
ograničenje 300 µg/L. Prema Uredbi o graničnim vrednostima emisije zagađujućih materija u
vode i rokovima za njihovo dostizanje (Službeni glasnik RS, br.67/2011 i 48/2012) granična
vrednost emisije fenola za tehnološke otpadne vode, pre ispuštanja u javnu kanalizaciju je 50
mg/L.

13
 5. PEROKSIDAZE

5.1. Podela i struktura

Peroksidaze predstavljaju superfamiliju proteina koji sadrži tri različite klase peroksidaza
(Passardi et al., 2005):
а) Intracelularne peroksidaze (klasa 1, E.C. 1.11.1.5/6/.11);
б) Ekstracelularne peroksidaze gljiva (klasa 2, E.C. 1.11.1.13/.14);
в) Ekstracelularne peroksidaze biljaka (klasa 3, E.C. 1.11.1.7).
Svi živi organizmi produkuju peroksidaze, a o njihovoj zastupljenosti govori i podatak da
je poznato blizu 11000 sekvencija peroksidaza sakupljenih u jedinstvenoj internet bazi
posvećenoj ovog grupi enzima (PeroxiBase). Klasifikacija peroksidaza je kompleksna, a počinje
sa podelom na peroksidaze koje sadrže ili ne sadrže hem prostetičnu grupu, koje obuhvataju
mnoštvo podklasa (Slika 4). Većina poznatih peroksidaza pripada superfamiliji neanimalnih
peroksidaza koja može da se podeli u tri velike klase na osnovu strukturne divergencije.
Neanimalne peroksidaze klase I se nalaze intraćelijski u biljkama, kvascima i bakterijama. Ovoj
klasi pripadaju citosolna askorbat oksidaza i citohrom c peroksidaza. Neanimalne peroksidaze
klase II i III se nalaze kod gljiva i biljaka i obične su locirane u vanćelijskom prostoru.
Neanimalne peroksidaze klase II su najbolje predstavljene primerima poput lignin degradirajuće
mangan-peroksidaze iz gljive Phanaerochaete chrysosporium, dok neanimalne peroksidaze klase
III obuhvataju široko proučavanu peroksidazu iz rena (Lončar, 2012).

Slika 4 Klasifikacija peroksidaza (Lončar, 2012).

14
 Peroksidaze specifične za biljke u svojoj strukturi imaju hem i pripadaju klasi 3
peroksidaza (u daljem tekstu peroksidaze).
Peroksidaze su glikoproteini koji sadrže po dva jona kalcijuma koji utiču na rastvorljivost
enzima kao i na strukturu aktivnog mesta (Huystee, 1987). U toku svog katalitičkog ciklusa
(peroksidativni ciklus), katalizuju redukciju vodonik peroksida uz pomoć elektrona koje uzimaju
od molekula kao što su fenolna jedinjenja, prekursori lignin, auksin ili sekundarni metaboliti
(Dunford, 1982). Uprkos tome što koriste širok spektar elektron donora imaju zajednički supstrat
gvajakol, pa im opšte ime može biti i gvajakol peroksidaze (Siegel, 1993). Niskospinskog +3
stanja gvožđa u kom je peroksidaza neaktivna mogu proizvesti neki supstrati (Metzler, 1977). U
odvojenom hidroksilnom ciklusu, peroksidaze mogu da katalizuju i nastajanje slobodno
radikalskih vrsta kiseonika (Slika 5).

Slika 5 Katalitički ciklus klase 3 peroksidaza (Passardi et al., 2005).

Peroksidaze mogu da katalizuju veliki broj reakcija što ukazuje na njihov značaj u
mnogobrojnim fiziološkim procesima kao što su metabolizam auksina, formiranje suberina i
lignina, odbrana od patogena, umrežavanje komponenata ćelijskog zida i klijanje semena. Kod
biljaka su peroksidaze prisutne u citoplazmi, peroksizomima, u sastavu ćelijskog zida, u
vakuolama, plazma membrani, mitohondrijama. Peroksidaze ćelijskog zida učestvuju u
polimerizaciji fenolnih jedinjenja i sintezi lignina, otpornosti na bolesti, degradaciji indol-3-
sirćetne kiseline i biosintezi etanola (Asada, 1992). Zbog toga peroksidaze imaju veoma važnu
ulogu u toku rasta i razvoja korena i nadzemnih organa tako da se i najintezivnija aktivnost

15
peroksidaza uočava upravo u mladom tkivu koje se diferencira i raste. Zapaženo je da do porasta
aktivnosti POD-a dolazi paralelno sa porastom količine lignina u ćelijskom zidu (Huystee, 1987).
Svaka promena u spoljašnjoj sredini može da indukuje promenu aktivnosti POD u
ćelijskom zidu, jer one imaju ulogu i u odbrani od stresa iz spoljašnje sredine (Huystee, 1987).
Sinteza peroksidaze u lišću različitog drveća je upotrebljavana kao parametar za monitoring i
mapiranje odbrane od aerozagađenja (Keller, 1974). POD kod vodenog cveta (Nymphaea) su
uključene u mehanizam zaštite od toksičnog dejstva kadmijuma (Lavid et al., 2001), tako što
katalizuju nastajanje fenolnog polimera koji kompleksira jone kadmijuma u vidu kristala. Osim u
otpornosti na teške metale peroksidaze mogu imati ulogu i u zaštiti od toksičnih organskih
molekula kao što je 2,4-dihloro fenol (Agostini et al., 2003).
Zahvaljujući hidroksilnom ciklusu, peroksidaze mogu katalizovati nastajanje vodonik
peroksida i superoksidnog radikala. Tako je u radu gde su semena Castanea sativa izložena
sušenju, uočena povećana produkcija ekstracelularnog superoksidnog radikala, nastalog u
reakciji redukcije vodonik peroksida cinamičnom kiselinom, katalizovanoj od strane
ekstracelularne peroksidaze ćelijskog zida (Roach et al., 2010). Proizvodnja vodonik peroksida u
apoplastu lista kravljeg graška (Vigna unguiculata) je katalizovana peroksidazom i ima ulogu u
toleranciji biljke na mangan (Fecht-Christoffer et al., 2006).

5.2. Peroksidaza iz rena (horseradish peroxidase – HRP) (Armoracia

rusticana G. M. Sch.)
Peroksidaza iz rena (na engl. horseradish peroxidase - HRP, EC 1.11.1.7) je enzim
izolovan iz korena rena koji se intenzivno koristi pre svega u biohemijskim procesima. Ova
peroksidaza se često koristi kod konjugata, da bi se utvrdilo prisustvo ciljanog molekula. HRP je
najpoželjniji enzim za detekciju antitela jer je najmanji i najstabilniji od tri najpopularnija
enzima (HRP, alkalna fosfataza i β-galaktozidaza) (Prodanovic, 2016).
HRP je jedan od enzima koji mogu katalizovati oksidaciju velikog broja organskih i
neorganskih jedinjenja zbog čega je našla primenu za različite namene od sinteze finih
hemikalija kao što su DOPA (L-3,4-dihidroksifenilalanin) i bifenoli, uklanjanja toksičnih
jedinjenja iz otpadnih voda u prečišćavanju voda, pa do primene u biosenzorima. Ova
peroksidaza, zajedno sa drugim hem peroksidazama, je jarko obojena, posebno pod UV
svetlošću. Ova osobina hem peroksidaza ih čini korisnim jer oni mogu biti vidljivi na različitim
talasnim dužinama svetlosti. Hem grupa u peroksidazi iz rena je jednostavnija od one kod sisara
i samim tim odlična polazna tačka u studijama hem peroksidaza i njenih funkcija. Pronađeno je
da, kada se HRP kombinuje sa drugim jedinjenjima, postaje visoko reaktivna prema ćelijama
tumora kod čoveka. To bi moglo da dovede do mnogih dostignuća u ciljanoj terapiji raka. HRP
je izolovana iz korena rena (Armoracia rusticana) i pripada feroprotoporfirinskoj grupi
peroksidaza. To je jednolančani polipeptid koji sadrži četiri disulfidna mosta. Predstavlja
glikoprotein, koji sadrzi 18% ugljenih hidrata. Od ugljenih hidrata zastupljeni su: galaktoza,
arabinoza, ksiloza, fukoza, manoza, manozamin i galaktozamin, u zavisnosti od specifičnog

