La célula. Conceptos generales.

Técnicas básicas en biología

molecular.
Dr. Ricardo Sánchez Prieto
CRIB
Facultad de Medicina
Campus de Albacete
UCLM
Adapted from ECB Fig 1-9
Sense of scale
 The Animal Cell
plasma
• The fundamental unit of life membrane
• Must be capable of: nucleus
cytoplasm
metabolism
growth
reproduction
• Cellular dimensions
5-20 µm diameter

• Require microscope
Light microscope (> 0.2 µm)
Electron microscope (> 2 nm)

Adapted from ECB Fig 1-7 (A)

4 µm
 Diversity of animal cells
More than 200 cell types identified in human body
Arranged into tissues - 4 basic tissue types

epithelia connective tissue muscle nervous tissue

Specialised cell types:

germ cell - sperm

red blood cells

hair cell - sound receptor

rod cells - photoreceptor cells

Adapted from ECB Panel 1-3 (1st Edn)
 Components of “typical” animal cell
mitochondrion

lysosome
peroxisome

cytosol

Golgi
nuclear apparatus
envelope
nucleus

vesicle
endoplasmic plasma
Adapted from ECB Fig 1-24
reticulum membrane
PHOSPHOLIPID
MEMBRANE

Compartmentalization
Protection
Cell recognition
Entry/exit
Fluid mosaic
 Cytoplasm
• Cell contents excluding
organelles
• Largest single compartment in
most cells
• Viscous aqueous solution (gel)
due to concentration of large
and small molecules
• Site of many chemical
reactions
⇒ initial stages in metabolic
breakdown of nutrients
⇒ protein manufacture -
ribosomes
Adapted from ECB Fig 1-24
 Mitochondria
• Present in all
eukaryotic cells
• Two membranes -
inner membrane
folded into interior
10 µm
• Contain their own
DNA - reproduce
by dividing in two
• Oxidation of food
molecules ⇒ ATP -
energy generation
(cellular respiration
aerobic metabolism)

Adapted from ECB Figs 1-17,1-18 100 nm

ENDOPLASMIC RETICULUM
 Endoplasmic Reticulum
nuclear endoplasmic
nucleus envelope reticulum

• Production of
cell membrane
components
(proteins)
• Ribosomes ⇒
protein synthesis

Adapted from ECB Fig 1-22 1 µm

RIBOSOME
Free-floating in cytoplasm
Bound to membranes
Protein synthesis
Translate mRNA
Two subunits
Larger in eukaryotes
Ribosome - ER - golgi
Thousands per cell
 SMOOTH ENDOPLASMIC
RETICULUM
No ribosomes
Lipid transport
Large surface area
Enzyme attachment
 Golgi apparatus
• Synthesis and
packaging of
molecules
secreted by cell
• Routing of
synthesised
protein to
correct cellular
membrane compartment
bounded
vesicles • Organised into
Golgi stacks of
apparatus membrane-
endoplasmic reticulum bound sacs
nuclear envelope from which
vesicles bud off
Adapted from ECB Fig 1-23
1 µm
 Cytoskeleton
intermediate
actin microtubules filaments

Adapted from ECB Fig 1-27

• Extensive network of long, thin protein filaments

• Thinnest filaments - actin ⇒ contractile machinery
• Thickest filaments - microtubules (minute hollow tubes)
- important for dividing cells - chromosomes
• Intermediate filaments - mechanical strengthening
CENTRIOLE
Right angle cylinders
Microtubules
Spindle fibers
Cell division
 The Nucleus

nuclear
envelope

nucleus

• Most prominent
organelle
• Contains genetic
information of
organism - DNA

Adapted from ECB Fig 1-15 2 µm

DNA RNA Proteína
(Enzimas)
 Técnicas basadas en la interacción
Antígeno/anticuerpo

-Western Blot/Inmunoprecipitación..
Blot/Inmunoprecipitación..
-ELISA
-Inmunofluorescencia
.Inmunohistoquímica
.Inmunocitoquimica
.FACS. Microchips.
 Western Blot
Muestra con proteínas +
-
Cátodo Cubeta

Tampón
Gel Ánodo

Transferencia de las
Tampón proteínas a una membrana

Incubación de la membrana Incubación con Proteína A

con anticuerpo específico radioactiva o un Autorradiografía
para la proteína de interés anticuerpo 2ºunido a una
actividad enzimática
- - + + - - + + - - + + - - + + sb203580
- +
- + - + - + - + - + - + - + 20 Gy

