บทความวิ ชาการเพื่อการศึกษาต่อเนื่ องทางเภสัชศาสตร์

การทดสอบความถูกต้องของวิธีวิเคราะห์
Analytical Method Validation
ดร.ภญ.สุภาณี ดวงธีรปรีชา

1. วัตถุประสงค์
1. เพือ่ ให้ผอู้ ่านเข้าใจแนวทางการทดสอบความถูกต้องของวิธวี เิ คราะห์
2. เพือ่ ให้ผอู้ ่านสามารถเลือก parameter ทีเ่ หมาะสมในการทา method validation ของวิธี
วิเคราะห์แต่ละประเภท

2. บทนา
Method validation คือ การทดสอบประเมิน วิธีวิเ คราะห์ว่ า มีค วามเหมาะสม สามารถใช้
วิเคราะห์ตวั อย่างได้ถูกต้อง แม่นยา เชื่อถือได้ ตามวัตถุประสงค์ทก่ี าหนด วิธวี เิ คราะห์ทอ่ี ยู่ในตารายา
ม า ต ร ฐ า น ห รื อ ที่ เ รี ย ก ว่ า เ ภ สั ช ต า รั บ เ ช่ น USP (United State Pharmacopeia), BP (British
Pharmacopeia) ซึง่ เรียกว่า compendial methods เป็ นวิธวี เิ คราะห์ทไ่ี ด้รบั การทดสอบมาแล้วว่ามีความ
ถูกต้อง แม่นยา เชื่อถือได้ในขอบข่ายการใช้ทก่ี าหนด จึงไม่ตอ้ งทาการศึกษา method validation อีก แต่
วิธวี เิ คราะห์อ่นื ๆ นอกเหนือตารายามาตรฐาน ซึง่ เรียกว่า non-compendial methods รวมทัง้ วิธวี เิ คราะห์
ทีพ่ ฒั นาขึน้ มาใหม่ หรือการนา compendial methods มาใช้นอกขอบข่ายทีร่ ะบุไว้ จะต้องทาการศึกษา
method validation
ในการยื่นขึ้นทะเบียนต ารับ ยา บริษัทจะต้องแสดงข้อมูลทัง้ ทางด้าน safety, efficacy และ
quality ของผลิตภัณฑ์ยา ซึ่งข้อมูลการศึกษา method validation ของวิธีวเิ คราะห์ท่ใี ช้ในการควบคุม
คุณภาพยา จะเป็ นข้อมูลทีส่ าคัญอย่างหนึ่งทีใ่ ช้ประกอบในการขึน้ ทะเบียนตารับยาในส่วนของ quality
ประเทศไทยมีก ารก าหนดให้ก ารขึ้น ทะเบีย นต ารับ ยาเป็ น ไปตามข้อ ตกลง ASEAN หรือ ASEAN
Harmonization ภายในวัน ที่ 31 ธัน วาคม พ.ศ. 2550 เป็ นต้ น มา โดยวิธีป ฏิบ ัติส าหรับ method
validation ตามแบบ ASEAN เป็ นข้อปฏิบตั ทิ ร่ี บั มาจาก The International Council for Harmonization
of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) guideline Q2(R1) ซึ่งจะให้
แนวทางและข้อแนะนาเกี่ยวกับลักษณะเฉพาะ (characteristics) หรือพารามิเตอร์ (parameters) ของ
การทดสอบความถูกต้องสาหรับวิธวี เิ คราะห์แต่ละประเภทสาหรับยาทีเ่ ป็ นสารเคมี ไม่รวมผลิตภัณฑ์ชวี
วัตถุ และผลิตภัณฑ์ทไ่ี ด้จากเทคโนโลยีชวี ภาพ

คาสาคัญ : การทดสอบความถูกต้องของวิธวี เิ คราะห์, method validation

ชื่อเรื่อง : การทดสอบความถูกต้องของวิธวี เิ คราะห์ รหัส : 3002-1-000-002-08-2561 จำนวนหน่ วยกิ ต : 2.0 หน่วยกิต