16
izoenzima. Njegova molekulska masa (44 kDa) obuhvata polipeptidni lanac (33.890 Da), hem sa
Ca2+ (700 Da) i ugljene hidrate (9.400 Da). Izoelektrična tačka HRP izoenzima je u opsegu od
3,00 do 9,00. Postoji najmanje 7 HRP izoenzima. Enzim HRP-a, nađen u renu se intenzivno
koristi u biohemijskim procesima, prvenstveno zbog njene sposobnosti da pojača slab signal i
poveća detekciju ciljanog molekula (Prodanovic, 2016).
Struktura peroksidaze je prvi put određena pomoću rendgenske kristalografije 1997.
godine, i to na više različitih supstrata. To je α-helikoidni protein koji ima vezan hem kao
kofaktor (Prodanovic, 2016).
Strukturne koordinate proučavane su pomoću programa za vizuelizaciju RasMol i Protein
Structure Explorer. Strukturni podaci su analizirani u pogledu (Prodanovic, 2016):
1. dužine α-heliksa,
2. broja formiranih vodoničnih veza po ostatku,
3. broja molekula vode u rastojanju vodoničnih veza do 3,5 A po ostatku.

Postalo je odmah jasno da u osnovi postoje dve grupe α-heliksa u molekulu: dugi i kratki.
Prilikom definisanja dugih α-heliksa, koji imaju najmanje 10 aminokiselinskih ostataka,
utvrđeno je da oni doprinose 34% sekundarnoj strukturi HRP-a (Prodanovic, 2016). Ovo se bliže
odnosi na oblast doprinosa α-heliksa amidnoj IR traci na 1660 cm-1 (31%). Kraći α-heliksi, sa
manje od 10 ostataka, doprinose 14% strukturi HRP-a. Ovo ukazuje na činjenicu da su nisko-
frekventni amid I veze na 1650 cm-1 (20%) u velikoj meri zastupljene kod kratkih heliksa, dok
visoke frekvencije proizilaze najčešće od dužih helikoidnih segmenata. Postoji veliki broj
izoenzima peroksidaze iz rena, ali najčešći je tip C. HRP tipa C ima dva metalna centra, jednu
hem grupu sa atomom gvožđa i dva atoma kalcijuma (Slika 6).

Slika 6 Struktura hem grupe u HRP-u (Prodanovic, 2016).

17
 Hem grupa ima planarnu strukturu sa atomom gvožđa koji se drži čvrsto u sredini
porfirinskog prstena koji se sastoji iz četiri molekula pirola. Gvožđe ima dve otvorene vezane
strane, jedna iznad i jedna ispod ravni hem grupe. Hem grupa ima histidin (enzim) pridodat
proksimalnom histidin ostatku (His170) koji se nalazi ispod hem grupe. Drugi ostatak histidina,
koji se nalazi u delu iznad hem grupe, predstavlja mesto vezivanja za vodonik-peroksid pri
oksido-redukcionim reakcijama. Atom kiseonika će se vezati za ovu slobodnu stranu tokom
aktivacije. Šesta oktaedarska pozicija atoma gvožđa predstavlja aktivno mesto enzima. Tokom
enzimske reakcije, vezivanje vodonik-peroksida za atom gvozđa, stvara oktaedarnu strukturu oko
atoma gvozđa. Drugi mali molekuli se takođe mogu vezati za distalnu stranu, stvarajući istu
oktaedarnu strukturu (Prodanovic, 2016).
Slika 7 prikazuje trodimenzionalnu strukturu HRP-a. Hem grupa je u centru enzima i
prikazana je crnom bojom sa atomom gvozđa koji je predstavljen crvenom sferom. Dva atoma
kalcijuma su crne sfere i leže izmedju helikoidnih oblasti enzima, jedan u distalnom delu i jedan
u proksimalnom delu. α-Heliks i β-naborane ploče enzima su prikazani kao raznobojne spiralne
strukture. I hem grupa i atomi kalcijuma su od presudnog značaja aktivnost enzima i, isto tako,
na stabilnost enzima jer gubitak jednog od njih prouzrokuje nestabilnost (Rodríguez-López,
2001).

Slika 7 Trodimenziona struktura HRP-a (Prodanovic, 2016).

Peroksidaze su visoko specifične samo prema vodonik-peroksidu, dok prema drugom

supstratu pokazuju malu specifičnost (Griffin and Ting, 1978). Tako peroksidaza iz rena može
kao donore vodonika da koristi veliki broj različitih hemijskih jedinjenja kao što su fenoli,
aromatični amini, nitriti, boje, pa čak i jodidi, ferocijanid i druga. Utvrđeno je da enzim pored
peroksidatne aktivnosti, poseduje i oksidaznu aktivnost, odnosno da može da oksiduje veliki broj
hemijskih jedinjenja u prisustvu kiseonika (Aitken et al., 2003).
Molekulska masa peroksidaze iznosi 44kDa, dok je izoelektrična tačka u rasponu od 3,0
do 9,0 sa najmanje sedam izoenzima. HRP se lako kombinuje sa vodonik-peroksidom (H2O2) i

18
kao rezultat (HRP-H2O2) kompleks može oksidovati širok spektar hromogenih donora vodonika.
Takođe HRP može koristiti hemiluminescentne supstrate kao sto su luminol i izoluminol, i
fluorogene supstrate kao sto su tiramin, homovanilična kiselina, 4-hidroksifenol acetatna
kiselina.
Inhibitori HRP-a su natrijum-azid, cijanid, L-cistin, dihromat, etilentiourea,
hidroksilamin, sulfid, p-aminobenzoeva kiselina, Cd , Co2+, Cu2+, Fe3+, Mn2+, Ni2+, Pb2+
2+

(Sullivan et al., 1987).

pH optimum HRP je u opsegu od 6,0-6,5; aktivnost na 7,5 je 84% od maksimuma. Enzim
je najstabilniji u pH opsegu od 5,0-9,0.
Apsorpcioni odnos A403/A275 je mera sadržaja hema u enzimu peroksidazi, ne
aktivnosti enzima. Čak i preparati sa visokim vrednostima RZ-a, mogu imati nisku enzimsku
aktivnost (Prodanović, 2016).

