LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:

Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP HCM, Bộ môn Công Nghệ Sinh
Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức và kinh nghiệm cho tôi trong suốt
quá trình học tại trường.
PGS.TS Lê Đình Đôn và Th.S Phan Thị Thu Hiền đã tận tình hướng đã hướng
dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để tôi thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Các anh chị thuộc Trung Tâm Kiểm Dịch Thực Vật Sau Nhập Khẩu II.
Các bạn lớp DH10SH luôn bên tôi, động viên, giúp đỡ tôi trong thời gian tôi
thực tập và hoàn thành khóa luận.
Xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, những người thân và bạn bè đã giúp đỡ và động viên
trong suốt thời gian học tập cũng như trong quá trình hoàn thành luận văn này.

Thành phố Hồ Chí Minh, 2014

Sinh viên thực hiện

HUỲNH TẤN PHI

i
 TÓM TẮT
Bệnh đốm nâu gây ra bởi nấm Alternaria là một trong những bệnh gây hại
nghiêm trọng trên chanh dây. Hằng năm bệnh gây thiệt hại lớn về sản lượng chanh
dây. Các biện pháp hóa học đã được áp dụng để xử lý nhưng gây tác động xấu đến môi
trường, ngoài ra cũng gây thiệt hại không nhỏ về kinh tế. Kiểm soát bệnh bằng di
truyền là phương pháp được hi vọng sẽ mang lại kết quả tốt hơn.
Đề tài “Định danh nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu trên chanh dây dựa vào
vùng gen ITS – rDNA” được thực hiện tại Trung tâm kiểm dịch thực vật sau nhập
khẩu II nhằm định danh phân tử dựa trên kết quả định danh hình thái của một số dòng
nấm Alternaria. Vùng ITS – rDNA là vùng trình tự tương đối bảo tồn và có ý nghĩa
trong nghiên cứu phân loại.
Nội dung nghiên cứu là phục hồi và nhân sinh khối các dòng nấm Alternaria, ly
trích DNA, thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng gen ITS – rDNA với cặp mồi
ITS4 và ITS5 nhằm khuếch đại vùng ITS1 – 5,8S – ITS2. Sử dụng chương trình
BLAST trên NCBI để so sánh các loài khác trên GenBank để định danh phân tử và xác
định vùng biến động nhất trong rDNA – ITS của nấm Alternaria.
Kết quả đạt được: phục hồi 9 dòng nấm Alternaria, ly trích DNA tổng số, chạy
PCR bằng cặp primer ITS4 và ITS5 trên 9 mẫu nấm Alternaria. Tiến hành khuếch đại
vùng rDNA – ITS thu được sản phẩm khuếch đại có kích thước 600 bp. Giải trình tự
vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 và đem so sánh với những dòng Alternaria trên cơ sở dữ liệu
NCBI dựa vào phần mềm BioEdit. Xác định được CDNK_1.13 là Alternaria
Alternata, kích thước vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 là 481 bp. Trình tự nucleotid ở vùng
ITS1 – 5,8S – ITS2 của CDNK_1.13 so với dòng A. alternata có mức độ tương đồng
là 99%.

ii
 SUMMARY

“Identification of Alternaria species disease brown spot on the passion

fruit trees on ITS – rDNA region" was carried out at the Plant quarantine center
after import II to identify and assessment of genetic diversity in some Alternaria
strains causing disease on the passion fruit trees, so that effective control of
diseases caused by this fungus.
Each year, disease caused by Alternaria fungi serious damage to
significant yield of passion fruit . Chemical controls are effective but they could
harm the environment. Genetic controls are hoped to bring better effect.
Content of this research includes isolation of Alternaria, extraction of
DNA and amplification the ITS – rDNA region. Those genes have been
compared with data in GenBank using BLAST tool in NCBI to identify and
assess the diversity of Alternaria isolates and test the results of identification
morphology.
This preliminary study would be useful for a better research of
disease on passion fruit trees, predicting future disease development and
developing effective strategy in breeding for disease resistant lines of passion
fruit trees.
The result of this research are: identified some Alternaria isolates. The
achievements: recovered 9 strains of Alternaria, extracted DNA genome, performed
PCR reaction with primers ITS4 ang ITS5 for Alternaria samples. We amplified
rDNA – ITS area, the amplification product was 600 bp in lenght. ITS1 – 5,8S – ITS2
area has been sequenced and this sequence was compared with Alternaria strains on
the NCBI database based on BioEdit software. We determined that CDNK_1.13
is Alternaria Alternata, ITS1 – 5,8S – ITS2 area was 481 bp in length. The sequence
in ITS1 – 5,8S – ITS2 area of CDNK_1.13 has similarity level of 99% to A. alternata.

iii
 Mục lục

LỜI CẢM ƠN.............................................................................................................................. i

TÓM TẮT .................................................................................................................................. ii
SUMMARY ..............................................................................................................................iii
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề: ....................................................................................................................... 1
1.2 Yêu cầu của đề tài............................................................................................................ 2
1.3 Mục đích của đề tài.......................................................................................................... 2
1.4 Nội dung thực hiện .......................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................................... 3
2.1 Tổng quan về chanh dây .................................................................................................. 3
2.2 Nguồn gốc ....................................................................................................................... 3
Hình 2.1 Đặc điểm hình thái thực vật học cây chanh dây (Passiflora edulis Sims) .................. 3
2.2.1 Vị trí phân loại ............................................................................................................. 3
2.2.2 Đặc điểm cây chanh dây .............................................................................................. 4
2.2.3 Giá trị dinh dưỡng và lợi ích của chanh dây ................................................................ 5
2.2.4 Tình hình phát triển của cây chanh dây trên thế giới và Việt Nam ............................. 7
2.2.4.1 Trên thế giới ............................................................................................................. 7
2.2.4.2 Ở Việt Nam .............................................................................................................. 8
2.2.5 Tình hình bệnh hại trên chanh dây............................................................................. 10
2.2.5.1 Bệnh đốm nâu......................................................................................................... 10
2.2.5.2 Bệnh đốm Septoric ................................................................................................. 11
2.2.5.3 Bệnh thối quả ......................................................................................................... 11
2.2.5.4 Bệnh chết héo ......................................................................................................... 11
2.2.5.5 Bệnh do vi khuẩn.................................................................................................... 12
2.3 Tổng quan về nấm Alternaria........................................................................................ 12
2.4 Kỹ thuật PCR ................................................................................................................. 15
2.4.1 Nguyên tắc PCR......................................................................................................... 15
2.4.2 Quy trình thực hiện .................................................................................................... 16
2.4.3 Thành phần, vai trò các chất tham gia phản ứng PCR ............................................... 17
2.4.4 Các yếu tố khác .......................................................................................................... 19
2.4.5 Ưu và nhược điểm của PCR ...................................................................................... 20
2.4.6 Ứng dụng của PCR .................................................................................................... 20
2.5 Tổng quan về ITS - rDNA ............................................................................................. 21
2.5.1 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS ...................................................................... 21

iv
2.5.2 Lịch sử nghiên cứu rDNA.......................................................................................... 23
2.5.3 Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền ......................................... 24
2.6 Giới thiệu chung về BLAST .......................................................................................... 25
2.6.1 Chức năng của chương trình BLAST ........................................................................ 25
2.6.2 Các bước thực hiện BLAST....................................................................................... 26
2.7 Nghiên cứu về vùng rDNA – ITS trên nấm Alternaria ................................................. 26
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................. 30
3.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu ................................................................... 30
3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................. 30
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................................ 30
3.2 Hóa chất và trang thiết bị ............................................................................................... 30
3.2.1 Hóa chất ..................................................................................................................... 30
3.2.1.1 Môi trường phục hồi dòng nấm: môi trường PCA ................................................. 30
3.2.1.2 Môi trường nhân sinh khối dòng nấm: môi trường PC .......................................... 31
3.2.1.3 Hóa chất ly trích DNA sợi nấm .............................................................................. 31
3.2.1.4 Hóa chất sử dụng trong điện di .............................................................................. 31
3.2.1.5 Hóa chất cho phản ứng PCR .................................................................................. 31
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị ..................................................................................................... 31
3.3 Phục hồi các dòng nấm Alternaria từ ống nghiệm chứa các bào tử nấm Alternaria bằng
môi trường PCA ....................................................................................................................... 31
3.4 Nhân sinh khối nấm và thu lấy các mẫu nấm ................................................................ 32
3.5 Ly trích DNA từ nấm..................................................................................................... 32
3.6 Kiểm tra kết quả ly trích ................................................................................................ 33
3.7 Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA các dòng nấm Alternaria ..... 33
3.7.1 Vật liệu và thành phần hóa chất cho phản ứng PCR.................................................. 33
3.7.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ...................................................................................... 33
3.7.3 Đánh giá kết quả PCR ................................................................................................ 34
3.8 Xử lý trình tự ban đầu .................................................................................................... 34
3.9 So sánh vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 với GenBank ........................................................... 34
3.10 Tạo cây phát sinh loài .................................................................................................... 34
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................................. 36
4.1 Kết quả nhân sinh khối .................................................................................................. 36
4.2 Kết quả ly trích DNA .................................................................................................... 36
4.3 Kết quả khuếch đại trình tự vùng ITS – 5,8S – ITS2 .................................................... 37
4.4 Kết quả định danh các dòng Alternaria ......................................................................... 37
4.5 Xác định vùng biến động nhất trong toàn vùng rDNA – ITS........................................ 41
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 44
5.1 Kết luận ......................................................................................................................... 44

v
5.2 Đề nghị .......................................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 46
PHỤC LỤC

vi
 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

µg: microgram
µl: microlitre
µM: micromolar
ng: nanogram
bp: base pair
kp: kilo base – pair
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate
EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid
ITS: Internal Transcribed Spacer
NCBI: National Center for Biotechnology Information
PCR: Polymerase Chain Reaction
PCA: Potato carrot agar
rDNA: ribosomal DNA
RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA
SSR: Simple sequence repeat
TAE: Tricacetic ethylene diamine tetra acetate
Taq: Thermus aquaticus
TE: Tris ethylene diamine tetraacetic acid
Tm: Melting Tempereture
UV: Ultra violet
BLAST: Basic Local Alignment Search Tool

vii
 DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Các dòng nấm Alternaria được sử dụng trong nghiên cứu này ................... 30
Bảng 3.2 Các thành phần để thực hiện phản ứng PCR ................................................ 33
Bảng 3.3 Danh sách các loài trên GenBank được sử dụng để so sánh ........................ 35
Bảng 4.1 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA(%) dòng CDNK_1.13 với cái loài trên
GenBank ....................................................................................................................... 38
Bảng 4.2 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA(%) dòng ĐN8L_2.11 với các loài trên
GenBank ....................................................................................................................... 38
Bảng 4.3 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA(%) dòng LĐ4T_3.10 với các loài trên
GenBank ....................................................................................................................... 40
Bảng 4.4 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA (%) dòng LĐ17L_1.10 với các loài trên
GenBank ....................................................................................................................... 40
Bảng 4.5 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA (%) dòng ĐN1T_4.11 với các loài trên
GenBank ....................................................................................................................... 40
Bảng 4.6 Kết quả định danh 5 dòng Alternaria trong 11 mẫu nghiên cứu dựa vào trình
tự vùng ITS – rDNA ..................................................................................................... 41

viii
 Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề:

Chanh dây (Passiflora edulis) là loại cây trồng có nguồn gốc từ Nam Mỹ và phát
triển từ thế kỷ XIX ở Châu Âu. Các bộ phận của chanh dây đều có thể sử dụng để phục vụ
cho con người. Lá và rễ được sử dụng như một loại trà có tác dụng an thần, hoa chanh dây
được sử dụng để trang trí. Quan trọng nhất là quả chanh dây có ý nghĩa nhiều nhất trong
sản xuất kinh tế.
Trước đây, chanh dây được trồng chủ yếu ở các nước Nam Mỹ. Với giá trị kinh tế
và lợi ích mà nó mang lại, chanh dây đã du nhập vào Châu Âu và được trồng phổ biến ở
các quốc gia khác như Ấn Độ, Kenya, Hawaii, Úc, Indonesia…. Ở Việt Nam, chanh dây
du nhập vào khoảng đầu thế kỷ XX và diện tích trồng càng được mở rộng. Cho đến nay
chanh dây vẫn là loại cây trồng khảo nghiệm ở nước ta, nhưng lợi nhuận mà chanh dây
mang lại là rất cao nên người dân ồ ạt trồng và bất chấp rủi ro về dịch bệnh cũng như đầu
ra cho sản phẩm. Số lượng chanh dây du nhập vào nước ta tăng theo từng năm. Trong thời
điểm từ đầu năm 2009 đến tháng 7/2010, chanh dây phát triển mạnh tại các vùng Đăk
R’Lấp, Đăk G’Long và ven thị xã Gia Nghĩa. Tại thời điểm này, trồng chanh dây mang
lại lợi nhuận rất cao. Do lợi ích trước mắt mà người dân địa phương đã tự phát trồng tràn
lan, diện tích chanh dây mở rộng tại các tỉnh lân cận, làm cho thị trường chanh dây trong
nước có tổng cung lớn hơn cầu, đẩy giá xuống và diện tích chanh dây cũng thu hẹp lại.
Thế nhưng, năm 2013 với giá chanh dây cao ngất ngưỡng trở lại thì phong trào trồng
chanh dây lại bùng phát. Đây là nguyên nhân làm gia tăng bệnh hại trên cây chanh dây
(Theo Trang Thông Tin Điện Tử TTXT - Đầu Tư, TM & DL Tỉnh Đắk Nông).
Bệnh hại quan trọng nhất trên chanh dây là bệnh đốm nâu do nấm Alternaria
passiflorae gây hại trên quả, thân và lá. Hai loài gây bệnh phổ biến nhất là Alternaria
passiflorae và Alternaria alternata gây hại nguy hiểm và cũng là một trong số các loại
bệnh quan trọng làm thiệt hại năng suất lớn trên chanh dây (Barry Pryor, Mike Matheron
và Patricia Figuli, 2008). Chi Alternaria là một loại nấm gây hại có phổ ký chủ rộng, gây
bệnh trên cây trồng và một số loài gây hại trên thực phẩm, cây cảnh (Pitt và công sự,

1
1997). Một số loài nấm thuộc chi Alternaria tiết ra các độc tố như Axit tenuazoic,
alternarion, methyl ether alternarion gây ảnh hưởng đến sức khỏe người sử dụng. Ở Việt
Nam, nấm Alternaria vẫn chưa được nghiên cứu, vì phổ ký chủ rộng nên việc định danh
về hình thái học, về các phản ứng sinh hóa hay các dòng nấm theo phương pháp cổ điển
cần thời gian dài mà kết quả không chính xác. Với sự phát triển của công nghệ sinh học
và sinh học phân tử với nhiều kỹ thuật hiện đại như PCR, RFLP, RAPD, SSR… là những
công cụ hữu ích để nghiên cứu đa dạng di truyền, biểu hiện gen.
Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, đề tài sử dụng phương pháp phân tích trình tự vùng
ITS – rDNA để định danh các dòng nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu trên chanh dây.
1.2 Yêu cầu của đề tài
Nuôi cấy các dòng nấm Alternaria đã được định danh hình thái học.
Nhân sinh khối và ly trích DNA của các dòng nấm.
PCR khuếch đại vùng gen ITS1 – 5,8S – ITS2.
Đọc trình tự các vùng gen và sử dụng chương trình BLAST.
Định danh và phân tích đa dạng di truyền các dòng nấm Alternaria.
1.3 Mục đích của đề tài
Định danh các dòng nấm Alternaria gây bệnh đốm nâu trên chanh dây dựa trên vùng
ITS – rDNA.
1.4 Nội dung thực hiện
Nuôi cấy các dòng nấm Alternaria.
Nhân sinh khối và ly trích DNA các dòng nấm.
Khuếch đại các vùng gen ITS – rDNA của các dòng nấm Alternaria dùng cặp mồi
ITS4 và ITS5.
Đọc trình tự vùng gen ITS1 – 5,8S – ITS2 trực tiếp từ sản phẩm PCR và tiến hành
so sánh với cơ sở dữ liệu NCBI.

