Professional Documents
Culture Documents
เทคโนโลยีชีวภาพทางเภสัชศาสตร์ 1
ผศ.ดร.ภญ.สุนทรา เอกอนันต์กลุ
ภาคการศึกษาที่ 1/2564
Recombinant protein production and purification
วัตถุประสงค์การเรียนรู้: นักศึกษาสามารถอธิบาย
1. คุณสมบัติพื้นฐานของรีคอมบิแนนท์โปรตีน 3. ความแตกต่างระหว่าง upstream และ downstream process
2. กระบวนการผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีน
บทนำ I คำนิยามของยาชีววัตถุ (Biological product definition) และประเภทของ
ตั ้ ง แต่ ม ี ก ารคิ ด ค้ น เทคนิ ค รี ค อมบิ แ นนท์ ด ี เ อ็ น เอ (recombinant DNA ยาชีววัตถุ
technology, rDNA) ตั้งแต่ปี ค.ศ. 1973 โดย Stanley Cohen และ Herbert Boyer องค์กรที่เกี่ยวข้องกับการกำกับดู แลและเรื่องการขึ้นทะเบียนยาในโลกนี้มี
และมี ช ี ว เภสั ช ภั ณ ฑ์ ว ั ต ถุ ต ั ว แรกคื อ recombinant human insulin โดยบริ ษั ท หลายองค์ ก ร โดยที ่ U.S. Food and Drug Administration (U.S. FDA) และ
Genentech พัฒนาขึ้นและบริษัท Eli Lilly เป็นบริษัทที่ผลิต ในระดับอุตสาหกรรม European Medicines Agency (EMA) เป็น 2 องค์กรที่มีความน่าเชื่อถือและมีการ
และจำหน่าย โดยยานี้ได้รับการรับรองจาก U.S. FDA ในปี ค.ศ. 1983 กำหนดมาตรฐานต่าง ๆ ที่เกี่ยวกับการผลิต คุณภาพยา และเป็นองค์กรที่เป็นยอมรับ
ทั่ว โลก รวมถึงองค์การอนามัยโลก (World Health Organization, WHO) แม้ว่า
ปัจจุบันมีชีวเภสัชภัณฑ์คือยาชีววัตถุที่ผลิตโดยใช้เทคนิครีคอมบิแนนท์ดีเอ็น
WHO จะไม่ได้ทำหน้าที่เกี่ยวข้องกับการขึ้นทะเบียนยาโดยตรงก็ตาม
เอจำนวนมากขึ้นเรื่อย ๆ ในปี ค.ศ. 2020 จำนวนยาใหม่ที่ได้รับการรับรองการขึ้น
ทะเบียนยาจาก U.S. FDA ทั้งหมด 53 รายการ โดยแบ่งเป็นยาเคมี 40 รายการและ สำหรั บ ประเทศไทย หน่ ว ยงานที ่ ท ำหน้ า ที ่ ส ำคั ญ นี ้ ค ื อ สำนั ก งาน
ยาชีววัตถุ 13 รายการ เอกสารนี้จะครอบคลุมเรื่องคำนิยามของยาชีววัตถุ ประเภท คณะกรรมการอาหารและยา (อย.) โดยทั้ง 4 หน่วยงานนี้ได้กำหนดคำนิยามของ
ของยาชีววัตถุ คุณสมบัติพื้นฐานของรีคอมบิแนนท์โปรตีน กระบวนการผลิตรีคอม ยาชีววัตถุไว้ที่อาจจะดูแตกต่างกัน แต่โดยสาระสำคัญนั้นมีความเหมือนกันคือ ยาชีว
บิแนนท์โปรตีนทั้งส่วนของกระบวนการ upstream และ downstream วัตถุคือยาที่ผลิตได้จากสิ่งมีชีวิต รายละเอียดของคำนิยามแสดงในตารางที่ 1
1
ตารางที่ 1 คำนิยามของยาชีววัตถุ
องค์กร Term คำนิยาม
EMA Biological medicinal product “a substance that is produced by or extracted from a biological source & that needs for its characterization and the determination
of its quality a combination of physico-chemical-biological testing, together with the production process and its control”
FDA Biological product ‘‘a virus, therapeutic serum, toxin, antitoxin, vaccine, blood, blood component or derivative, allergenic product, protein (except
