SDP1

ความเปนพิษตอเซลลมะเร็งของสารสกัดจากพืชสมุนไพรไทยที่มีฤทธิ์ยับยั้งการทํางานของ
เอนไซมฮิสโทนดีอะเซทิลเลส
Cytotoxicity of cancer cells by Thai medicinal plant extracts possessing the activity
of histone deacetylase inhibitor

สุวัชชัย มิสุนา (Suwatchai Misuna)* ธนเศรษฐ เสนาวงศ (Thanaset Senawong)**

วิภา จึงจตุพรชัย (Wipa chungjatupornchai)***

บทคัดยอ

ตัวยับยั้งเอนไซมฮิสโทนดีอะเซทิลเลส (Histone deacetylase inhibitor: HDAC inhibitor) เปนกลุมของ

สารประกอบที่ใชเปนยารักษามะเร็งไดอยางมีประสิทธิภาพในปจจุบัน งานวิจัยในครั้งนี้ตองการที่จะศึกษาถึงความเปน
พิษตอเซลลมะเร็งของสารสกัดซึ่งมีสารธรรมชาติที่มีคุณสมบัติเปน HDAC inhibitor จากพืชสมุนไพรไทยสามชนิดคือ
ขันทองพยาบาท (Suregada multiflorum Baill.) ผักคราดหัวแหวน (Spilanthes acmella Murr.) และหัวรอยรู
(Hydnophytum formicarum Jack.) พบวาสารสกัดหยาบดวยเอทานอลจากรากหัวรอยรู เปลือกตนขันทองพยาบาท และ
ตนผักคราดหัวแหวน มีความเปนพิษตอเซลลมะเร็งแตละชนิดแตกตางกันเมื่อทดสอบดวยวิธี LDH cytotoxicity assay
โดยสารสกัดจากรากหัวรอยรูมีความเปนพิษตอเซลลมะเร็งปากมดลูก (Hela cells) และเซลลมะเร็งเม็ดเลือดขาว (Jurkat
cells) สารสกัดจากเปลือกตนขันทองพยาบาทมีความเปนพิษตอเซลลมะเร็งปากมดลูก สวนสารสกัดจากตนผักคราดหัว
แหวนคอนขางมีความเปนพิษนอยตอเซลลมะเร็งทุกชนิดที่ใชในการทดสอบ

ABSTRACT

Histone deacetylase (HDAC) inhibitor represent a class of agents that are currently used as potentially
effective anticancer drugเ. In this research work, the cytotoxic activity of crude extracts having HDAC inhibitory
properties from three Thai medicinal plants (Suregada multiflorum Baill., Spilanthes acmella Murr. and
Hydnophytum formicarum Jack.) against cancer cells was investigated. The results from LDH cytotoxicity assay
showed that ethanolic crude extracts from bark of S. multiflorum Baill., stem of S. acmella Murr. And root of H.
formicarum Jack. exhibited cytotoxic activity with a certain degree of selectivity against the different cancer cell
types. The crude extract from H. formicarum Jack. exhibited cytotoxic activity against Hela cells and Jurkat cells,
while the crude extract from S. multiflorum Baill. exhibited cytotoxic activity against Hela cells. In addition, the
crude extract from S. acmella Murr. exhibited weak cytotoxic activity against to most cancer cells used in this study.

คําสําคัญ : ตัวยับยั้งเอนไซมฮิสโทนดีอะเซทิลเลส สมุนไพรไทย มะเร็ง

Key word : HDAC inhibitor, Thai medicinal plant, cancer

* นักศึกษา หลักสูตรปรัชญาดุษฎีบัณฑิต สาขาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน

** ผูชวยศาสตราจารย ภาควิชาชีวเคมี คณะวิทยาศาสตร มหาวิทยาลัยขอนแกน
*** รองศาสตราจารย สถาบันอนูชีววิทยาและพันธุศาสตร มหาวิทยาลัยมหิดล

