Pewarnaan PAS

(Periodic Acid Schiff)

Kuliah mikroteknik 2022
 Periodic Acid Schiff
• Pewarnaan PAS banyak digunakan untuk
1. visualisasi karbohidrat
2. diagnosis tumor
3. mendeteksi infeksi jamur

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 2

 Aplikasi PAS dalam mendeteksi
infeksi jamur

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 3

 Aplikasi PAS dalam mendeteksi sel
kangker

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 4

 Aplikasi PAS dalam mendeteksi sel
tumor paru-paru

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 5

 Aplikasi PAS dalam mendeteksi
infeksi jamur

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 6

 Periodic Acid Schiff
• Pewarnaan PAS menghasilkan reaksi histokimia di mana
asam periodik mengoksidasi karbon menjadi ikatan karbon
membentuk aldehida yang bereaksi dengan asam fuchsin-
sulfur yang membentuk warna magenta.

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 7

 Periodic Acid Schiff
digunakan untuk mendeteksi glikogen dalam jaringan
1. Hati
2. jantung
3. otot rangka
• jaringan yang difiksasi dengan formalin, parafin, dan tekni
beku).
• Glikogen, musin, dan jamur akan diwarnai ungu dan inti akan
diwarnai biru.

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 8

 Manual: Pewarnaan PAS
• Fixation: 10% formalin.
• Section: paraffin sections at 5 um.
• Solutions and Reagents:
• 0.5% Periodic Acid Solution:

Periodic acid ---------------------- 0.5 g

Distilled water -------------------- 100 ml

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 9

 Manual: Pewarnaan PAS
Prosedur:
1. Deparafinisasi dan hidrasi dengan aquades.
2. Oksidasi dalam larutan PAS 0,5% selama 5 menit.
3. Bilas dengan aquades.
4. Tempatkan dalam reagen Schiff selama 15 menit (sampel menjadi warna pink
muda selama langkah ini).
5. Cuci dengan air keran hangat selama 5 menit (sampel berubah warna pink tua).
6. Counterstain dalam pewarna hematoxylin selama 1 menit.
7. Cuci dengan air keran selama 5 menit.
8. Dehydrate dan tutup dengan cover glass.

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 10

 Manual: Pewarnaan PAS
Hasil:
1. Glikogen, musin dan beberapa membran basal:
merah/ungu
2. jamur : merah/ungu
3. Bagian dasar : biru

