PCA: đếm vsv hiếu khí

PDA: đếm men mốc

PW: phục hồi, tăng sinh Salmonella

XLD:

Có natri deoxycholate ngăn sự phát triển của vk G+

Phenol red để chỉ thị sự biến đổi pH của môi trường.

Natri thiosulfate được Sal dùng như một nguồn lưu huỳnh, tạo thành H2S kết hợp với Fe, nên khuẩn
lạc có tâm đen

RV

Có Malachite Green, ức chế được vk G+, Sal có khả năng chống chịu được chất này.

LTB

Sodium Lauryl sulphate thúc đẩy sự Sinh trưởng và giải phóng khí của vi sinh vật coliform. Vi khuẩn
gây hiếu khí đã được ức chế hoàn toàn

BGBB

Muối mật ức chế vk G+ trong quá trình lên men lactose

EC

Có muối mật

EMB

Chứa thuốc nhuộm anilin (eosin và xanh methylen), hoạt động như chất ức chế, ngăn chặn sự phát
triển của hầu hết các vi khuẩn gram dương và một số trực khuẩn Gram âm.

Bgbb có Brilliant Green ức chế G- (nhưng mà không có tác dụng với nhóm coliform)

EC có loại muối mật Bile salr No.3, chỉ có nhóm coliform chịu nhiệt mới có khả năng chịu đựng chất
này

Nhỏ parafilm vào một số giếng là nhằm tạo môi trường kị khí

Ưu nhược điểm pp truyền thống và hiện đại

Theo như kết quả 2 pp e nên dùng pp nào
Nêu các môi trường có chức năng gì
Tại sao môi trường di động
Lý do mẫu xuất hiện E.coli/ samonella
Dấu hiệu nhận biết pư +/- có chứa ống duham
Tại sao chứng dương đi lên chứng âm nằm ngang
Tại sao RV đục
Tại sao dung dịch huyền phù mà cô chuẩn bị để kit định danh lại có chỉ số 0.2-0.5
 Trong tính tổng số coliform và coliform chịu nhiệt phải x1000 vì tụi em phải pha loãng
xuống 1000 lần tức từ nồng độ ban đầu 10^1 đến nồng độ đã được pha loãng 10^-2 để
đạt đc MPN là ...
EC và BGBB đều dùng để phát hiện coliform nhưng EC có thể dùng để ức chế nhóm
coliform chịu nhiệt do có thành phần là muối mật

Chứng dương là gì, chứng âm là gì...Đồ thị mẫu gộp thể hiện điều j...Tại sao ống RV lại
vừa đục, vừa có khí... Trình bày nguyên lí của các giếng... Tại sao phải nhỏ parafiln vào
một số giếng... Theo TCVN, tại sao ta kết luận đc mẫu ko đạt chuẩn?

I. Các câu hỏi ôn:

Chức năng môi trường RV: tăng sinh chọn lọc Salmonella từ mẫu vật thực phẩm.

Chức năng môi trường XLD: Môi trường phân lập chọn lọc, so sánh nhóm vi khuẩn Salmonella

Chức năng môi trường Peptone Water (PW): phục hồi, tăng sinh Salmonella.

Tại sao ống RV đục? Có sự hiện diện của Salmonella

Phenol red: chất chỉ thị màu pH

Đặc điểm khuẩn lạc Salmonella: Salmonella (2-3mm) có lạc khuẩn tròn, lồi, đôi khi có tâm màu đen,
môi trường giữ được màu đỏ hồng. Không làm biến đổi màu môi trường.

Theo TCVN, tại sao ta kết luận được mẫu không đạt chuẩn?

Salmonella có thể nhiễm vào trong sữa đậu nành thông qua các quá trình sau:

Trong tự nhiên: Salmonella có thể nhiễm vào trong sữa thông qua thao tác sử dụng dụng cụ chế
biến sai quy tắc, điều kiện môi trường không đảm bảo khi bảo quản buôn bán. Đậu nành có thể bị
 nhiễm Salmonella khi trồng trọt và thu hoạch, điều kiện vệ sinh khi bảo quản cũng như vận chuyển
không an toàn.

Trong phân tích: Có thể nhiễm từ nhiều nguồn như các dụng cụ trước khi sử dụng và trong lúc thao
tác thí nghiệm (ống nghiệm, pippet, enpendod), môi trường điều kiện thực hiện thí nghiệm, thao tác
thực hành (đóng- mở enpedod, hút dịch mẫu, đèn cồn), có thể do pippet bị nhiễm từ trước khi sử
dụng trong lúc thao tác Salmonella nhiễm mẫu.