109

บทนํา
มะเร็ง (cancer or malignant tumor) เกิดจากเซลล
ที่มีคุณสมบัติเปลี่ยนแปลงไป ทําใหมีการแบงตัวและ
เพิ่มจํานวนมากขึ้นจนกลายเปนกอนเนื้อใหญ (ยกเวน
มะเร็งเม็ดเลือดขาว) หรือที่เรียกกันวาเนื้องอก (tumors)
โดยถาเปนเนื้องอกชนิดราย จะมีการเจริญเติบโตรุกล้ํา
(invasion) และแพรกระจาย (metastasis) ไปยังเนื้อเยื่อ
และอวัยวะอื่น ๆ ได มะเร็งระยะแรกจะยังไมมีอาการ
เจ็บปวด ตอมาเมื่อเนื้องอกโตมากขึ้นจะเริ่มมีอาการ
ปวดมากขึ้น ทําใหรางกายทรุดโทรมจนถึงแกชีวิต
ปจจุบันอัตราการตายของคนไทยดวยโรคมะเร็ง ถือวา
สูงเปนอันดับตนๆ โดยพบวาสูงเปนอันดับหนึ่ง จาก
ขอมูลสถิติสาธารณสุขป พ.ศ. 2545–2549 (สํานัก
นโยบายและแผนยุทธศาสตร กระทรวงสาธารณสุข,
2551)
การรักษาโรคมะเร็งมีหลายวิธี ขึ้นกับชนิดและ
ระยะการเจริญของเซลลมะเร็ง การรักษาดวยเคมีบําบัด
(Chemotherapy) หรือการรักษาโดยการใชยาเปนวิธี
หนึ่งที่ใชกันมากในการรักษาโรคมะเร็ง และถือเปน
ทางเลือกตน ๆ ในการรักษาโรคมะเร็งบางชนิด เชน
มะเร็งเม็ดเลือดขาว เปนตน ซึ่งในการรักษาดวยเคมี
บําบัดนี้ ยาหลายชนิดมีฤทธิ์แรงและออกฤทธิ์ที่ระยะ
จําเพาะของ cell cycle จึงมีฤทธิ์เฉพาะตอเซลลที่มีการ
แบงตัวเทานั้น ยาที่ใชในการรักษาโรคมะเร็งมีหลาย
ประเภทตามกลไกการแสดงฤทธิ์ของยา แตอยางไรก็
ตามยาหลายชนิดมีผลกระทบขางเคียงตอเนื้อเยื่อปกติที่
มีการแบงตัวเร็วคลายเซลลมะเร็ง เชน เซลลไขกระดูก
เซลลรากขน (hair follicles) และเซลลเยื่อบุลําไส จึงทํา
ใหมีขอจํากัดในการรักษาดวยเคมีบําบัด นอกจากนี้ยา
เหลานี้มักจะมีราคาคอนขางแพง
เมื่อไมนานมานี้ ไดมีการศึกษาการใชยาชนิดใหม
ซึ่งมีคุณสมบัติเปนตัวยับยั้งการทํางานของเอนไซมฮิส
โทนดีอะเซทิลเลส (Histone Deacetylase (HDAC)
Inhibitor) ในการรักษาโรคมะเร็ง โดยพบวา HDAC
inhibitor บางตัว เชน Butyrate (Newmark et al., 1997)
110
SDP1-2
และ Suberoylanilide Hydroxamic acid (SAHA)
(Butler et a.l, 2000; Kelly et al., 2003) มีผลกระทบ
ขางเคียงตอเซลลปกตินอย ทําให HDAC inhibitors
ไดรับความสนใจอยางมาก ในการใชเปนยารักษา
โรคมะเร็ง ซึ่งรวมถึงใชรวมกับยารักษาโรคมะเร็งตัว
อื่น (Warrell et al., 1998; Lindemann et al., 2004)
เพราะใหผลตอการรักษาดี และไมกอใหเกิดผลกระทบ
ขางเคียงที่เปนอันตรายมากตอเซลลปกติ
โดยสารตางๆ ที่มีคุณสมบัติเปน HDAC inhibitor
จะมีคุณสมบัติรวมกัน คือสามารถยับยั้งการทํางานของ
เอนไซม Histone Deacetylase ซึ่งเปนเอนไซมที่มี
บทบาทสําคัญ ในการควบคุมการแสดงออกของยีน
(gene) โดยเปนที่ทราบกันดีวา ความผิดปกติในการ
ควบคุมการแสดงออกของยีนนั้น เปนสาเหตุหนึ่งของ
การเกิดมะเร็ง แตอยางไรก็ตาม การที่ HDAC
inhibitors สามารถตอตานเซลลโดยเหนี่ยวนําให
เซลลมะเร็งเกิด apoptosis และ/หรือ differentiation ยัง
ไมทราบกลไกที่แนชัด แตจากความสําเร็จของการใช
HDAC inhibitors ในการรักษาโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาว
ชนิด Acute Promyelocytic Leukemia โดยมีผลกระตุน
ใหเซลลมะเร็งเกิด differentiation และ/หรือ apoptosis
อยางจําเพาะ และสามารถรักษาผูปวยไดหายขาด
(Warrell et al., 1998) ทําใหมีการศึกษาผลของ HDAC
inhibitor หลายชนิด ตอเซลลมะเร็งชนิดตาง ๆ เพิ่มมาก
ขึ้น (Kwon, 1997; Saito et al, 1999; Butler et al.,
2000; Maeda et al., 2004) รวมถึงมีการเริ่มตนสํารวจ
หาสารธรรมชาติที่มีสมบัติเปน HDAC inhibitor เพื่อ
นําไปศึกษาคุณสมบัติในการตานเซลลมะเร็ง ศึกษาผล
ทางพิษวิทยาและทางคลินิก เพื่อใหสามารถเลือกสารที่
เหมาะสมที่จะนําไปใชในการรักษาโรคมะเร็งชนิดตาง
ๆ ตอไป
สมุนไพรเปนอีกทางเลือกหนึ่ง ที่เขามามีบทบาท
ในการตอตานเซลลมะเร็ง สมุนไพรที่ใชรักษามะเร็งที่
พิสูจนทางการแพทยแลวไดแก แพงพวยฝรั่ง ที่อยู
ระหวางการวิจัยไดแก หญาปกกิ่งและราชดัด สวน
สมุนไพรไทยบางชนิด เชน กระเบา ขอย ทองพันชั่ง