any chemically synthesized polypeptide), or analogous product, or arsphenamine or derivative of arsphenamine (or any other
trivalent organic arsenic compound), applicable to the prevention, treatment, or cure of a disease or condition of human beings’’
WHO Biological products “defined as substances of biological origin that are assayed by biological tests and used in the prophylaxis, therapy or diagnosis
of human diseases”
อย. ยาชีววัตถุ (Biological products) ยาแผนปัจจุบันซึ่งผลิตจากสิ่งมีชีวิต โดยกระบวนการเพาะเลี้ยงจุลินทรีย์หรือเซลล์ชั้นสูง (eukaryotic cells) การสกัดสารจากเนื้อเยื่อสิ่งมีชีวิตทั้งมนุษย์
สัตว์ และ พืช (extraction of substances from biological tissues including human, animal, and plant tissues (allergens)) เทคนิคดีเอ็นเอ
สายผสม (rDNA techniques) เทคนิคการผสมต่างพันธุ์ (hybridoma technique) การขยายพันธุ์จุลินทรีย์ในตัวอ่อนหรือในสัตว์ (propagation of
microorganisms in embryo or animals) การสกัดหรือแยกจากเลือดและพลาสมา (derived from blood and plasma) หรือ กระบวนการอื่นที่
รัฐมนตรีกำหนดเพิ่มเติมโดยประกาศในราชกิจจานุเบกษา
2
II ความแตกต่างระหว่างชีวเภสัชภัณฑ์และยาเคมี และโครงสร้างพื้นฐานของยาโปรตีน
ชีวเภสัชภัณฑ์มีความแตกต่างจากยาเคมีในหลายด้าน ทั้งเรื่องของขนาดที่ใหญ่กว่า โครงสร้างยามีความซับซ้อนมากกว่า กระบวนการผลิตใช้เซลล์สิ่งมีชีวิตในการผลิตยา
ขณะที่ยาเคมีใช้วิธีการสังเคราะห์ การผลิตยาแต่ละครั้งอาจจะไม่ได้โมเลกุลของยาที่เหมือนกันทั้งหมด แต่จะมีความคล้ายกันมากกว่าจึง เรียกว่ายามีความเป็น heterogenous สูง
ในการตรวจสอบคุณลักษณะของยาใช้วิธีการวิเคราะห์หรือตรวจสอบที่ยุ่งยาก ซับซ้อนกว่าวิธีที่ใช้กับยาเคมี และตัวยาเองไม่ค่อยทนต่อสภาวะแวดล้อมได้ดีเท่ายาเคมี และยาอาจจะ
ทำให้กระตุ้นภูมิคุ้มกันของร่างกายได้มากกว่ายาเคมี ดังแสดงในตารางที่ 2
ตารางที่ 2 ความแตกต่างระหว่างชีวเภสัชภัณฑ์และยาเคมี
ยาเคมี ชีวเภสัชภัณฑ์
ตัวอย่าง Aspirin Monoclonal Ab
ขนาด (Size) Small (< 1,000 Da) Large (1,000-200,000 Da)
โครงสร้าง (Structure) Simple & well-defined Complex with many post translational modification (PTM)
การผลิต (Manufacturing) Predictable chemical process Using unique cell line
Complex biomanufacturing processes
Identical copy can be made Highly similar but not identical
การตรวจสอบคุณลักษณะของยา (Characterization) Easy to characterize Difficult to characterize due to a mixture of related molecules
ความคงตัว (Stability) Relatively stable Sensitive to storage and handling conditions