Trong lúc thao tác để các dụng cụ như ống nghiệm, pipet,...xa đèn cồn hoặc quên hơ qua cồn.

Lý do mẫu xuất hiện Salmonella?

- Vấy nhiễm từ môi trường, dụng cụ lấy mẫu, nơi lấy mẫu…

Ưu nhược điểm giữa phương pháp truyền thống và hiện đại?

Ưu điểm Nhược điểm

Phương pháp - Ưu điểm của phương pháp nuôi cấy là nhạy, rẻ và
truyền thống dễ thực hiện, cung cấp thông tin về chất lượng, số
lượng và cả chủng loại vi sinh vật sống hiện diện
trong thực phẩm.
Phương pháp - Phát hiện vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy
hiện đại được xây dựng và phát triển trong thời gian dài,
được nhiều nước công nhận và chúng đã trở thành
những phương pháp tiêu chuẩn.
- Nhanh,đặc hiệu, nhạy
- Thời gian có kết quả nhanh
- Phương pháp truyền thống làm sự phân bố không đồng đều
của vi sinh trong mẫu và sự hiện diện của các vi sinh bản địa
có thể làm ảnh hưởng đến độ đặc hiệu và tính chính xác của
quy trình nuôi cấy.
- Mất nhiều thời gian.Thông thường cần tốn khoảng 1 tuần để
thực hiện toàn bộ quy trình trên và định danh được vi sinh vật.
- Khó thực hiện đúng kĩ thuật
- Đòi hỏi người thực hiện cần được đào tạo có chuyên môn
trình độ cao
- Rất khó thực hiện được một cách chuẩn mực
- Giá thành khá cao.
- Đòi hỏi trang thiết bị, máy móc kỹ thuật hiện đại.
 BÀI 1: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ VSV HIẾU KHÍ

Làm thế nào để có thể đếm được khuẩn lạc? Sử dụng máy
đếm khuẩn lạc

Chức năng môi trường Plate count agar (PCA): xác định
tổng số lượng vi khuẩn hiếu khí sống trong mẫu. Đây không
phải là dạng môi trường chọn lọc. Số lượng vi khuẩn được
biểu hiện như các đơn vị hình thành khuẩn lạc trên gram
(CFU/g) trong mẫu dung dịch.
Tại sao phải dùng nước muối sinh lý NaCl 0,9%? Cân bằng
áp suất thẩm thấu bên trong và bên ngoài tế bào vi sinh vật,
giúp cho vi sinh vật có thể sống được.
 BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ MEN MỐC

Chức năng môi trường Potato Destrose Agar (PDA)? xác

định, nuôi cấy nấm men và nấm mốc trong mẫu thực phẩm.
Môi trường này kích thích sự hình thành bào tử và sắc tố, nên
được sử dụng để nuôi cấy và phân biệt nấm gây bệnh và
không gây bệnh.

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG SỐ COLIFORM VÀ

COLIFORM CHỊU NHIỆT
Chức năng của môi trường LSB? sử dụng để phát hiện vi
khuẩn coliform trong nước và trong các sản phẩm thực phẩm.
Lauryl sulphate thúc đẩy sự Sinh trường và giải phóng khí vi
sinh vật coliform. Có thành phần Tryptone nhằm cung cấp các
dưỡng chất như hợp chất nitơ, cacbon, vitamin và axit amin.

Chức năng môi trường EC broth? Để đếm tổng coliforms

trong các mẫu nước và thực phẩm, trong đó tác nhân chính
liên quan là Escherichia coli.

Chức năng môi trường BRILLIANT GREEN BILE

BROTH (BGBB)? BGBB được dùng để phát hiện và định
lượng coliform, coliform chịu nhiệt trong thực phẩm, nước
dùng trong xử lý thực phẩm và mẫu nước thải.

Dấu hiệu nhận biết ống Durham dương tính? Môi trường
đục và ống Durham (ống chuông) nổi hoặc có bọt khí trong
ống chuông (thể tích bọt khí trong ống chuông =1/10 thể tích
ống chuông). Ống Durham, sẽ cho phép xác định sự sinh hơi
(H2) từ quá trình lên men.

BÀI 4: ĐỊNH TÍNH E.COLI

Chức năng môi trường Eosin methylene blue (EMB)? là

môi trường chứa chất nhuộm màu chọn lọc cho vi khuẩn gram
âm và vi phân cho coliforms. Chúng được sử dụng để tạo một
môi trường vi sinh khác biệt, ức chế sự phát triển của vi khuẩn
gram dương và cung cấp một chỉ thị màu phân biệt giữa các
sinh vật lên men lactose.