พญาสัตบรรณ สะบาลิง เหงือกปลาหมอดอกขาว และ
เหงือกปลาหมอดอกมวง เชื่อวารักษามะเร็งบางชนิดได
แตยังไมไดมีการพิสูจน ในจํานวนสมุนไพรที่กลาว
ขางตน มีบางชนิดเทานั้นที่ทราบสารประกอบจําเพาะ
ในการออกฤทธิ์ตานเซลลมะเร็ง เชน สารประกอบ
Vincristin และ Vinblastin ที่สกัดไดจากแพงพวยฝรั่ง
สามารถยับยั้งการแบงตัวของเซลลมะเร็งได เพราะสาร
ดังกลาวสามารถจับกับ tubulin ซึ่งเปนองคประกอบ
ของ microtubules ในระยะ metaphase ของเซลลที่
กําลังแบงตัว อยางไรก็ตามยังไมมีการตรวจสอบวา
สมุนไพรดังกลาว มีสารธรรมชาติที่มีสมบัติเปน
HDAC inhibitor หรือไมแตอยางใด
จากความหลากหลายทางชีวภาพของพืชสมุนไพร
ในประเทศไทย จึงไดมีการศึกษาและสํารวจหาสาร
ธรรมชาติที่มีคุณสมบัติเปน HDAC inhibitor จากพืช
สมุนไพรหลากหลายชนิดในประเทศไทย (Senawong
et al., 2005) ซึ่งงานวิจัยดังกลาวไดใชวิธี HDAC
Fluorescent Activity Assay ในการทดสอบคัด
เบื้องแรก เพื่อสํารวจหาสมุนไพรที่มีสารยับยั้งการ
ทํางานของเอนไซมฮิสโทนดีอะเซทิลเลส โดยพบวา
สารสกัดหยาบ (crude extract) ของสมุนไพรดวยเอทา
นอลจากรากหัวรอยรู (Hydnophytum formicarum
Jack) เปลือกตนขันทองพยาบาท (Suregada multiflora
Baill) และตนผักคราดหัวแหวน (Spilanthes acmella
Murr.) สามารถยับยั้งการทํางานของเอนไซมฮิสโทน
ดีอะเซทิลเลสได
ดังนั้นในโครงการวิจัยครั้งนี้ จึงมุงเนนที่จะ
ทําการศึกษาความเปนพิษของสารสกัดจาก ราก
หัวรอยรู (Hydnophytum formicarum Jack) เปลือกตน
ขันทองพยาบาท (Suregada multiflora Baill) และตน
ผักคราดหัวแหวน (Spilanthes acmella Murr.) ตอ
เซลลมะเร็งชนิดตางๆ เพื่อเปนขอมูลที่จะนําไปสู
การศึกษาแยกบริสุทธิ์ ศึกษาโครงสรางทางเคมีของ
สารธรรมชาติที่มีสมบัติเปน HDAC inhibitor จาก
สมุนไพรดังกลาว อันจะนําไปสูการคนพบยารักษา
โรคมะเร็งตัวใหม ซึ่งอาจเปนทางเลือกหนึ่งสําหรับคน
111
SDP1-3
ไทย ในการลดคาใชจายเพื่อซื้อยารักษาโรคมะเร็งที่มี
ราคาแพงจากตางประเทศ
วัตถุประสงคของงานวิจัย
ศึกษาความเปนพิษ (cytotoxicity) ของสารสกัด
จากพืชสมุนไพร ซึ่งมีสารธรรมชาติที่มีสมบัติเปน
HDAC inhibitor ตอเซลลมะเร็งชนิดตางๆ และเซลลที่
ไมใชเซลลมะเร็ง
วิธีการวิจัย
เตรียมตัวอยางพืชสมุนไพร
เก็บรวบรวมพืชสมุนไพร ตนผักคราดหัวแหวน
และเปลือกตนขันทองพยาบาท จากสวนสมุนไพรสิรี
รุกขชาติ มหาวิทยาลัยมหิดล จังหวัดนครปฐม สวน
รากหัวรอยรู ซื้อจากรานขายสมุนไพรในจังหวัด
ขอนแกน
การเตรียมสารสกัด crude extract ของสมุนไพร
ดวย 95% เอทานอล
ลางสมุนไพรดวยน้ําสะอาด หั่นเปนชิ้นเล็กๆ แลว
ตากลมใหแหง หรืออบใหแหงในตูอบที่ 50oC บด
สมุนไพรที่แหงแลวใหละเอียด นําสมุนไพรที่บดแลว
มา 5 กรัม ผสมกับเอทานอล 30 มิลลิลิตร ทิ้งไวที่
อุณหภูมิหองและกวนเปนระยะๆ เปนเวลา 2 วัน กรอง
สารละลายดวยกระดาษกรองเบอร 4 ถายังเห็นตะกอน
นําไปปนที่ 3000 rpm เปนเวลา 15 นาที นําสวน
สารละลายใสไประเหยเอทานอลออกจนหมด เก็บสาร
สกัดที่ไดไวที่ -20oC จนกวาจะนําไปทําการทดสอบ
ตอไป
การทดสอบความสามารถ ของสารสกัดจากพืช
สมุนไพร ในการยับยั้งการทํางานของเอนไซมฮิสโทน
ดีอะเซทิลเลส
ในการทดสอบการทํางานของเอนไซม ฮิสโทน
ดีอะเซทิลเลส ใชวิธี HDAC fluorescence activity
assay โดยชุดน้ํายาทดสอบ BIOMOL’S HDAC
fluorescence activity assay/Drug Discovery Kit