5.3. Primena peroksidaza u biotehnologiji

Peroksidaze se najčešće primenjuju u kliničkoj biohemiji i enzimskim imunoesejima, ali
se u poslednje vreme sve češće pominje njihova upotreba i u biotehnologiji za tretman otpadnih
voda i uklanjanje fenola, sintezu različitih hemikalija kao što su DOPA i bifenoli, uklanjanje
peroksida iz industrijskog otpada i proizvodnju biosenzora. Aromatična jedinjenja koja se
najčešće mogu pronaći u otpadnim vodama su fenoli i oni predstavljaju toksična koja moraju biti
uklonjena pre nego što se izluče u okolnu sredinu. Enzimski tretman je jedna od metoda za
njihovo uklanjanje i većina tih metoda se zasniva na primeni peroksidaze iz rena u prisustvu
vodonik peroksida gde dolazi do polimerizacionih reakcija i precipitacije polifenolnih proizvoda
(Azevedo et al., 2003). Da bi se povećala efikasnost procesa i smanjila inaktivacija peroksidaze
ona se imobilizuje na različite nosače ili joj se dodaju polimeri kao što je polietilen glikol koji
formira zaštitni sloj u blizini aktivnog mesta enzima tako da ograničava napad fenoksi radikala
koji se formira u katalitičkom ciklusu (Aumiller et al., 2014).
Peroksidaza iz rena se uglavnom koristi kao reagens za organske sinteze i
biotransformacije, kao i u kuplovanim enzimskim analizama, hemiluminiscentnim analizama,
imunotestovima ali i u tretmanu otpadnih voda (obezbojavanje, uklanjanje ulja, fenola) (Aitken et
al., 2003).
Unapređenje poželjnih svojstava enzima, kao na primer njegova relativno dobra
stabilnost u vodenim i nevodenim sistemima, postiže se hemijskom modifikacijom i usmerenom
mutagenezom. Neke primene HRP u malim organskim sintezama uključuju N- i O-dealkilaciju,
oksidativno kuplovanje, selektivnu hidroksilaciju i reakcije prenosa kiseonika. Primena
peroksidaze u enantioselektivnim reakcijama oksidacije, na industrijskom nivou, zahteva znatno
smanjenje cene samog enzima po jedinici proizvoda. Rešenje ovog problema je bolje upravljanje
procesima sa H2O2 da bi se sprečila inaktivacija enzima ili korišćenje modifikovanih enzima sa
poboljšanom stabilnošću i katalitičkom efikasnošću (Diaz et al., 1998).

19
 Reakcije kuplovanja biološki aktivnih jedinjenja, katalizovane peroksidazom iz rena su
našle veliku primenu u sintezi lekova protiv kancera (Diaz et al., 1998).
Pokazano je da je peroksidaza iz rena efikasna u obezbojavanju otpadnih voda, kao i da
poseduje aktivnost u dužem vremenskom periodu pri prečišćavanju otpadnih voda industrije
papira. Peroksidaza iz rena, imobilisana na aluminijumske i hitozanske nosače, je efikasna pri
oksidaciji različitih hlorfenola u otpadnim vodama i zemljištu (Prodanović,2016). Imobilizacija
na magnetitu putem fizičke adsorpcije je efikasnija od umrežavanja enzima za nosač (Aumiller et
al., 2014). Istraživanja su pokazala značajno smanjenje koncentracije fenola u otpadnim vodama
industrije papira pri korišćenju imobilisane peroksidaze iz rena na poroznom nosaču na bazi
litijum-titana, stakla i keramike (Huang et al., 2003). Napravljen je biosensor za detekciju fenola
korišćenjem sol-gel tehnologije, pri čemu je peroksidaza “zarobljena” u konduktivan polimer
koji je nanošen na staklene ugljene elektrode. Biosenzor je pokazao nizak operacioni potencijal,
brz odgovor, visoku osetljivost i mikromolarnu detekciju različitih fenola (Jiang et al., 1998).
Takođe, dizajniran je biosensor visoke osetljivosti i reproduktivnosti, imobilizacijom
peroksidaze iz rena na tetraetil-ortosilikat sol-gel filmove zajedno sa holesterol-oksidazom
(Wicomb et al., 1989). Isto tako, komercijalna peroksidaza je koimobilisana sa holesterol-
oksidazom i holesterol-esterazom pomoću glutaraldehida, pri čemu su zadržale 76% svoje
početne aktivnosti. Ovi koimobilisani enzimski sistemi imaju moguću primenu kao senzori za
određivanje ukupnog holesterola. U novije vreme postoji veliko interesovanje za biosenzore koji
se baziraju na konduktivnim polimerima kao što je polianilin. Na primer, razvijen je biosensor
koji sadrži holesterol-oksidazu, holesterol-esterazu i peroksidazu sa prihvatljivom
temperaturnom stabilnošću i dobrom osetljivošću. Napravljen je i imobilizat pri čemu je
peroksidaza imobilisana samostalno ili zajedno sa holesterol-oksidazom na silicijumski nosač,
aktiviran reakcijom aminosilana i glutaraldehida (Ayranci and Duman, 2005). I imobilisana
peroksidaza i koimobilisana peroksidaza pokazale su dobru stabilnost pri različitim uslovima u
poređenju sa nativnom peroksidazom (Dabrowski et al., 2005).

5.4. Peroksidaza iz rena u tretmanu otpadnih voda

Posebna pažnja se danas pridaje razvoju zelene i održive tehnologije za tretman otpadnih
voda. Zbog uvođenja strogih zakona za prečišćavanje otpadnih voda razvijene su različite
metode tretmana otpadnih voda. Ove metode uključuju: adsorpciju pomoću aktivnog
uglja/smola, okisdaciju vlažnim vazduhom, ozonizaciju/napredni proces oksidacije,
elektrohemijsku oksidaciju, fotokatalitičku oksidaciju i aerobnu/anaerobnu degradaciju (Ayranci
and Duman, 2005). Najčešće korišćena metoda za ukljanaja fenola je adsorpcija pomoću
aktivnog uglja (Ahmaruzzaman, 2008). Nedostatak ove metode je što je proces regeneracije uglja
skup i nekompletan zbog delimične ireverzibilne adsorpcije. Napredni procesi oksidacije, kao na
primer H2O2/UV, ozon/H2O2/UV, Fentonova reakcija i TiO2/UV se danas češće koriste pri
uklanjanju sintetičkih organskih jedinjenja iz otpadnih voda. Ove metode su pogodne za tretman
ogromnih količina otpadnih vodagde je i procenat uklanjanja fenola, kao primarnog zagađivača,
veliki. Međutim, ne može se kontrolisati formiranje međuproizvoda koji su u sledećem koraku
procesa - biološkom prečišćavanju, toksični (Lee and Lim, 2005).

20
 Kod tretmana otpadnih voda pomoću aktivnog mulja, prevaziđeni su problemi sa
toksičnim međuproizvoda, ali ovaj pristup nije pogodan za visoke koncentracije zagađivača. U
poređenju sa konvencionalnim metodama, enzimi imaju veću specifičnost i mogu da podnesu
veliku koncentraciju zagađivača. Supstrat se taloži van rastvora i može se lako ukloniti, umesto
da se prenosi na sedeći sistem (Piccolo et al., 2000). Metod enzimskog uklanjanja fenola iz
otpadnih voda, koristeći peroksidaze je razvijen od strane Klibanov-a 1980-te. Prednost ove
metode je visoka specifičnost enzima, što rezultuje visokom efikasnošću uklanjanja fenola i
niskim rizikom formiranja sekundarnih polutanata. Takođe, enzimi zadržavaju svoju aktivnost i
pri visokim koncentracijama zagađivača, širokom opsegu pH i temperatura, smanjeno je
formiranje biomasa i lakša kontrola procesa (Barbosa et al., 2014).
Fenol je glavni zagađivač u otpadnim vodama iz petrohemijske, farmaceutske, naftne
industrije i sl. On je veoma korozivan, a izaziva dijareju, zamućen vid, ekskreciju tamnog urina.
Takođe, fenol je toksičan za ribe. Smrtonosna koncentracija fenola u krvi je oko 150 mg/100 ml.
Različiti tretmani se koriste za uklanjanje fenola, kao na primer adsorpcija, jonska izmena,
oksidacija i biološki tretman.
Istražđivanja koja su objavili Stanisavljević i Nedić odnose se na uklanjanje fenola
polimerizacijom. Polimerizacija fenola je izvršena pomoću enzima peroksidaze i vodonik–
peroksida. Peroksidaza konvertuje molekule fenola do slobodnih radikala i vraća ih u sistem, gde
slobodni radikali fenola reaguju međusobno formirajući poliaromatične proizvode. Ovi polimeri
su nerastvorni u vodi i lako je ih ukloniti. Konverzija fenola u svim eksperimentima je bila veća
od 90%, pri korišćenju prečišćene peroksidaze. Ustanovili su da dolazi do 94% polimerizacije
fenola pri njegovoj koncentraciji od 100 mg/L sa slobodnom peroksidazom, a do 62% sa
imobilisanom peroksidazom (Stanisavljević i Nedić, 2004).