การกระตุ้นภูมิคุ้มกัน (Risk of immunogenicity) Low High
เนื่องจากยาชีววัตถุในกลุ่มของชีวเภสัชภัณฑ์เป็นยาที่ใช้รักษาโรคมากขึ้นเรื่อย ๆ ในหลายกลุ่มโรค เช่น เบาหวาน โลหิตจาง มะเร็ง ไขมั นในเลือดสูง เป็นต้น โดย
คุณลักษณะพื้นฐานของโมเลกุลของยากลุ่มนี้คือ โปรตีน โครงสร้างพื้นฐานหลักของโปรตีนคือ กรดอะมิโน กรดอะมิโนประกอบด้วยหมู่เอมีน (-NH2) หมู่คาร์บอกไซลิก (-COOH)
และหมู่ side chain หรือ เรียกว่า“R group” ที่แตกต่างกัน (รูปที่ 1)
3
5. กรดอะมิ โ นที่ ม ี ห มู่ aromatic: Phenylalanine (Phe, F), Tryptophan (Trp,
W) และ Tyrosine (Tyr, Y)
4
สาย จะเรียกว่า “parallel -pleated sheet” แต่ถ้าเรียงตัวในทิศทางตรงกัน
ข้ามเรียกว่า “anti-parallel -pleated sheet”
3. โครงสร้างระดับตติยภูมิ (Tertiary structure)
เกิดจากการม้วนพับของโครงสร้างระดับทุติยภูมิ เกิดเป็นโครงสร้าง 3 มิติที่มีความ
เสถียร และสามารถทำหน้าที่ของโปรตีนที่ มีฤทธิ์ทางชีวภาพ การม้วนพับของ
กรดอะมิโนที่มีหมู่ R ที่ไม่ชอบน้ำมักจะม้วนพับอยู่ด้านใน ขณะที่กรดอะมิโนที่มีหมู่
R ที่ชอบน้ำมักจะอยู่ด้านนอก อันตรกิริยาระหว่างหมู่ R ช่วยให้โครงสร้างระดับ
ตติยภูมิมีความเสถียร อันตรกิริยาที่เกิดขึ้นได้แก่ พันธะไดซัลไฟด์ระหว่างหมู่ –SH
ของ Cys, hydrophobic interactions มั ก เกิ ด ขึ ้ น กั บ หมู ่ R ที่ ไ ม่ ช อบน้ ำ และ
มักจะอยู่ด้านในโครงสร้างของโปรตีน พันธะไฮโดรเจนมักจะเกิดขึ้นกับกรดอะมิโน
Ser และ Thr มักเกิดที่บริเวณผิวด้านนอกของโปรตีน (surface of proteins)
พันธะไอออนิกมักเกิดระหว่างกรดอะมิโนที่มีความเป็นกรดและด่าง
4. โครงสร้างระดับจตุรภูมิ (Quaternary structure)
เป็นโครงสร้าง 3 มิติ ของโปรตีนหลายยูนิตมารวมกัน หรือหลายโมเลกุล มาจับ
ก ล ุ ่ ม ก ั น ด ้ ว ย พ ั น ธ ะ แ บ บ non-covalent (hydrogen bond, salt bridge, รูปที่ 2 โครงสร้างระดับต่าง ๆ ของโปรตีน
hydrophobic interaction, van der Waals interaction) เช่น hemoglobin รูปจาก https://en.wikipedia.org/wiki/Protein_structure
(accessed July 5, 2021).
5
III กระบวนการผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีน (Recombinant protein manufacturing processes)
การผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีนนั้นใช้ recombinant DNA technology โดยอาศัยสิ่งมีชีวิตขนาดเล็ก เช่น แบคทีเรีย เซลล์พืช หรือ เซลล์สัตว์ ทำหน้าที่เป็นโรงงานผลิตตัว
ยาสำคัญ (drug substance) ขั้นตอนหลักของการผลิตเริ่มตั้งแต่การโคลนนิ่งคือการนำเอายีนที่ต้องการใส่ไปในเวคเตอร์หรือพลาสมิด (plasmid) เพื่อนำเวคเตอร์นี้ไปใส่ในเซลล์เจ้า
บ้าน (host cells) ที่เหมาะสม และทำการเพาะเลี้ยงเพื่อเพิ่มจำนวนเซลล์เหล่านี้ ในถังปฏิกรณ์ชีวภาพ (bioreactor หรือ fermenter) ภายใต้สภาวะการเลี้ยงเซลล์ที่เหมาะสม