ละลายสารสกัดจากพืชสมุนไพรดวย DMSO ให
ไดความเขมขน 40 ไมโครกรัมตอไมโครลิตร จากนั้น
ผสมสารสกัดจากพืชสมุนไพร 200 ไมโครกรัม กับ
สารละลายของเอนไซม HDAC (Hela nuclear extract
= source of HDAC enzyme) แลวบม (incubate) ที่
อุณหภูมิ 37oC เปนเวลา 5 นาที จากนั้นเติมซับสเตรต
(Fluor de Lys Substrate) โดยใหความเขมขนของซับส
เตรตเปน 250 ไมโครโมลาร (μM) ตอปฏิกิริยา แลว
incubate ที่อุณหภูมิ 37°C เปนเวลา 15 นาที จากนั้น
เติม Developer (Fluor de Lys Developer) incubate ตอ
ที่อุณหภูมิหอง (22-25°C) เปนเวลา 10 นาที แลววัด
ปริมาณผลิตภัณฑ (product) ซึง่ เปนสาร Fluorophore
ที่เกิดขึ้น โดยใชเครื่อง Fluorescent Plate Reader
(Fluoroskan II, MTX Lab Systems, Inc) ที่
excitation/emission ความยาวคลื่นเทากับ 360 nm/460
nm โดยชุดควบคุม สําหรับการทดสอบนี้ ไดแก
Trichostatin A (TSA) ซึ่งเปน purified HDAC
inhibitor เปน positive control (ความเขมขนที่ใชคือ
0.5 ไมโครโมลารตอปฏิกิริยา) และ DMSO ที่ใชเปน
ตัวทําละลายสารสกัดสมุนไพร เปน negative control
เรียกการทดสอนี้วา HDAC inhibition test
การตรวจสอบยืนยันผลการยับยั้งการทํางานของ
เอนไซมฮิสโทนดีอะเซทิลเลส (Interference Test)
ในการทํา Interference test จะทําการทดสอบการ
รบกวนปฏิกิริยาในขั้นตอน Developing step โดยใช
deacetylated standard ซึ่งมีในชุดน้ํายาทดสอบ (Kit)
ใหเปนเสมือนผลิตภัณฑ (deacetylated form) ที่ไดจาก
ขั้นตอนแรกของปฏิกิริยา โดยใชปริมาณของ
deacetylated standard ที่เมื่อทําปฏิกิริยากับ developer
แลวใหคา Fluorescent Reading เทากับหรือใกลเคียง
กับคา Fluorescent Reading ที่ไดจาก HDAC Inhibition
Test ในสภาวะที่ไมมี HDAC inhibitor โดย
deacetylated standard จะทําปฏิกิริยากับ developer
และไดสาร Fluorophore เกิดขึ้น ซึ่งถาตัวอยางที่ใช
ทดสอบมีสารบางชนิดที่สามารถรบกวนปฏิกิริยาการ
112
SDP1-4
ทดสอบขั้นตอน Developing step คา Fluorescent
Reading ที่ไดจะต่ําลง แตถาไมมีสารรบกวนการ
ตรวจวัดในขั้นตอนนี้ คา Fluorescent Reading ที่ไดจะ
เทากับหรือใกลเคียงกับคา Fluorescent Reading ที่ได
จาก HDAC Inhibition Test ในสภาวะที่ไมมี HDAC
inhibitor
ผลการยับยั้งการทํางานของเอนไซม HDAC
รายงานเปนรอยละของการยับยั้งการทํางาน ของ
เอนไซม HDAC (%HDAC Inhibition) ซึ่งสามารถ
คํานวณไดจากสวนตางของคา RFU (Relative
Fluorescence Unit) จาก HDAC inhibition test และ
Interference test ซึ่งคา % HDAC Inhibition จะ
สะทอนผลการยับยั้งการทํางานของเอนไซม HDAC
นั่นเอง
% HDAC inhibition = [RFU1- RFU2] x 100
RFU1
RFU1 = RFU (Interference test)
RFU2 = RFU (HDAC inhibition test)
การทดสอบความเปนพิษ ตอเซลลที่ไมใช
เซลลมะเร็งของสารสกัดสมุนไพรดวยวิธี LDH
Cytotoxicity Assay (BioVision)
เซลลมะเร็งที่ใชทดสอบในการวิจัยครั้งนี้คือ เซลล
มะเร็งลําไส (HCT116 cells) เซลลมะเร็งปากมดลูก
(Hela cells) เซลลมะเร็งเม็ดเลือดขาว (Jurkat cells)
เซลลมะเร็งเตานม (MCF7 cells) สวนเซลลที่ไมใช
เซลลมะเร็งคือ เซลลไฟโบบลาสต (NIH3T3) และ
Human embryonic kidney cell (HEK293)
เลี้ยงเซลลมะเร็งและเซลลที่ไมใชเซลลมะเร็งใน 96
well plate ดวย RPMI medium ที่มี 10% Fetal Bovine
Serum (FBS), 100 U/mL penicillin และ 100 μg/mL
streptomycin ที่อุณหภูมิ 37o C และ 5% CO2 ซึ่ง
ปริมาณเซลลเริ่มตนที่ใชเทากับ 2 x 104 cell / 100 μL
เลี้ยงเซลลเปนเวลา 24 ชั่วโมง เติม 1 μl ของสารสกัด
สมุนไพร (crude extract) ที่ความเขมขนตาง ๆ โดยใช