2
 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về chanh dây

2.2 Nguồn gốc
Chanh dây còn có tên gọi khác như mát mát, lạc tiên, chanh leo; danh pháp hai phần
là Passiflora edulis là một loại dây leo thuộc họ Lạc tiên (Theo hệ thống APG III, 2009).
Chi Passiflora có khoảng 525 loài. Trong đó có các loài quan trọng là: Chanh dây
(Passiflora edulis), Lạc tiên hoa tía (Passiflora incarnata), Lạc tiên hoa vàng (Passiflora
lutea), Dưa gang tây (Passiflora quadrangularis).
(Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/List_of_Passiflora_species#Species )
Chanh dây là loại cây lâu năm, dây leo và thuộc loại cây rừng. Chanh dây có nguồn
gốc từ Nam Mỹ (Argentina, Paraguay và Brasil) sau đó được du nhập sang Úc và châu Âu
từ thế kỷ XIX (Lê Hoài Hương, 2012).

Hình 2.1 Đặc điểm hình thái thực vật học cây chanh dây (Passiflora edulis Sims)
(A): Hoa chanh dây (B): Quả chanh dây
Nguồn: Đặng Thị Hạnh, 2014
2.2.1 Vị trí phân loại
Giới (Kingdom): Viridiplantae
Ngành (Phylum): Spermatophyta

3
 Ngành phụ (Subphylum): Angiospermae
Lớp (Class): Dicotyledonae
Bộ (Order): Violales
Họ (Family): Passifloraceae
Chi (Genus): Passiflora
Tên khoa học: Passiflora edulis Sims
Tên khoa học khác:
Passiflora edulis f.edulis
Passiflora edulis f.flavicarpa
(Theo CABI, 2007)
Passiflora được tìm thấy trên toàn thế giới khoảng 500 loại và 12 giống, tuy nhiên
chỉ có khoảng 60 loại ăn được. Chanh dây là một cây dây leo có khi dài tới hàng chục
mét, thân gỗ nhỏ, nhiều lông thưa, vỏ ngoài hơi sần sùi, bên trong quả có nhiều hạt và có
cùi màu vàng, vị mát. Có 2 loại chanh dây:
- Loại vỏ vàng (Passiflora edulis Sims f. flavicarpa): các chanh dây màu vàng có
nguồn gốc ở vùng Amazon của Brazil hoặc là cây lai giữa Passiflora edulis và Passiflora
ligularis, trồng nhiều ở Peru, Brazil, Ecuador. Quả lớn hơn dạng quả tím (6 – 12 x 4 – 7
cm), có tua dây, nhánh và gân lá ửng đỏ tím. Hoa lớn và có tràng (corona) màu tím sậm
hơn dạng quả tím, đồng thời dây cũng mọc mạnh hơn. Đây là dạng chịu nóng, thích hợp
với vùng có cao độ thấp (0 – 800m) như Đồng Bằng Sông Cửu Long (Lê Cảnh Tuấn,
2009).
- Loại vỏ tím (Passiflora edulis Sims f. edulis): các chanh dây tím có nguồn gốc ở
miền Nam Brazil thông qua Paraguay vào miền Bắc Argentina, chanh dây tím được trồng
phổ biến hơn, chủ yếu ở Châu Phi, Ấn Độ, Úc, New Zealand, Mỹ, Việt Nam. Quả nhỏ
(đường kính 4 – 5cm), có tua dây, nhánh và gân lá xanh. Dạng này rất phổ biến ở vùng
khí hậu mát (cao độ 1.200 – 2.000m), có vĩ độ cao (như Đà Lạt, Tây Nguyên của Việt
Nam) và cho hương vị quả ngon nhất (Lê Cảnh Tuấn, 2009).
2.2.2 Đặc điểm cây chanh dây

4
 Chanh dây là loại cây dây leo mảnh, khá dài, rễ mọc cạn, thân mềm, hình ống có
rãnh dọc, nhiều lông thưa. Lá mọc so le, chia làm 3 thùy, phiến lá dài 7,5 – 20cm: mặt
trên màu lục xậm nhẵn bóng, mặt dưới nhạt hơn và hơi nhám. Mép có khía răng, gốc lá
hình tim có 2 tuyến nhỏ, đầu nhọn, gân lá chẻ 3 từ gốc. Lá kèm nhọn hình sợi, tua cuống
mọc ở kẽ lá. Mỗi hoa mang 5 nhị đực với 5 chỉ dính với nhau thành ống ở đáy và tách rời
ở phần mang phấn. Hoa của giống chanh dây quả màu tím thường nở vào buổi sáng sớm,
thường là lúc bình minh và đóng vào buổi trưa, hoa của giống màu vàng nở vào buổi trưa
và đóng vào khoảng 9 – 10 giờ đêm. Không có khả năng tự thụ phấn chéo giữa 2 giống
tím và vàng (Akamine EK và ctv, 1974). Quả mọng, hình trứng, lớn từ 4 – 7cm, khi chính
chuyển sang mày da cam (quả giống vàng lớn hơn giống tím, nhưng quả tím ít chua, thơm
hơn và chứa nhiều nước cốt hơn). Quả chưa đến 250 hạt nhỏ, hạt có áo bọc màu vàng
cam.
Cây chanh dây rất dễ trồng, ưa nắng, cần ít nước, sống được trên đất sỏi đá và đất
cát, nhân giống bằng hạt. Cây trưởng thành ở 12 tháng tuổi, có chiều dài khoảng 15m, bắt
đầu cho quả sau 4 tháng tuổi và cho thu hoạch tốt từ 4 – 5 năm. Chỉ có chanh dây cho quả
màu tím (Passiflora edulis) và quả màu vàng (Passiflora edulis f. flavicarpa) được coi là
có giá trị cho ngành sản xuất chanh dây. Chanh dây quả tím phát triển tốt ở vùng có cao
độ cao, khí hậu mát mẻ, chanh dây quả vàng phát triển vùng thấp hơn và ưa khí hậu nóng
hơn.
2.2.3 Giá trị dinh dưỡng và lợi ích của chanh dây
Tại một số khu vực, toàn bộ chanh dây leo tươi hay khô đã từng được sử dụng như
là một loại thảo dược làm an thần và điều trị chứng mất ngủ. Lá và thân cây phơi khô, thái
nhỏ thường được dùng để trộn lẫn với trà để uống. Một loại kẹo cao su có tác dụng an
thần cũng đã từng được sản xuất từ chanh dây.
Ở Úc và New Zealand “chanh dây” được buôn bán dạng quả tươi và các sản phẩm
đóng hộp. Nước chanh dây được thêm vào món salad trái cây, bột trái cây tươi hoặc nước
sốt chanh dây thường được sử dụng trong các món tráng miệng, làm hương liệu cho bánh
pho mát và bột vani đông lạnh. Loại nước giải khát từ chanh dây gọi là Passiona cũng đã
được sản xuất tại Úc từ những năm 1920.

5
 Ở Brazil quả chanh dây là một món tránh miệng phổ biến, hạt chanh dây thường
được sử dụng để trang trí ở các đỉnh của bánh ngọt. Nước ép trái chanh dây cũng được sử
dụng rộng rãi. Sản phẩm từ quả chanh dây “Caipirinha”, được trung hòa với vôi được gọi
là “Caipifruta de maracujá”. Chanh dây được sử dụng như là một loại thuốc an thần nhẹ
và thành phần hoạt chất của nó được thương mại hóa theo một số thương hiệu, đáng chú ý
nhất là “Maracugina”.
Trồng chanh dây ở Hawaii gọi là “lilikoi” gồm giống có quả màu tím và vàng.
Món xiro chanh dây LiliKoi dùng phổ biến làm hương liệu cho các loại bánh như :
malasadas, cheesecakes, kem cookies và mochi. Quả chanh dây cũng được chế biến thành
mứt, thạch và bơ. Chanh dây và các sản phẩm có chanh dây được bán ở khắp các đảo.
Ở Mexico, chanh dây được sử dụng để làm nước trái cây hoặc ăn sống với ớt bột
và vôi.
Tại Hoa Kỳ, nó thường được sử dụng như một thành phần trong các hỗn hợp nước
trái cây.
Tại Israel, chanh dây được sử dụng để làm rượu vang.
Tại Việt Nam, chanh dây được dùng làm nước giải khát, sinh tố hoặc pha với mật
ong để uống giải khát. (Hồ Đình Hải, 2012).
Theo Đông y, “nạc” quả chanh dây có vị chua, ngọt, tính mát, tác dụng thanh nhiệt,
giải khát, làm tăng hưng phấn, tăng cường khí lực và bỗ dưỡng.
Bảng 2.1 Thành phần dinh dưỡng của trái chanh dây tím trong 100g thịt trái
Thành phần Trong 100g Thành phần Trong 100g
Năng lượng 406kJ Carbohydrat 23.38g
Đường 11.2g Chất xơ 10.4g
Chất béo 0.7g Protein 2.2g
Vitamin A 64µg Riboflavin 0.13mg
Niacin 1.5mg Acid folic 14µg
Vitamin C 30mg Canxi 12mg
Sắt 1.6mg Magie 29mg
Phospho 68mg Kali 348mg

6
 Kẽm 0.1 mg
(Nguồn: Theo cơ sở dữ liệu USDA)

2.2.4 Tình hình phát triển của cây chanh dây trên thế giới và Việt Nam
2.2.4.1 Trên thế giới
Chanh dây hoang dại được tìm thấy và trồng ở nhiều nơi khác nhau trên thế giới
gồm có vùng cao nguyên Java, Sumatra, Malaya, Western Samoa, đảo Norfolk, quần đảo
Cook, Solomon, Guam, Philippines, bờ biển Ngà, Zimbabwe và Đài Loan. Năm 1954,
chanh dây vàng từ Brazil sang Venezuela, trở thành một ngành công nghiệp và nổi tiếng
tại quốc gia này. Nhiều nỗ lực để đạt được sản lượng đáp ứng nhu cầu trong công nghệ
nước giải khát, kem chanh dây, cocktail và các rum đóng chai. Năm 1913, chanh dây tím
được nhập từ Blue Mountains của Jamaica. Cả chanh dây tím và vàng được trồng nhiều ở
Puerto Rico (Nguyễn Thị Hoàng Yến, 2009).
Năm 1880, chanh dây đã xuất hiện ở Hawaii và nhanh chóng có mặt trong các
nhà vườn. Năm 1930, chanh dây có mặt khắp các hòn đảo ở Hawaii bởi khí hậu ở đây gần
như hoàn hảo cho sự phát triển của chanh dây. Năm 1951, đại học Hawaii chọn chanh dây
như là một sự hứa hẹn phát triển của nông nghiệp và bắt tay tiến hành vào việc sản xuất
nước ép chanh dây tập trung, do đó vào năm 1953 diện tích trồng tăng lên 490 hecta và
kinh doanh phát triển rất tốt. Tuy nhiên sự phát triển này không được dài lâu do sự phát
triển của bệnh do virus gây ra trên cây chanh dây, chi phí lao động cao và sự tăng giá đất
nhanh chóng. Ngày nay diện tích trồng chanh dây đã giảm đi rất nhiều nhưng hương vị
thơm ngon của chanh dây vẫn được người tiêu dùng ưa chuộng. Do đó số lượng lớn nước
ép chanh dây được chuyển đến hàng năm và nước ép chanh dây được tiêu thụ trên đầu
người là cao nhất trên thế giới (Nguyễn Thị Hoàng Yến, 2009).
Vào trước 1900, Úc cũng là một khu vực tiêu thụ chanh dây cao và cùng với sự
phát triển của các vườn chuối. Sự tàn phá của bệnh do virus gây ra trên cây chanh dây đã
làm dừng lại sự phát triển của chanh dây, mặc dù một số nông trại đã xây dựng lại nhưng
không thể đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trên thị trường. Chanh dây phát triển nhất hiện nay ở
Nam Mỹ. Bắt đầu năm 1950, chanh dây vàng được quan tâm và trồng ở Colombia (chủ