P21WAF

HaCaT Hop62 A549 A431

ELISA (Enzyme-
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)

1. Cubrir el pocillo con la

muestra que contiene
antígenos
2. Bloquear el resto de la
superficie con proteína no
específica
3. Incubar con el anticuerpo
dirigido contra el antígeno de
interés
4. Incubar con un anticuerpo
unido a un enzima dirigido
contra el primer anticuerpo
5. Añadir el sustrato del
enzima
6. La formación del producto
coloreado indica la presencia
del antígeno
 La inmunofluorescencia permite identificar la
localización celular de muchas moléculas

INMUNOCITOQUÍMICA

Anticuerpos marcados
con substancias
fluorescentes

Células fijadas e
incubadas con los
anticuerpos

Observación al microscopio
 INMUNOHISTOQUÍMICA

Ej. Identificación de IGFBP–3 en

Keratinocitos humanos por
microscopia de fluorescencia
La inmunohistoquímica es un estudio histopatológico que
se basa en la utilización de un anticuerpo específico,
previamente marcado mediante un enlace químico con una
enzima que puede transformar un sustrato en visible, sin
afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo
con el antígeno, aplicado a una muestra de tejido orgánico,
correctamente fijada e incluida en parafina. El complejo
antígeno - anticuerpo así formado, mediante la utilización de
alguna de las técnicas específicas (peroxidasa antiperoxidas,
fluoresceína, etc), permite ser localizado e identificado
dentro de las muestras tisulares o citológicas a estudiar,
logrando la identificación de marcadores antigénicos
característicos de distintas líneas de diferenciación y
funcionalismo celular, con lo que se determina el tipo de
célula involucrado en la muestra.
 BIOLOGÍA MOLECULAR
DE ÁCIDOS NUCLEÍCOS

--Southern
-- Southern blot.
Electroforesis en gel:
--Northern
-- Northern Blot. agarosa, acrilamida,
--Secuenciación
--Secuenciación de Transferencia, detección.
ácidos nucléicos.
--PCR.
--PCR.
--MICROARRAYS
--MICROARRAYS
SOUTHER! BLOT
 NORTHERN BLOT
mR!A
Hibridación con sonda D!A marcada radiactivamente

Gel

Electroforesis
Detección
Transferencia Autorradiografía
Secuenciación de Ácidos Nucléicos
Métodos clásicos de secuenciación
•Método químico de Maxam y Gilbert
•Método enzimático de Sanger (Dideoxi)

Secuenciación automática empleando el método

enzimático
•Secuenciación con cebadores fluorescentes
•Secuenciación con terminadores fluorescentes

Otros métodos de secuenciación automática de AD!

•Secuenciación de AD! empleando microarrays.
•Pirosecuenciación.
Maxan y Gilbert
 Sanger
“Dideoxi”.
 SECUE!CIACIÓ! AUTOMÁTICA
-Cuatro reacciones de secuencia distintas: oligonucleótido marcado en 5´5 con una sonda
fluorescente distinta.
-Uso de ddNTPs.
-Derivados de fluoresceína (verde y azul) y rodamina (amarillo y rojo).
SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA.
Terminadores marcados cada uno con un fluoróforo
diferente. EN UNA SOLA REACCIÓN.
SECUENCIADOR SISTEMA CAPILAR
ABI 377

Sistema geles de Acrilamida

DETECCIÓ! Y A!ÁLISIS
Reacción en
cadena de la
polimerasa
(PCR)
 PCR
• Técnica cuyo objetivo es la amplificación de fragmentos
de DNA específicos. Detección de DNAs muy escasos

• Componentes necesarios:
- DNA molde
- DNA polimerasa termoestable (Taq polimerasa)
- primers específicos. Programas informáticos para
diseñarlos
- los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)
- tampón específico (MgCl2)
- termociclador

• Aplicaciones: Uso muy amplio en distintos campos

como genética, biología molecular, medio ambiente,
medicina forense, diagnóstico, biotecnología,
microbiología, industria alimenticia, epidemiología, etc.
Protocolo Pefil de un ciclo