เอธานอลเปนตัวทําละลายและใหมีปริมาณเอธานอล
ในแตละ well ไมเกิน 0.5% (v/v) สําหรับ low control
เติมเฉพาะเอธานอลใหไดความเขมขน 0.5% (v/v)
สวน high control เติม Lysis buffer ที่มี Triton X-100
ความเขมขน 1% ตอ well จากนั้น incubate ที่อุณหภูมิ
37o C และ 5% CO2 เปนเวลา 24 ชั่วโมง ปเปต medium
ใสลงใน microtube แลวนําไปปนที่ 7,000 rpm เปน
เวลา 5 นาที ปเปตสวน supernatant มา 10 μl ใสลงใน
96 well plate ชุดใหม เติม 100 μl ของ LDH reaction
mix ลงในแตละ well โดยระวังอยาใหเกิดฟอง จากนั้น
incubate ที่อุณหภูมิหอง เปนเวลา 30 นาที แลววัดคา
การดูดกลืนแสงที่ 490 nm
คํานวณ % Cytotoxicity ไดดังนี้
SDP1-5
ความสามารถในการยับยั้งการทํางานของเอนไซม คือ
200 ไมโครกรัมตอปฏิกิริยา โดยผลการยับยั้งการ
ทํางานของเอนไซม HDAC ดวยสารสกัด crude
extracts ของรากหัวรอยรู เปลือกตนขันทองพยาบาท
และ ตนผักคราดหัวแหวน ดังแสดงในรูปที่1 โดย
พบวา สารสกัดดวยเอทานอลที่ไดจากรากหัวรอยรู
เปลือกตนขันทองพยาบาท และตนผักคราดหัวแหวน
มีความสามารถที่จะยับยั้งการทํางานของเอนไซม ฮิส
โทนดีอะเซทิลเลสได โดยใหคาเปอรเซ็นตการยับยั้ง
การทํางานของเอนไซมออกมาเทากับ 63.66%,
36.78% และ 31.59% ตามลําดับ ซึ่งสอดคลองกับ
รายงานที่ผานมาของ Senawong, et al., 2005
110
HDAC inhibiton test
Interference test
100