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 11

 Contoh Teknik pewarnaan PAS
https://youtu.be/cxoajMdYd1o

5/23/2022 Pewarnaan PAS (Periodic Acid Schiff) 12

Thank you
IMUNOHISTOKIMIA
MK: MIKROTEKNIK

2022
 Imunohistokimia
• Proses utk mendeteksi antigen
(ags) pd preparat histologi
• Menggunakan antibodi (abs) scr
lgs pd sisi antigen tertentu pd sel
dan jaringan
• Labeling/menandai dgn zat warna
(atau senyawa fluoresens, atau
Representative mIHC/IF images captured through the Vectra, Chipcytometry, or DISCOVERY
ULTRA imaging system.
materi elektron) utk
(A) mIHC/IF of pancreatic adenocarcinoma FFPE sections labelled with DAPI (blue), CD73 memvisualisasikan reaksi ag-ab
(green), CD8 (yellow), CD68 (red), FoxP3 (cyan), CD3(magenta) and CK (orange) were
scanned using the Vectra imaging system.
(B) Mouse pancreas FFPE sections labelled with CD45 (brown), CD274(green), CD3e (purple),
CD4 (cyan), CD8a (pink), CD11b (yellow), CD31 (dark brown), CD326/EpCAM (red),
B220 (orange), F4/80 (blue), NK1.1(purple), Pan-CK (maroon), Hoechst 33342 (dark blue)
were scanned using the Chipcytometry imaging system.
(C) Cholangiocarcinoma FFPEsections labelled with CD20 (blue), CD8 (red), CD68 (turquoise),
CD3 (yellow) were scanned using the DISCOVERY ULTRA imaging system.Abbreviations:
mIHC/IF, multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence; FFPE, Formalin-Fixed
Paraffin-Embedded; DAPI,4′,6-diamidino-2-phenylindole
2
 Imunohistokimia
• Bahan aktif harus terakumulasi
dalam jumlah cukup di dalam sel
atau jaringan sehingga dapat
diikat oleh antibodi spesifik dan
dapat divisualisasikan.
• Dalam proses pembuatannya harus
dapat mempertahankan
Representative mIHC/IF images captured through the Vectra, Chipcytometry, or DISCOVERY keberadaan epitop yang diperlukan
ULTRA imaging system.
(A) mIHC/IF of pancreatic adenocarcinoma FFPE sections labelled with DAPI (blue), CD73
untuk reaksi antigen-antibodi.
(green), CD8 (yellow), CD68 (red), FoxP3 (cyan), CD3(magenta) and CK (orange) were
scanned using the Vectra imaging system.
(B) Mouse pancreas FFPE sections labelled with CD45 (brown), CD274(green), CD3e (purple),
CD4 (cyan), CD8a (pink), CD11b (yellow), CD31 (dark brown), CD326/EpCAM (red),
B220 (orange), F4/80 (blue), NK1.1(purple), Pan-CK (maroon), Hoechst 33342 (dark blue)
were scanned using the Chipcytometry imaging system.
(C) Cholangiocarcinoma FFPEsections labelled with CD20 (blue), CD8 (red), CD68 (turquoise),
CD3 (yellow) were scanned using the DISCOVERY ULTRA imaging system.Abbreviations:
mIHC/IF, multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence; FFPE, Formalin-Fixed
Paraffin-Embedded; DAPI,4′,6-diamidino-2-phenylindole
3
 Kegunaan Imunohistokimia
• Keberadaan antigen di dlm sel dapat
dideteksi, baik di dlm sitoplasma, inti
sel, dan axon pada sel-sel syaraf, juga
pada ektraseluler.
• Untuk mendeteksi keberadaan suatu
bahan aktif di dlm jaringan,sehingga sel-
sel mana saja yang menghasilkan dapat
diketahui.
• Dapat mendeteksi dan melokalisasi
bahan-bahan aktif tsb, juga dapat
memperlihatkan keberadaan bahan aktif
Representative mIHC/IF images captured through the Vectra, Chipcytometry, or DISCOVERY tsb secara utuh.
ULTRA imaging system.
(A) mIHC/IF of pancreatic adenocarcinoma FFPE sections labelled with DAPI (blue), CD73 • Dengan menggunakan mik. elektron