5.5. Peroksidaza iz krompira (Solanum tuberosum L.)

Krompir je otpadni proizvod dobijen tokom proizvodnje skroba. To čini ostatak koji
ostaje posle pranja gotovo svog skroba od krompira i sastoji se od vodenog soka (90%), celuloze,
hemiceluloze, pektina, skroba, proteina, slobodnih aminokiselina i soli. Ispuštanje pulpe
krompira postaje problem zagađivanja životne sredine i faktor troškova, delom zbog ogromnih
količina ovog otpadnog proizvoda (Beaumont et al., 1990).
Aktivnost peroksidaze pulpe krompira analizirana je testiranjem njegove sposobnosti
oksidacije pirogalola u purpurogalin u prisustvu H2O2. Povećanjem mase pulpe krompira u
reakcionoj smeši dovelo je do progresivnog povećanja proizvodnje purpurogalina. Ovaj nalaz je
pokazao da je aktivnost perokidaze povezana sa pulpom krompira. Kada je preparat proteina,
dobijen od pulpe krompira ekstrakcijom sa NaCl-dopunjeni pufer, izložen izvornoj elektroforezi
i nadgledana aktivnost peroksidaze, otkriveno je sedam peroksidaznih izoformi (Beaumont et al.,
1990).
Stopa inaktivacije enzima može se smanjiti dopunjavanjem reakcionog medija sa
supstancom koja smanjuje adsorpciju polimera na aktivno mesto enzima, koristeći supstance kao

21
što je polietilen glikol (PEG). Nekoliko autora je prijavilo stimulativni efekat PEG-a na
efikasnost uklanjanja fenola pomoću HRP-a. PEG zamenjuje enzim u adsorpciji na čvrste
polimerne proizvode, čime sprečava enzim od koprecitacije sa polimernim proizvodima. Shodno
tome, dodavanje PEG pomaže u održavanju aktivnosti peroksidaze u reakcionoj smeši i može
smanjiti količinu potrebnog enzima (Kurnik et al., 2015).
Rezultati analiza pokazali su da pH pokazuje da fenol može biti efikasno uklonjen pri pH
od 6 do 8 uz pomoć peroksidaze iz krompira.
Korišćenjem peroksidaza iz krompira za dekontaminaciju zagađenih otpadnih voda
zasnovanih na fenolu, smanjuje nedostupnost jeftinog izvora enzima, koji bi zadovoljio zahteve
velikog obima sanacije. Krompir daje dobru alternativu za prečišćene peroksidaze (Kurnik et al.,
2015).

22
6. MATERIJALI I METODE

6.1. Materijal i pribor

 Krtola krompira,
 Vodonik peroksid (30 %, „Zorka Pharma“ a.d., Šabac),
 Destilovana voda,
 Fenol (Sigma Aldrich),
 Polietilenglikol 400 (Merck-Schuchardt),
 4-aminoantipirin (Sigma Aldrich),
 Natrijum dihidrogen fosfat (Sigma Aldrich),
 Dinatrijum hidrogen fosfat (Sigma Aldrich),
 Sirćetna kiselina (Sigma Aldrich),
 Natrijum acetat (Sigma Aldrich),
 Spektrofotometar (VARIAN Cary-100 Conc. Spectrophotometer),
 Analitička vaga (Sartorius),
 Automatska pipeta (10-100 µl, Labwere),
 Automatska pipeta (20-200 µl, Labwere),
 Vortex (Snijders 34524 Scientific Tilburg, Holandija),
 Magnetna mešalica (Labwere).

6.1.1. Rastvori
Korišćeni rastvori
 50 mM fosfatni pufer pH=7,0 (odmereno je 7,2 ml 0,5 M rastvora Na2HPO4 i 2,8 ml
0,5 M rastvora NaH2PO4 u normalnom sudu od 50 ml i dopunjeno destilovanom
vodom do crte),
 25 mM rastvor 4-aminoantipirina (0,127 g 4-aminoantipirina odmereno je u
normalnom sudu od 25 ml i dopunjeno vodom do crte),
 2,08 mM rastvor 4-aminoantipirina (0,0105 g 4-aminoantipirina odmereno je u
normalnom sudu od 25 ml i dopunjeno vodom do crte),
 8.34 mM rastvor kalijum fericijanida (0,069 g kalijum fericijanida odmereno je u
normalnom sudu od 25 ml i dopunjeno vodom do crte),

23
  0.5 M rastvor Na2HPO4 (7,098 g Na2HPO4 odmereno je u normalnom sudu od 100 ml
i dopunjeno destilovanom vodom do crte),
 0.5 M rastvor NaH2PO4 (6 g NaH2PO4 odmereno je u normalnom sudu od 100 ml i
dopunjeno destilovanom vodom do crte),
 0.5 M rastvor CH3COOH (3,025 g (2,9 ml) CH3COOH odmereno je u normalnom
sudu od 100 ml i dopunjeno destilovanom vodom do crte),
 0.5 M rastvor CH3COONa (4,1 g CH3COONa odmereno je u normalnom sudu od 100
ml i dopunjeno destilovanom vodom do crte),
 8,8 mM H2O2 (odmereno je 0,181 ml 30% H2O2 u normalnom sudu od 200 ml i
dopunjeno destilovanom vodom do crte),
 10 mM H2O2 (odmereno je 0,206 ml 30% H2O2 u normalnom sudu od 200 ml i
dopunjeno destilovanom vodom do crte),
 50 mM rastvor fenola (odmereno je 0,47 g fenola u normalnom sudu od 100 ml i
dopunjeno destilovanom vodom do crte),
 5 mM rastvor fenola (odmereno je 0,047 g fenola u normalnom sudu od 100 ml i
dopunjeno destilovanom vodom do crte).

6.2. Metode
6.2.1. Ekstrakcija enzima
Očišćena i usitnjena krtolakrompira (2 g) (Solanum tuberosum L.) ekstrahovana je 30
minuta sa 10 ml 50 mM fosfatnog pufera (pH 7,0). Nakon završetka ekstrakcije, vršeno je
centrigugiranje 15 min na 3000 obrtaja. Dobijeni supernatant je filtriran, prebačen u epruvetu i
čuvan u frižideru na +4C do korišćenja. Početna aktivnost izolovane peroksidaze je bila 1,04
U/ml uzorka enzima.