Análisis en gel de agarosa

La amplificación de la secuencia
de DNA deseada es exponencial
 Modificaciones y mejoras de la técnica
• Polimerasas correctoras de errores
• “Hot Start” PCR
• RT-PCR (Transcriptasa reversa: mRNA cDNA)
• Mutagénesis dirigida
• Amplificación de polimorfismos de DNA al azar (RAPDs)
• PCR múltiple
• DD-PCR (Differential display)
• PCR in situ, RT-PCR in situ PCR cuantitativa
PCR cuantitativa, PCR en tiempo real, qPCR o RT-PCR (real
time PCR) es una variante de la reacción en cadena de la PCR en la
cual se cuantifica de forma absoluta o relativa la amplificación de
ADN. Para ello emplea, un fluorocromo que, en un termociclador que
albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluorocromo
a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación
de uno o más productos específicos. En muchos casos el molde que se
emplea para la PCR cuantitativa no es desde el principio ADN, sino
que puede ser ADNc, de hebra simple, obtenido por retrotranscripcion
de ARN; en este caso, la técnica es una RT-PCR cuantitativa.
Fig. 7. Mechanisms of
reporters used in real-time
PCR: (A) the molecular
beacon, (B) the Taqman
probe,
(C) the hybridization
probes,(D) the LightUp
probe, (E) the simpleprobe,
(F) scorpion primer,
(G) sequence non-specific
dyes (SYBR
Green/BOXTO).
• Las sondas TaqMan permiten medir la producción
de productos de PCR mediante un sistema de
sondas marcadas mediante dos fluorocromos.
• Poseen un fluoróforo en su extremo 3' y una
molécula en el 5' que bloquea su emisión de
fluorescencia (quencher)
• Esta sonda marcada híbrida específicamente en la
parte central del producto de PCR a obtener
• Cuando la polimerasa se topa con la sonda la
hidroliza mediante su actividad exonucleasa 5'-3',
lo cual provoca la separación del quencher del
fluorocromo y, por tanto, la emisión de
fluorescencia. Fluorescencia que está relacionada
con la cantidad de amplicón producido.
• El SYBR Green es un agente intercalante
tinción de ADN (electroforesis) o como
fluorocromo (productos de la PCR en tiempo real)
• Esta molécula se introduce en la estructura
secundaria de la doble hélice del ADN y se acopla
energéticamente a los ácidos nucleicos que lo
forman, de manera que se incrementa
notablemente su tasa de emisión fluorescente.
(FRET).
• El complejo resultante ADN-SYBR Green
presenta el pico de absorción en λ = 498 nm y el
pico de emisión en λ = 522 nm (zona verde del
espectro).
Biochips de
DNA
GENÓMICA: LOS MICROARRAYS

-2-3 MILLONES DE FRAGMENTOS

(OLIGONUCLEÓTIDOS) DE DNA/cm2.
 GENÓMICA
CONJUNTO DE TÉCNICAS QUE PERMITEN EL ESTUDIO
DE LOS GENOMAS EN SU CONJUNTO

-SECUENCIACIÓN COMPLETA DEL GENOMA DE MÚLTIPLES

ORGANISMOS

-LOCALIZACIÓN PRECISA DE MILES DE SONDAS

CONCRETAS EN PEQUEÑAS SUPERFICES

-ESTUDIO DE LA DOTACIÓN GÉNICA (GENOMA)

Y DE RNA MENSAJEROS (TRANSCRIPTOMA) DE
UN ORGANISMO O SISTEMA BIOLÓGICO DADO
•El genoma es una biblioteca de manuales de instrucciones,
(cada uno de los cuales es un gen)

•Cada manual permite hacer de forma correcta una

función (una proteína)

•Pérdida de un manual
•Descolocarlo
•Arrancar un hoja
•Insertar una hoja errónea
•….. ….mutaciones del genoma
 MUTACIONES EN EL DNA

•INSERCIONES
•DELECIONES
•INVERSIONES
•DUPLICACIONES
•CAMBIOS DE UNA SOLA BASE:
SNP, Single Nucleotide polimorfism

ACGTGGATCCGACGTCAGTACGGTACGTAG

ACGTGGATCCGACGTTAGTACGGTACGTAG
CCCATAATCCAAATGTCTATATGTATATGTCTATATGTATGGATATACATACATGTGAATTTATATGTGTAGATATGTAGGTATGCATGAATACTTG
TGAAATAGATGAAACAGATTGCAGGGCCCAACCAGGGCCATATGAAACTGTTGCTTTGAACTCATAATGAACATAGAGAATGAAACACTGCTTTGAA
CTTAATATCAACATCCTTCTGTAACTCCCATTTTATGTAACATTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTATGAGTGTATGTGTATCTGTGCCTG