(green), CD8 (yellow), CD68 (red), FoxP3 (cyan), CD3(magenta) and CK (orange) were dapat scr detil mengamati lokalisasi
scanned using the Vectra imaging system. bahan aktif pada jaringan, jadi observasi
(B) Mouse pancreas FFPE sections labelled with CD45 (brown), CD274(green), CD3e (purple), dapat dilakukan pada tingkat sub-
CD4 (cyan), CD8a (pink), CD11b (yellow), CD31 (dark brown), CD326/EpCAM (red), mikroskopis, a.l. mengamati bentuk dan
B220 (orange), F4/80 (blue), NK1.1(purple), Pan-CK (maroon), Hoechst 33342 (dark blue) ukuran granul bahan aktif di dalam sel.
were scanned using the Chipcytometry imaging system.
(C) Cholangiocarcinoma FFPEsections labelled with CD20 (blue), CD8 (red), CD68 (turquoise),
CD3 (yellow) were scanned using the DISCOVERY ULTRA imaging system.Abbreviations:
mIHC/IF, multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence; FFPE, Formalin-Fixed
Paraffin-Embedded; DAPI,4′,6-diamidino-2-phenylindole
4
 Kegunaan Imunohistokimia
1. Keberadaan antigen di dlm sel dapat
dideteksi, baik di dlm sitoplasma, inti
sel, dan axon pada sel-sel syaraf, juga
pada ektraseluler.
2. Untuk mendeteksi keberadaan suatu
bahan aktif di dlm jaringan,sehingga
sel-sel mana saja yang menghasilkan
dapat diketahui.
3. Dapat mendeteksi dan melokalisasi
bahan-bahan aktif tsb, juga dapat
memperlihatkan keberadaan bahan
Representative mIHC/IF images captured through the Vectra, Chipcytometry, or DISCOVERY aktif tsb secara utuh.
ULTRA imaging system.
(A) mIHC/IF of pancreatic adenocarcinoma FFPE sections labelled with DAPI (blue), CD73 4. Dengan menggunakan mik. Elektron
(green), CD8 (yellow), CD68 (red), FoxP3 (cyan), CD3(magenta) and CK (orange) were dapat scr detil mengamati lokalisasi
scanned using the Vectra imaging system. bahan aktif pada jaringan, jadi
(B) Mouse pancreas FFPE sections labelled with CD45 (brown), CD274(green), CD3e (purple), observasi dapat dilakukan pada
CD4 (cyan), CD8a (pink), CD11b (yellow), CD31 (dark brown), CD326/EpCAM (red), tingkat sub-mikroskopis, a.L.
B220 (orange), F4/80 (blue), NK1.1(purple), Pan-CK (maroon), Hoechst 33342 (dark blue) Mengamati bentuk dan ukuran granul
were scanned using the Chipcytometry imaging system. bahan aktif di dalam sel.
(C) Cholangiocarcinoma FFPEsections labelled with CD20 (blue), CD8 (red), CD68 (turquoise),
CD3 (yellow) were scanned using the DISCOVERY ULTRA imaging system.Abbreviations:
mIHC/IF, multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence; FFPE, Formalin-Fixed
Paraffin-Embedded; DAPI,4′,6-diamidino-2-phenylindole
5
 Langkah Imunohistokimia
1. Preparasi sampel dan labelling:
2. Preparasi sampel: pengambilan
jaringan --------fiksasi ------
dehidrasi ----- clearing ------
infiltrasi ------ embedding -----
pemotongan ------- pelekatan ------
-----deparafinasi dan antigen
retrieval (utk membebaskan epitop
jaringan) dan bloking dari protein
yang tidak spesifik
Representative mIHC/IF images captured through the Vectra, Chipcytometry, or DISCOVERY
ULTRA imaging system. 3. Labelling (pemberian bahan-bahan
(A) mIHC/IF of pancreatic adenocarcinoma FFPE sections labelled with DAPI (blue), CD73
(green), CD8 (yellow), CD68 (red), FoxP3 (cyan), CD3(magenta) and CK (orange) were
utk pewarnaan preparat) :
scanned using the Vectra imaging system. imunodeteksi dengan antibodi
(B) Mouse pancreas FFPE sections labelled with CD45 (brown), CD274(green), CD3e (purple), p r i m e r d a n s e k u n d e r, - - - - - - - -