7
yếu ở thung lũng Cauca) và Venezuela, năm 1975 ở Suriman sau đó lan rộng sang
Ecuador (Lê Cảnh Tuấn, 2009).
Ngày nay, Nam Mỹ đặc biệt là Ecuador chính là nơi tập trung xuất khẩu chanh
dây vào phương Tây. Đức là một trong những nước tiêu thụ lớn trên thế giới, bột chanh
dây và chuối cung cấp nhiều vitamin khác nhau chỉ sau nước táo ép phổ biến ở Đức. New
Zealand, đầu những năm 1930 đã có một ngành công nghiệp chanh dây nhỏ nhưng nhộn
nhịp trong tỉnh Auckland. Nhưng do sự tàn phá của bệnh do virus gây ra trên cây chanh
dây đã làm sản lượng giảm đi nhanh chóng. Nhưng sau đó, triển vọng về xuất khẩu và
tiếp thị đã làm cho chanh dây hồi sinh lại và diện tích tăng lên rất nhanh chủ yếu ở khu
vực vịnh Plenty. Ngày nay, các sản phẩm từ quả chanh dây được xuất khẩu và ngành công
nghiệp này cũng phát triển ở New Guinea (Nguyễn Thị Hoàng Yến, 2009).
Nam Phi năm 1947, sản lượng là 2.000 tấn chanh dây tím. Năm 1950, tăng gấp
đôi. Năm 1965, đồn điền chanh dây đã được khởi xướng trên diện tích rộng ở Transvaal
nhằm đáp ứng nhu cầu tiêu thụ. Ở Ấn Độ, chanh dây tím được trồng nhiều ở phía Nam
Nilgiris và các vùng khác ở niềm Bắc Ấn Độ. Chanh dây vàng được trồng nhiều ở
Ceylon, Madras và Kerala (Nguyễn Thị Hoàng Yến, 2009).
2.2.4.2 Ở Việt Nam
Loài cây này được nhập vào Việt Nam khoảng đầu thế kỷ hai mươi, được trồng ở
Lâm Đồng, Kontum, Gia Lai, Đắk Lắk … để lấy quả làm nước giải khát, làm cảnh và che
bóng mát. Mặc dù mới du nhập vào Việt Nam nhưng đã có sức hấp dẫn rất lớn nhờ hương
vị thơm ngon đặc biệt và theo Đông y thì các hợp chất trong chanh dây có tính hàn, giúp
bổ dưỡng cho tim mạch, lưu thông khí huyết, hạ thân nhiệt. Với các đặc tính trên mà ngày
càng có nhiều sản phẩm được chế biến từ loài quả này, chính vì vậy mà chanh dây ngày
càng được chú ý khai thác và nhân rộng, hướng tới canh tác theo quy mô, điều này đã tạo
thêm một giống cây trồng mới cho bà con nông dân. Nhiều nông dân không ít vùng đã
được đổi đời nhờ trồng chanh dây ở quy mô công nghiệp với diện tích lớn (Đoàn Thắng,
2013).
Theo một số nông dân đây là cây cho thu nhập “siêu lợi nhuận”, là cây xóa đói
giảm nghèo nhanh và hiệu quả nhất hiện nay. Mỗi hộ dân chỉ cần trồng vài sào là đã có

8
một nguồn thu nhập khá với mức đầu tư khoảng 70 triệu đồng/hecta, sau 2 – 3 tháng thu
hoạch đợt đầu có thể được 60 – 70 tấn/hecta (nếu chăm sóc tốt có thể 120 – 130
tấn/hecta). Giá bán hiện nay trên thị trường 18.000 – 20.000 đồng/kg, thì mỗi hécta chanh
dây thu 1 tỷ – 1,4 tỷ đồng. Vì vậy, trong thời gian ngắn, diện tích chanh dây tỉnh Đắk
Nông, Lâm Đồng đã tăng lên nhanh chóng. Và đây cũng là loại cây mà người dân thường
đưa vào trồng thay thế cho vườn cà phê già cỗi (Đoàn Thắng, 2013).
Thông tin từ một số nhà doanh nghiệp thì giống chanh dây tại Đắk Nông, ngoài
lượng giống lấy từ Lâm Đồng và một số nơi khác về, giống chanh dây Đài Loan tốt hơn
về sinh trưởng, năng suất, chất lượng cũng đã được nhập về để nông dân trồng thử
nghiệm và kết quả đạt khá cao, hứa hẹn tạo ra vùng chanh dây lớn ở đây. Tại Đồng Bằng
Sông Cửu Long cây chanh dây được trồng rải rác tại: Hậu Giang, Cần Thơ, Tịnh Biên
(An Giang), Hòn Đất (Kiên Giang). Ở khu vực thành phố Hồ Chí Minh, tại trại Giống
Cây Trồng Đồng Tiến dạng quả vàng cũng cho quả rất sum suê và thu được lợi nhuận cao
cũng bắt đầu phát triển trồng chanh dây để lấy quả cung ứng cho nhu cầu thị trường. Sản
phẩm cung ứng thị trường nội địa và xuất khẩu. Năm 2012, xí nghiệp nhân giống bò sữa
Delta (huyện Hóc Môn, thành phố Hồ Chí Minh) đưa giống chanh dây Brazil quả vàng
trồng thử trên vùng đất phèn với dự kiến năng suất thu hoạch 30 tấn/hecta (đất tốt năng
suất có thể 50 – 60 tấn/hecta) để cung ứng cho các nhà máy chế biến đồ hộp xuất khẩu và
nhân giống cung cấp cho người dân. Chanh dây đã góp phần làm thay đổi ngành nông
nghiệp, thay thế hay trồng xen canh với các các cây trồng truyền thống, đem lại một
nguồn lợi lớn cho nông dân và thúc đẩy phát triển sản xuất và xuất khẩu (Thanh Nga,
2013).
Theo báo cáo của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Ðắk Nông thì đến
nay, Sở chỉ mới cho phép HTX Nông lâm nghiệp, Thương mại và Du lịch Tia Sáng trồng
khoảng 180 hecta. Do đây là cây trồng mới, nên cần phải trồng thí điểm ba đến bốn năm
để khảo nghiệm. Hiện ngành nông nghiệp đang theo dõi sát sao tình hình phát triển của
cây chanh dây và khuyến cáo người nông dân không nên mở rộng diện tích ồ ạt vì ngành
nông nghiệp vẫn chưa nắm hết kỹ thuật gieo trồng, tình hình dịch bệnh cũng như thị
trường “đầu ra” của loại cây trồng này. Mặc dù trước những khuyến cáo của ngành nông

9
nghiệp nhưng do trồng cây chanh dây có lãi cao nên nhiều hộ nông dân đã tự động mua
giống về trồng, mở rộng diện tích, bất chấp rủi ro (Thanh Nga, 2013).
Với cây trồng siêu lợi nhuận, hiện nay cây chanh dây đã được nông dân ở nhiều
địa phương như: Lâm Ðồng, Gia Lai, Kon Tum, Kiên Giang, Cần Thơ và một số tỉnh phía
Bắc. Chỉ riêng tỉnh Lâm Ðồng, nông dân đã trồng hơn 500 hecta chanh dây, nhưng cũng
có những thời gian hàng trăm hecta chanh dây nhiễm bệnh, làm hàng trăm hộ dân điêu
đứng. Nhiều vườn cây chanh dây đang phát triển tốt bỗng nhiên bị nhiễm sâu bệnh như:
nhện đỏ, bọ xít, rệp, phấn trắng, nấm rễ, nấm trái, quăn đọt. khiến quả chanh dây bị héo
úa, rơi rụng dẫn đến năng suất giảm chỉ bằng một phần tư so với mọi năm, cho thu nhập
thực tế chỉ khoảng 20 đến 25 triệu đồng/hecta. Do chưa nắm được kỹ thuật phòng trừ sâu
bệnh, nhiều hộ nông dân đã sử dụng các loại thuốc bảo vệ thực vật nhưng không mang lại
hiệu quả. Nhiều người lại chặt phá chanh dây để trồng các loại cây khác (Nguyễn Công
Lý, 2011).
Tên thường dùng ở Việt Nam là: chanh dây, chanh vàng, chanh nước, lạc tiên, táo
chuông, mác mác. Hiện tại, ở Việt Nam có 2 loại giống chanh dây, một loại được chiết
ghép với giống của Đài Loan, một loại thuần Việt (Nguyễn Công Lý, 2011).
2.2.5 Tình hình bệnh hại trên chanh dây
2.2.5.1 Bệnh đốm nâu
Bệnh hại quan trọng nhất là bệnh đốm nâu do nấm Alternaria passiflorae gây hại
trên lá, thân và quả chanh dây. Là một trông số những bệnh rất phổ biến, gây thiệt hại
nặng tại một số vùng trồng trên thế giới như: Úc, New Zealand, Kenya, Colombia và
Malaysia. Bệnh thường gây hại vào giai đoạn mùa xuân và đầu mùa hè, có thể gây héo và
rụng lá, gây chết dây (Theo CABI, 2007).
Trên lá những đốm nâu nhỏ xuất hiện trên lá đầu tiên. Sau đó phát triển thành
đốm màu sắc sáng ở giữa và có thể có hình dạng bất định. Trên thân, những vết bệnh có
hình thon dài màu tối xuất hiện, thường gần nách lá hoặc gân lá (bị tổn thương cơ giới,
nhựa cây). Sự lây lan từ những điểm này và khi vết bệnh bao quanh thân cây thì quả teo
lại và rơi xuống. Trên quả, vết châm kim xuất hiện và lan rộng thành những vòng tròn
đồng tâm với vết nâu lõm.

10
 Theo Akmine E.K và ctv (1974), ghi nhận rằng bệnh đốm nâu do nấm Alternaria
passiflorae, Alternaria tenuis và Alternaria tomato gây hại nghiêm trọng nhất trên cây
chanh dây ở Hawaii. Loại bệnh quan trọng đứng thứ hai là bệnh thối rễ do nấm Pythium
spendens, Pythium aphanidermatum và loại bệnh gây hại kém nghiêm trọng hơn là bệnh
do nấm Rhizoctonia solani.
Bệnh quan trọng nhất là bệnh do nấm gây hại các bộ phận trên mặt đất của cây
chanh dây, đó là bệnh thán thư và bệnh đốm nâu. Chúng tấn công gây hại trên lá và trên
quả ở giai đoạn tiền thu hoạch và sau thu hoạch ở hầu hết các nước trồng chanh dây.
Ngoài ra, một số loại bệnh khác như bệnh thối do nấm Diplodia, Phomopsis, bệnh ghẻ do
nấm Clasdosporium oxsporum (Willingham S. l., 2009) cũng có ảnh hưởng rất lớn ở các
quốc gia khác. Các loại bệnh sau thu hoạch ít quan trọng là bệnh thối do nấm Fusarium,
Penicillium và Septoria (Manicom B. và ctv, 2003).
2.2.5.2 Bệnh đốm Septoric
Do nấm Septoria passiflorae gây hại trên lá, thân và quả.
Bệnh làm rụng lá và giảm năng suất cây trồng. Bệnh thường xuất hiện trong suốt
mùa hè và mùa thu. Trên lá, nhỏ, bề mặt, không có hình dạng cố định, đốm nhỏ màu nâu
sáng xuất hiện, nhanh chóng làm lá rụng kéo dài. Trên thân, đốm xuất hiện tương tự như
ở trên lá, đốm trở nên lõm sâu. Trên quả, sự xâm nhiễm là những đốm nhỏ, tương tự như
trên lá và thân. Những đốm này kéo thành những thương tổn gây nên rụng lá và quả.
2.2.5.3 Bệnh thối quả
Glomerella cinsulata hại quả nhất là vào mùa hè nóng, quả bị xây xát dễ nhiễm
bệnh. Trên quả bệnh xuất hiện các vết nứt màu đen, thối mềm lan khắp quả, làm quả rụng.
2.2.5.4 Bệnh chết héo
Bệnh héo Fusarium là loại bệnh nấm đất do nấm Fusarium oxysporium f. sp.
passiflorae tấn công gây hại trên cây chanh dây tại các khu vực của Palmira, Cerrito và
Ginebra thuộc thung lũng Cauca ở Colombia. Triệu chứng bệnh đầu tiên là lá vàng, hoại
tử và rụng lá; tiếp theo vỏ cây bong ra khỏi thân cây và thối dần. Nectria haematococca
hoặc Hypomyces solani hoặc Fusarium solani là các loại nấm gây héo đột ngột trên cây
chanh dây tím ở Uganda (Willingham S. L., 2009).

11
2.2.5.5 Bệnh do vi khuẩn
Vi khuẩn là tác nhân gây ra nhiều triệu chứng bệnh khác nhau trên cây chanh dây.
Vi khuẩn Agrobacterium tumefacsiens gây bệnh u sung, u bướu; Erwiniacarotovora ssp.
carotovora gây bệnh thối mềm; Ralstonia solanacearum gây bệnh héo rũ và
Pseudomonas syringae pv. Syringae, Pseudomonas syringae pv. passiflorae,
Pseudomonas viridiflava gây đốm lá (Manicom B. và ctv, 2003).
Bệnh cháy do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. syringe gây hại, là bệnh quan
trọng nhất do vi khuẩn gây ra. Vết bệnh ban đầu thường là đốm có kích thước nhỏ,
khoảng 1cm. Triệu chứng phổ biến trên lá là vết bệnh sáng, xung quanh có màu vàng và
có một giọt dầu trên bề mặt vết bệnh, bệnh nặng gây rụng lá. Trên trái, vết bệnh có màu
đen hoặc xanh nâu sáng, có giọt dầu và đường viền màu xanh quanh vết bệnh. Bệnh nặng
nhiều vết bệnh liên kết với nhau ăn xâu vào trong quả làm hư quả hoàn toàn (Manicom và
ctv, 2003).
Bệnh đốm do vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. passiflorae gây hại. Đây là
loại bệnh quan trọng nhất do vi khuẩn gây ra. Bệnh đốm do vi khuẩn đã được ghi nhận ở
Úc, Colombia và Brazil. Vi khuẩn là tác nhân gây hại nghiêm trọng và gây thiệt hại lớn
cho ngành sản xuất chanh dây. Vết bệnh ban đầu thường là những đốm có kích thước nhỏ
khoảng 1cm. Trong điều kiện thích hợp hầu hết triệu chứng phổ biến ở trên lá. Chúng có
thể xuất hiện bất kỳ vị trí nào trên lá, nhưng phổ biến nhất là dọc theo rìa lá. Vết bệnh
sáng, có màu xanh tối, xung quanh có viền màu vàng và có một giọt dầu trên bề mặt vết
bệnh, bệnh nặng gây rụng lá. Lá bị nhiễm bệnh có thể lây qua cành, qua rễ, bệnh nặng
làm thâm đen mạch dẫn và làm khô cành. Trên quả, vết bệnh có màu đen hoặc xanh nâu
sáng, có giọt dầu và có đường viền rõ ràng xung quanh vết bệnh. Bệnh nặng nhiều vết
bệnh liên kết với nhau ăn sâu vào phần thịt quả và làm cho quả hư hoàn toàn (Manicom
B. và ctv, 2003).
2.3 Tổng quan về nấm Alternaria
Đặc điểm hình thái và đặc điểm phát triển của nấm Alternaria:
Giới: Fungi
Ngành: Ascomycota

12
 Lớp: Euascomycetes
Bộ: Pleosporales
Họ: Pleosporaceae
Chi: Alternaria
(Theo Nees ex Wallroth, 1816)
Đặc điểm: Nhóm nấm này khá phổ biến gây hại nhiều loài cây trồng khác nhau trên
thế giới. Chúng tấn công chủ yếu trên lá, cuống, hoa và quả quanh năm trên các loài cây
trồng, đặc biệt là nhóm cây rau màu và cây kiểng, nhưng cũng có một vài cây khác như
cây có múi, cây táo. Bệnh do nấm Alternaria thường gây ra triệu chứng như: đốm và
cháy, nhưng nó cũng gây ra triệu chứng chết rạp cây con, thối cuống, thối củ và thối quả
(George N. A., 1997). Có nhiều loài Alternaria hoại sinh và gây chết từng phần cây trồng.
Alternaria là tác nhân gây nhiễm chính trong nuôi cấy ở phòng thí nghiệm. Bào tử của
chúng rất dễ lẫn tạp trong bụi bặm trong không khí và là tác nhân chính gây nên dị ứng,
một số bệnh về da và rối một vài rối loạn nghiêm trọng ở cơ thể người. Nhiều loài
Alternaria ký sinh trên thực vật, triệu chứng sớm của bệnh là những đốm nhỏ màu vàng
nâu trên lá, sau đó lan rộng tạo thành những vết hình nhẫn đồng tâm; toàn bộ phiến lá,
cuống lá, gân lá và thậm chí cả hệ thống mạch dẫn cũng tổn thương đứt gãy do bị nhiễm
nấm (Nguyễn Văn Bá và ctv, 2005).