6.2.2. Postupak uklanjanja fenola iz vode pomoću peroksidaze iz krompira

U čašu je prvo odmerena odgovarajuća količina vode i fosfatnog pufera, a zatim je dodata
odgovarajuća zapremina 5 mM rastvora fenola, zatim uzorak enzima i na kraju je reakcija
započeta dodatkom 10 mM rastvora vodonik peroksida. Nakon 120 min uzimani su uzorci iz
reakcione smeše i određivana je zaostala količina fenola u vodi.

24
 6.2.3. Određivanje sadržaja fenola
Određivanje sadržaja fenola je rađeno po metodi Alemzadeh i Nejati (2009), uz male
modifikacije. Nakon završetka reakcije iz reakcione smeše uzima se uzorak zapremine 1 ml u
kome se dodaje po 10 l 2,08 mM rastvora 4-aminoantipirina i 8,34 mM rastvora kalijum
fericijanida. Nakon 10 minuta merena je absorbanca na 510 nm. U cilju određivanja tačne
koncentracije fenola urađena je kalibraciona kriva za fenol u opsegu 0,5-10 mM.

6.2.4. Određivanje aktivnosti peroksidaze

Određivanje aktivnosti peroksidaze je rađeno na sobnoj temperaturi (25 ºC) po metodi
Metelitza i saradnika (1991) uz određene modifikacije. Odmeri se 2 ml 50 mM rastvora fenola, 1
ml 25 mM 4-aminoantipirina, 1 ml 250 mM fosfatnog pufera (pH 7,0) i 1 ml 2 mM H2O2, dobro
promućka i doda 0,2 ml rastvora uzorka enzima. Kontrolna kiveta na spektrofotometru umesto 1
ml 2 mM H2O2 sadrži 1 ml destilovane vode. Meri se apsorbancija rastvora svakih 1-2 min, ili
zavisno od brzine promene apsorbancije. Nakon toga, crta se grafik promene apsorbancije na 510
nm u funkciji od vremena. Aktivnost se izračunava na osnovu molarnog koeficijenta apsorpcije ε
za dati supstrat na datoj talasnoj dužini prema formuli:

A [U/ml] = tgαR/ε[mM−1cm−1],

gde je R (razblaženje) odnos zapremine ukupne reakcione smeše i zapremine uzorka enzima, a ε
molarni koeficijent ekstinkcije.
Za određivanje sa 4-aminoantipirinom se koristi ε510 = 6,28 mM−1cm−1.

25
 7. REZULTATI

U reakciji uklanjanja fenola iz vodenog rastvora pomoću peroksidaze iz krompira

ispitivan je uticaj početne koncentracije fenola, vodonik peroksida, peroksidaze i polietilen
glikola kako bi se ispitao njihov uticaj i utvrdile njihove optimalne koncentracije pri kojima
dolazi do maksimalnog stepena uklanjanja fenola iz vodenog rastvora. Pored toga u radu je
ispitivan i uticaj pH vrednosti rastvora u kome se odigrava reakcija uklanjanja fenola kao i vreme
trajanja same reakcije. Fenol, vodonik peroksid i peroksidaza su neposredni učesnici reakcije dok
polietilen glikol svojim prisustvom ima za zadatak da poveća stabilnost peroksidaze. U
prethodnim istraživanjima (Liu i sar., 2002; Savić i sar., 2014) ispitivan je proces uklanjanja
fenola pomoću peroksidaze ektrahovane iz rena dobijeni rezultati su pokazali da prisustvo
polietilen glikola pozitivno utiče na uklanjanje fenola iz vodenog rastvora. Za razliku od
predhodnih ispitivanja u kojima su korišćeni visokomolekularni polietilen glikoli, u ovom radu
na proces uklanjanja fenola ispitivan je uticaj polietilenglikola sa nižom molekulskom masom
(PEG 400). Do uklanjanja fenola iz reakcione smeše nije dolazilo kada u reakcionoj smeši nije
bilo peroksidaze ili vodonik peroksida, što potvrđuje činjenicu da proces uklanjanja fenola iz
vodenog rastvora nastaje isključivo kao rezultat dejstva peroksidaze i vodonik peroksida.
Takođe, treba dodati da i nakon završetka reakcije, čak i u slučaju kada su u reakcionoj smeši
istovremeno bili prisutni peroksidaza i H2O2, reakciona smeša pokazuje određeni stepen
apsorbcije na talasnoj dužini koja je karakteristična za fenolna jedinjenja. Pojava ovog fenomena
je očekivana i u skladu je sa rezultatima koje je objavio Nicell sa svojim saradnicima (1995).
Dobijeni zaostatak fenolnih jedinjenja je prema objašnjenju Nicell-a rezultat postojanja
sporednih reakcija u reakcionoj smeši koje daju fenolne proizvode koji su rastvorljivi u vodenom
rastvoru.
U cilju određivanja zaostale količine fenola u reakcionoj smeši napravljena je
kalibraciona kriva koja je data na slici 8. Rezultati ispitivanja uticaja pH vrednosti i vreme
trajanja reakcije dati su na slikama 9 i 10, respektivno. Pored pH vrednosti i vremena trajanja
reakcije, u okviru optimizacije procesa uklanjanja fenola pomoću peroksidaze iz krompira
ispitivan je i uticaj početnih koncentracija ostalih učesnika reakcije. Dobijeni rezultati ispitivanja
uticaja početne koncentracije fenola, vodonik peroksida, peroksidaze i polietilen glikola
prikazani su na slikama 1114, respektivno.

26
 1.1

1.0

0.9

0.8

Apsorbanca, AU 0.7

0.6

0.5

0.4

0.3

0.2

0.1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Fenol, mM

Slika 8 Kalibraciona kriva za fenol.

70

3.0
Zaostala količina fenola, mM

Uklonjena količina fenola, %

60
2.5

2.0 50
4 5 6 7 8
pH

Slika 9 Uticaj pH vrednosti na proces uklanjanja fenola iz vode. Sastav reakcione smeše: 500 µl
fenola, 400 µl uzorka enzima, 200 µl H2O2, 1500 µl 50 mM fosfatni puffer (pH 4,0−8,0) i voda
do 5 ml.

27
 65
3.8

3.6 60

Zaostala koli~ina fenola, mM

Uklonjena koli~ina fenola, %

3.4
55
3.2

3.0 50

2.8
45
2.6

2.4
40

2.2
20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Vreme, min

Slika 10 Uticaj vremena trajanja reakcije na proces uklanjanja fenola iz vode. Sastav reakcione
smeše: 500 µl fenola, 400 µl uzorka enzima, 200 µl H2O2, 1500 µl 50 mM fosfatni puffer (pH
7,0) i voda do 5 ml.

2.2
80
2.0
Zaostala količina fenola, mM

Uklonjena količina fenola, %

1.8 70

1.6
60
1.4

1.2 50

1.0
40
0.8

0.6 30

0.4
20
0.2
0 1 2 3 4 5 6 7
Koncentracija fenola, mM

Slika 11 Uticaj početne koncentracije fenola na reakciju uklanjanja fenola pomoću peroksidaze
iz krompira. Sastav reakcione smeše: 50−500 µl fenola, 400 µl uzorka enzima, 200 µl H2O2,
1500 µl 50 mM fosfatni puffer (pH 7,0) i voda do 5 ml.

28
 2.4 100

2.2

Uklonjena količina fenola, %

Zaostala količina, mM 2.0

1.8
80

1.6

1.4

1.2
60
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
Vodonik peroksid, mM

Slika 12 Uticaj početne koncentracije vodonik peroksida na reakciju uklanjanja fenola pomoću
peroksidaze iz krompira. Sastav reakcione smeše: 500 µl fenola, 400 µl uzorka enzima, 50−500
µl H2O2, 1500 µl 50 mM fosfatni puffer (pH 7,0) i voda do 5 ml.