CD4 (cyan), CD8a (pink), CD11b (yellow), CD31 (dark brown), CD326/EpCAM (red), penambahan substrat kromogen ---
B220 (orange), F4/80 (blue), NK1.1(purple), Pan-CK (maroon), Hoechst 33342 (dark blue)
were scanned using the Chipcytometry imaging system.
counterstain --------- mounting
(C) Cholangiocarcinoma FFPEsections labelled with CD20 (blue), CD8 (red), CD68 (turquoise),
CD3 (yellow) were scanned using the DISCOVERY ULTRA imaging system.Abbreviations:
mIHC/IF, multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence; FFPE, Formalin-Fixed
Paraffin-Embedded; DAPI,4′,6-diamidino-2-phenylindole
6
 Langkah Imunohistokimia
1. Ikatan antigen antibodi scr lgs atau
tdk lgs dgn substansi penanda
2. reaksi positif tervisualisasi krn ada
kromogen yg berikatan dgn substansi
penanda tsb
3. Kromogen hrs dapat
memvisualisasikan substansi penanda
pada ikatan imunokompleks pada
pewarnaan imunohistokimia Contoh
Representative mIHC/IF images captured through the Vectra, Chipcytometry, or DISCOVERY kromogen yg digunakan:
ULTRA imaging system.
(A) mIHC/IF of pancreatic adenocarcinoma FFPE sections labelled with DAPI (blue), CD73 • DAB (3,3-diaminobenzine
(green), CD8 (yellow), CD68 (red), FoxP3 (cyan), CD3(magenta) and CK (orange) were tetrahydrochloride) warna coklat
scanned using the Vectra imaging system.
(B) Mouse pancreas FFPE sections labelled with CD45 (brown), CD274(green), CD3e (purple), • AEC (3-amino 9-ethylcarbazol) merah
CD4 (cyan), CD8a (pink), CD11b (yellow), CD31 (dark brown), CD326/EpCAM (red),
B220 (orange), F4/80 (blue), NK1.1(purple), Pan-CK (maroon), Hoechst 33342 (dark blue) • 4-chloro-1-naphtol biru tua
were scanned using the Chipcytometry imaging system.
(C) Cholangiocarcinoma FFPEsections labelled with CD20 (blue), CD8 (red), CD68 (turquoise),
CD3 (yellow) were scanned using the DISCOVERY ULTRA imaging system.Abbreviations:
mIHC/IF, multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence; FFPE, Formalin-Fixed
Paraffin-Embedded; DAPI,4′,6-diamidino-2-phenylindole
7
 Counterstain:
1. Untuk memberikan warna scr
d e t i l p d j a r, s e l a i n b a g i a n y g
terwarnai scr imunohistokimia.
2. Jika bagian sitoplasma sel
terwarnai dgn imunohistokimia,
maka inti sel perlu
dicounterstain.
Representative mIHC/IF images captured through the Vectra, Chipcytometry, or DISCOVERY
ULTRA imaging system.
Contoh: Hematoxilin
(A) mIHC/IF of pancreatic adenocarcinoma FFPE sections labelled with DAPI (blue), CD73
(green), CD8 (yellow), CD68 (red), FoxP3 (cyan), CD3(magenta) and CK (orange) were
scanned using the Vectra imaging system.
(B) Mouse pancreas FFPE sections labelled with CD45 (brown), CD274(green), CD3e (purple),
CD4 (cyan), CD8a (pink), CD11b (yellow), CD31 (dark brown), CD326/EpCAM (red),
B220 (orange), F4/80 (blue), NK1.1(purple), Pan-CK (maroon), Hoechst 33342 (dark blue)
were scanned using the Chipcytometry imaging system.
(C) Cholangiocarcinoma FFPEsections labelled with CD20 (blue), CD8 (red), CD68 (turquoise),
CD3 (yellow) were scanned using the DISCOVERY ULTRA imaging system.Abbreviations:
mIHC/IF, multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence; FFPE, Formalin-Fixed
Paraffin-Embedded; DAPI,4′,6-diamidino-2-phenylindole
8
 Metode
a. Metode langsung
• antigen + [antibodi + substansi
penanda/marker]