เพื่อให้เซลล์เจ้าบ้านผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีนปริมาณมาก ขั้นตอนตั้งแต่โคลนนิ่งจนถึงการเพาะเลี้ยงเซลล์เพื่อสร้างโปรตีนเรียกว่า “upstream process” กระบวนการหลังจาก
ที่เซลล์ทำการผลิตโปรตีนออกมาแล้ว คือการนำมาแยกสกัด ทำโปรตีนให้บริสุทธิ์ จนถึงการตั้งตำรับยา เรียกขั้นตอนเหล่านี้ว่า “downstream process” (รูปที่ 3)
รูปที่ 3 กระบวนการผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีน
ในกระบวนการผลิตมีปัจจัยสำคัญที่ต้องพิจารณาตั้งแต่การเลือกพลาสมิด การคัดเลือกเซลล์เจ้าบ้านที่เหมาะสมเพื่อจะได้นำส่งยีนที่ต้องการให้เข้าไปอยู่ในเซลล์เจ้าบ้าน
และทำให้เซลล์เจ้าบ้านมีการแสดงออกของยีน และแสดงออกของโปรตีน (protein expression)
6
Upstream process
หลักการเลือกพลาสมิดและเซลล์เจ้าบ้านเพื่อเตรียมเซลล์ที่เหมาะสมต่อการแสดงออกของโปรตีน
1. เซลล์เจ้าบ้านและพลาสมิดจะต้องเข้ากันได้ เซลล์เจ้าบ้านที่นิยมใช้ได้แก่ E.coli, yeasts และ mammalian cells (Hela cells, Chinese hamster ovary cells) เป็นต้น
2. พลาสมิดควรหาได้ง่าย (availability) และสามารถเพิ่มจำนวนใหม่ได้ (regeneration)
3. เซลล์เจ้าบ้านและพลาสมิดควรมีราคาสมเหตุสมผล
4. ประเด็นเรื่องการควบคุมดูแล ผลที่มีต่อสิ่งแวดล้อม และ เรื่องทรัพย์สินทางปัญญา (intellectual property)
5. ชนิดของโปรตีนที่ต้องการผลิตว่าเป็นไกลโคโปรตีน (glycoprotein) หรือ เป็นโปรตีนที่ไม่มีโมเลกุลของน้ำตาลมาเกาะ (non-glycoprotein)
ตัวอย่าง expression vector ที่นิยมใช้กับ E.coli
Expression vector ที่ใช้ในปัจจุบันมีหลายระบบมาก แต่ละระบบจะทำงาน 2. lacO หรือเรียกว่า lac operon เป็นตำแหน่งที่ inducer/ repressor จะมาจับ
แตกต่างกันขึ้นกับ promotor ของแต่ละระบบ ตัวอย่าง expression vector ที่ใช้ แล้วกระตุ้นหรือยับยั้งการเกิด transcription
กันอย่างแพร่หลายกับ E.coli คือ pET expression system 3. pLink หรือเรียกอีกอย่างว่า “multiple cloning site, MCS” เป็นดีเอ็นเอสาย
pET expression system เป็น vector ได้รับความนิยมระบบหนึ่งใช้สำหรับ สั ้ น ๆ ที ่ ป ระกอบไปด้ ว ย restriction sites หลายแบบที ่ ส ามารถตั ด ได้ ด ้ ว ย
การแสดงออกของโปรตีน องค์ป ระกอบหลักของ pET vector ประกอบด้ว ย T7 เอนไซม์ตัดจำเพาะ (restriction enzymes) หลายชนิด เป็นตำแหน่งที่ต้องการ
promoter, lacO, multiple cloning site, origin of replication, selectable แทรกยีนที่ต้องการลงไปในพลาสมิด
marker gene (ampR), lacI (รูปที่ 4) 4. f1 ori คือ origin of replication เป็นตำแหน่ง ที ่ท ำให้ เกิด replication ของ
1. PT7 คือตำแหน่ง promoter ซึง่ T7 RNA polymerase มาจับเพื่อทำให้เกิด DNA
กระบวนการ transcription 5. ampR คื อ ยี น ที ่ ด ื ้ อ ต่ อ ยา ampicillin (ampR resistant) ใช้ เ ป็ น ตั ว คั ด เลื อ ก
คัดเลือกเซลล์ที่มีพลาสมิดที่ต้องการ