4.0 100

90
Zaostala količina fenola, mM

Uklonjena količina fenola, %

3.5 80

70

3.0 60

50

2.5 40

30

2.0 20

10

1.5 0
0 100 200 300 400 500
Peroksidaza, μL

Slika 13 Uticaj početne zapremine peroksidaze na reakciju uklanjanja fenola iz vode. Sastav
reakcione smeše: 500 µl fenola, 50−500 µl uzorka enzima, 400 µl H2O2, 1500 µl 50 mM fosfatni
puffer (pH 7,0) i voda do 5 ml.

29
 1.7 78

Zaostala koli~ina fenola, mM

Uklonjena koli~ina fenola, %

1.6 76

1.5 74

1.4 72
0 100 200 300 400 500

PEG, l

Slika 14 Uticaj polietilenglikola na proces uklanjanja fenola iz vode. Sastav reakcione smeše:
500 µl fenola, 400 µl uzorka enzima, 200 µl H2O2, 1500 µl 50 mM fosfatni puffer (pH 7,0),
50−500 µl PEG 400 i voda do 5 ml.

30
 8. DISKUSIJA

Upotreba peroksidaze u procesu uklanjanja fenolnih jedinjenja iz otpadnih voda je od

pojave prvih rezultata (Klibanov, 1983) bila stalni predmet interesovanja brojnim istraživačima.
Proces uklanjanja fenola pomoću peroksidaze uključuje katalitičku oksidaciju aromatičnih
kontaminanata pomoću vodonik peroksida do oblika aromatičnih slobodnih radikala koji
kasnijom rekombinacijom dovode do formiranja proizvoda velike molekulske mase koji se na
kraju zbog smanjene rastvorljivosti talože. Upotreba peroksidaze i drugih enzima za uklanjanje
fenola i drugih aromatičnih jedinjenja iz otpadnih voda predstavlja dobru alternativnu metodu za
tretman industrijskih otpadnih voda u situaciji kada se druge konvencionalne metode kao što su
biološko tretiranje, upotreba ugljenika i brza oksidacija zbog prirode odpadnih voda ne mogu
koristiti (Aitken et al., 1994; Nicell et al., 1993). Međutim, i pored brojnih pogodnosti koje
generalno pružaju enzimi prilikom upotrebe u različitim procesima, dva njihova najveća
problema svakako su smanjenje aktivnosti tokom procesa i visoka cena. Problem inaktivacije
enzima se obično rešava korišćenjem različitih hemijskih aditiva, i to najčešće PEG-a (Nakamoto
and Mashida, 1992), dok se problem visoke cene enzima može izbeći upotrebom jeftinijih izvora
enzima, što ujedno predstavlja i jedan od naših ciljeva u ovom istraživanju.
U okviru optimizacije reakcije uklanjanja fenola pomoću peroksidaze iz krompira najpre
je ispitivan uticaj pH vrednosti rastvora (slika 9). Posmatranjem grafika promene količine fenola
u zavisnosti od pH vrednosti reakcione smeše mogu se primetiti dva dela: prvi (pH 4,0−7,0) u
kome dolazi do smanjenja količine fenola i drugi (pH 7,0−8,0) u kome količina fenola sa
porastom pH vrednosti proporcionalno raste. Na osnovu rezultata može se zaključiti da je najveći
procenat uklonjenog fenola postignut kada pH vrednost reakcione smeše bila 7,0. Optimalna pH
vrednost za uklanjanje fenola pokazuje dobro slaganje sa pH vrednošću pri kojoj peroksidaza
pokazuje najveću aktivnost (pH 6−8) (Veitch, 2004), što predstavlja još jedan dokaz da proces
uklanjanja fenola u ovakvom sistemu zavisi najviše od peroksidaze i njene aktivnosti.
Promena zaostale količine fenola u odnosu na vreme trajanja reakcije prikazana je na slici
10. Na osnovu dobijenih rezultata može se zaključiti da se tokom vremena količina fenola u
reakcionoj smeši stalno smanjuje, međutim naglo smanjenje količine fenola (više od 20%)
postignuto je između 90 i 120 minuta. Sa daljim povećanjem vremena trajanja reakcije (120−180
min) količina fenola u reakcionoj smeši se i dalje smanjuje, ali je procenat uklonjene količine

31
fenola između 120 i 180 minuta manji od 5%. U cilju postizanja veće efikasnosti i uštede
vremena u daljim istraživanjima vreme trajanja reakcije je bilo ograničeno na 120 minuta.
Rezultati ispitivanja uticaja početne koncentracije fenola na reakciju uklanjanja fenola iz
vodenog rastvora pomoću peroksidaze iz krompira može se zaključiti da sa porastom
koncentracije fenola raste i količina uklonjenog fenola. Dobijeni rezultat se može objasniti
činjenicom da u odnosu na peroksidazu koncentracija fenola nije u višku, odnosno koncenracija
fenola je limitirajući faktor za reakciju uklanjanja fenola pomoću peroksidaze. Dobijeni rezultati
ispitivanja su u skladu sa prethodnim rezultatima dobijenim u istraživanjima uklanjanja fenola iz
vodenog rastvora pomoću peroksidaze ekstrahovane iz rena (Savić i sar., 2014). U pomenutoj
studiji najveći stepen uklanjanja fenola postignut je kada je koncentracija fenola bila 4 mM, dok
je pri većim koncentracijama fenola rezultat bio lošiji, što se objašnjava činjenicom da fenol
svojim prisustvom utiče na smanjenje aktivnosti peroksidaze što na kraju utiče na veći zaostatak
fenola u reakcionoj smeši.
Uticaj početne koncentracije vodonik peroksida na proces uklanjanja fenola iz vodenog
rastvora prikazan je na slici 12. Posmatranjem krive zavisnosti uklanjanja fenola od početne
koncentracije vodonik peroksida može se zaključiti da u prvom delu (0,125−0,5 mM) sa
povećanjem zapremine vodonik peroksida zaostala količina fenola u reakcionoj smeši se
smanjuje. Međutim, u drugom delu (0,5−1,25 mM) povećanje koncentracije vodonik peroksida
ne dovodi do smanjenja količine fenola u reakcionoj smeši. Ovakav rezultat je verovatno
posledica činjenice da vodonik peroksid u izvesnim koncentracijama može da deluje kao
inhibitor za peroksidazu što na kraju ima za posledicu veći zaostatak fenola u reakcionoj smeši.
Naime, pri niskim koncentracijama vodonik peroksida (obično ispod 2 mM), inhibicija
peroksidaze vodonik peroksidom je pretežno reverzibilna, što dovodi do formiranja i
akumuliranja katalitički inertnog intermedijera. Sa druge strane, sa povećanjem koncentracije
vodonik peroksida ireverzibilna inhibicija postaje dominantana (Baynton i sar., 1994).
Na slici 13 prikazani su rezultati ispitivanja uticaja početne koncentracije peroksidaze na
reakciju uklanjanja fenola iz vodenog rastvora. Dobijeni razultati pokazuju da stalno povećanje
količine peroksidaze smanjuje količinu fenola u reakcionoj smeši, osim u poslednje dve
koncentracije kada je uklonjena količina fenola bila gotovo ista, što se može objasniti činjenicom
da je pri poslednjoj koncentraciji peroksidaza bila u višku.