Cytotoxicity (%) = (Test sample)–(Low control)X100 90

80

(High control) – (Low control) 70

RFU

60

50

40

ผลการวิจัยและการอภิปรายผล
30

20

ผลการตรวจสอบยืนยันความสามารถของสารสกัด
10

0
DMSO
CONTROL

TSA

ขันทองพยาบาท
หัวรอยรู

สมุนไพร ในการยับยั้งการทํางานของเอนไซมฮิสโทน
ดีอะเซทิลเลส ดวยวิธี Fluorometric HDAC Activity
Assay
จากงานวิจัยที่ผานมาพบวาสารสกัด crude extract
ของรากหัวรอยรู (Hydnophytum formicarum Jack.)
เปลือกตนขันทองพยาบาท (Suregada multiflorum
Baill.) และ ตนผักคราดหัวแหวน (Spilanthes acmella
Murr.) สามารถยับยั้งการทํางานของเอนไซมฮิสโทน
ดีอะเซทิลเลส โดยใหผล % HDAC inhibition เปน
50.50%, 40.00% และ 34.10% ตามลําดับ (Senawong,
et al., 2005; 31th Congress on Science and
Technology of Thailand) ดังนั้นในงานวิจัยนี้จึงไดนํา
สารสกัด crude extract ของสมุนไพรทั้งสามชนิดมา
ตรวจสอบยืนยันอีกครั้งวาสารสกัดสมุนไพรดังกลาวมี
สารธรรมชาติ ที่มีสมบัติเปน HDAC inhibitor ปริมาณ
สารสกัด crude extract ที่ใชในการทดสอบ
ผักคราดหัวแหวน
HDAC 0 13.17 70.22 63.66 36.78 31.59
Inhibition (%)
รูปที่ 1 ผลการยับยั้งปฏิกิริยาการทํางานของเอนไซม
Histone Deacetylase (HDAC) ดวยสารสกัด Crude
extract ของสมุนไพรหัวรอยรู ขันทองพยาบาท และผัก
คราดหัวแหวน (DMSO= ตัวทําละลายสารสกัด
สมุนไพร (negative control), TSA= HDAC inhibitor
(positive control), RFU = Relative Fluorescence Unit)
ผลการทดสอบความเปนพิษของสารสกัด crude
extract ของสมุนไพรหัวรอยรู ขันทองพยาบาท และ
ผักคราดหัวแหวน ตอเซลลมะเร็งและเซลลที่ไมใช
เซลลมะเร็งดวยวิธี LDH Cytotoxicity Assay

113
 SDP1-6
การทดสอบความเปนพิษ ของสารสกัดตอทั้ง pathway ของการตายแบบ apoptosis ซึ่งจะไดทําการ
เซลลมะเร็งและเซลลที่ไมใชมะเร็ง ตามวิธีที่อธิบายไว ทดสอบตอไป
ในวิธีทดลอง ผลการทดสอบในเบื้องตนตามรูปที่ 2 ใน
งานวิจัยครั้งนี้ เปนผลจากการทดลองที่ incubate สาร A 10090
HCT116

หัวรอยรู Hela
สกัดกับเซลลตางๆ เปนเวลา 24 ชั่วโมง (Exposure 80
70
MCF-7

% Cytotoxicity
Jurkat
time = 24 ชั่วโมง) สารสกัดสมุนไพรความเขมขน 60
50 HEK293
40
ตางๆ ละลายดวย 50% เอทานอล โดยใหมีปริมาณเอทา 30
20
NIH3T3

10
นอลในแตละ well ไมเกิน 0.5% (v/v) 0
-10
จากผลการทดลองในรูปที่2 พบวาที่ exposure time -20
-30
700 1000 1400 2000 μg/ml
เทากับ 24 ชั่วโมง สารสกัดหัวรอยรูมีความเปนพิษตอ B100
เซลลมะเร็งปากมดลูก (Hela cells) และเซลลมะเร็งเม็ด 90 ขันทองพยาบาท HCT116

80 Hela
เลือดขาว (Jurkat cells) มากกวาเซลลมะเร็งชนิดอื่นที่ 70 MCF-7

ใชทดสอบ และพบวาสารสกัดขันทองพยาบาทมีความ % Cytotoxicity

60 Jurkat
50 HEK293
เปนพิษตอเซลลมะเร็งปากมดลูก (Hela cells) มากกวา 40 NIH3T3
30
เซลลมะเร็งชนิดอื่นที่ใชทดสอบ สวนสารสกัดผัก 20
10
คราดหัวแหวน คอนขางมีความเปนพิษนอยตอ 0

เซลลมะเร็งทุกชนิดที่ใชทดสอบ -10
-20
62.5 125 250 500 μg/ml
นอกจากนี้พบวา สารสกัดสมุนไพรขันทอง
C100
พยาบาท และผักคราดหัวแหวน มีความเปนพิษนอย 90 ผักคราดหัวแหวน HCT116
ตอเซลลที่ไมใชเซลลมะเร็ง ทั้ง HEK293 cells และ 80
70 Hela
60
% Cytotoxicity