6. lacI สร้าง lac repressor protein
7
ในสภาวะปกติ lacI จะสร้าง lac repressor protein มาจับที่ lac operon ทำให้ T7 RNA polymerase ไม่สามารถทำงานได้ ดังนั้นกระบวนการ transcription จึงไม่
เกิดขึ้น แต่ถ้ามีการเติมสารกระตุ้น (inducer) ที่นิยมคือ Isopropyl--D-thio-galactoside (IPTG) ซึ่งเป็น lactose analog เข้าไปในอาหารเลี้ยงเชื้อเพื่อที่ inducer จะไปแย่ง
lac repressor protein ในการจับที่ lac operon ทำให้ lac repressor protein หลุดออก T7 RNA polymerase จึงทำงานได้ทำให้เกิดการ transcribe ยีนที่ต้องการเพื่อสร้าง
โปรตีนต่อไป (รูปที่ 5)
นอกจาก pET expression system แล้วยังมีระบบอื่น ๆ อีก เช่น pQE, pGEX, pSVK3, pSVL ซึง่ แต่ละระบบอาจมี promoter ที่แตกต่างกัน ซึ่งในการกระตุ้นให้ระบบ
ทำงานก็จะใช้สารที่ทำหน้าที่กระตุ้นที่เหมาะสมกับระบบนั้น ๆ เช่น L-arabinose, tetracycline, tryptophan
8
แต่ข้อเสียหลักของการใช้ E.coli คือ E.coli เป็นเซลล์แบบ prokaryotes ไม่มีกระบวนการ post-translational modification จึงไม่เหมาะกับการผลิตพวก glycoproteins
โปรตีนที่ผลิตได้มักจะอยู่ภายในเซลล์หรืออยู่ใน inclusion bodies ซึ่งอาจจะทำให้โปรตีนม้วนพับได้ไม่เหมาะสม ดังนั้นในการทำให้บริสุทธิ์ต้องมีขั้นตอนที่ช่วยทำให้โปรตีนกลับมา
ม้วนพับได้อย่างเหมาะสมต่อไป นอกจาก E.coli แล้วยีสต์ก็เป็นเซลล์เจ้าบ้านที่นิยมใช้มากขึ้นในการผลิตยาเนื่องจากยีสต์สามารถเพาะเลี้ยงได้ง่าย เจริญเติบโตเร็ว และอาหารเลี้ยง
ยีสต์มีราคาไม่แพง แต่ในกรณีที่ต้องการผลิตไกลโคโปรตีน เช่น monoclonal antibodies, epoetins เซลล์ที่นิยมใช้ในการผลิตคือเซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม เช่น Chinese
hamster ovary cells (CHO cells), Hela cells เป็นต้น ดังนั้นในการเลือกเซลล์เจ้าบ้านเพื่อผลิตรีคอมบิแนนท์โปรตีนควรคำนึงถึงคุณลักษณะสำคัญของโปรตีนที่ต้องการก่อนว่า
มีคุณลักษณะสำคัญพื้นฐานเป็นอย่างไร เพื่อที่จะสามารถเลือกชนิดของเซลล์ให้เหมาะสมสำหรับการผลิตยา โดยปัจจัยที่มีผลต่อการเลือกเซลล์เจ้าบ้านแสดงในตารางที่ 3
ตารางที่ 3 ปัจจัยที่มีผลต่อการเลือกเซลล์เจ้าบ้านเพื่อการผลิตโปรตีน
ปัจจัย แบคทีเรีย ยีสต์ เซลล์สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม
Downstream process
หลังจากที่เซลล์ทำการผลิตโปรตีนออกมาแล้วนั้น ขั้นตอนต่อมาคือการแยก
เอาเซลล์ออกมาจากอาหารเลี้ยงเชื้อในกรณีที่ใช้ E.coli ในการผลิต หากใช้เซลล์ของ
สัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมในการผลิตก็ต้องทำการแยกเอาสารละลายของอาหารเลี้ยงเชื้อ
ออกจากเซลล์ เ นื ่ อ งจากยาที ่ ผ ลิ ต ได้ ป นอยู ่ ใ นอาหารเลี ้ ย งเชื ้ อ โดยมี ข ั ้ น ตอน
รายละเอียดต่าง ๆ ดังนี้ (รูปที่ 6)
1. การทำให้เ ซลล์แ ตก (cell disruption) วิธ ีการที่ทำให้เซลล์แตกมีห ลายวิธี