32
 U cilju postizanja veće stabilnosti peroksidaze u okviru ovog istraživanja ispitivan je
efekat polietilenglikola za koga je na osnovu prethodnih ispitivanja poznato da ima aktivirajući
efekat na peroksidazu (Bódalo i sar. 2006; Nicell, 1994; Savić i sar., 2014), odnosno svojim
prisustvom deluje stabilizirajuće peroksidazu i na taj način joj pomaže da sačuva svoju aktivnost.
Rezultati dobijeni u ovom istraživanju (slika 14) su pokazali da polietilen glikol svojim
prisustvom takođe pozitivno utiče na process uklanjanja fenola iz vodenog rastvora, ali je taj
uticaj izuzetno mali. Povećanje zapremine polietilenglikola u rasponu od 50 do 500 µl utiče na
smanjenje koncentracije fenola u vodenom rastvoru ali za samo 3%, što je izuzetno malo i nije
od značaja. Ovakav uticaj polietilen glikola na aktivnost peroksidaze nije u skladu je sa ranije
objavljenim rezultatima dobijenim u istraživanjima sprovedenim od strane Savić-a i njegovih
saradnika (2014), gde je najveći stepen uklanjanja fenola (skoro 90% od početne količine fenola)
postignut kada je koncentracija PEG-a bila 300 i 400 mg/ml. Treba imati u vidu da je
peroksidaza koja je korišćena u ovom istraživanju dobijena ekstrakcijom iz biološkog materijala
u ovom slučaju iz krompira što može da utiče na njenu povećanu stabilnost tako da se efekat
stabilizatora (PEG 300) ne može primetiti.

33
 9. ZAKLJUČAK

Cilj ovog rada je bio da se ispita mogućnost upotrebe peroksidaze koja je dobijena
ekstrakcijom iz krompira za proces uklanjanja fenola iz vodenog rastvora u prisustvu vodonik
peroksida na sobnoj temperaturi. Tok svih reakcija je praćen spektrofotometrijski i na osnovu
dobijenih rezultata ispitivanja može se zaključiti:
1. Dobijeni ekstrakt peroksidaze iz krompira se može uspešno koristiti za uklanjanje
fenola iz vodenih rastvora.
2. Proces uklanjanja fenola iz vodenog rastvora se ne odvija bez prisustva peroksidaze u
reakcionoj smeši i u najvećoj meri zavisi od njene aktivnosti.
3. Prisustvo polietilen glikola u reakcionoj smeši ne utiče značajno na povećanje
stabilnosti peroksidaze a samim tim i na proces uklanjanja fenola.
4. Najveći stepen uklanjanja fenola je postignut kada su koncentracije fenola i vodonik
peroksida bile 6,25 mM i 0,5 mM respektivno, a zapremina peroksidaze u reakcionoj
smeši 400 l.

34
 10. LITERATURA

Agostini E., Coniglio M. S., Milrad S. R., Tigier H. A., Giulietti A. M. (2003). Phytoremediation
of 2, 4‐dichlorophenol by Brassica napus hairy root cultures. Biotechnology and applied
biochemistry, 37(2), 139-144.
Ahmaruzzaman M. (2008). Adsorption of phenolic compounds on low-cost adsorbents: a
review. Advances in colloid and interface science, 143(1-2), 48-67.
Aitken S. M., Ouellet M., Percival M. D., Ann M. (2003). Mechanism of horseradish peroxidase
inactivation by benzhydrazide: a critical evaluation of arylhydrazides as peroxidase
inhibitors. Biochemical Journal, 375(3), 613-621.
Aitken M., Massey I., Chen T., Heck P. (1994). Caracterizacion of reaction products from the
enzyme catalyzed oxidation of phenolic pollutants, Wat. Res 28, 1879-1889.

Asada K. (1992). Ascorbate peroxidase–a hydrogen peroxide‐scavenging enzyme in

plants. Physiologia Plantarum, 85(2), 235-241.
Ayranci E., Duman O. (2005). Adsorption behaviors of some phenolic compounds onto high
specific area activated carbon cloth. Journal of hazardous materials, 124(1-3), 125-132.
Azevedo A. M., Martins V. C., Prazeres D. M., Vojinovic V., Cabral J. M., Fonseca L. P. (2003).
Horseradish peroxidase: a valuable tool in biotechnology. Biotechnology annual
review, 9(3), 1387-2656.
Barbosa O., Ortiz C., Berenguer-Murcia Á., Torres R., Rodrigues R. C., Fernandez-Lafuente R.
(2014). Glutaraldehyde in bio-catalysts design: a useful crosslinker and a versatile tool in
enzyme immobilization. Rsc Advances, 4(4), 1583-1600.
Basha K. M., Rajendran A., Thangavelu V. (2010). Recent advances in the biodegradation of
phenol: a review. Asian J Exp Biol Sci, 1(2), 219-234.
Baynton K,. Bewtra J., Biswas N., Taylor K. (1994). Inactivation of horseradish peroxidase by
phenol and hydrogen peroxide, Biochim. Biophys. Acta 1206, 272-278

Beaumont F., Jouvec H. M., Gagnon J., Gaillard J., Pelmont J. (1990). Purification and
properties of a catalase from potato tubers (Solanum tuberosum). Plant Science, 72(1),
19-26.
Berardinelli S., Resini C., Arrighi L. (2008). Technologies for the removal of phenol from fluid
streams: a short review of recent developments. Journal of Hazardous Materials, 160 (2-
3), 265-288.
Bódalo A., Gómez J., Gómez E., Bastida J., Màximo M. (2006) Comparison of commercial
peroxidases for removing phenol from water solutions, Chemosphere 63, 626–632.

35
Contreras S., Rodrıguez M., Al Momani F., Sans C., Esplugas S. (2003). Contribution of the
ozonation pre-treatment to the biodegradation of aqueous solutions of 2, 4-
dichlorophenol. Water Research, 37(13), 3164-3171.
Dąbrowski A., Podkościelny P., Hubicki Z., Barczak M. (2005). Adsorption of phenolic
compounds by activated carbon—a critical review. Chemosphere, 58(8), 1049-1070.
Dermeche S., Nadour M., Larroche C., Moulti-Mati F., Michaud P. (2013). Olive mill wastes:
biochemical characterizations and valorization strategies. Process Biochemistry, 48(10),
1532-1552.
Diaz A. N., Sanchez F. G., González Garcia J. A. (1998). Phenol derivatives as enhancers and
inhibitors of luminol–H2O2–horseradish peroxidase chemiluminescence. Journal of
bioluminescence and chemiluminescence, 13(2), 75-84.
Dunford H.B., Peroxidases. Advances in Inorganic Biochemistry, 1982. 4: p. 41-68.
Dragičević T., Hren M., Gmajnić M., Pelko S., Kungulovski D., Kungulovski I., Delaš F. (2010).
Biodegradation of olive mill wastewater by Trichosporon cutaneum and Geotrichum
candidum. Archives of Industrial Hygiene and Toxicology, 61(4), 399-405.
Fecht-Christoffers M. M., Führs H., Braun H. P., Horst W. J. (2006). The role of hydrogen
peroxide-producing and hydrogen peroxide-consuming peroxidases in the leaf apoplast of
cowpea in manganese tolerance. Plant physiology, 140(4), 1451-1463.
Griffin B. W., Ting P. L. (1978). Mechanism of N-demethylation of aminopyrine by hydrogen
peroxide catalyzed by horseradish peroxidase, metmyoglobin, and
protohemin. Biochemistry, 17(11), 2206-2211.
Huang Q., Al-Azzam W., Griebenow K., Schweitzer-Stenner R. (2003). Heme structural
perturbation of PEG-modified horseradish peroxidase C in aromatic organic solvents
probed by optical absorption and resonance Raman dispersion spectroscopy. Biophysical
journal, 84(5), 3285-3298.
Huystee R. V. (1987). Some molecular aspects of plant peroxidase biosynthetic studies. Annual
Review of Plant Physiology, 38(1), 205-219.
Janton N., (2015). Biološko uklanjanje fenola iz otpadnih voda. PhD diss., University of Zagreb.
Faculty of Chemical Engineering and Technology.
Jiang T. J., Ji X. S., Huang H., Yuan Z. Y. (1998). PEG-Modified Horseradish Peroxidase and Its
Properties in Nonaqueous Media. Sheng wu hua xue yu sheng wu wu li xue bao Acta
biochimica et biophysica Sinica, 30(6), 644-647.
Keller T. (1974). The use of peroxidase activity for monitoring and mapping air pollution
areas. Forest Pathology, 4(1), 11-19.
Klibanov A., Tu T. (1983). Peroxidase-catalysed removal of phenols from coat-conversion
waster, Science 221, 259-261.