NIH3T3 cells (รูปที่ 2b, 2c) แตพบวาสารสกัดหัวรอยรู 50 MCF-7

40
คอนขางมีความเปนพิษตอ NIH3T3 cells (รูปที่ 2A) 30
20
Jurkat
10 HEK293
HDAC inhibitor เปนกลุมของสารประกอบที่มี 0
-10 NIH3T3
โครงสรางหลากหลาย งานวิจัยที่ผานมาพบวา HDAC -20
-30
-40
inhibitor บางตัวเชน Trichostatin A (TSA) และ -50 400 700 1000 1500 μg/ml
Valproic acid (VPA) สามารถเหนี่ยวนําใหเซลลมะเร็ง
เกิดการตายแบบ apoptosis ได (Richon, et al., 2002)
รูปที่ 2 ผลความเปนพิษ (Cytotoxicity) ของสารสกัด
และจากการตรวจสอบสารประกอบดวยเอทานอล ของ
(ethanolic crude extract) สมุนไพรหัวรอยรู (A)
พืชสมุนไพรไทยทั้งสามชนิดพบวา ใน crude extract มี
ขันทองพยาบาท (B) และผักคราดหัวแหวน (C) ตอ
ความสามารถที่จะยับยั้งการทํางานของเอนไซมฮิสโท-
เซลลมะเร็งลําไส (HCT116 cell) เซลลมะเร็งปาก
นดีอะเซทิลเลส (รูปที่ 1) ดังนั้นสารสกัดที่ไดจากพืช
มดลูก (Hela cells) เซลลมะเร็งเตานม (MCF-7 cells)
สมุนไพร นาจะมีสารธรรมชาติบางตัวที่มีคุณสมบัติ
เซลลมะเร็งเม็ดเลือดขาว (Jurkat cells) เซลล Human
เปน HDAC inhibitor ที่มีความเปนพิษตอเซลลมะเร็ง
Embryonic Kidney (HEK293 cells) และ เซลล mouse
(รูปที่ 2) โดยผูทําการวิจัยคาดวา สารสกัดที่ไดจากพืช
fibroblast (NIH3T3 cells) ที่ความเขมขน (μg/ml) ของ
สมุนไพรนี้ มีความสามารถที่จะเหนี่ยวนําให
สารสกัดตางๆ และ exposure time = 24 ชั่วโมง
เซลลมะเร็งเกิดการตายของเซลลผานทาง Extrinsic

114

สรุปผลการวิจยั
สารสกัดดวยเอทานอลที่ความเขมขน 200
ไมโครกรัมตอปฏิกิริยา ของสมุนไพรไทยทั้งสามชนิด
คือ รากหัวรอยรู เปลือกตนขันทองพยาบาท และตนผัก
คราดหัวแหวน มีคุณสมบัติเปนตัวยับยั้งการทํางาน
ของเอนไซมฮิสโทนดีอะเซทิลเลส โดยพบวาใหคา
เปอรเซ็นตการยับยั้งการทํางาน ของเอนไซมเทากับ
63.66 36.78 และ 27.98 % ตามลําดับ
สารสกัดดวยเอทานอล จากรากหัวรอยรูมีความ
เปนพิษตอเซลลมะเร็งปากมดลูก (Hela cells) และ
เซลลมะเร็งเม็ดเลือดขาว (Jurkat cells) ในขณะที่สาร
สกัดจากเปลือกตนขันทองพยาบาท มีความเปนพิษตอ
เซลลมะเร็งปากมดลูก (Hela cells) มากกวาเซลลมะเร็ง
ชนิดอื่นที่ใชทดสอบ สวนสารสกัดผักคราดหัวแหวน
คอนขางมีความเปนพิษนอย ตอเซลลมะเร็งทุกชนิดที่
ใชทดสอบ นอกจากนี้พบวาสารสกัดสมุนไพร
ขันทองพยาบาท และผักคราดหัวแหวนมีความเปนพิษ
นอยตอเซลลที่ไมใชเซลลมะเร็ง ทั้ง HEK293 cells
และ NIH3T3 cells แตพบวาสารสกัดหัวรอยรูคอนขาง
มีความเปนพิษตอ NIH3T3 cells
ขอเสนอแนะ
จากการทดสอบความเปนพิษ ของสารสกัดตอทั้ง
เซลลมะเร็งและเซลลที่ไมใชมะเร็ง ตามวิธีที่อธิบายไว
ในวิธีทดลอง ผลการทดสอบในเบื้องตนเปนผลจาก
การทดลองที่ incubate สารสกัดกับเซลลตางๆ เปน
เวลา 24 ชั่วโมง อยางไรก็ตาม ผูวิจัยยังไมสามารถ
สรุปผลการทดลองไดชัดเจนมากกวานี้ เพราะยังตอง
ทําการทดลองที่เวลาเทากับ 48 ชั่วโมง และ 72 ชั่วโมง
กอน ซึ่งคาดวาจะสามารถหาคา IC50 ไดชัดเจนขึ้น
กิตติกรรมประกาศ
1. งานวิจัยนี้ไดรับการสนับสนุนจาก โครงการ
ทุนสนับสนุนนักวิจัยใหม (วท.) ศูนยประสานงาน
นักเรียนทุนรัฐบาลทางดานวิทยาศาสตร และ
เทคโนโลยี สํานักงานพัฒนาวิทยาศาสตรและ
เทคโนโลยีแหงชาติ กระทรวงวิทยาศาสตร
115
SDP1-7
2. สวนสมุนไพรสิรีรุกขชาติ มหาวิทยาลัย
มหิดล จังหวัดนครปฐม ที่อนุเคราะหตัวอยางพืช
สมุนไพร
เอกสารอางอิง
สํานักนโยบายและแผนยุทธศาสตร กระทรวง
สาธารณสุข 2551. จํานวนและอัตราการตายตอ
ประชากร 100,000 คนตามลําดับของกลุมสาเหตุ
การตาย 10 กลุมแรก พ.ศ. 2545 – 2549.
Brosch, G., Ransom, R., Lechner, T., Walton, D. and
Loidl, P. 1995. Inhibition of Maize Histone
Deacetylases by HC Toxin, the Host-Selective
Toxin of Cochilobolus carbonum. Plant Cell. 7;
1941-1950.
Butler, L. M., Agus, D. B., Scher, H. I., Higgins, B.,
Rose, A., Cordon-Cardo, C., Thaler, H. T.,
Rifkind, R. A., Mark, P. A. and Richon, V.
2000. Suberoylanilide Hydroxamic Acid, an
Inhibitor of Histone Deacetylase, Suppresses the
Growth of Prostate Cancer Cells In Vitro and In
Vivo. Cancer Research. 60; 5165-70.
Darkin-Rattray, S. J., Gurnett, A. M., Myers, R. W.,
Dulski, P. M., Crumley, T. M., Allocco, J. J.,
Cannova, C., Meinke, P. T., Colletti, S. L.,
Bednarek, M. A., Singh, S. B., Goetz, M. A.,
Dombrowski, A. W., Polishook, J. D. and
Schmatz, D M. 1996. Apicidin: a novel
antiprotozoal agent that inhibits parasite histone
deacetylase. Proceedings of National Academic
Science USA. 93; 13143-13147.
Kelly, W. K., Richon, V. M., O’Conner, O, Curley,
T., MacGregor-Curtelli, B., Tong, W., Klang,
M., Schwartz, L., Richardson, S., Rosa, E.,
Drobnjak, M., Cordon-Cordo, C. Chiao, J. H.,
Rifkind, R., Marks, P. A. and Scher, H. 2003.
Phase I clinical trial of histone deacetylase