ผูเ้ ขียน : ดร.ภญ.สุภาณี ดวงธีรปรีชา อีเมล : supanee.d@dmsc.mail.go.th สถำนที่ทำงำน : กรมวิทยาศาสตร์การแพทย์ กระทรวงสาธารณสุข
จำนวนหน้ ำ 5 หน้า วันที่รบั รอง : 27 สิงหาคม 2561 วันที่หมดอำยุ : 26 สิงหาคม 2562
สุข
Continuing Pharmaceutical Education Articles
3. วิ ธีวิเคราะห์ที่ต้องทดสอบความถูกต้อง
แบ่งเป็ น 3 ประเภทคือ
1. การพิสจู น์เอกลักษณ์ (Identification tests)
2. การควบคุมสารปนเปื้ อน (Control of impurities)
2.1 Quantitative tests for impurities content
2.2 Limit tests for the control of impurities
3. การวิเคราะห์ปริมาณตัวยาสาคัญ (Assay)
ก่อนการทา method validation จะต้องเข้าใจถึงวัตถุประสงค์ของวิธวี เิ คราะห์อย่างชัดเจน
เนื่องจากจะเป็ นสิง่ ทีค่ วบคุมว่าจะต้องประเมิน performance characteristics หรือ parameters ใดบ้างใน
การทดสอบความถูกต้องของวิธวี เิ คราะห์
Parameters ทีค่ วรพิจารณาในการทา method validation มีดงั นี้
- ความเทีย่ ง (accuracy)
- ความแม่น (precision) มี 3 ระดับ
- Repeatability
- Intermediate precision
- Reproducibility
- ความจาเพาะ (specificity)
- ขีดจากัดของการตรวจพบ (detection limit)
- ขีดจากัดของการหาเชิงปริมาณ (quantitation limit)
- ความเป็ นเส้นตรง (linearity)
- พิสยั (range)
- ความคงทน (robustness)
การประเมินความถูกต้องของวิธวี เิ คราะห์ไม่จาเป็ นต้องทาครบทุกหัวข้อ การจะทาหัวข้อใดบ้าง
ขึน้ อยูก่ บั ประเภทของวิธวี เิ คราะห์ แนวทางการพิจารณาเลือก parameter ในการทา method validation
แสดงในตารางที่ 1

2
 บทความวิ ชาการเพื่อการศึกษาต่อเนื่ องทางเภสัชศาสตร์

ตารางที่ 1 การแบ่งประเภทการทดสอบและพารามิเตอร์ของ method validation ตามแนวทาง ASEAN

Type of Analytical Procedure
Performance Testing for Impurities Assay
Characteristics -dissolution
(parameters) Identification Quantitative Limit
(measurement only)
test
-content/potency
Accuracy - + - +
Precision
- Repeatability - + - +
- Intermediate - + - +
Precision
Specificity + + + +
Detection limit - - + -
Quantitation limit - + - -
Linearity - + - +
Range - + - +
+ เป็ นพารามิเตอร์ทต่ี อ้ งทดสอบ
ข- เป็ นพารามิเตอร์ทไ่ี ม่ตอ้ งทดสอบ
-
4. Analytical Performance Characteristics (Parameters)
4.1 Specificity คือ ความสามารถของวิธวี เิ คราะห์ในการจาแนกสารทีต่ อ้ งการวิเคราะห์ออกจาก
สารอื่นๆ รวมถึงสารปนเปื้ อน (impurities) สารทีเ่ กิดจากการสลายตัว (degradants) และ matrix เป็ น
พารามิเตอร์ทก่ี าหนดให้ทดสอบสาหรับวิธวี เิ คราะห์ทุกประเภท
4.2 Linearity คือการประเมินความเป็ นเส้นตรงระหว่างค่าสัญญานจากการวิเคราะห์กบั ความ
เข้มข้นของสาร โดยต้องประเมินตลอดช่วง (range) ทีร่ ะบุสาหรับการวิเคราะห์นนั ้ การศึกษา linearity
อาจใช้สารละลายชุดความเข้มข้นทีเ่ ตรียมจากสารมาตรฐาน หรือเตรียมจาก synthetic mixtures ของ
ผลิตภัณฑ์ยา ควรใช้ระดับความเข้มข้นอย่างน้อย 5 ระดับ การประเมิน linearity จะประเมินด้วยตา
(visual inspection) ถ้ามีความสัมพันธ์เป็ นเส้นตรง ให้คานวณหา regression line โดยวิธี least squares
ในการขึน้ ทะเบียนตารับยา ควรยืน่ ข้อมูล correlation coefficient, y-intercept, slope of the
regression line และ residual sum of squares รวมทัง้ กราฟทีไ่ ด้
4.3 Range คือช่วงระดับความเข้มข้นต่าสุดและสูงสุดทีว่ ธิ วี เิ คราะห์นนั ้ มีคา่ linearity, accuracy
และ precision ทีย่ อมรับได้ตามเกณฑ์ทก่ี าหนด