ได้แก่ การใช้แรงในการบดให้ผนังของเซลล์แบคทีเรียแตก หรืออาจใช้พลังงานเสียง
เรียกว่า “sonication” ทำให้เกิดการสั่นของอนุภาคต่าง ๆ จนเซลล์แตก หรือ ใช้
การเปลี่ยนความเข้มข้นของสารละลายที่อยู่รอบ ๆ เซลล์ เพื่อทำให้เซลล์เกิดการช็อค
และแตก หรือใช้สารเคมี เอนไซม์ ทำให้เซลล์แตกเพื่อให้โปรตีนที่อยู่ในเซลล์ออกมา
อยู่ในสารละลาย เป็นต้น
2. การแยก cell debris ออกจากสารละลายโปรตีน (clarification) ขั้นตอนนี้
คือ การแยกเอาชิ้นส่วนของเซลล์ออกจากสารละลายโปรตีน มีหลายวิธี เช่น การปั่น
เหวี่ยง (centrifugation) ซึ่งในระดับอุตสาหกรรมใช้เครื่องปั่นเหวี่ยงขนาดใหญ่ที่ รูปที่ 6 ขั้นตอนของ downstream process
เรียกว่า disc stack centrifuge หรือมีการใช้ กระบวนการกรอง (filtration) เพื่อ
9 10
การทำโปรตีนให้บริสุทธิ์โดยเทคนิคทางคอลัมน์โครมาโตกราฟี
โปรตีนสามารถทำให้บริสุทธิ์และอยู่ในรูปที่ออกฤทธิ์ได้ (active form) ได้
โดยใช้คุณลักษณะของโปรตีนเองในการแยกสกัดและทำให้บริสุทธิ์ เช่น คุณสมบัติใน
การละลาย (solubility), ขนาด (size), ประจุ (charge) และความชอบจั บ แบบ
เฉพาะเจาะจง (specific binding affinity) เทคนิคทางคอลัมน์โครมาโทกราฟีที่ใช้
บ่ อ ยในการทำให้ โ ปรตี น บริ ส ุ ท ธิ ์ ค ื อ affinity chromatography, gel-filtration
chromatography และ ion-exchange chromatography ซึ่งในการทำให้โปรตีน
บริสุทธิ์นั้นจะใช้คอลัมน์โครมาโตกราฟีหลาย ๆ ชนิดประกอบกัน ซึ่งมีคอลัมน์หลัก 3
คอลั ม น์ คื อ การทำให้ บ ริ ส ุ ท ธิ ์ เ บื ้ อ งต้ น เรี ย กว่ า capturing step ขั ้ น ตอน
intermediate purification และขั ้ น ตอนสุ ด ท้ า ยเรี ยกว่ า polishing โดยที ่ แต่ล ะ
ขั้นตอนจะเลือกใช้คอลัมน์โครมาโตกราฟีแบบไหนขึ้นกับคุณลักษณะของโปรตีน เช่น
รูปที่ 7 Affinity chromatography
1. Affinity chromatography เป็นเทคนิคที่มีประสิทธิภาพในการทำให้โปรตีน
บริสุทธิ์ โดยอาศัยคุณสมบัติของหมู่ฟังก์ชันบางหมู่ที่อยู่บนสายของเปปไทด์ หรือ 2. Gel filtration chromatography วิธีนี้มีชื่อเรียกอื่น เช่น gel permeation
โปรตี น ให้จ ับ กั บ stationary phase (รู ป ที ่ 7) เช่ น การผลิ ต โมโนโคลนอล หรือ size exclusion chromatography (SEC) โดยหลักการคือการแยกโปรตีน
แอนติบ อดีในขั้น ตอน capturing step จะใช้ affinity chromatography ที่มี ออกจากกันโดยอาศัยขนาดของโปรตีน โดย stationary phase จะเป็นเรซินที่มี
protein A resin เป็น stationary phase เนื่องจากส่วนของ Fc ของแอนติบอดี รู พ รุ น ซึ ่ ง อาจจะเป็ น dextran, agarose, polyacrylamide โดยโปรตี น ที ่ มี
สามารถจับกับ protein A ได้ ทำให้แยกแอนติบอดีออกจากโปรตีนอื่นที่ปนมาใน โมเลกุลขนาดใหญ่กว่ารูพรุนบนผิวของเรซินก็จะเคลื่อนที่ออกจากคอลัมน์ก่อน
สารละลายได้ นอกจากนี้แล้ วยังมี affinity resin อื่นอีก เช่น Ni-NTA affinity ขณะที่โปรตีนที่มีขนาดเล็กจะเข้าไปอยู่ในรูพรุนจะทำให้เคลื่อนที่ออกมาหรือถูก