b. Metode tdk langsung

• antigen + 1° antibodi + [2° antibodi
+ substansi penanda/marker
substance]
Representative mIHC/IF images captured through the Vectra, Chipcytometry, or DISCOVERY • Metode tidak langsung merupakan
ULTRA imaging system.
(A) mIHC/IF of pancreatic adenocarcinoma FFPE sections labelled with DAPI (blue), CD73
proses amplifikasi
(green), CD8 (yellow), CD68 (red), FoxP3 (cyan), CD3(magenta) and CK (orange) were • Sejumlah besar marker substance
scanned using the Vectra imaging system. dilekatkan
(B) Mouse pancreas FFPE sections labelled with CD45 (brown), CD274(green), CD3e (purple),
CD4 (cyan), CD8a (pink), CD11b (yellow), CD31 (dark brown), CD326/EpCAM (red),
• Metode yg paling banyak digunakan
B220 (orange), F4/80 (blue), NK1.1(purple), Pan-CK (maroon), Hoechst 33342 (dark blue) • M e t o d e PA P & A B C
were scanned using the Chipcytometry imaging system.
(C) Cholangiocarcinoma FFPEsections labelled with CD20 (blue), CD8 (red), CD68 (turquoise),
CD3 (yellow) were scanned using the DISCOVERY ULTRA imaging system.Abbreviations:
mIHC/IF, multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence; FFPE, Formalin-Fixed
Paraffin-Embedded; DAPI,4′,6-diamidino-2-phenylindole
9
TEKNIK IMUNOHISTOKIMIA
 TEKNIK IMUNOHISTOKIMIA