3
Continuing Pharmaceutical Education Articles
การกาหนดค่า range ขึน้ อยูก่ บั วัตถุประสงค์ของงานทีใ่ ช้ แนวทางในการกาหนดช่วงความ
เข้มข้น (range) สาหรับงานวิเคราะห์ต่างๆ มีดงั นี้
- วิธี assay ควรให้ครอบคลุมช่วง 80-120% ของ test concentration
- วิธี content uniformity ควรให้ครอบคลุมช่วง 70-130% ของ test concentration
- วิธี dissolution test กาหนดช่วง + 20% over the specified range
- วิธหี าปริมาณ Impurity กาหนด range ตัง้ แต่ระดับสารปนเปื้ อนทีร่ ายงาน ถึง 120% ของ
specification
4.4 Accuracy คือความเทีย่ งของวิธวี เิ คราะห์ แสดงโดยความใกล้เคียงกันระหว่างค่าทีไ่ ด้จากการ
วิเคราะห์นนั ้ เปรียบเทียบกับค่าจริง หรือค่าอ้างอิงทีเ่ ป็ นทีย่ อมรับ
accuracy ต้องประเมินตลอดช่วงความเข้มข้นทีร่ ะบุสาหรับวิธวี เิ คราะห์นนั ้ โดยทัวไปจะวิ
่ เคราะห์
อย่างน้อย 9 ซ้าที่ 3 ความเข้มข้น ทีค่ รอบคลุม range ทีก่ าหนด โดยการเติมสารมาตรฐานทีท่ ราบความ
เข้มข้นลงใน sample และหาค่าความต่างของค่าทีว่ เิ คราะห์ได้กบั ค่าทีแ่ ท้จริง แล้วรายงานเป็ นค่าร้อยละ
การคืนกลับ (percent recovery)
4.5 Precision คือความแม่นของวิธวี เิ คราะห์ แสดงโดยความใกล้เคียงกันระหว่างค่าทีไ่ ด้จากการ
วิเคราะห์ตวั อย่างเดียวกันซ้าหลายๆครัง้ โดยตัวอย่างต้องเป็ นเนื้อเดียวกัน หัวข้อ precision นี้แบ่ง
ออกเป็ น 3 ระดับคือ
- Repeatability คือการแสดงความแม่นของการวิเคราะห์ชุดการวิเคราะห์ซ้า ทีท่ าในสภาวะ
เดียวกัน ในระยะเวลาทีห่ า่ งกันไม่นาน
- Intermediate precision คือการแสดงความแม่นของการวิเคราะห์ชุดการวิเคราะห์ ทีท่ าซ้า
โดยมีการเปลีย่ นแปลงปั จจัยในการวิเคราะห์ในห้องปฏิบตั กิ ารเดียวกันเช่นเปลีย่ นเครือ่ งมือ เปลีย่ น
นักวิเคราะห์ เปลีย่ นวัน
- Reproducibility คือการแสดงความแม่นของการวิเคราะห์ทท่ี าโดยห้องปฏิบตั กิ ารหลายห้อง
โดยทัวไปใช้
่ ในการนาเสนอวิธใี หม่ทจ่ี ะใช้เป็ นวิธมี าตรฐานในเภสัชตารับ
การรายงานค่า precision แต่ละชนิด ให้รายงานเป็ น standard deviation, relative standard
deviation และ confidence interval
4.6 Detection limit หรือ Limit of detection (LOD) คือปริมาณต่าสุดของสารทีว่ เิ คราะห์ใน
ตัวอย่างใดๆ ทีส่ ามารถตรวจพบได้ แต่ไม่จาเป็ นต้องทราบว่ามีปริมาณทีแ่ น่นอนเท่าใด การหา LOD มี
หลายวิธี ได้แก่
4.6.1 Based on visual evaluation คือการประเมินด้วยการมองเห็น โดยการวิเคราะห์
ตัวอย่างทีท่ ราบความเข้มข้น และหาค่าต่าสุดของตัวอย่างทีว่ ธิ วี เิ คราะห์สามารถตรวดวัดได้
4.6.2 Based on signal-to-noise วิธนี ้สี ามารถใช้กบั เทคนิคทีใ่ ห้ baseline noise เช่น
เทคนิค HPLC โดยทาการเปรียบเทียบ signal ทีว่ ดั ได้จากตัวอย่างทีร่ คู้ วามเข้มข้นต่าของสารทีว่ เิ คราะห์
กับตัวอย่างทีเ่ ป็ น blank เรียกว่า signal-to-noise ratio โดยทัวไปส่ าหรับ LOD ค่าทีย่ อมรับคือ 3 หรือ 2
ต่อ 1