Kurnik K., Treder K., Skorupa-Kłaput M., Tretyn A., Tyburski J. (2015). Removal of phenol
from synthetic and industrial wastewater by potato pulp peroxidases. Water, Air, & Soil
Pollution, 226(8), 254.
36
Lavid N., Schwartz A., Yarden O., Tel-Or E. (2001). The involvement of polyphenols and
peroxidase activities in heavy-metal accumulation by epidermal glands of the waterlily
(Nymphaeaceae). Planta, 212(3), 323-331.
Lee K. M., Lim P. E. (2005). Bioregeneration of powdered activated carbon in the treatment of
alkyl-substituted phenolic compounds in simultaneous adsorption and biodegradation
processes. Chemosphere, 58(4), 407-416.
Lee K. M., Lim P. E. (2005). Bioregeneration of powdered activated carbon in the treatment of
alkyl-substituted phenolic compounds in simultaneous adsorption and biodegradation
processes. Chemosphere, 58(4), 407-416.
Lončar N. L. (2012). Uklanjanje fenola i boja iz otpadne vode prirodnim i rekombinantnim
oksidativnim enzimima (Doctoral dissertation, Универзитет у Београду, Хемијски
факултет).
Liu J., Song H., Weng L., Nian J. (2002). Increased thermostability and phenol removal
efficiency by chemical modified horseradish peroxidase, Journal of Molecular Catalysis
B: Enzymatic 18, 225–232.

Ljubisavljević D., Đukić A., Babić B.(2004). Prečišćavanje otpadnih voda, Građevinski fakultet
Univerziteta u Beogradu, Beograd, 143 144 Литература.
Mantzavinos D., Kalogerakis N. (2005). Treatment of olive mill effluents: Part I. Organic matter
degradation by chemical and biological processes—an overview. Environment
international, 31(2), 289-295.
Metzler D.E., The Chemical Reactions of Living Cells. Biochemistry. 1977: Academic Press.
New York.
Michałowicz J., Duda W. (2007). Phenols transformations in the environment and living
organisms. Current topics in biophysics, 30(suppl A), 24-36.
Nakamoto S., Mashida N. (1992). Phenol removal from aqueous solution by peroxidase-
catalyzed reaction using additives, Wat. Res 26, 49-54.

Nazari K., Esmaeili N., Mahmoudi A., Rahimi H., Moosavi M. (2007). Peroxidative phenol
removal from aqueous solutions using activated peroxidase biocatalyst, Enzyme and
Microbial Technology 41, 226–233.

Nicell A., Al- Kassim L., Biswas N., Taylor K. (1993). Wasterwather tretman by enzyme
catalyzed polimerization and precipitation. Biodeterioration Abstract 25, 1-8.

Nicell A. (1994). Kinetics of horseradish peroxidase-catalysed polimerization of aqueous 4-

chlorophenol, J. Chem. Biotechnol 60, 203-215.

37
Paraskeva P., Diamadopoulos E. (2006). Technologies for olive mill wastewater (OMW)
treatment: a review. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 81(9), 1475-
1485.
Passardi F., Cosio C., Penel C., Dunand C. (2005). Peroxidases have more functions than a Swiss
army knife. Plant cell reports, 24(5), 255-265.
Perušina M. (2010). Značajke i obrada industrijskih otpadnih voda. Završni rad, Sveučilište u
Zagrebu, Fakultet kemijskog inženjerstva i tehnologije, Sveučilišni preddiplomski studij.
Piccolo A., Cozzolino A., Conte P., Spaccini R. (2000). Polymerization of humic substances by
an enzyme-catalyzed oxidative coupling. Naturwissenschaften, 87(9), 391-394.
Prodanović O. L. (2016). Razvoj imobilisanih sistema peroksidaze iz rena (Armoracia rusticana)
za polimerizacione reakcije i uklanjanje fenola iz otpadnih voda (Doctoral dissertation,
Универзитет у Београду, Технолошко-металуршки факултет).
Roach T., Beckett R. P., Minibayeva F. V., Colville L., Whitaker C., Chen H., Kranner I. (2010).
Extracellular superoxide production, viability and redox poise in response to desiccation
in recalcitrant Castanea sativa seeds. Plant, Cell & Environment, 33(1), 59-75.
Rodríguez-López J. N., Lowe D. J., Hernández-Ruiz J., Hiner A. N., García-Cánovas F.,
Thorneley R. N. (2001). Mechanism of reaction of hydrogen peroxide with horseradish
peroxidase: identification of intermediates in the catalytic cycle. Journal of the American
Chemical Society, 123(48), 11838-11847.
Stanisavljević M., Nedić L. (2004). Removal of phenol from industrial wastewaters by
horseradish-Cochlearia armoracia L-peroxidase. Facta universitatis-series: Working and
Living Enviromental Protection, 2(4), 345-349.
Siegel B. Z. (1993). Plant peroxidases—an organismic perspective. Plant growth
regulation, 12(3), 303-312.
Sullivan P. C., Ferris A. L., Storrie B. (1987). Effects of temperature, pH elevators, and energy
production inhibitors on horseradish peroxidase transport through endocytic
vesicles. Journal of cellular physiology, 131(1), 58-63.
Tušar B. (2004). Ispuštanje i pročišćavanje otpadne vode, Croatiaknjiga, Zagreb.
Veitch N.C. (2004). Horseradish peroxidase: a modern view of a classic enzyme,
Phytochemistry, 65, 249–259.

Wicomb W. N., Wood J., Hill J. D., Bry W. I., Collins G. M. (1989, February). Value of
polyethylene glycol (PEG) and horseradish peroxidase (HRP) for hypothermic rabbit
heart perfusion. In Transplantation proceedings (Vol. 21, No. 1 Pt 2, pp. 1366-1368).
Yamada K., Akiba Y., Shibuya T., Kashiwada A., Matsuda K., Hirata M. (2005). Water
purification through bioconversion of phenol compounds by tyrosinase and chemical
adsorption by chitosan beads. Biotechnology progress, 21(3), 823-829.
Zuzana S., Katarína D., Lívia T. (2009). Biodegradation and ecotoxicity of soil contaminated by
pentachlorophenol applying bioaugmentation and addition of sorbents. World Journal of
Microbiology and Biotechnology, 25(2), 243-252.
38