EL GENOMA HUMANO
TGTAAAGGGTTTTAATTCTTTTCTTTGTAACATTTATCTACAAGTTAATTCTCTTTTACCTAGAAAACTTTTTGTCTAAAAGCTATTAAAGACTAAC
ATAATAAATAAAAGGTGATGTAGCCATTTTCCACTTTATCTGGTGTGTGTGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAAACTGGAATCAA
GGAAACTCCAATCCAAGCTGGTACCATCCATGTAGGTGGCCAAGAAGCCATTTCCAGCCACATTGGCAATATTTGTCAGGACAGAAAGCCAAATGCT
CCTTGGCACAGTTATTCTGGGCAGATGCCAGTGTTGCTCATGACAGGAAGATGCTCCTTGTAATGATGCAATTATACTGGAATATCTCTAGAGACTA
TATCAGGGTTTGCCCTCATAAATAGAGTGGAATCATCTGTACTTCTCAAGAATGGGGATTGTAGTGCAATTAGAGCATTCACCATCATCCACAATAA
GGGGACCACAGAACATCAGTTTCTTTCCAATAAAGCAAAACACAAGAGATGAAGCCCTTTCCCCTTTGGCACACAGCATTGAGACAAAGGAACCATG
TCCAAAGGCAGTTACCATCAGGCATCTTTTTGTCTCTAGCCTAAGAAGCAGAGAACTGAAAGTAGTTTGCTTTTCCTGGACAGGAACAGTGGTACAC
CCTCACCATTTTGTACAGGGTTATAGCTGATCTCTTACTCTTCTATGCTACAAAAATCTTGCTCAGCTCTCTAGCTCACAGGACAACATATTCTATA
TTGATAGTTTTACGACTGTATAACCCAACAGAAAGAAGTAGGTGCTTCTGAAGGGCCATTGGAAAACACAGATACCAGAAGCTAATAAATAAATGTC
ATGAAAATGGGATCCTGACTTCTTGGTGAAATTTCTGGAGATACAATTGTCTTAGTTACCTTTCTGTTGCTATGGTAAGACACTATGAACAAGGCAA
CCTATAGAAAAAAAAGAATAATTAAAAAAAAGAAAAAAGAATACTGGGGGATTATATTCATGACCATCATGGCAGAAAGTAGGCAAGTATGGAGCTG
•3 MIL MILLONES DE BASES (MIL LIBROS DE MIL PAGINAS)
AAGTAGTAGCTAAGAGCTCATATATTGAGACAACAACCAAGAAACAGAAGGAGCTAACTGGTAATAGCCTGGACTTTTGAAACCTCAAAGCTAGTCC
CCCAGTGACACATTTCCTTTAACAAGGCCACACCTCCTAATCCTTCCCAAACTGTTCCACCAATTGTGGACCAAGTATCTACGCACACATGGGACCA
TTCTCATTCAAACCACTACAACAATTATCTGTAAGCAATCTGAAACATAACATATCTTTAAATATCTTTAAAGCAAAAGATAAATAGTTGTACACAA
TATGTACCAATAAAAAGGTACAGCACTCACTTTGTGCTTCTGAGTTCCCTAGATAGCTTTCCAGGCTAAACCAGCTCAATAGCTGTGTCTGCCCACC
•25000-30000 GENES
TTCTTCTTCACTCTCTTCAGACTTCCAGATACCTTATTCCCTCCATTAGGGGAGTTTTCCAGAATGAATTAGAGAGGAAAATAAGCAATGATTATAA
CAATTACTTAGCATAAGGCATTCTTCTAAAGATTGTCACAGATTAATTTTCATGATCCTGGTCTTACTTAGGAGAATTCTCAGTAAATCCCAATTCT