Đặc điểm khuẩn lạc E.coli? Tròn, lồi, đường kính 2-3mm,
màu tím đen, tâm đen chiếm hơn ¾ đường kính, có ánh kim
hơi lục trong ánh sáng phản chiếu.

Lý do mẫu xuất hiện E.coli?

- Vấy nhiễm từ môi trường, dụng cụ lấy mẫu, nơi lấy mẫu…

BÀI 5: ĐỊNH TÍNH SALMONELLA

Chức năng môi trường RV: tăng sinh chọn lọc Salmonella
từ mẫu vật thực phẩm dưới điều kiện thẩm thấu cao và độ
pH thấp.

Chức năng môi trường XLD: Môi trường phân lập chọn lọc,
so sánh nhóm vi khuẩn gây bệnh đương ruột (Salmonella và
Shigella) loại gram âm từ mẫu phân và các vật liệu lâm sàng
khác

Sự thích hợp đặc biệt của nó đối với phân lập các loài Shigella
và Salmonella
Xét nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm, nước và các sản
phẩm hàng ngày khác.
Tăng tần suất sinh trưởng của nhiều vsv.

Chức năng môi trường Peptone Water (PW): phục hồi,

tăng sinh Salmonella (sử dụng nguồn đạm để phát triển, giúp
cân bằng áp suất để bảo vệ tế bào), giúp phục hồi tế báo tổn
thương nhạy cảm với độ pH thấp. Dùng làm cơ sở cho các
nghiên cứu lên men carbohydrate.
Tại sao ống RV đục? Có sự hiện diện của Salmonella
Phenol red: chất chỉ thị màu pH
Đặc điểm khuẩn lạc Salmonella: Salmonella (2-3mm) có lạc
khuẩn tròn, lồi, đôi khi có tâm màu đen, môi trường giữ được
màu đỏ hồng. Không làm biến đổi màu môi trường.

Thời gian chạy 1 vòng RT-PCR? 6 phút

Máy PCR chạy bao nhiêu vòng? Nhiệt độ mỗi vòng là bao
nhiêu? Gồm một chuỗi 30 - 45 vòng biến đổi nhiệt độ được
lặp đi lặp lại trong đó mỗi chu kỳ gồm khoảng 2 - 3 giai đoạn
nhiệt độ riêng. Mỗi chu kỳ thường sẽ bắt đầu bằng giai đoạn
nhiệt độ cao (>90°C) sau đó dừng lại ở nhiệt độ thấp để lưu
trữ sản phẩm PCR trong một thời ngắn hoặc khi sản phẩm
cuối cùng được tổng hợp.

Biểu đồ có 2 cột, trục tung là gì? Trục hoành là gì?

Trục hoành: thời gian thu nhập
Trục tung: cường độ vi sinh vật

Nhiệt độ phát quang? 72 độ C

Vòng lặp thứ mấy? 20

Ưu nhược điểm giữa phương pháp truyền thống và hiện

đại?
Ưu điểm Nhược điểm
Phương pháp truyền - Ưu điểm của phương - Phương pháp truyền
thống pháp nuôi cấy là nhạy, rẻ thống làm sự phân bố
và dễ thực hiện, cung không đồng đều của vi
cấp thông tin về chất sinh trong mẫu và sự
lượng, số lượng và cả hiện diện của các vi sinh
chủng loại vi sinh vật bản địa có thể làm ảnh
sống hiện diện trong hưởng đến độ đặc hiệu
thực phẩm. và tính chính xác của
quy trình nuôi cấy.
- Mất nhiều thời
gian.Thông thường cần
tốn khoảng 1 tuần để
thực hiện toàn bộ quy
trình trên và định danh
được vi sinh vật.
Phương pháp hiện đại - Phát hiện vi sinh vật - Khó thực hiện đúng kĩ
bằng phương pháp nuôi thuật
cấy được xây dựng và - Đòi hỏi người thực
 phát triển trong thời gian hiện cần được đào tạo có
dài, được nhiều nước chuyên môn trình độ cao
công nhận và chúng đã - Rất khó thực hiện được
trở thành những phương một cách chuẩn mực
pháp tiêu chuẩn. - Giá thành khá cao.
- Nhanh,đặc hiệu, nhạy - Đòi hỏi trang thiết bị,
- Thời gian có kết quả máy móc kỹ thuật hiện
nhanh đại.