13
 Hình 2.2 A – F: Sự phát triển bào tử đính của Alternaria solani.
G: 2 bào tử đính thành chuỗi của Alternaria brascicae; H: bào tử nảy chồi của Alternaria
brasicicola; I: chuỗi bào tử phân nhánh của Alternaria brascicae; J: bào tử nảy chồi của
Alternaria brasicicola (Sharma, 1998).

Hình 2.3 Hình thái bào tử; chuỗi bào tử sơ cấp, thứ cấp; cành bào tử và tế bào thân của
nấm Alternaria alternata (Simmons E.G., 2007 và www.mycobank.org).

Hình 2.4 Hình ảnh triệu chứng bệnh trên lá và trên quả
Nguồn: Đặng Thị Hạnh, 2014

14
 Đặc điểm sợi nấm: Màu nâu sáng, mảnh, phân nhánh mạnh, sợi nấm có vách ngăn
trước hết lá gian bào, sau đó có thể trở thành nội bào. Mỗi tế bào thường có nhiều nhân
(Nguyễn Văn Bá và ctv, 2005).

Hình 2.5 Hình ảnh nấm Alternaria phân lập trên môi trường PCA
Nguồn: Đặng Thị Hạnh, 2014
Đặc điểm sinh sản: chi Alternaria chủ yếu sinh bằng cách tạo bào tử đính; giai đoạn
hoàn chỉnh của Alternaria là Pleospora infectoria. Kiểu đặc trưng sinh sản bào từ của
nấm Alternaria gồm có cuống bào từ đơn trên đỉnh cuống bào tử đính những nhánh bào tử
dạng chuỗi với những bào tử nhỏ thứ cấp trên những cành bào tử ngắn riêng lẽ.
Đặc điểm phát triển: Bào tử phân sinh nảy nầm trong giọt nước sau 1 – 2 giờ ở nhiệt
độ 16 – 340C, nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 26 – 280C. Nấm xâm nhập
vào cây qua lỗ khí khổng hoặc vết thương trực tiếp qua biểu bì. Từ 130C nấm có thể xâm
nhập và gây bệnh, nhiệt độ càng cao thì sự xâm nhập càng dễ dàng. Trong điều kiện nhiệt
độ thuận lợi và môi trường ẩm ướt thì thời kỳ tiềm dục của bệnh là 3 – 4 ngày và sau đó 3
- 4 ngày nấm có thể sinh bào tử mới. Thông thường thời gian tiềm dục kéo dài từ 8 – 10
ngày. Trời càng mưa nhiều và sương thì bào tử phát triển càng nhiều. Nấm có thể tồn lại
trên hạt, trên tàn dư của cây bệnh (Vũ Triệu Mân, 2007).
2.4 Kỹ thuật PCR
2.4.1 Nguyên tắc PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis và cộng sự công bố vào năm
1985. Đây là kỹ thuật trong sinh học phân tử, nó giúp tạo ra dòng DNA rất đơn giản và

15
hiệu quả. Với việc phát minh ra máy thermocycler và sử dụng enzyme Taq DNA
polymerase trong phản ứng PCR là một bước phát triển cực kì quan trọng trong các thí
nghiệm sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Trong phản ứng
PCR, các mạch đơn mới được tổng hợp lại được làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch
mới của chu kì tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn DNA mới cần sự tham gia của primer tạo
các 3’-OH tự do. Các nucleotide được gắn vào vị trí nhóm –OH kéo dài tạo thành mạch
mới (Khuất Hữu Thanh, 2003).
2.4.2 Quy trình thực hiện
Toàn bộ quá trình là một chuỗi phản ứng gồm nhiều chu kỳ nhiệt nối tiếp nhau.
Mỗi chu kỳ có ba giai đoạn xảy ra tuần tự:
- Giai đoạn 1: giai đoạn biến tính (denaturation) để tách chuỗi DNA. Nhiệt độ được
nâng cao khoảng 940C – 950C trong vòng 30 - 60 giây, các cầu nối hydrogen giữa
2 mạch DNA bị phá vỡ và mạch kép được tách thành hai mạch đơn.
- Giai đoạn 2: giai đoạn bắt cặp primer (hybridization). Nhiệt độ phản ứng được hạ
thấp hơn nhiệt độ nóng chảy Tm của các primer (Tm là nhiệt độ mà tại đó 2 mạch
của sợi đôi DNA tách ra hoàn toàn) cho phép primer gắn vào 2 sợi đơn DNA ở vị
trí chuyên biệt. Nhiệt độ này dao động trong khoảng 400C – 700C (tùy thuộc vào
Tm của primer) và kéo dài từ 30 – 60 giây.
- Giai đoạn 3: giai đoạn tổng hợp (extension) mạch DNA mới. Nhiệt độ được tăng
lên đến 720C giúp DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Thời gian tổng hợp tùy
thuộc vào độ dài đoạn DNA cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài
phút.
Một chu kỳ gồm ba bước trên sẽ được lập đi lập lại nhiều lần, mỗi lần lặp lại làm
tăng gấp đôi lượng DNA khuôn mẫu lần trước đó. Sự khuếch đại này xảy ra theo cấp số
nhân (hình 2.2). Theo nguyên tắc, ta có thể tính lượng DNA tạo ra theo công thức:
Tổng số DNA khuếch đại = m x 2n.
Trong đó: m là số bản sao của chuỗi trình tự DNA cần nhân bản.
n là số chu kỳ.

16
 Tuy nhiên, lượng DNA tạo ra thực tế thường ít hơn so với lý thuyết do nhiều nguyên
nhân như điều kiện phòng thí nghiệm, chất lượng hóa chất, chu kỳ nhiệt…

Hình 2.2 Số lượng sản phẩm PCR tạo thành sau 35 chu kỳ
( Nguồn: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html )
2.4.3 Thành phần, vai trò các chất tham gia phản ứng PCR
Khi tiến hành PCR, người ta sẽ pha trộn các thành phần theo nồng độ thích hợp. Tùy
vào đặc điểm của DNA mẫu và nồng độ ban đầu của từng hóa chất mà thể tích hút mỗi
loại khác nhau. Tuy vậy, thành phần tham gia phản ứng trên cơ bản giống nhau, bao gồm:
MgCl2, dNTPs, primer, dung dịch PCR buffer, DNA polymerase chịu nhiệt và trình tự
DNA mục tiêu cần khuếch đại. Mỗi loại hóa chất đều giữ vai trò riêng biệt.
- Ion Magnesium (Mg2+): Mg2+ được bổ sung vào phản ứng ở dạng dung dịch
MgCl2. Ion này là một nhân tố ảnh hưởng lớn đến kết quả PCR. Nếu nồng độ Mg2+
cao sẽ làm cho dây đôi DNA ổn định hơn dẫn đến khả năng biến tính và tách mạch
DNA từ dạng sợi đôi thành sợi đơn giảm, do vậy sản phẩm PCR tạo thành ít. Thừa
Mg2+ gây ra sự bắt cặp sai giữa primer và khuôn, kết quả là tạo ra sản phẩm không
mong muốn. Ngược lại, nếu Mg2+ quá thấp sẽ làm giảm quá trình tổng hợp mạch
mới vì hoạt động của enzyme bị ức chế. Do đó, người ta cần phải xác định nồng độ
tối ưu của ion Mg2+ để đảm bảo tính chuyên tính cũng như số lượng sản phẩm
khuếch đại được tạo thành (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).

17
 - dNTPs: Đây là nguyên liệu chính gắn kết vào mạch khuôn để tổng hợp nên mạch
DNA mới. Khi nồng độ dNTPs cao sẽ dẫn đến việc tạo ra các sản phẩm không
mong muốn. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide này sẽ gia tang các
lỗi sao chép của DNA polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
- DNA mẫu: Kết quả PCR phụ thuộc nhiều vào độ tinh sạch DNA mẫu. Lượng DNA
mẫu thường sử dụng trong khoảng 10 – 100ng. Hàm lượng khuôn DNA cao
thường tăng hiệu suất thu hồi sản phẩm PCR không đặc hiệu, Lượng mẫu thích
hợp có tác dụng hạn chế sự hình thành các sản phẩm không mong muốn.
- Dung dịch PCR buffer: PCR buffer cần phù hợp với DNA polymerase để đảm bảo
cho phản ứng xảy ra ổn định. PCR buffer thường được cung cấp theo loại DNA
polymerase chịu nhiệt được sử dụng trong phản ứng, có hoặc không có ion Mg2+ .
- Taq polymerase: Trong phản ứng PCR, nhiệt độ cao hơn trong cơ thể sống, vì vậy
cần sử dụng DNA polymerase có khả năng chịu nhiệt cao. Loại DNA polymerase
được dung phổ biến hiện nay là Taq polymerase. Loại enzyme này được thu nhận
từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên 1100C
và có tính ổn định nhiệt cao. Nhờ đặc điểm này mà khi gia nhiệt để tách mạch đôi
DNA, enzyme không bị phá vỡ hay biến tính. Taq polymerase có mức tối ưu về
nhiệt độ trong sinh tổng hợp DNA khoảng 70 – 720C.
Sử dụng Taq có hai thuận lợi chính, một là enzyme có khả năng phục hồi nhanh sau
khi tác động nhiệt; hai là Taq hoạt động ở nhiệt độ cao giúp cho các primer ở đầu dây
đơn bắt cặp chuyên biệt và sinh tổng hợp DNA nhanh hơn. Tuy nhiên, Taq thỉnh thoảng
nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA dẫn đến sai sót trong tổng hợp mạch DNA mới,
cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide (Hồ Thùy Dương, 1998). Ngoài Taq,
một số enzyme khác cũng có khả năng chịu nhiệt cao như Tth, Pwo, hay Pfu. Tth phân lập
từ Thermus thermophiles, Pwo và Pfu thu thập từ các vi sinh vật cổ Pyrococcus woesii và
Pyrococcus furious sống ở suối nước nóng.
- Primer: là đoạn DNA mạch đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu
của mạch khuôn trong quá trình nhân đôi DNA. Dưới tác động của DNA
polymerase, primer sẽ được nối dài để hình thành mạch DNA bổ sung mới. Primer

18
 là yếu tố quan trọng trong quá trình khuếch đại vì nó có tính đặc hiệu và chuyên
biệt với trình tự DNA đích để giúp phản ứng đạt hiệu quả cao hơn.
Trong phản ứng PCR chuẩn, cặp primer được sử dụng gồm forward primer (mồi
xuôi) và reserve primer (mồi ngược). Mồi xuôi gắn vào đầu 3’ của mạch khuôn 5’-3’(sợi
sense), còn ngồi ngược thì bắt cặp ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’-5’ (sợi antisense). Trình tự
của primer được thiết kế cần đảm bảo không xảy ra sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi –
mồi ngược (primer dimer), không tạo nhưng cấu trúc “kẹp tóc” (hairpin) trong mỗi primer
và Tm của 2 primer không chênh lệch nhiều. Thành phần nucleotide của primer tránh lặp
lại nhiều lần các cặp GC.
2.4.4 Các yếu tố khác
Yếu tố quan trọng nhất trong phản ứng PCR là nhiệt độ nóng chảy của primer Tm.
Trong số 3 giai đoạn của phản ứng PCR, giai đoạn 2 quan trọng nhất bởi vì trong giai
đoạn này sự lai DNA-DNA giữa primer và khuôn xảy ra. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng
quá thấp thì việc lai DNA sẽ bị nhiều lỗi. Nếu nhiệt độ chọn cho phản ứng quá cao thì
không lai được DNA. Vì thế để thiết lập nhiệt độ cho phản ứng PCR người ta cần xác
định nhiệt độ nóng chảy Tm với từng primer như sau:
Tm = [4(G + C) + 2(A + T)]0C .
Đây là công thức Wallace chung nhất hay được sử dụng, xác định gốc từ phân tử lai
oligonucleotide, được thực hiện trong 1M NaCl. Ở nồng độ muối thấp, công thức chỉ
chính xác đối với mồi dài không quá 20 nucleotide (Quyền Đình Thi & Nông Văn Hải,
2008).
Số lượng chu kỳ phản ứng: Thông thường không được vượt quá 40 chu kỳ. Do phản
ứng PCR diễn tiến quá hai giai đoạn đầu số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân tỉ lệ với
số lượng mẫu ban đầu, sau đó hiệu quả khuếch đại giảm hẳn vì những nguyên nhân sau:
sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ làm
ức chế phản ứng khuếch đại, các bản sau vừa được tổng hợp không bắt cặp với mồi mà
chúng bắt cặp với nhau. Số chu kỳ cho một phản ứng còn phụ thuộc vào số lượng mẫu
ban đầu.