4
 บทความวิ ชาการเพื่อการศึกษาต่อเนื่ องทางเภสัชศาสตร์
4.6.3 Based on the standard deviation of the response on the slope
โดย LOD = 3.3 /S
ซึง่  = the standard deviation of the response
S = the slope of the calibration curve
ในการยืน่ ขอขึน้ ทะเบียนตารับยา วิธวี เิ คราะห์สารปนเปื้ อนแบบ limit test ต้องมีการแสดง
ค่า LOD และระบุวธิ ที ใ่ี ช้ในการประเมินด้วย
4.7 Quantitation limit หรือ Limit of quantitation (LOQ) คือปริมาณต่าสุดของสารทีว่ เิ คราะห์
ในตัวอย่างทีส่ ามารถตรวจหาเชิงปริมาณโดยมีความเทีย่ งและความแม่นอยูใ่ นเกณฑ์ทเ่ี หมาะสม การหา
LOQ มีหลายวิธี ได้แก่
4.7.1 Based on visual evaluation คือการประเมินด้วยการมองเห็น โดยการวิเคราะห์
ตัวอย่างทีท่ ราบความเข้มข้นและหาค่าต่าสุดซึง่ สามารถหาปริมาณสารทีว่ เิ คราะห์ได้ดว้ ยความเทีย่ งและ
ความแม่นทีเ่ หมาะสม
4.7.2 Based on signal-to-noise วิธนี ้ีสามารถใช้กบั เทคนิคทีใ่ ห้ baseline noise เช่นเทคนิค
HPLC โดยทาการเปรียบเทียบ signal ทีว่ ดั ได้จากตัวอย่างทีร่ คู้ วามเข้มข้นต่าของสารทีว่ เิ คราะห์กบั
ตัวอย่างทีเ่ ป็ น blank เรียกว่า signal-to-noise ratio โดยทัวไปส
่ าหรับ LOQ ค่าทีย่ อมรับคือ 10 ต่อ 1
4.7.3 Based on the standard deviation of the response on the slope
โดย LOD = 10 /S
ซึง่  = the standard deviation of the response
S = the slope of the calibration curve
ในการยืน่ ขอขึน้ ทะเบียนตารับยา วิธวี เิ คราะห์ปริมาณสารปนเปื้ อน ต้องมีการแสดงค่า LOQ
และระบุวธิ ที ใ่ี ช้ในการประเมินด้วย

5. บทสรุป
การศึกษา method validation ของวิธวี เิ คราะห์ทใ่ี ช้ในการควบคุมคุณภาพยา เป็ นข้อมูลทีส่ าคัญ
อย่างหนึ่งทีใ่ ช้ประกอบในการขึน้ ทะเบียนตารับยาในส่วนของ quality เพือ่ แสดงให้เห็นว่าวิธวี เิ คราะห์นนั ้
สามารถใช้วเิ คราะห์ตวั อย่างได้ถูกต้อง แม่นยา เชื่อถือได้ ตามวัตถุประสงค์ทก่ี าหนด โดยแนวทาง
การศึกษา method validation ในอุตสาหกรรมยาของประเทศไทย จะปฏิบตั ติ ามแนวทางของ ASEAN
Analytical Validation Guideline ทีร่ บั มาจาก ICH Guideline Q2(R1) ซึง่ จะให้แนวทางปฏิบตั แิ ละ
ข้อแนะนาเกีย่ วกับลักษณะเฉพาะ (characteristics) หรือพารามิเตอร์ (parameters) ของการทดสอบ
ความถูกต้องสาหรับวิธวี เิ คราะห์แต่ละประเภท

6. เอกสารอ้างอิ ง
1. ICH Q2 (R1) : Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology. 2005.
2. ASEAN Technical Guidelines to ACTR on Quality: ASEAN Analytical Validation
Guideline. 2549.
5