GTTTTTGTGCCTCTGAGAAGAAAGCCTCTACAGAACAAATATATGGGACAGGGCTGCCTTTGCCACTAGTTCATCCCCAATCCCCTGCTTCTGCCTG
GCCCACTCTGTGGGCATTTGAGAGACACTGCTGACTCCACCCTTCAATAATGAGAGATGATGAGGCCAGAAGACCTAGGAGGTCTAGGAAAACCCAC
•10 MILLONES DE SNPs
TCACTGTCAGGCTGAGTCTCAGCTCCTAATAAACTCTGATTGGAAGCCAGATGAGCTCACACAATCCACCTATACTGTTTCCAGCACAGTGGTTATT
TTTAACTACACGGTACCGATCATACCCCTGGGCACCACGACTGTCTATGAATCACCTGCAATACTGGTGATATCTGCCAAAGGGCATCGTGTTATAT
TTAGCCAGGACTGCCTCAGAAAGACTTACAGCTGGAACAGAGAAAGTGTTTTTTCTTGCTTACAACTTGTGCTATGCAGCAGACTGAGTTCGTCTTC
CATGGCTGGAATGGCTTATCTTAGGCAGAATCTGTTCTCCACCAGGGGTATAAACAGATACCCAGATGAATGAGCAGGAGGCTAAGTGTTCCACATT
GTCAAATAAGTCCTCAATGCTCAGGAAAGCTCCAGTATCATGAGGGAAATCTGGATACAGCGGAGGGACTGGCAACAAACATCCAGGTTCTAGCTTC
AACCTTTGTTAACTACATTTCCTGTAGTCATGGACCCGCCCTCTCTCCATCTGCTGCTGTCTTCTTGTTCAGTGATATCAATCAACTTCCCGAGGTC
TCTAGAGAGTGATGAGAAGAGGCTTTAGAAACTCTAAAGTGCTGGTCAGAACAGTGGTTGTTAATGGGAGACTAAAAGATAAATTCAGAGACTCCAG
GTTTCCGGTCTCATTTAGACAAAACTGGATGACCAAGATCAGGTCAGCTCCTTTAGAGCCTTGGACACTTTTTAGTAGACAACTTTCTGTTCATGAC
TTCAGCAGCCATAATTCTTCCTTTCTCCAAGCTTCTGTTAAGGAGGGGTCTGCTCTGGTGTTTAATTCACTCTCCCTGTTTTGGTATGGGCAGCTAA
GTAGCCAGACAGGATGGGCTGGAAGTGATCTGCATTTTGATAGGTGAAATGTCACTTCAGGGCCCCCTGTGCTGCTGACTGCCCCTCTGACCACACA
TTTACAGTCTCTCTCTGTTTTCTTCCTTGTCTGCAGCACAGAAAAAGGCTGGAAAGCACAGCTCAGGGGTATTTTGGTTAACCTATTTCTTAAACCA
AACACCTATCTCAGCTGTACAGGAGAGCTTGCTGCCTCTTTGCATATAGTCAGTAAGGACAAATGTCTGTGCCATTCCCCAAGTCCTGAGAACCACA
CTTGGAAGCAAGCCTCATACAATTCTCTTTTGGTGAGTTCTTTGTTTTAAAAAAAAAAAATCTAATAATTTTAATTGTATGTGTGTGAGTGCCTTGT
CTGTATGTTTTGTATGTATGTATGCATGTATGTATGTATGTATGTATGTATGTATGTATACCACATGTGCTGTGCCCAAAGAGGCTAGAAGAGGGTA
TTAGATCACCTAGAACTGTAGTTCTAGCTGGTTGTTATCTTGTAGGCGCTGGGTACCAAACTGAGGTCCTCTTAACAGCTGAGTCACCTCTCTAGTA
 Tecnología de los Biochips
de DNA
• Términos: biochips, micromatrices de DNA, DNA chips, DNA
microarrays, Gene arrays.