inhibitor: suberoylanilide hydroxamic acid
administered intravenously. Clin. Cancer Res. 9;
3578-3588.
Kijima, M., Yoshida, M., Suita, K., Horinouchi, S.
and Beppu, T. 1993. Trapoxin, an antitumor
cyclic tetrapeptide, is an irreversible inhibitor of
mammalian histone deacetylase. Journal of
Biological Chemistry. 268; 22429-22435.
Kwon, H. J., Owa, T., Hassig, C. A., Shimada, J. and
Schreiber, S. L. 1997. Depudecin Induces
Morphological Reversion of Transformed
Fibroblasts via the Inhibition of Histone
Deacetylase. Proceedings of National Academic
Science USA. 95; 1356-61.
Lindemann, R. K., Gabrielli, B. and Johnstone, R. W.
2004. Histone-deacetylase inhibitors for the
treatment of cancer. Cell Cycle. 3; 779-788.
Maeda, T., Nagaoka, Y., Kuwajima, H., Seno, C.,
Maryyama, S., Kurotaki, M. and Uesato, S.
2004. Potent Histone Deacetylase Inhibitors: N-
hydroxybenzamides with Anti-tumor Activities.
Bioorganic & Medicinal Chemistry. 12; 4351-
60.
Mark, P. A., Richon, V. and Rifkind, R. A. 2000.
Histone Deacetylase Inhibitors: Inducers of
Differentiation or Apoptosis of Transfomed
cells. Journal of the National Cancer Institute.
92(15); 1210-16.
Mclaughlin, F. and La Thangue, N. B. 2004. Histone
Deacetylase Inhibitors Open New Doors in
Cancer Therapy. Biochemical Pharmacology.
68; 1139-44.
Newmark, H. L., Lupton, J. R. and Young, C. W.
1997. Butyrate as a Differentiating Agent:
Pharmacokinetics, Analogues and Current
Status. Cancer Lett. 78; 1-5.
116
SDP1-8
Richon, V. M. and O’Brien, O. P. 2002. Clin.
Cancer Res. 8; 662–664.
Russo, A., Cardile, V., Lombardo, L., Vanella, L.,
Vanella, A. and Garbarino, J. A., 2005.
Antioxidant activity and antiproliferative action
of methanolic extract of Geum quellyon Sweet
roots in human tumor cell lines. Journal of
Ethnopharmacology 100; 323-332.
Saito, A., Yamashita, T., Mariko, Y., Nosaka, Y.,
Tsuchiya, K., Ando, T., Suzuki, T., Tsuruo, T.
and Nakanishi, O. 1999. A synthetic Inhibitor of
Histone Deacetylase, MS-27-275, with Marked
In Vivo Anti-tumor Activity against Human
Tumors. Proceedings of National Academic
Science USA. 96; 4592-97.
Senawong, T., Pongthaisong, S. Chungjatupornchai,
W., Nuchdomrong, S. and Swatsitang, P. 2005.
Screening for Histone Deacetylase Inhibitors
from Medicinal Plant Extracts. 31st Congress on
Science and Technology of Thailand (Poster
prsentation), Technopolis, Suranaree University
of Technology, Nakhon Ratchasima, Thailand,
October 18-20, 2005.
Warrell, R. P., He, L. Z., Richon, V., Calleja, E. and
Pandolf, P. P. 1998. Therapeutic Targeting of
Transcription in Acute Promyeolocytic
Leukemia by Use of an Inhibitor of Histone
Deacetylase. Journal of the Nation Cancer
Institute. 90(21); 1621-25.