Faktor utama dari teknik imunohistokimia dalam mendeteksi suatu bahan aktif.

Antibodi yg digunakan harus memenuhi persyaratan, yaitu:

1. Spesifikasi yg tinggi : a.b. hrs berikatan scr spesifik dgn antigen, tdk boleh
mempunyai reaksi silang dgn antigen lain.

2. Titer yang cukup tinggi: menggambarkan jml a.b. yg banyak, shg akan dapat
mengikat keseluruhan antigen yg terdpt di dlm jaringan.

3. Afinitas tinggi: yaitu kemampuan u/ berikatan dgn satu/lbh dari sisi antigenik/epitop
dari antigen

4. Aviditas tinggi: ikatan antara antigen–antibodi hrs dlm ikatan yg kuat, tdk mdh lepas
sewaktu proses pewarnaan

5. Mudah didapat
 JENIS ANTIBODI

1. Antibodi monoklonal : a.b. ini spesifisitasnya tinggi, karena hanya mengikat satu
epitop saja dr antigen. Apabila pada proses fiksasi preparat, epitopnya hilang,
maka tidak terjadi ikatan antara antigen-antibodi.

2. Antibodi poliklonal: a.b. ini spesifitasnya lbh rendah, tapi afinitasnya dlm berikatan
dgn antigen lbh tinggi. Antibodi poliklonal mrpkan campuran antibodi2 yg berasal
dr bbrp epitop spesifik dr suatu antigen, shg a.b. ini lbh toleran apbl kehilangan
satu/lbh epitop akibat fiksasi, dan ikatan antara antigen-antibodi msh dpt terjadi
dgn epitop yg msh tersisa pada antigen tersebut.
THANK YOU
 Preparat tulang termasuk gigi:
mengandung zat kapur
 Adanya kandungan Ca menyebabkan
tulang mjd keras
 Diperlukan cara untuk ‘melunakkan’
 Ada 2 cara yang sering digunakan:
1. maserasi
2. dekalsifikasi
 Cara ini dilakukan utk membuat
preparat gosok tulang
 Tulang diperlakukan secara
manual, tdk diiris melintang
 Pengirisan dilakukan secara
membujur
 Tulang direndam dalam air selama 2
hari/lebih agar lunak
 Tulang dibelah setipis mungkin
 Dioven sampai kering
 Digosok pd batu asah pada 2 sisi
sampai tipis dengan ketebalan yang
sesuai dengan kebutuhan
 Ditutup dengan entellan
 Pembuatan preparat gosok tulang
membutuhkan waktu yang lama
 Komponen sel sulit diketahui, yang
dapat diketahui hanya bekas komponen
sel
 Tidak dapat diperoleh irisan melintang
 Ketebalan preparat sulit ditentukan →
tdk dapat diperoleh sayatan yg benar-
benar tipis
 Dekalsifikasi dilakukan untuk
membuat preparat dengan metode
irisan/parafin
 Dpt diperoleh preparat dgn ketebalan
6-8 µ
 Dekalsifikasi adalah proses
penghilangan Ca → tulang menjadi
lunak → dpt diproses dgn metode
parafin → dilakukan pengirisan
1. Fiksasi
2. Dekalsifikasi
3. Proses washing-dehidrasi-
clearing-infiltrasi-embedding
4. Sectioning
 Fiksatif yg dpt digunakan:
alkohol, formalin, Bouin, Zenker
 Sampel yg akan difiksasi diiris
dengan pisau yg tajam/gergaji
halus dgn ukuran 0,5 cm.
 Jenis fiksatif yang digunakan
harus diperhatikan
 Tulang mengandung
hydroksiapatit Ca10(PO4)6(OH)2
→ akan terlarut dgn asam kuat
→ membentuk endapan
 Proses dekalsifikasi merupakan
proses yang sangat menentukan
berhasil tidaknya pembuatan
preparat tulang
 Dalam pembuatan preparat tulang
proses dekalsifikasi dan fiksasi
dapat dilakukan secara bersamaan
atau terpisah (fiksatif dulu baru
kemudian dilanjutkan dengan
proses dekalsifikasi)
 Zat yang dapat digunakan untuk
dekalsifikasi antara lain: asam
nitrat, asam format, atau HCl 1 N
 Jenis-jenis dekalsifikan:
1. Asam nitrat
◦ Konsentrasi 1 s/d 5 %
◦ Daya dekalsifikasi lebih cepat
◦ Tulang menjadi kuning
2. Asam Format
◦ Konsentrasi 5 s/d 10 %
◦ Daya dekalsifikasi lebih lambat
◦ Pewarnaan setelah proses ini tidak
terlalu bagus
3. HCL 1 N
◦ Konsentrasi 8 %
 Proses dekalsifikasi tidak cukup
hanya sekali → harus berulang,
dgn penggantian cairan
dekalsifikasi minimal 24 jam
 Proses dekalsifikasi berkisar 1-2
hari sampai 7 hari
 Agar proses dekalsifikasi lebih
cepat, cairan dekalsifikasi harus
sering diganti-ganti → dgn
melihat jenis dan umur tulang
Deteksi kesempurnaan proses
dekalsifikasi dapat dilihat dengan
cara:
1. Disinari UV → utk tulang padat
2. Ditusuk jarum
◦ Bila telah lunak → dekalsifikasi
dianggap telah selesai
◦ Kelemahan : dapat merusak jaringan
3. Reaksi kimiawi
◦ Hal ini dilihat dgn cara melihat cairan
yg digunakan utk dekasifikasi
 Apabila cairan yg digunakan
utk dekasifikasi sdh jernih
→ proses dekalsifikasi
dianggap telah sempurna
 Larutan yg digunakan untuk
mendeteksi ada/tdknya Ca
adalah: amoniak kuat
 Cara mendeteksi Ca menggunakan amoniak :
Ambil 5ml larutan → tes dgn litmus (biru) warna
kertas mjd merah → ditambah amoniak kuat →
digojok → tes dgn litmus → warna biru → ditambah
amoniak oksalat jenuh (0,5 ml) → gojok → biarkan ½
jam → jika larutannya keruh, berarti masih ada Ca
sehingga perlu dilakukan dekalsifikasi kembali. Namun
bila larutannya sdh jernih → berarti dekalsifikasi
telah sempurna
 Washing (pencucian) adalah proses
penghilangan dekalsifikan
 Proses washing harus sempurna →
preparat harus bebas asam.
 Adanya asam (pada dekalsifikan) akan
menghalangi proses pewarnaan →
khususnya utk pewarnaan inti (asam)
Larutan yg digunakan utk washing
tergantung dekalsifikan yg digunakan:
◦ Apabila dekalsifikasinya menggunakan
asam nitrat → dilakukan washing
menggunakan merkuri dalam alkohol 70%
+ air mengalir
◦ Apabila dekalsifikasinya menggunakan
asam format → washing menggunakan
sodium sulfat 5 %
 Dehidrasi: menggunakan alkohol bertingkat. Tulang
tdk boleh terlalu lama dalam alkohol konsentrasi
tinggi (mulai 80%).
 Clearing: tdk menggunakan xylol tapi menggunakan
toluol/chloroform
 Infiltrasi: ada yg masih menggunakan perbandingan
toluol parafin ( bertingkat). Infiltrasi tdk boleh
terlalu lama (maksimal 12 menit)
 Perhatikan ketajaman pisau