• Concepto: Técnica concebida para detectar la expresión de miles

de genes simultáneamente mediante el desarrollo y miniaturización
de técnicas de afinidad conocidas.

• Aplicaciones potenciales:
- Determinar el nivel de expresión de genes a lo largo del
tiempo, entre distintos tejidos, estadíos de enfermedad, etc.
- Identificación y clasificación de enfermedades genéticas
complejas.
- Detección de mutaciones/polimorfismos (SNP’s).
- Identificación de patógenos y mecanismos de patogenicidad.
- Diseño de nuevas drogas y estudios toxicológicos.
- Seguimiento de terapias y medicina preventiva
 Tecnología Básica
• DNA de los genes de interés (sondas) se fija
en cantidades microscópicas sobre superficies
sólidas, en posiciones definidas.

• El cDNA de las muestras a estudiar (dianas) se

marca con fluorocromos y se hibrida con las
sondas fijadas en el biochip.

• El grado de hibridación se cuantifica mediante

fluorescencia después de excitación con láser.
Normal Tumor

RNA
Sondas
marcado

Muestra A Muestra B

Microarray
Genes altamente expresados en células tumorales
Genes reprimidos en las células tumorales

Genes igualmente expresados en ambos tipos celulares

Genes no expresados en ambos tipos celulares

 Variantes de la Tecnología
• Universidad de Standford
Las sondas son cDNAs completos/EST (500-5000
nu) y se fijan a un sustrato sólido (ej. cristal)
automáticamente mediante un robot. Capaz de
medir cualitativamente los niveles de expresión
de genes.

• Affymetrix
Las sondas son oligonucleótidos (20-80 mer) fijados
in situ y en altísima densidad al sustrato mediante
fotolitografía. Método muy poderoso para re-
secuenciación de DNA y detección de polimorfismos.
Tecnología
Affymetrix
 Perfil de expresión

Fuente: De Risi et al. Science 278:680-686

 OBJETIVOS DEL ANÁLISIS GENÓMICO EN
TUMORES HUMANOS

•IDENTIFICACIÓN DE FIRMAS O MARCHAMOS MOLECULARES

-GRUPOS DE GENES QUE PERMITAN DIAGNOSTICAR LA

ENFERMEDAD Y PREDECIR SU EVOLUCIÓN FUTURA
(PROGNOSIS).

•IDENTIFICACIÓN DE NUEVAS DIANAS TERAPEÚTICAS

-ONCOGENES

-SUPRESORES
 ANÁLISIS GENÓMICO EN TUMORES HUMANOS

•PERFILES O PATRONES DE EXPRESIÓN DE mRNA

•PERFIL DEL GENOMA

 UNA FIRMA MOLECULAR PARA EL CÁNCER DE MAMA

Nature 2002 415(6871):530-6

Gene expression profiling
predicts clinical outcome of
breast cancer.
van 't Veer LJ, Dai H, van de Vijver MJ, He YD,
Hart AA, Mao M, Peterse HL, van der Kooy K,
Marton MJ, Witteveen AT, Schreiber GJ,
Kerkhoven RM, Roberts C, Linsley PS,
Bernards R, Friend SH.

-25000 genes
-78 pacientes (N0, sin ganglios
afectados)
-70 genes discriminatorios
UNA FIRMA MOLECULAR PARA EL CÁNCER DE MAMA

GENES DE BUEN
PRONÓSTICO

SUPERVIVENCIA

GENES DE MAL
PRONÓSTICO

AÑOS
 Biochips de Proteínas/Anticuerpos

• Características:
- Tecnología poco desarrollada.
- Sondas: proteínas, anticuerpos, péptidos, oligonucleótidos
que se unen a proteínas.
- Prevenir evaporación y desnaturalización de las
sondas, uniones no específicas, etc.
- Diferentes métodos de detección.

• Aplicaciones:
- Perfil proteico: abundancia, modificaciones, localización
en una célula o tejido...

- Determinación de la función: interacciones moleculares.

Interacciones

proteína-proteína

enzima-sustrato

Proteína-pequeñas
moléculas
Cultivos celulares
cristal violeta

Control Cis-platino Oxali-platino

350
5 15 40

450

450
150 350 450 650

650
Carbo-platino
HOP 62 (5x104 cels/ml) cDDP ug/ml x24h
Ensayo de focos
0 Gy

8 Gy
Cultivos y ensayos de radiosensibilidad
Citometria de flujo
 Citómetro de Flujo (CMF)
• Aparato que mide componentes y propiedades de
células y orgánulos celulares (partículas biológicas)
individuales que fluyen en suspensión.

• Posibilidad de separación (sorting) celular.

Parámetros medibles por CMF
ESTRUCTURALES FUNCIONALES

Tamaño y forma celular Estadío de Red-Ox

Granularidad citoplasma
Contenido pigmentos
Fluoresc. Proteínas
Contenido DNA, RNA
Ratio bases DNA
Estructura cromatínica
Proteínas totales o básicas
Grupos químicos
Antígenos
Azúcares superficie
Estructura citoesqueleto
Estudios de membrana
Actividad enzimática
Endocitosis
Síntesis de DNA
Receptores
Potencial de membrana
pH, Calcio, carga superficie
 Componentes de un CMF
Fluidos Células o partículas en suspensión marcadas con
fluoróforos. Pasan de una en una