chromatography ที่ใช้แยก His-tagged protein ชะออกมาจากคอลัมน์ได้ช้ากว่า (รูปที่ 8)
11
รูปที่ 8 Gel filtration chromatography
3. Ion-exchange chromatography เ ป ็ น เ ท ค น ิ ค ท ี ่ น ิ ย ม ใ ช ้ ท ั ้ ง ใ น ขั้ น รูปที่ 9 Ion exchange chromatography
intermediate และ polishing เพื่อทำหน้าที่ในการกำจัดสิ่งเจือปน (impurities) หลั ง จากการทำให้ บ ริ ส ุท ธิ์ โ ดยใช้ column chromatography แล้ ว ยั งมี
ต่าง ๆ ที่ปนมาในสารละลายโปรตีน อาศัยหลัก การแยกโปรตีนตามประจุสุทธิ (net ขั้นตอนการกรองที่เรียกว่า diafiltration และ ultrafiltration อีก ซึ่งความสำคัญของ
charge) เนื่องจากโครงสร้างของโปรตีนมีหมู่ฟังก์ชันหลายหมู่และโปรตีนจะมีประจุที่ 2 ขั้นตอนหลังนี้มีว ัตถุประสงค์เพื่อทำการเปลี่ยนสารละลายโปรตีนให้ไปอยู่ใน
แตกต่างไปภายใต้สภาวะความเป็นกรด-ด่างของสารละลายที่โปรตีนอยู่ เช่น ถ้าที่ pH สารละลายบัฟเฟอร์ที่เหมาะสม และทำการกรองให้สารละลายมีความบริสุทธิ์มาก
7 แล้วโปรตีนมีประจุเป็นบวก (+ve) โปรตีนนี้ก็สามารถแยกได้โดยใช้ resin ที่มีประจุ ยิ่งขึ้นโดยใช้แผ่นกรองหรือ filter ที่มีขนาดรูพรุนของการกรองที่เล็กมาก เช่น กรอง
ลบเรียกว่า cation exchange resin เช่น carboxymethyl (CM resin) มีหมู่ -COO- ไวรัสที่มีขนาดเล็กกว่า 0.1 micron เรียกว่า ultrafiltration เพื่อขจัดไวรัสให้ออกไป
, high S resin มีหมู่ -SO3- ขณะที่โปรตีนที่มีประจุลบจะไม่จับกับ resin แต่โปรตีน จากสารละลาย หรือกรองเพื่อทำให้ปราศจากเชื้อในขั้นตอนสุดท้ายโดยใช้ filter ที่มี
เหล่านั้นจะถูกชะออกจากคอลัมน์ก่อน สำหรับเรซินที่มีประจุบวกจะเรียกว่า anion ขนาดรูพรุน 0.22 micron เป็นต้น หลังจากที่ได้สารละลายโปรตีนที่เป็นตัวยาสำคัญ
exchange resin ได้ แ ก่ DEAE resin, high Q resin ซึ ่ ง เรซิ น เหล่ า นี ้ ก ็ จ ะจั บ กั บ ออกมาแล้วขั้นตอนต่อไปคือ การตรวจสอบคุณลักษณะทางเคมี กายภาพ และชีวภาพ
โปรตีนที่มีประจุเป็นลบ (รูปที่ 9) การเลือกใช้เรซินชนิดใดนั้นต้องพิจารณาจากค่า pI ของยา ซึ่งจะมีรายละเอียดในเอกสารประกอบการสอนชุดต่อไป
(isoelectric point) ของโปรตีนประกอบ
12
บรรณานุกรม
1. Luitjens A, Corven EV. Production and purification of recombinant proteins. In: Crommelin DJA, Sindelar RD, Meibohm B (eds.) Pharmaceutical
biotechnology. 5th ed. Cham, Switzerland. Springer Nature Switzerland AG. p.57-82.
2. Clark DP, Pazdernik NJ. Recombinant proteins. In: Clark DP, Pazdernik NJ (eds.) Biotechnology. Burlington, MA: Academic Press; 2012. p.305-327.
3. European Molecular Biology Laboratory/ Protein Expression and Purification Core Facility
[http://www.embl.de/pepcore/pepcore_services/index.html
13