19
 Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR: Máy PCR cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi
nhiệt độ thật nhanh, thật chính xác, tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng
PCR. Eppendorf dùng cho phản ứng PCR phải là loại có vách mỏng và có khả năng
truyền nhiệt tốt.
2.4.5 Ưu và nhược điểm của PCR
Ưu điểm: thời gian thực hiện nhanh, thao tác đơn giản và cho độ nhạy cao.
Nhược điểm: nhược điểm đầu tiên là sự giới hạn về kích thước đoạn DNA cần
khuếch đại. Thông thường, kỹ thuật PCR không khuếch đại hiệu quả đối với những đoạn
DNA kích thước lớn hơn 3kb, với những đoạn DNA có độ dài dưới 1,5kb cho kết quả rất
tốt. Quá trình thực hiện dễ bị ngoại nhiễm. Đặc biệt trong những lần thao tác như nhỏ hóa
chất, hút mẫu, các phân tử của lần thí nghiệm trước còn hiện diện trong không khí hoặc
các enzyme lơ lửng sẽ ảnh hưởng nhiều đến quá trình khuếch đại sản phẩm DNA (Bùi
Chí Bữu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Trên nền tảng PCR truyền thống, các nhà khoa học còn phát triển thêm các phương
pháp PCR cho hiệu quả tin cậy như kỹ thuật Real time – PCR, Nested PCR, Reverse
transcriptase PCR, neo-PCR.
2.4.6 Ứng dụng của PCR
Hiện nay, thành tựu của PCR mở ra nhiều triển vọng cho sinh học phân tử với nhiều
ứng dụng trong sinh học, y khoa, nông nghiệp, kiểm nghiệm vi sinh vật gây bệnh: thực
phẩm, mỹ phẩm, nước, trong phát hiện pháp y. Ứng dụng PCR để sản xuất những Probe
(mẫu dò) dùng trong phương pháp lai phân tử, xác định các trình tự acid nucleic, tạo các
đột biến điểm định hướng.
Hơn thế nữa PCR còn được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác như:
 Trong nghiên cứu genome :
- Nhân bản vô tính với PCR Recombinant PCR
- Kỹ thuật Footprinting Dnase I Multiplex PCR
- HLA DNA
 Phát hiện DNA có tính đa hình nhờ PCR:

20
 PCR là kỹ thuật chuẩn và từ đó cải tiến để tăng thêm hiệu quả nghiên cứu cho những
gen có tính đa hình cao hay lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lý. Tính đa hình của gen được
ứng dụng nhiều trong di truyền và chọn giống.
PCR chuẩn cần phải biết trước trình tự đầu tiên của gen để thiết kế các primer đặc
hiệu. Tuy nhiên có những nghiên cứu thực hiện trên những vùng thông tin về các chuỗi
mã di truyền trên vùng genome một số đối tượng chưa biết trước. Cho nên để phát hiện
tính đa hình của DNA trên những vùng chưa biết trước đó ta phải cải tiến kỹ thuật PCR
để có thể ứng dụng vào những nghiên cứu tính đa hình hay những trình tự DNA ngắn hay
tính lập lại của một vùng nào đó của genome.
Dựa trên nguyên tắc cơ bản của PCR các marker phân tử sau được đưa ra để phục vụ
cho mục đích trên:
Marker Thuật ngữ Tác giả
AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Vos và ctv, 1995
RFLP Restriction Frangment Length Polymorphism Botsein và ctv, 1980
SSR Simple Sequence Repeat Litt & Luty, 1998
RADP Random Amplified Polymorphic DNA William và ctv, 1991
STS Sequence Tagged Site Fukuoka và ctv, 1994

Hiện nay, các nhà khoa học đã và đang xây dựng nên các thư viện DNA của genome
và thư viện cDNA trên cơ sở PCR.
Kỹ thuật PCR là công cụ hữu ích để khuếch đại trình tự của đoạn gen chứa vùng ITS1
– 5,8S – ITS2 với việc sử dụng cặp primer ITS4 và ITS5.
2.5 Tổng quan về ITS - rDNA
2.5.1 Giới thiệu về vùng rDNA và vùng ITS
rDNA là nhóm gen mã hóa rDNA của ribosome và đóng vai trò quan trọng trong
các nguyên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được nghiên cứu vì nó là gen có nhiều bản
sao và đặc biệt không mã hóa cho bất kỳ protein nào. Các bản sao của gen nằm liên tiếp
trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Ribosome hầu như tồn tại
trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc. Phần lớn phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên

21
được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác
nhau. Các primer thiết kế dựa trên những Oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử
dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại các vùng tương đương dùng trong so sánh.
Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng
trong phát hiện và định danh vi sinh vật (Van de peer và ctv, 1996).
rDNA chứa vùng ITS1; 5,8S; 18S; ITS2, 28S và vùng IGS (Intergenic Spacer).
Vùng phiên mã 18S kết thúc tiểu đơn vị nhỏ (SSU), trong khi 28S với 5,8S và một gen 5S
thêm vào từ những phần khác của genome hình thành tiểu đơn vị lớn (LSU) của ribosome
RNA. Những vùng ITS được phiên mã (tổng hợp từ RNA), nhưng bị cắt trước khi rRNA
hoàn thiện được hình thành, tuy nhiên ITS lại có chức năng trong sự hình thành ribosome
(Albert và ctv, 1994). Ở đầu kết thúc 5’ của 18S và đầu kết thúc 3’ của 28S, cũng có một
vùng được biết đến là ETS (External Transcribel Spacer). IGS là vùng kém bảo tồn nhất
của rDNA. Tuy nhiên vùng không gian không phiên mã của những rDNA chứa trình tự
kết thúc phiên mã của những gene rRNA.

Hình 3 Sơ đồ vùng rDNA-ITS của nấm

(Nguồn: http://nature.berkeley.edu/brunslab/picts/results/its-map.GIF )
Các rDNA 5,8S; 28S; 18S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen kẽ với
các vùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS). Giữa các
nhóm gene gồm nhiều bản sao lặp lại là vùng không phiên mã. Có một rDNA 5S thường
không có vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại, rDNA 5S thường
chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm (Guarro, 1999).

22
 rDNA 18S thường được quan tâm nghiên cứu, rDNA 5,8S có kích thước rất nhỏ và
ít có sự biến đổi song rRNA 5S là thành phần không thể thiếu của nu-LSU-rRNA, có vai
trò ổn định cấu trúc ribosome và thúc đẩy quá trình tổng hợp protein (Szymanski và ctv,
2001).
Vùng ITS là vùng có rất nhiều biến đổi, mặc dù vùng ITS thường được sử dụng
trong nghiên cứu tiến hóa của sinh vật tuy nhiên phần lớn các so sánh trên vùng này chỉ
thường sử dụng ở mức độ xác định các biệt hóa trong cùng loài (Guarro, 1999).
Những gen rRNA ở sinh vật có nhân điển hình (ribosome DNA hay rDNA) được
tìm thấy như những phần đơn vị lặp lại được sắp xếp thành từng cặp.
Mỗi đơn vị lặp lại chứa một vùng phiên mã (ETS1, ETS2, 18S, 25S và 5,8S) và
một vùng không phiên mã (NTS). Trong vùng phiên mã, ITS được tìm thấy trên gen 5,8S
rRNA bao gồm ITS1 và ITS2.
2.5.2 Lịch sử nghiên cứu rDNA
Nghiên cứu rDNA để xác định mối quan hệ trong phát sinh loài của động vật đa
bào (Field và ctv, 1988). rDNA nhân mã hóa rRNA 18S có thể dùng làm cơ sở đề giải
quyết vấn đề liên quan đến lịch sử phát sinh động vật đa bào (Halanych Kenneth M,
1998).
rDNA được quan tâm nghiên cứu từ rất sớm. Bằng cách tách gen, nhân dòng và
đọc trình tự. Tuy nhiên phương pháp đọc trình tự DNA trực tiếp từ sản phẩm PCR ra đời
tạo rất nhiều thuận lợi cho các nghiên cứu liên quan đến vùng rDNA (White và ctv,
1989). Ngoài ra, phương pháp PCR được cải tiến thay vào đó là phương pháp RAPD,
RFLP, AFLP được đưa vào để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của sinh vật dựa vào
vùng rDNA thay vì đọc trình tự vùng rDNA.
Thực vật cũng được quan tâm nghiên cứu vùng rDNA. Palmer và cộng sự (1990)
đã so sánh trình tự SSU-rDNA của nhân, ty thể và lục lạp của thực vật hạt kín. Kết quả
cho thấy trình tự rDNA 18S của nhân là có nhiều biến đổi nhất.
Trên nấm, các nghiên cứu trên rDNA để phân loại nấm, nhận biết tính đa dạng di
truyền, mối quan hệ di truyền của những loài nấm sợi khi so sánh thay đổi của SSU-
rDNA (18S) (Bruns và ctv, 1991, 1992).

23
2.5.3 Sử dụng vùng rDNA để nghiên cứu sự đa dạng di truyền
Việc phân loại nấm dựa vào đặc điểm hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách
tế bào và thành phần protein nên kết quả phân loại thường không chính xác và cần khoảng
thời gian dài. Việc so sánh dựa trên trình tự nuclotide được giải mã của vùng ITS-rDNA
được xem là cơ sở chính xác để phân loại nấm cũng như xác định tính đa dạng di truyền
của sinh vật cũng như hầu hết các dòng nấm (Guarro, 1999).
Nhờ những phân tích trên nu-SSU-rDNA có thể chia giới nấm thành 4 lớp Fungi,
Myxomycota, Oomycota, Acrasiomycota (Bruns và ctv, 1991).
rDNA chứa những vùng bảo tồn (18S; 28S; 5,8S) cũng như những vùng ít bảo tồn
(ITS) và những vùng ít biến động (IGS). Những vùng này có thể được sử dụng để phân
tích sự phát sinh loài và sự đa dạng di truyền của sinh vật (Carbone và Kobn, 1993;
Rehner và Uecker, 1994; Lloyd-MacGilp và ctv, 1996; Hallenberg và ctv, 1996; Hirata và
Takamatsu, 1996; Sreenivasaprasad và ctv, 1996).
Vùng ITS1 và ITS2 được tìm thấy giữa gen của tiểu đơn vị ribosome nhỏ (18S) và
tiểu đơn vị ribosome lớn (28S) chỉ ra sự biến thiên trong cùng loài. Khuếch đại vùng ITS
này sau đó phân tích bằng các enzyme cắt giới hạn, được sử dụng để khám phá sự khác
nhau của các loài nấm (Bernier và ctv, 1994; Fabre và ctv, 1995; Aora và ctv, 1996,
Redeckera và ctv, 1997). Vùng ITS2 được khám phá sau vùng ITS1, vùng ITS2 có tính
bảo tồn cao hơn ở một vài vùng 18S (Hershkovitz và ctv, 1999).
Chiều dài và trình tự của những vùng ITS của rDNA được cho là vùng tiến hóa
nhanh nhất và vì vậy có thể rất biến đổi. Vùng ITS được nghiên cứu về sự tiến hóa và
phát sinh loài, đa dạng di truyền.
Trình tự rDNA được sử dụng nhiều trong nghiên cứu quan hệ phát sinh loài trên
một phạm vi rộng, từ những nghiên cứu giữa những nòi giống cơ bản của sự sống đến
quan hệ giữa những loài có quan hệ gần. rDNA có thể được áp dụng trong nhiều trường
hợp như vậy là do rDNA bao gồm nhiều mức độ tiến hóa trong những vùng khác nhau và
sự hiện diện nhiều bản sao trong mỗi genome. rDNA có thể được phân tích dựa trên kỹ
thuật giải trình tự RNA, DNA hay sử dụng enzym cắt.

24
 Vùng được nghiên cứu nhiều nhất của rDNA là vùng mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ
16 – 18 rRNA. Gen này được nghiên cứu phổ biến do nó là vùng tiến hóa chậm trong sinh
vật, vì thế có thể sử dụng để nghiên cứu những sự kiện tiến hóa cổ xưa. Ngoài ra, tỉ lệ
thay đổi thấp cho phép tạo ra những primer phổ biến, điều này giúp cho việc giải trình tự
của những nhóm sinh vật mà trước đây chưa được nghiên cứu.
Vùng không mã hóa cho rRNA có thể được sử dụng để tìm hiểu quan hệ phát sinh
loài trong những loài có quan hệ gần. Ngoài ra, những thay đổi trong vùng này cũng có
thể được sử dụng trong định danh loài, nghiên cứu sự lai giống, và như những marker
trong nghiên cứu di truyền quần thể. Vùng NTS tiến hóa nhanh nhất và vùng ITS bảo tồn
hơn. Việc khuếch đại hai vùng ITS1 và ITS2 khá dễ dàng bằng phản ứng PCR do những
vùng bảo tồn của 18S; 5,8S; 28S có thể được sử dụng để thiết kế những primer phổ biến.
vì thế việc sử dụng vùng này trong nghiên cứu tiến hóa của những loài có quan hệ gần
đang trở nên phổ biến (Hillis & Dixon, 1991).
2.6 Giới thiệu chung về BLAST
Trong tin sinh học, Basic Local Alignment Search Tool, hay BLAST, là một thuật
ngữ để so sánh các chuỗi sinh học, như các chuỗi amino acid của các protein hay của các
chuỗi DNA khác nhau.
2.6.1 Chức năng của chương trình BLAST
Sự so sánh những trình tự nucleotide hay protein của cùng một sinh vật hay của
những sinh vật khác nhau có vai trò quan trọng trong những nghiên cứu sinh học phân tử.
Sự giống nhau giữa các trình tự có thể cho biết chức năng của gen mới, tiên đoán những
thành viên mới của một họ gen, cũng như quan hệ tiến hóa. Việc tìm sự giống nhau giữa
các trình tự có thể được sử dụng để tiên đoán vị trí và chức năng của những vùng điều hòa
phiên mã và mã hóa protein (Nguyễn Văn Cách, 2005).
Chương trình BLAST có thể được tải về và chạy dưới dạng tiện ích dòng lệnh tên
là "blastall" hoặc có thể truy xuất miễn phí qua web. Máy chủ web chứa BLAST, đăng kí
bởi NCBI, cho phép mọi người dùng trình duyệt web để thực thi tìm kiếm sự giống nhau
trên các cơ sở dữ liệu các protein và DNA được cập nhật liên tục với hầu hết các chuỗi
mới được tìm thấy trên các thực thể sống.