Sistema Hidráulico Cámara de flujo y sistema de presión y de

inyección de la muestra. Velocidad constante

Sistema Óptico Fuente de iluminación, filtros para discriminar la

señal lumínica y fotodetectores que recogen la luz

Sistema Electrónico Los valores se digitalizan. Procesamiento

informático y almacenamiento de la señal
Sistema hidráulico: Cámara
de flujo
 Sistema Óptico
• Dispersión Frontal de la luz o Forward
Scatter (FSC)
• Proporcional al tamaño, forma y
heterogeneidad de las células
 Sistema Óptico
• Dispersión Lateral (90º) de la luz
o Side Scatter (SSC)
• Proporcional a la complejidad
citoplasmática y la estructura interna
 Sistema electrónico
• Procesamiento de las señales captadas por los detectores (fotodiodos o
fotomultiplicadores) en señales digitales
- Preamplificación
- Amplificación: lineal o logarítmica
- Compensación: utilización simultánea de varios fluorocromos

• Adquisición y almacenamiento de datos

- Cada detector mide una variable (parámetro)
- Los datos se adquieren como una lista de valores para
cada célula (evento), para cada parámetro
- Los datos se analizan con programas informáticos: Histogramas
mono-, bi- o multiparamétricos

225 300
E vent Param1 Param2 Param3 Param4
FS SS F IT C PE
Células
1 50 100 80 90 150

2 55 110 150 95
75

3 110 60 80 30
0

0 200 400 600 800 1000

Fluorescencia
 Ciclo celular
M
G0
G2
Fases:
G1 • G0: reposo
S 2N
• G1: síntesis de proteínas y RNA

• S: replicación de DNA

• G2: síntesis de proteínas

4N
• M: mitosis
 Ciclo celular
M
G0

G2 Análisis de DNA

G1 G0 G1
S
Células

S G2 M

0 200 400 600 800 1000

2N 4N
Fluorescencia IP
Análisis del estadío del ciclo celular
G0/G1 S G2/M

Células

Fluorescencia IP
G0/G1 S G2/M G0/G1 S G2/M
bromodeoxyuridina
Nombre químico:, 5-bromo-2'-deoxy-Uridine
Un nucleosido que sustituye a la Timina en
el ADN y que puede actuar como
antimetabolito. Sólo se incorpora en células
en división. Se ha propuesto su uso como
antitumoral.
Control γ−Radiation
Detección de células aneuploides
con Ioduro de Propidio

2N Aneuploides (índice DNA:1,58)

Efecto de daño al DNA en el
ciclo celular

Células AT

Células
normales
Células Apoptosis

Fluorescencia IP
Apoptosis y necrosis

Hoechst 33342
7-AAD
Detección de Apoptosis con Anexina V

La anexina V se une específicamente a células que

están entrando en apoptosis
Tipos de marcaje
Single cell gel (SCG) electrophoresis o 'Comet assay'

El ensayo funciona sobre el principio siguiente:

Las roturas de la hélice de DNA disminuyen el tamaño de la estructura
superen rollada de las cadena de ADN y que las cadenas se pueden separa
por electroforesis. (Ostling and Johanson in 1984)
También en condiciones extremadamente alcalinas (pH >13) hay
desnaturalización de la doble hélice y desenrrollamineto permitiendo la
detección de roturas simples como sitios sensible a condiciones alcalinas
Singh et al (1988)

Luego
1.- la migración del DNA es función del numero y tamaño de las roturas
2.- la longitud de la cola se incrementa con daño inicialmente pero luego
alcanzara un máximo que dependerá de las condiciones de la electroforesis
y no del tamaño de los fragmentos.
Single cell gel (SCG) electrophoresis o 'Comet assay'
Irradiated
 Ventajas del Comet assay
• No invasiva
•Requiere <10,000 cells
•Contando solo 50-100 cells por individua disponemos de una
potente estadística
• se pude evaluar en cualquier tipo celular
•Alta sensibilidad (1 break in 1010 daltons)
•Resultados rápidos (en el día ) comparando con las técnicas de
citogenética convencional
•Posibilidad de detección de roturas sencillas (SSB’s)
•Con muy poca muestra se puede realizar el estudio (5-10ml de
sangre ),PAF , Biopsias con aguja fina etc. ,
 Conclusiones

• Existen distintas técnicas para evaluar

proteínas, DNA, RNA, ect…
• Existen formas de ver varios genes,
proteínas, RNAs, (“omicas”)
• Existen técnicas para trabajar con al células
en conjunto (Cultivo, citometría, etc)