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2푸코실락토오스의자가포식을통한멜라닌감소연구
2푸코실락토오스의자가포식을통한멜라닌감소연구
*
아주대학교 응용생명공학과, 석사과정 학생
**
아주대학교 응용생명공학과, 박사과정 학생
***
아주대학교 응용생명공학과, 교수
****
경기도경제과학진흥원
*****
세명대학교 화장품뷰티생명공학부, 연구교수
(2022년 5월 17일 접수, 2022년 6월 20일 수정, 2022년 6월 21일 채택)
So Young Jung1,†, Han Jun Yoo1, Hyojin Heo1, So Min Lee1, Sofia Brito1, Byungsun Cha1,
Lei Lei1, Sang Hun Lee1, Bum-Ho Bin1,††, Mi-Gi Lee2,††, and Byeong-Mun Kwak3,††
1
Department of Applied Biotechnology, Ajou University, 206, World cup-ro,
Yeongtong-gu, Suwon-si, Gyeonggi-do 16499, Korea
2
GBSA, Gyeonggido Business and Science Accelerator
3
School of Cosmetic Science and Beauty Biotechnology, Semyung University
(Received May 17, 2022; Revised June 20, 2022; Accepted June 21, 2022)
1)
†† 주 저자 (e-mail: jjyksks@ajou.ac.kr)
call: 031-219-2618
†† 교신저자 (e-mail: bhb@ajou.ac.kr)
call: 031-219-2618
†† 교신저자 (e-mail: migi@gbsa.or.kr)
call:***-****-****
***-****-****
Abstract: 2'-fucosyllactose (2'-FL) is the most abundant human milk oligosaccharide (HMO) present in breast milk, promoting
the growth of beneficial microorganisms in the gut and aiding in the relief of allergic and inflammatory
reactions. In this study, the anti-melanogenic effects of 2'-FL, and its potential for application in whitening cosmetics,
were evaluated. MTT assay was performed on MNT-1 cells, human-derived melanocytes. 2'-FL was treated and replaced
at 48 h intervals for 7 days, and it was confirmed that there was no cytotoxicity at 20 g/L or less, while a 40% reduction
in melanin production was also observed. Western blot analysis of TYR and TYRP1, factors involved in melanogenesis,
revealed that 2'-FL treatment reduced their expression levels. In addition, 2'-FL application and observation of the autophagy
marker microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) revealed it was converted from LC3-Ι to LC3-Π, indicating
increased autophagy. Likewise, confocal microscopy revealed an increase in LC3 puncta after 2'-FL treatment. Therefore,
it is suggested that 2'-FL-mediated activation of autophagy reduces melanogenesis by inhibiting the expression levels of
TYR and TYRP1 proteins. In conclusion, it has been confirmed that 2'-FL induces autophagy and suppresses melanin
production, so its potential as a whitening cosmetic material is expected.
제거하고 2'-FL을 20 g/L 농도로 DMEM 배지에 희석하여 서 24 h 동안 세포를 고정하였다. 고정된 세포에 염색을 위해
각 well 내 첨가하였다. 대조군에는 2'-FL를 첨가하지 않은 triton X-100을 PBS에 1%로 희석하여 4 ℃에서 5 min 배양한
DMEM 배지를 첨가한 후 다시 2 h 동안 배양하였다. 이후 후 LC3 antibody를 1 : 200 비율로 PBS에 희석하여 24 h 동안
세포를 0.05 M tris-HCI (pH 7.5), 0.15 M sodium chloride, 세포에 부착시켰다. 이후 형광 접합 2 차 항체 alexa fluor
0.01 M magnesium chloride solution와 protease inhibitor cocktail 488-conjugated goat anti-rabbit IgG로 4 ℃에서 1 : 400 비율
이 포함된 용액에서 1% IGEPAL® CA-630으로 용해하였다. 로 1 h 동안 2 차 반응시킨 후 DAPI로 세포의 핵을 염색
이후 13,000 rpm으로 15 min 간 원심분리하여 상층액을 획 하였다. 염색된 세포는 공초점 현미경(confocal laser-scanning
득한 후 BCA assay를 이용하여 정량하였다. 20 μL의 단백 microscope, LSM 700, Germany)으로 관찰하였다.
질을 SDS-PAGE 상에서 전기영동 하여 크기 별로 분리한
후 단백질은 PVDF에 옮겨 blocking buffer (1% BSA in TBS) 2.7. 통계처리
을 제조하여 실온에서 1 h blocking 하였다. 이후 1 차 항체 모든 실험에 대한 분석값은 3 회 반복 실험을 통하여
를 1 : 4,000 농도로 희석하여 4 ℃에서 over night 후, 다시 평균값과 표준 편차(mean ± SD)로 나타내었다. 통계적으
10 min 간격으로 tris-buffered and tween 20 (TBS-T)로 3 회 로 유의한 차이는 student’s t-test 방법을 사용하여 p < 0.05
세척하였다. 2 차 항체는 1 : 10,000 농도로 희석하여 실온 1 의 신뢰수준에서 검증하였다.
h 반응한 후 3 회 세척하여 발광시약 키트(Thermo Fisher
Scientific Inc., USA)를 사용하여 밴드를 검출하고 Fusion 3. 결과 및 고찰
Solo S (Koreabimics, Korea) 기기로 이미지를 획득하였다.