25
 Một đối trọng với tốc độ cực kì nhanh so với BLAST nhằm so sánh các chuỗi
nucleotide với genome là BLAT (Blast Like Alignment Tool). Một phiên bản được thiết
kế cho việc so sánh nhiều genome hay chromosomes lớn là BLASTZ.
BLAST thực sự là một họ các chương trình (bao gồm cả chương trình blastall). Sau
đây là một số chương trình trong họ, được sắp xếp theo thứ tự quan trọng của nó:
- Nucleotide-nucleotide BLAST (blastn): So sánh trình tự DNA với cơ sở dữ liệu
DNA.
- Protein-protein BLAST (blastp): So sánh trình tự protein với cơ sở dữ liệu protein
- blastx (translated BLAST): Dịch mã trình tự DNA thành 6 trình tự protein sử dụng
6 khung đọc có thể xảy ra, sau đó so sánh mỗi protein này với cơ sở dữ liệu
protein.
- tblastn (translated BLAST): Dịch mỗi trình tự DNA thành cơ sở dữ liệu gồm 6
protein có thể xảy ra, sau đó so sánh trình tự protein nhập vào với mỗi protein
trong cơ sở dữ liệu này.
- tblastx (translated BLAST): Sử dụng thuật toán phức tạp nhất, dịch mã DNA nhập
và từ một cơ sở dữ liệu thành những nhóm 6 protein có thể xảy ra sau đó thực hiện
tìm kiếm với những protein này.
2.6.2 Các bước thực hiện BLAST
Thực hiện một chương trình BLAST gồm 4 bước:
Bước 1: Chọn trình tự, trình tự ở dạng FASTA.
Bước 2: Chọn chương trình BLAST phù hợp trên NCBI.
Bước 3: Chọn cơ sở dữ liệu.
Bước 4: Chọn tham số. Có thể chọn sinh vật, mở hay đóng chức năng filtering,
thay đổi expect value, thay đổi kích cỡ chữ, thay đổi định dạng kết quả.
2.7 Nghiên cứu về vùng rDNA – ITS trên nấm Alternaria
J.H.C. Woudenberg và cộng tác viên(2013) đã được thực hiện phương pháp định
danh phân tử khuếch đại vùng 18S nrDNA(SSU), 28S nrDNA(LSU), ITS1 – 5,8S – ITS2,
vùng GAPDH, vùng RPB2 và TEF1 với mục đích xây dựng cây phát sinh loài Alternaria.
Dựa vào kết quả trình tự và kết quả hình thái học nghiên cứu trước đó cho thấy một nhánh

26
Pleospora / Stemphylium và Embellisia annulata có chung nguồn gốc tổ tiên với nấm
Alternaria.
Nghiên cứu của Motoaki và Kusaba (1995) về vùng rDNA – ITS của các loài nấm
Alternaria và bảy dòng nấm Alternaria sinh độc tố, đã sử dụng phương pháp RFLPs phân
tích rDNA và phân tích bằng phản ứng PCR với mồi ITS1 và ITS2, giải trình tự trực tiếp.
Phân tích phát sinh loài dựa theo phương pháp Neighbor-joining (Naruya Saitou
và Masatoshi Nei, 1987) cho thấy bảy loại nấm sinh độc tố cùng nhóm với A. Alternata.
Trong cùng chi, A. dianthi, A. panax, A. dauci, A. bataticola, A. porri, A. sesami và A.
solani, có hình thái khác với A. Alternaria.
Barry M. Pryor and Robert L. Gilbertson (2000) nghiên cứu về mối quan hệ giữa
Alternaria, Ulocladium,và các loài Stemphylium dựa trên vùng ITS, rDNA – SSU trình tự
của 18 loại Alternaria, bốn loại Ulocladium và bốn loài Stemphylium spp.. Vùng rDNA –
ITS, bao gồm ITS1, ITS2 và vùng 5,8S ribosome khuếch đại bằng cặp mồi ITS4 và ITS5
(White và ctv, 1990); vùng ti thể rDNA – SSU được khuếch đại bằng cặp mồi NMS1 and
NMS2 (Li và ctv, 1994); vùng 18S được phân tích thành 3 mảng riêng biệt với cặp mồi
NS1 và NS2, NS3 và NS6, NS5 và NS8 tương ứng (White và ctv, 1990). Phân tích phát
sinh loài dựa vào vùng ITS và SSU rDNA, thực hiện bởi phương pháp Neighbour joining.
Cho thấy rằng Stemphylium spp. là loài phát sinh từ Alternaria và Ulocladium spp. gần
giống với Alternaria spp. có chung nguồn gốc với giá trị bootstrap trung bình 65%.
Phân lập Alternaria được lấy từ mô hạt dẻ khác nhau thu thập trong năm vườn cây ở
California. Đối với tất cả các chủng, hình thái đặc điểm của khuẩn lạc và sự hình thành
bào tử được so sánh với những chủng đại diện của A. alternata, A.tenuissima, A.
arborescens, và A. infectoria. Kiểu gen đặc trưng của các loài Alternaria phân lập được
xác định bằng phương pháp RAPD và RFLP phân tích rDNA – ITS (Barry M. Pryor and
Themis J. Michailides, 2001).
B. Cherie Millar và ctv (2002) đã quan sát thấy có sự lây nhiễm một loại nấm sợi
trong mẫu kem mềm, sau khi tiến hành kiểm tra khuẩn lạc nấm kết quả đã có được kiểu
hình và kiểu gen. Chiết xuất DNA và khuếch đại PCR của vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 được
đoạn khuếch đại có chiều dài 525bp. Phân tích trình tự thì xác định là Alternaria

27
Alternata với độ tương đồng là 100%. A. alternata đã được báo cáo trước đây như là một
nguyên nhân gây ra nhiễm trùng cơ hội liên quan đến da và các bệnh nhân suy giảm miễn
dịch.
Chín loài Alternaria khác nhau được phân lập từ 27 chủng được thu thập từ một số
cây trồng Ai Cập và phân tích RAPD-PCR cho đa dạng di truyền, sử dụng bốn mồi
RAPD khác nhau OPA03 (5'-AGTCAGCCAC-3'), OPA09 (5'-GGGTAACGCC-3'),
OPA18 (5 '- AGGTGACCGT-3') và M13 (5'-GAGGGTGGCGGTTCT-3 ') (Messner và
ctv, 1994) cho thấy có sự khác biệt giữa các đoạn DNA. Tương tự di truyền giữa các
chủng A. alternata loài nhóm dao động từ 14,8 đến 100%, trong khi phạm vi là 14,81-
96,30% giữa các loài khác được sử dụng trong nghiên cứu này. Kết quả cho thấy biến đổi
di truyền đáng kể giữa các Alternaria, ngay cả trong nhóm cùng loài (Youssuf A.M.H.
Gherbawy, 2004).
Karim Dagno và ctv (2011) đã khuếch đại vùng rDNA – ITS (541bp) sử dụng mồi
ITS1 và ITS4, gen 18S DNA (527bp) với mồi NS1 và NS2, gen elongation factor 1-alpha
(1182bp) với mồi EF1-728F và TEF1LLErev, gen calmodulin (1182bp) với mồi CAL-
228F và CAL-737R và gen actin (240bp) với mồi ACT-783R và ACT-512F. Phát hiện
một loài mới trong chi Alternaria. Các trình tự gen của nghiên cứu này đã được gửi lên
GenBank. Dựa vào trình tự DNA của 5 gen đã phân tích, sự tương đồng trình tự ITS là
99% giữa Alternaria sp. phân lập với 93 chủng khác trên GenBank. Ngoài ra, gen 18S –
rDNA cho thấy độ tương đồng từ 98 -99% so với 72 chủng Alternaria khác. Đối với mô
tả hình thái học, Alternaria sp. phân lập không xuất hiện trong một mô tả nhận dạng với
hình thái được công nhận bởi E.G.S trong tài liệu. Từ kết quả hình thái học và phân tích
phân tử, Karim Dagno và ctv đã phát hiện được được loài mới gây bệnh trên cây lục bình
là A. jacinthicola.
Năm 2012, NiKoo Kakvan và ctv đã ly trích lá trên cây có múi bị nhiểm bệnh đốm
nâu bằng CTAB, phenol – chloroform và các đoạn DNA được khuếch đại bởi RAPD –
PCR với 2 mồi ngẫu nhiên là đoạn oligonucleotide 10–mer, với cặp mồi AL3 và P12; độ
dài của đoạn gen mã hóa được khuếch đại bởi cặp mồi AL3 và P12 trong cam và quýt có
chiều dài là 850bp và 1250bp. Đánh dấu và kiểm tra khả năng gây bệnh, kháng

28
Alternaria đốm nâu trên cam quýt và có gen kháng (khuếch đại bởi P12 và AL3) . Đây là
báo cáo đầu tiên của gen kháng trong cây họ cam quýt để Alternaria alternata ở Iran.
Mamta Sharma và ctv (2013), đã nghiên cứu về đặc điểm phân tử của loài A.
alternata gây bệnh bạc lá trên cây đậu pigeonpea ở Ấn Độ. Vùng rDNA – ITS được
khuếch đại sử dụng cặp mồi ITS1 và ITS4 (White và ctv,1990). Vùng trình tự này được
so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank sử dụng chương trình BLAST. Cho thấy sự tương
đồng mạnh mẽ từ 99% - 100% với trình tự công bố trên GenBank. Trong các báo cáo
trước đó, đã có báo cáo A. tenuissima gây bệnh bạc lá trên đậu pigeonpea, từ đóôtacho
thấy các dòng Alternaria được phân lập trên cùng vật chủ có thể có đặc điểm phân tử
giống nhau. Tóm lại, sự phân tích phân tử vùng ITS có thể cung cấp thêm hiểu biết về
phân loại Alternaria nhưng việc sử dụng phân tích phân tử sử dụng nhưng gene khác hoặc
phương pháp khác thì tốt hơn.
Liang-Dong Guo và ctv (2004), đã sử dụng kỹ thuật RAMS để khảo sát nấm A. alternata
mà trước đó được xem là nấm cộng sinh trên cây thông tabuliformis. Sự biến đổi di
truyền của A. alternata được đánh giá dựa trên phân tích RAPD, RFLPs, AFLP và trình tự
DNA đã được công bố bỡi Tanabe và cộng sự, 1990. Kết quả khuếch đại 112 chủng A.
alternata với mồi CCA và CGA cho sản phẩm 1273 bp. Kích thước dao động 200 – 2000
cặp base. A. alternata dường như có tiềm năng pháp triển tương đối nhanh và duy trì biến
dị di truyền đáng kể.

29
 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Tháng 12/2013 đến 5/2013.
Địa điểm: Phòng thí nghiệm bệnh cây thực thuộc Trung tâm Kiểm dịch thực vật
sau nhập khẩu II.
Địa chỉ: 28 Mạc Đĩnh Chi, Phường Đa Kao, Quận 1, Hồ Chí Minh.
3.1.2 Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là 9 dòng nấm Alternaria gây bệnh trên chanh dây được
phân lập từ tỉnh Đắk Nông, Lâm Đồng và mẫu chanh dây nhập khẩu từ Đài Loan. Nguồn
nấm và kết quả định danh hình thái từ phòng Điều tra giám sát, Trung tâm kiểm dịch thực
vật sau nhập khẩu II.
Bảng 3.1 Các dòng nấm Alternaria được sử dụng trong nghiên cứu này
STT Kí hiệu Địa điểm phân lập Định danh hình thái học
1 CDNK_1.13 Nhập khẩu Alternaria alternata
2 CDNK_7.13 Nhập khẩu Alternaria alternata
3 LĐ17L_1.10 Lâm Đồng Alternaria pasiflorae
4 LĐ1L_2.11 sp(2) Lâm Đồng Alternaria pasiflorae
5 LĐ4T_3.10 Lâm Đồng Alternaria pasiflorae
6 ĐN9L_1.10 Đắk Nông Alternaria pasiflorae
7 ĐN8L_2.11 Đắk Nông Alternaria pasiflorae
8 LĐ12T_5.10 Lâm Đồng Alternaria hawaiiensis
9 ĐN8T_4.11 Đắk Nông Alternaria hawaiiensis

3.2 Hóa chất và trang thiết bị

3.2.1 Hóa chất
3.2.1.1 Môi trường phục hồi dòng nấm: môi trường PCA
Thành phần cho 1 lít môi trường

30
 Cà rốt: 20g
Khoai tây: 20g
Agar: 15g
Nước cất cho đủ 1 lít
3.2.1.2 Môi trường nhân sinh khối dòng nấm: môi trường PC
Thành phần cho 1 lít môi trường
Cà rốt: 20g
Khoai tây: 20g
Nước cất cho đủ 1 lít
3.2.1.3 Hóa chất ly trích DNA sợi nấm
Nito lỏng (nghiền mẫu nấm), lysis buffer, phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol
(25:24:1), chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), isopropanol,ethanol 70%, dung dịch TE
1X.
3.2.1.4 Hóa chất sử dụng trong điện di
Dung dịch TAE 0.5X, agarose, ethidium bromide 1%.
3.2.1.5 Hóa chất cho phản ứng PCR
Master mix, primer ITS4 và ITS5, nước đã khử ion.
3.2.2 Dụng cụ và thiết bị
Nồi hấp khử trùng, cân điện tử (Precisa, Thụy Sĩ), tủ sấy, tủ cấy nấm, bình thủy
tinh, bộ cối chày nghiền mẫu, micropipette: 10µl, 100 µl, 1000 µl, máy ly tâm, tủ giữ
mẫu: tủ lạnh (-700C, - 200C), tủ mát (-40C), bộ chạy điện di (Scie Plas – Anh), máy cất
nước 2 lần, máy PCR (Eppendorp, Mỹ), máy chụp hình gel, máy làm khô DNA
(Eppendorp, Mỹ).
3.3 Phục hồi các dòng nấm Alternaria từ ống nghiệm chứa các bào tử nấm
Alternaria bằng môi trường PCA
Nấm được thu thập.
Chuẩn bị cho lít môi trường PCA: rửa sạch, gọt vỏ, cắt nhỏ khoai tây 20g, cà rốt 20g
cho vào 800ml nước cất, đun sôi trong 1 giờ, lọc bỏ bã qua rây mịn. Cho vào 20g agar,

31
đun tan agar và thêm vào một lượng nước cất vừa đủ 1000ml. Hấp khử trùng 1210C trong
20 phút.
Để môi trường nguội bớt rồi đổ môi trường từ những bình tam giác vào đĩa petri
sạch.
Đĩa petri có chứa môi trường để nguội, đông cứng lại thì ta có thể cấy những bào tử
nấm Alternaria vào. Sau 10 ngày các khuẩn ty của nấm sẽ mọc bên trên bề mặt đĩa.
3.4 Nhân sinh khối nấm và thu lấy các mẫu nấm
Môi trường PC: rửa sạch, gọt vỏ, cắt nhỏ khoai tây 20g, cà rốt 20g cho vào 1000ml
nước cất, đun sôi trong 1 giờ, lọc bỏ bã qua rây mịn. Thêm vào một lượng nước cất vừa
đủ 1000ml. Hấp khử trùng 1210C trong 20 phút.
Cấy các mẫu nấm đã được phục hồi từ đĩa vào từng chai môi trường PC đã chuẩn
bị. Thời gian thu hoạch sinh khối nấm Alternaria từ 18 đến 21 ngày.
Cách thu sinh khối sợi nấm: giấy lọc và cốc đựng phải được khử trùng sấy khô
dùng để lọc thu lấy phần sợi nấm. Ép khô rồi đặt trên giấy bạc. Giữ vào tủ lạnh – 200C.
3.5 Ly trích DNA từ nấm
Phương pháp ly trích DNA được thực hiện theo quy trình của Lee và Taylor có cải
tiến (Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005):
Nghiền sinh khối nấm trong Nito lỏng đến khi thành bột mịn. Chuyển bột nấm vào
eppendorf 1.5ml, sao cho bột nấm chiếm khoảng 1/3 thể tích tube.
Thêm 600µl lysis buffer, vortex thật mạnh để tạo dịch đồng nhất.
Ủ 650C trong 1 giờ, cứ 15 phút đảo nhẹ tube.
Thêm 600µl dung dịch Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), vortex để trộn
đều dung dịch.
Ly tâm 9000 vòng/ phút trong 15 phút ở 250C.
Chuyển dịch nổi vào eppendorf mới.
Thêm 400µl Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), lắc nhẹ.
Ly tâm 9000 vòng/ phút trong 20 phút ở 250C.
Hút dịch nổi vào eppendorf mới.
Thêm 0.03V Sodium acetate 3M và 0.6V Isopropanol. Trộn nhẹ bằng micropipette.