3.1. 2'-FL 농도에 따른 세포 생존능(Cell Viability) 측정
2.6. 면역형광염색법(Immunofluorescence) 2'-FL의 농도에 따른 세포 독성을 확인하기 위해 MTT
MNT-1 세포를 1 × 105 cells/dish 농도로 Lab-tek chamber assay 실험을 통하여 농도에 따른 세포 생존율을 검토하
slide (Thermo Fisher Scientific Inc., USA)에 분주한 후 37 였다. 2'-FL은 10, 20, 40 g/L 농도로 처리하여 24 h 배양하
℃, 5% CO2 배양기에서 24 h 배양하였다. 세포 배양에 사 였다. 10, 20 g/L 농도 적용 시 대조군과 비교하여 20 g/L
용된 배지를 제거하고 2'-FL 혹은 glucose을 20 g/L 농도로 농도 조건까지 농도 의존적으로 세포 생존율이 증가했으
DMEM 배지에 희석하여 각 dish 내 분주하고 72 h 배양하 며, 40 g/L 농도 조건에서는 세포 생존율이 감소함을 보여
였다. 대조군에는 2'-FL 및 glucose을 첨가하지 않은 주었다(Figure 1). 따라서 후속 실험들은 세포 생존율에 영
DMEM 배지를 첨가한 후 다시 72 h 동안 배양하였다. 향을 미치지 않는 20 g/L를 최대 농도로 설정하여 진행하
이후 형광 현미경 관찰을 위해 4% formaldehyde로 4 ℃에 였다.
(A) (B)
Figure 1. 2'-FL improved cell viability in MNT-1 cells. CTL, also known as Control, was not treated with 2'-FL. The results are
presented as the mean ± SD of the experiment (N = 3), *p < 0.05, **
p < 0.01, ***
p < 0.005, compared to CTL.
(A) (B)
Figure 2. 2'-FL reduced melanin contents in MNT-1 cells. CTL, also known as Control, was not treated with 2'-FL. (A) The result of
optical comparison of melanin contents in CTL and 2'-FL. (B) The result of melanin contents using melanin assay. The results are
presented as the mean ± SD of the experiment (N = 3), *p < 0.05, **
p < 0.01, ***
p < 0.005, compared to CTL.
(A) (B)
Figure 3. 2'-FL decreased the expression levels of melanogenesis-associated proteins. (A) The results of protein expression levels of
TYR and TYRP1 after treatment of skin MNT-1 cells with 2'-FL. (B) Comparison of TYR and TYRP1 protein expression levels by
Image J calculated values. CTL, also known as Control, was not treated with 2'-FL. The results are presented as the mean ± SD of
the experiment (N = 3), *p < 0.05, **
p < 0.01, ***
p < 0.005, compared to CTL.
3.3. MNT-1 세포에서의 TYR 및 TYRP1 단백질 발현 3.4. 2'-FL 처리에 의한 자가포식 변화 관찰
멜라닌은 자외선으로부터 피부를 보호하고, 피부 및 모 자가포식은 세포 내 항상성 유지 및 피부색 개선에 도
발의 색을 결정하는 중요한 인자이다. 하지만 과도하게 생 움을 준다. 따라서 2'-FL 처리에 의해 자가포식소체 형성이
성된 멜라닌은 피부에 침착되어 기미, 주근깨 등의 피부질 촉진되는지 확인하기 위해 자가포식소체 표지자로 알려진
(A) (B)
(C)
Figure 4. Increased autophagy by 2'-FL treatment in MNT-1 cells. (A) The results of protein expression level of LC3-Ι and LC3-Π
after treatment with 2'-FL. (B) Comparison of Image J calculated values of LC3-Ι and LC3-Π protein expression levels. (C) Increased
autophagosomes after 2'-FL treatment observed by confocal microscopy. CTL, also known as Control, was not treated with 2'-FL. The
results are presented as the mean ± SD of the experiment (N = 3), *p < 0.05, **
p < 0.01, ***
p < 0.005, compared to CTL.
LC3의 발현량을 비교하여 확인하였다. 무처리군과 글루코 MNT-1 세포에서 2'-FL 처리에 의한 멜라닌 생성 변화를
오스 처리군을 대조군으로 하였으며, 글루코오스는 2'-FL 검토한 결과 20 g/L 농도 적용시 대조군에 비교하여 멜라
과 동일한 양을 처리하였다. 실험 결과, 같은 당류인 글루 닌 생성량이 감소됨을 확인하였으며, western blot 실험을
코오스보다 2'-FL 처리군에서 자가포식 활성화로 인해 자 통하여 멜라닌 생성 관련 인자인 TYR 및 TYRP1의 단백
가포식소체가 증가한 것을 확인하였다(Figure 4). 질 발현량이 상대적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
더불어 같은 당류인 글루코오스를 2'-FL과 동일한 양을 처
4. 결 론 리하였을 때, 자가포식 표지자로 알려진 LC3의 발현량이
글루코오스보다 2'-FL 처리군에서 자가포식 활성화로 인해
자가포식소체가 증가한 것을 확인하였다. 이를 바탕으로
본 연구에서는 2'-FL의 미백 화장품 소재로써의 응용 가
2'-FL은 미백 효능이 있을 수 있음을 시사한다.
능성을 확인하고자 인간 흑색종 세포로 알려진 MNT-1로
2'-FL은 모유에 가장 많이 존재하는 올리고당으로 자가
세포실험을 통하여 2'-FL의 세포 독성 및 멜라닌 생성 감
포식을 유도하여 멜라닌 생성 억제를 시킬 뿐 아니라 당
소량 및 자가포식 활성화를 통한 자가포식소체 증가량을
성분으로, 화장품 제형에 쉽게 적용될 수 있음을 확인하며
확인하였다.
미백 화장품 소재로써의 응용이 기대된다.
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