32
 Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút ở 40C.
Loại bỏ dịch nổi, rửa tủa 3 lần bằng ethanol 70% lạnh.
Làm khô DNA kết tủa, hòa tan DNA với 50µl TE 1X. Lưu mẫu trong tủ - 200C.
3.6 Kiểm tra kết quả ly trích
Sản phẩm của quá trình ly trích DNA được điện di trong gel agarose 0.8%. Quá
trình điện di thực hiện ở 80V, 250mA, trong 20 phút.
3.7 Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS – rDNA các dòng nấm
Alternaria
3.7.1 Vật liệu và thành phần hóa chất cho phản ứng PCR
Primer: Trình tự primer theo chiều 5’ – 3’
ITS4: TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
ITS5: GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G
(White và ctv, 1990)
DNA khuôn được thu nhận qua quá trình ly trích DNA mẫu nấm Alternaria.
Bảng 3.2 Các thành phần để thực hiện phản ứng PCR
Thành phần Nồng độ cuối Thể tích sử dụng
Master mix 25 µl
Mồi xuôi 10 pM 2 µl
Mồi ngược 10 pM 2 µl
DNA khuôn 3 µl
Nuclease – Free Water 18 µl
Tổng thể tích 50 µl
3.7.2 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR
Quy trình nhiệt cho phản ứng PCR gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: 950C trong 3 phút
Giai đoạn 2:
Bước 1: 950C trong 1 phút
Bước 2: 520C trong 30 giây 35 chu kỳ
Bước 3: 720C trong 1 phút

33
 Giai đoạn 3: 720C trong 10 phút
3.7.3 Đánh giá kết quả PCR
Sản phẩm PCR được điện di trên agarose gel 1.5%, dung dịch đệm TAE 0.5X.
Chạy điện di: 100V, 250mA, 45 phút.
Nhuộm gel bằng dung dịch ethidium bromide trong vòng 15 phút.
Kết quả được ghi lại nhờ đọc tia UV.
3.8 Xử lý trình tự ban đầu
Các sản phẩm khuếch đại được giải trình tự với cả 2 chiều xuôi và ngược tại công ty
Macrogen Hàn Quốc.
Chuỗi trình tự ban đầu cần được xử lý bằng phần mềm BioEdit v7.2.0.
3.9 So sánh vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 với GenBank
Trình tự vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của dòng nấm Alternaria nghiên cứu được so
sánh với các dòng Alternaria trên GenBank sử dụng chương trình BLAST.
3.10 Tạo cây phát sinh loài
Các dòng nấm Alternaria được phân tích mối quan hệ di truyền dựa trên cây phát
sinh loài. Những cây phát sinh loài này được tạo bằng chương trình MegAlign theo
phương pháp Neigbor Joning.

34
 Bảng 3.3 Danh sách các loài trên GenBank được sử dụng để so sánh
Địa điểm Thời gian
Tên loài Mã số truy cập Tác giả
phân lập công bố

KM015489.1 China 17/6/2014 Zhuang,Q.

KJ739880.1 Turkey 23/4/2014 Savas,N.G. and
A.alternata Yildiz,F.
KJ188714.1 USA 23/1/2014 Luo,J. and Zhang,N.
KM519671.1 Portugal 11/9/2014 Martins,F.và ctv
A.brassicae KJ592052.1 India 18/3/2014 Verma,A. and
Prakash,A.
AY154689.1 Iran 24/9/2002 Ghosta,Y.
KC584204.1 Netherlands 4/2/2013 Woudenberg,J.H.C.và
A.macrospora ctv
KM186140.1 Indian 10/7/2014 Kaur,M., Kumar,V.
and Aggarwal,N.
AF229469.1 USA 31/1/2000 Pryor,B.M. and
Gilbertson,R.L.
A.tomato JX418359.1 China 24/7/2012 Li,Y.
AF314588.1 China 19/10/2000 Wang,H.K. and
A.sesami Zhang,T.Y.
HM204453.1 India 7/6/2010 UdayaShankar,A.C.và
ctv
KJ634071.1 China 21/3/2014 Li,P. and Zhang,L.
Russian
A.solani KF998549.1 22/12/2013 Kokaeva,L.Y.
Federation

EU617617.1 Brazil 30/3/2008 Lourenco,V. Jr.và ctv

A.zinniae AY445813.1 China 224/10/2003 Ying,C.
A.passiflorae AM237288.1 Austria 27/3/2006 Sterflinger,K.

35
 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả nhân sinh khối

Sau khi nấm đã mọc trong đĩa petri chứa môi trường PCA phục hồi nấm. Chuyển
từng mảng thạch vào chai môi trường PC để nhân sinh khối. Sau 18 – 21 ngày, sợi nấm
mọc kín mặt môi trường thì thu sinh khối.
4.2 Kết quả ly trích DNA
Kết quả ly trích DNA tổng số của các dòng nấm Alternaria thể hiện qua hình sau:

Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số các dòng nấm Alternaria trên gel Agarose
0.8%, TAE 0.5X ở 80V, 250mA trong 20 phút
Kết quả ly trích cho thấy DNA tổng số không tinh sạch hoàn toàn. Ngoài DNA tổng
số còn có thêm những đoạn DNA bị đứt gãy và phần tạp.
Nguyên nhân tạo ra những đoạn DNA đứt gãy và tạp do:
- Quá trình nghiền chưa tốt.
- Các hóa chất như phenol, chloroform có thể làm hỏng DNA do thời gian tiếp xúc
dài hoặc do vortex mạnh.
- Ly tâm với tốc độ thấp và thời gian ngắn thì sự phân lớp chưa tốt giữa phần dịch
chứa DNA, lớp xác tế bào, lớp hóa chất.
- Ly tâm với thời gian quá dài và tốc độ quá cao thì phenol phá hủy nhiền DNA hơn
gây ra nhiều đoạn đứt gãy.
- Trong quá trình ly trích không sử dụng Rnase và Proteinase nên kết quả ly trích
còn có RNA và Protein.

36
 Để kết quả ly trích được tốt hơn có thể dùng thêm Rnase và Proteinase vào quá trình
ly trích. Tinh sạch DNA sau quá trình ly trích để có được DNA tổng số tốt hơn. Tuy nhiên
do vùng ITS – rDNA là một vùng lập lại nhiều lần trên genome và dễ dàng khuếch đại
nên có thể sử dụng DNA tổng số trên để sử dụng cho PCR.
4.3 Kết quả khuếch đại trình tự vùng ITS – 5,8S – ITS2

Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR các dòng nấm Alternaria trên gel Agarose
1.5%, thực hiện ở 100V, 250mA trong 45 phút
Với 1: CDNK_1.13, 2: CDNK_7.13, 3: LĐ17L_1.10, 4: LĐ1L_2.11 sp(2), 5:
LĐ4T_3.10, 6: ĐN9L_1.10, 7: ĐN8L_2.11, 8: LĐ12T_5.10, 9: ĐN8T_4.11, M:
LADDER
Dựa vào thang ladder, cho thấy các dòng nấm Alternaria chạy với primer ITS4 và
ITS5 có kích thước khoảng 600bp.
4.4 Kết quả định danh các dòng Alternaria
Sử dụng chương trình BLAST để so sánh độ tương đồng giữa trình tự vùng ITS1 –
5,8S – ITS2 của các dòng nấm Alternaria nghiên cứu với các dòng nấm Alternaria đã
công bố trên GenBank. Sau đó sử dụng chương trình MegAlign để tạo ma trận tương
đồng.
So sánh trình tự vùng ITS –rDNA các dòng nấm nghiên cứu với các dòng Alternaria
trên GenBank. Sau đó dùng MegAlign để tạo ma trận tương đồng:

37
 Bảng 4.1 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA(%) dòng CDNK_1.13 với cái loài
trên GenBank
1 2 3 4 5 6
1.CDNK_1.13 100 99.4 98.8 99 98.8 98.4
2.KM015489.1 A.alternata 99.4 100 98.5 98.8 99.8 99.6
3.KJ739880.1 A.alternata 98.8 98.5 100 98.9 99.8 97.6
4.KJ188714.1 A.alternata 99 98.8 98.9 100 98.9 98.1
5.KM519671.1 A.alternata 98.8 99.8 99.8 98.9 100 98.9
6.KJ592052.1 A.brassicae 98.4 99.6 97.6 98.1 98.9 100

Dòng nấm CDNK_1.13 được định danh hình thái là A. alternata. CDNK_1.13 có độ
tương đồng rất cao với 2 loài A. alternata và 1 loài A. brassicae đã được công bố trên
GenBank dựa vào trình tự vùng ITS – rDNA. Dòng A. brassicae gây bệnh đốm lá trên súp
lơ, cải bắp, bông cải xanh (M. Sharma và ctv, 2011) nhưng không gây bệnh trên chanh
dây. Với kết quả định danh hình thái và có độ tương đồng với A. alternata đến 99%, ta có
thể khẳng định dòng CDNK_1.13 phân lập trên chanh dây là loài A. alternata.
Bảng 4.2 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA(%) dòng ĐN8L_2.11 với các loài
trên GenBank
1 2 3 4 5 6 7 8
1.ĐN8L_2.11 100 99.6 99.2 98.8 99.8 98.8 99.2 99.2
2.AY154689.1A.macrospora 99.6 100 99.6 96.9 98.8 99.1 99.3 98.8
3.KC584204.1A.macrospora 99.2 99.6 100 98.3 99.4 99 99.6 99.6
4.JX418359.1 A.tomato 98.8 96.9 98.3 100 97.1 97.8 97.9 96.9
5.AF314588.1 A.sesami 99.8 98.8 99.4 97.1 100 98.7 99.1 98.4
6.KF998550.1 A.solani 98.8 99.1 99 97.8 98.7 100 98.9 99.1
7.HM204453.1 A.sesami 98.2 98.5 98.1 96.7 98.7 97.7 100 97.8
8.KJ634071.1 A.solani 98.8 99.3 99.4 99.1 98.1 99.3 97.8 100

38
 Dòng nấm ĐN8L_2.11 được định danh hình thái là A. passiflorae. ĐN8L_2.11 có
động tương đồng cao với 4 loài trên GenBank là A. macrospora (99%)
(J.H.C.Woudenberg và ctv, 2013) , A. sesami (99%) (Y.P.Choi, 2011), A. tomatophila
(99%)(S.K. Hong và ctv, 2011) và A. solani (98.6%) (V. Jr. Lourenco và ctv, 2008). Dòng
A. sesami gây bệnh chủ yếu trên mè, đốm bệnh nâu đen và tròn (N'Gabala và
Zambettakis, 1970), A. tomatophila gây bệnh chủ yếu trên cà chua (T.T.M.S. Rodrigues
và ctv, 2010), A. solani gây bạc lá trên cà chua, khoai tây (Agrios, 1988) và chưa có báo
cáo nào liên quan đến bệnh trên cây chanh dây dó do A. sesami, A. tomatophila, A. solani
gây ra. Hơn nữa A. macrospora gây bệnh trên chanh dây, từ những điều trên cho thấy
ĐN8L_2.11 là loài A. macrospora, kết quả đinh danh bằng hình thái là không chính xác
vì môi trường sống của các giống loài ở những điều kiện khác nhau thì hình thái cũng có
sự thay đổi dần để thích nghi, tồn tại và phát triển.
Bảng 4.3 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA(%) dòng LĐ4T_3.10 với các loài trên
GenBank
1 2 3 4 5 6 7 8
1.LĐ4T_3.10 100 99.2 99.6 99.8 99.2 99 99 99.2
2.AM237288.1A.passiflorae 99.2 100 99.5 98.9 97.1 100 100 99.4
3.AY154689.1A.macrospora 99.6 99.5 100 98.8 97.9 99.3 99.3 98.9
4.AF314588.1A.sesami 99.8 98.9 98.8 100 99.1 98.3 98.9 98.9
5.AY445813.1A.zinniae 99.2 97.1 97.9 99.1 100 99.1 98.7 99.2
6.KJ634071.1A.solani 99 100 99.3 98.3 99.1 100 100 98.9
7.KF998549.1A.solani 99 100 99.3 98.9 98.7 100 100 99.4
8.KM186140.1A.macrospora 99.2 99.4 98.9 98.9 99.2 98.9 99.4 100

Dòng nấm LĐ4T_3.10 được định danh hình thái là A. passiflorae. LĐ4T_3.10 có
động tương đồng cao với 4 loài trên GenBank là A. macrospora (99%)
(J.H.C.Woudenberg và ctv, 2013), A. sesami (99.8%) (Y.P. Choi, 2011), A. passiflorae
(99%) (R. Labuda và ctv, 2006), A. zinniae (99%) (C. Ying, 2003). Dòng A. zinniae gây
bạc lá, đặc điểm vết bệnh nhỏ nâu đỏ hoặc tím, trung tâm đôi khi có màu xám, gây bệnh

39
chủ yếu trên hoa. Và A. passiflorae và A. macrospora đều gây bệnh trên chanh dây. Chưa
xác định được dòng nấm LĐ4T_3.10.
Bảng 4.4 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA (%) dòng LĐ17L_1.10 với các loài
trên GenBank
1 2 3 4 5 6 7
1.LĐ17L_1.10 100 99.2 99.2 98.6 99 98.8 99.4
2.KC584204.1A.macrospora 99.2 100 99.6 99.2 99.2 99.2 99.4
3.AF229469.1A.macrospora 99.2 99.6 100 99.1 99.1 99.2 99.1
4.KF998550.1A.solani 98.6 99.2 99.1 100 100 100 98.9
5.EU617617.1A.solani 99 99.2 99.1 100 100 100 99.3
6.AM237288.1A.passiflorae 98.8 99.2 99.2 100 100 100 98.8
7.AF314588.1A.sesami 99.4 99.4 99.1 98.9 99.3 98.8 100

Dòng nấm LĐ17L_1.10 được định danh hình thái là A. passiflorae. LĐ17L_1.10 có
động tương đồng cao với 4 loài trên GenBank là A. macrospora, A. solani, A. passiflorae,
A. zinniae. Dựa và kết quả hình thái và phân tử ta có thể khẳng định LĐ17L_1.10 là một
trong 2 loài A. macrospora hoặc A. passiflorae.
Bảng 4.5 Độ tương đồng trình tự ITS – rDNA (%) dòng ĐN1T_4.11 với các loài
trên GenBank
1 2 3 4 5 6 7
1.LĐ17L_1.10 100 99 99 98.8 98.8 99 99.6
2.KC584204.1A.macrospora 99 100 99.6 99.2 99.2 99.2 99.4
3.AF229469.1A.macrospora 99 99.6 100 99.1 99.1 99.2 99.1
4.KF998550.1A.solani 98.8 99.2 99.1 100 100 100 98.9
5.EU617617.1A.solani 98.8 99.2 99.1 100 100 100 99.3
6.AM237288.1A.passiflorae 99 99.2 99.2 100 100 100 98.8
7.AF314588.1A.sesami 99.6 99.4 99.1 98.9 99.3 98.8 100

40
 Dòng ĐN1T_4.11 được định danh hình thái là A. hawaiiensis. LĐ17L_1.10 có độ
tương đồng cao với 4 loài trên GenBank là A. macrospora, A. solani, A. passiflorae, A.
tomato. Chưa có dữ liệu về vùng ITS – rDNA của loài A. hawaiiensis trên GenBank. Nên
chưa đủ cơ sở để xác định dòng ĐN1T_4.11.
Bảng 4.6 Kết quả định danh 5 dòng Alternaria trong 11 mẫu nghiên cứu dựa vào
trình tự vùng ITS – rDNA
Kí hiệu Định danh hình thái Định danh phân tử
CDNK_1.13 A. alternata A. alternata
ĐN8L_2.11 A. passiflorae A. macrospora
A. passiflorae /
LĐ4T_3.10 A. passiflorae
A.macrospora
ĐN1T_4.11 A. hawaiiensis Chưa xác định
A. passiflorae /
LĐ17L_1.10 A. passiflorae
A.macrospora

4.5 Xác định vùng biến động nhất trong toàn vùng rDNA – ITS
Kết quả giải trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 của CDNK_1.13 là dòng Alternaria
Alternata, kết quả đọc trình tự vùng rDNA – ITS của CDNK_1.13 được 516 nucleotid,
trong đó:
# ITS1
CACAAATATGAAGGCGGGCTGGAATCTCTCGGGGTTACAGCCTTGCTGAATT
ATTCACCCTTGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCTTGGTGGGTTCGCCCACCAC
TAGGACAAACATAAACCTTTTGTAATTGCAATCAGCGTCAGTAACAAATTAAT
AATTA
# 5,8S
CAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGA
AATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAA
CGCACATTGCGCCCTTTGGTATTCCAAAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTT

41
# ITS2
GTACCCTCAAGCTTTGCTTGGTGTTGGGCGTCTTGTCTCTAGCTTTGCTGGAGA
CTCGCCTTAAAGTAATTGGCAGCCGGCCTACTGGTTTCGGAGCGCAGCACAA
GTCGCACTCTCTATCAGCAAAGGTCTAGCATCCATTAAGCCTTTTTTTCAACTA
So sánh sự tương đồng trình tự nucleotid trong vùng rDNA – ITS của dòng CDNK_1.13
với dòng KM015489.1 A. alternata (Trung Quốc).
- So sánh vùng ITS1 cho thấy trình tự nucleotid của dòng CDNK_1.13 và dòng
KM015489.1 A. alternata (Trung Quốc) có độ tương đồng 99%, có 1 nucleotid sai
khác trong tổng số 166 nucleotid. Sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh.

- So sánh vùng 5,8S cho thấy trình tự nucleotid của dòng CDNK_1.13 và dòng
KM015489.1 A. alternata (Trung Quốc) có độ tương đồng 100%, không có bất kỳ
sự sai khác nào trong trình tự DNA vùng 5,8S. Sử dụng phần mềm BioEdit để so
sánh.

- So sánh vùng ITS2 cho thấy trình tự nucleotid của dòng CDNK_1.13 và dòng
KM015489.1 A. alternata (Trung Quốc) có độ tương đồng 99%, có 1 nucleotid sai
khác trong tổng số 159 nucleotid. Sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh.

42
 Kết quả so sánh giữa các vùng cho thấy mức độ tương đồng cả 3 vùng ITS1; 5,8S;
ITS2 đều có sự tương đồng cao ( 99 -100%). Qua đó cho thấy ít có sự biến đổi giữa các
vùng rDNA –ITS.

43
 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận

Phục hồi các dòng nấm Alternaria và từ đó tiến hành nhân sinh khối ly trích các
dòng nấm qua các bước khác nhau và sử dụng các loại hóa chất cũng như tác nhân cơ
học để nghiền mịn sợi nấm thu DNA tổng số.
Tiến hành khuếch đại vùng gene rDNA – ITS với cặp primer ITS4 và ITS5 thu
được sản phẩm khuếch đại có kích thước 600 bp (dựa vào thang ladder), trên 9 dòng
Alternaria đã được định danh hình thái học.
Tiến hành đọc trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 của dòng Alternaria nghiên cứu.
So sánh trình tự DNA vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 giữa dòng Alternaria nghiên cứu
với cơ sở dữ liệu NCBI và dựa vào phần mềm BioEdit.
Qua đó cho thấy, định danh bằng hình thái học chưa chính xác, trình tự DNA
vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 (vùng bảo tồn của sinh vật) đối chiếu trên cơ sở dữ liệu NCBI
cũng chưa thật sự đáng tin cậy vì ít dữ liệu về dòng nấm đang nghiên cứu. Vùng rDNA
– ITS có thể được dùng trong nghiên cứu định danh nấm Alternaria ở cấp độ loài. Tuy
nhiên, một số trường hợp không có sự phân biệt rõ ràng giữa các loài Alternaria dựa
trên trình tự vùng rDNA – ITS, do đó cần kết hợp với những phương pháp khác, hay
phân tích trên những vùng gen khác mới có thể xác định chính xác tên loài của các
dòng nấm Alternaria.
So sánh kết quả đọc trình tự các vùng ITS1 – 5,8S – ITS2.
Kích thước của vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 là 481 bp.
Trình tự nucleotid vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 của dòng CDNK_1.13 A. alternata so
với dòng A. alternata có mức độ tương đồng là 99%.
5.2 Đề nghị
Trong những trường hợp định danh hình thái có kết quả không rõ ràng thì cần
phải kết hợp các phương pháp khác sử dụng những kỹ thuật sinh học phân tử để định
danh chính xác tên loài.

44
 Alternaria là nấm đa ký chủ, khả năng lây nhiễm trong môi trường cao. Cần phân
tích mối quan hệ di truyền và khảo sát khả năng lây nhiễm chéo của chúng.
Vùng rDNA – ITS cần được sử dụng kết hợp với những vùng gen khác trong
nghiên cứu định danh Alternaria.

45
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng việt

1. Nguyễn Văn Bá, 2005. Giáo trình môn nấm học.Trường Đại học Cần Thơ.
2. Nguyễn Thị Lang – Bùi chí bữu,2005.Sinh học phân tử - giới thiệu phương pháp
và ứng dụng. Nhà xuất bản nông nghiệp TPHCM.
3. Nguyễn Văn Cách, 2005. Chương trình phân tích cấu trúc tương đồng BLAST. Tin
sinh học. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật, Hà Nội, trang 90 – 91.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương – chuyên ngành Sinh học phân tử - Khoa Sinh – Đại học
khoa học tự nhiên thuộc Đại học Quốc gia TPHCM. Sinh học phân tử. Nhà xuất
bản giáo dục.
5. Phan Thị Thu Hiền, 2012. Nghiên cứu nấm Alternaria spp. gây bệnh đốm nâu trên
cây chanh dây (Passiflora edulis). Luận văn Thạc sĩ Khoa học Nông nghiệp.
Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
6. TS Nguyễn Thị Lang – GSTS Bùi Chí Bữu, 2004. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản
Nông nghiệp TPHCM.
7. Vũ Triệu Mân, 2007. Giáo trình bệnh cây chuyên khoa. Nhà xuất bản Nông nghiệp
Hà Nội, 252 trang.
8. Quyền Đình Thi, Nông Văn Hải (2008). Công nghệ sinh học (tập II): Những kỹ
thuật PCR và ứng dụng trong phân tích DNA. Nhà xuất bản: Khoa học Tự nhiên và
Công nghệ.
9. Nguyễn Thị Hoàng Yến, 2009. Chanh dây và ứng dụng. Nhà xuất bản Hà Nội, 94
trang, trang 23 – 25.

Tài liệu nước ngoài

1. J.H.C. Woudenberg, J.Z. Groenewald, M. Binder, and P.W. Crous, 2013.
Alternaria redefined. CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Mycology 75: 171-
212.

46
2. Guo, L.D., Xu, L., Zheng, W.H. and Hyde, K.D. (2004). Genetic variation of
Alternaria
3. alternata, an endophytic fungus isolated from Pinus tabulaeformis as determined
by random amplified microsatellites (RAMS). Fungal Diversity 16: 53-65.

4. Mamta Sharma, Raju Ghosh, Suresh Pande, 2013.Occurrence of Alternaria

alternata causing Alternaria blight in pigeonpea in India.ICRISAT, Patancheru,
India. Advances in Bioscience and Biotechnology, 2013, 4, 702-705.
5. Motoaki Kusaba _9 Takashi Tsuge, 1995. Phylogeny of Alternaria fungi known to
produce host-specific toxins on the basis of variation in internal transcribed spacers
of ribosomal DNA. Curr Genet (1995) 28:491-498.
6. Karim Dagno1*, Julien Crovadore2, François Lefort2, Rachid Lahlali3,
LudivineLassois1 and M. Haïssam Jijakli1.2011. Alternaria jacinthicola, a new
fungal species causing blight leaf disease on water hyacinth [Eichhornia crassipes
(Martius) Solms-Laubach]. Journal of Yeast and Fungal Research Vol. 2(7), pp. 99
– 105.
7. Barry M. PRYOR and Robert L. GILBERTSON. 2000. Molecular phylogenetic
relationships amongst Alternaria species and related fungi based upon analysis of
nuclear ITS and mt SSU rDNA sequences. Mycol. Res. 104 (11) : 1312±1321.
8. B. Cherie Millar, J. Xu, M. James Walker, Noeleen A.M. Boyd, Ronan McMullan
& John E. Moore. 2002. Isolation of Alternaria alternata from an emollient cream:
implications for public health. Mycopathologia 156: 273–277, 2003.
9. NIKOO KAKVAN, HAMIDREZA ZAMANIZADEH, BAHAR MORID,
SHAHAB HAJMANSOR, HOSSEIN TAERI. 2011. Evaluation of Citrus
Cultivars Resistance to Alternaria alternata, the Causal Agent of Brown Spot
Disease, Using RAPD-PCR. Journal of Research in Agricultural Science Vol. 8,
No. 1 (2012), Pages: 69 – 76.

47
Tài liệu từ Internet
1. Alternaria
<http://en.wikipedia.org/wiki/Alternaria>
<http://en.wikipedia.org/wiki/Passiflora_edulis>
<https://sites.google.com/site/raurungvietnam/rau-day-leo/chanh-day>
2. Đoàn Thắng – Hồ Chiến, 2013. Miền núi Quảng Trị phát triển kinh tế từ cây chanh
leo. Trang thông tin điện tử VTV Huế, đăng ngày 07 tháng 10 năm 2013. Truy cập
ngày 10 tháng 02 năm 2014.
<http://vtvhue.vn/tin-khu-vuc/201310/mien-nui-quang-tri-phat-trien-kinh-te-tu-
cay-chanh-leo-385906/>
3. Thanh Nga, 2013. Mô hình liên kết trồng cây chanh dây ở Đắk Ha đạt năng suất
cao. Trang thông tin điện tử Đắk Nông, đăng ngày 11 tháng 10 năm 2013. Truy
cập ngày 10 tháng 02 năm 2014.
<http://www.baodaknong.org.vn/chuyen-lam-an/mo-hinh-lien-ket-trong-cay-
chanh-day-o-dak-ha-dat-nang-suat-cao-27197.html>
4. Nguyễn Công Lý, 2011. Gía chanh dây rớt mạnh, nông dân điêu đứng. Trang
thông tin điện tử Nhân Dân, đăng ngày 30 tháng 11 năm 2011. Truy cập ngày 10
tháng 02 năm 2014.
<http://www.nhandan.com.vn/kinhte/chuyen-lam-an/item/13539702-.html>
5. Lê Cảnh Tuấn, 2009. Quy trình sản xuất nước chanh dây lên men. Luận văn Thạc
sĩ Công nghệ thực phẩm. Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm, Tp. Hồ Chí
Minh, Việt Nam.

48
 PHỤC LỤC

Kết quả giải trình tự vùng ITS1 – 5,8S – ITS2 với primer ITS4 – ITS5 một số dòng nấm
Alternaria
Kết quả giải trình tự dòng CDNK_1.13

Kết quả giải trình tự dòng LĐ4T_3.10

Kết quả giải trình tự dòng ĐN8L_2.11

Kết quả giải trình tự dòng ĐN1T_4.11

Kết quả giải trình tự dòng LĐ17L_1.10