Chứng dương là gì? ADN của Salmonella

Chứng âm là gì? Là nước thường

Phản ứng xảy ra đầu tiên trong quá trình chạy RT-PCR?
Biến tính DNA, DNA khuôn ở dạng sợi đôi được tách thành 2
sợi đơn.

Tại sao chứng dương đi lên, chứng âm nằm ngang?

Chứng dương (đỏ): ban đầu lượng ADN của Salmonella ít,
sau quá trình PCR thì ADN được nhân đôi nhiều hơn 2n, mỗi
ADN được nhân đôi sẽ xảy ra một phản ứng (giải phóng chất
phát sáng huỳnh quang được gắn trên đoạn mồi) tạo ra một
ánh sáng và sẽ được bộ phận thu sáng thu lại. Máy sẽ thể hiện
cường độ ánh sáng phát ra theo thời gian. Do chứng dương
chứa 100% là ADN nên cường độ ánh sáng thu được là nhiều
nhất, nên đường của chứng dương đi lên, chứng âm nằm
ngang.

Theo như kết quả của 2 phương pháp trên, em nên dùng
phương pháp nào? Kết hợp song song 2 phương pháp
Lý do mẫu xuất hiện Salmonella?
- Vấy nhiễm từ môi trường, dụng cụ lấy mẫu, nơi lấy mẫu…

KIT ĐỊNH DANH - PHẢN ỨNG SINH HÓA

(Học 12 cơ chế của phản ứng sinh hóa)

Thử nghiệm oxidase: được sử dụng để xác định vi khuẩn sinh
cytochrome C oxydase, một enzyme của chuổi vận chuyển
điện tử vi khuẩn. Khi hiện diện, cytochrome C oxidase oxy
hóa thuốc thử (tetramethyl-p-phenylenediamine) thành
indophenol, sản phẩm có màu tím. Khi không có enzyme,
thuốc thử bị khử và không màu.

Thử nghiệm trên môi trường di động: xác định khả năng di
động (nhờ tiêm mao) của
VSV. Nếu vi khuẩn có khả năng di động thì môi trường sẽ
xuất hiện màu đỏ mọc lan ra
khỏi đường cấy hoặc khiến môi trường bị đục, còn nếu vi
khuẩn không có khả năng di
động thì môi trường có màu đỏ theo đường cấy, môi trường
không bị đục.

Thử nghiệm trên bảng nhựa:

• Lên men Glucose: nhằm kiểm tra khả năng của VSV lên
men glucose tạo các sản phẩm cuối mang tính acid và
vượt quá khả năng ổn định pH của môi trường, dùng để
định tính khả năng sinh acid của 1 số VSV sinh acid
nhiều hơn VSV khác.
 • Khử Nitrate thành Nitrite: thử nghiệm khả năng khử
nitrate của vi khuẩn:
NO3-  NO2-, NH3, N2, NH2OH, NO
NO2 + sulphanilamine / N-napthylethylenediamine
hydrochloride
 chất có màu hồng

• ONPG: Trong quá trình thủy phân, nhờ tác dụng của
enzym β-galactosidase, ONPG tách thành hai phần cặn là
galactose và o-nitrophenol. ONPG là một hợp chất không
màu: O-nitrophenol có màu vàng, cung cấp bằng chứng
trực quan về sự thủy phân.
• Sinh Urease: khả năng VSV phân giải urease tạo ra 2
phân tử amoniac do tác dụng của enzyme này làm kiềm
hóa môi trường.
(NH2)2CO + H2O  2NH3 + CO2 => tăng pH môi
trường => đỏ phenol

• Phenylalanine deaminase: Môi trường Phenylalanin

deaminase kiểm tra khả năng sản xuất enzyme deaminase
của một sinh vật. Enzyme này loại bỏ nhóm amin khỏi
axit amin phenylalanin và giải phóng nhóm amin dưới
dạng amoniac tự do. Kết quả của phản ứng này, axit
phenylpyruvic cũng được tạo ra.

• Sử dụng Citrate: trong môi trường có chứa muối

amonium vô cơ, các VSV có khả năng sử dụng Citrate
làm nguồn C duy nhất thì có khả năng sử dụng muối
 amonium làm nguồn N và sinh NH3 làm môi trường trở
nên kiềm hóa. Trong môi trường có bromthymol blue -
chất chỉ thị pH, làm môi trường chuyển từ màu xanh lục
sang xanh dương.

• Thủy giải esculine: xác định khả năng thủy giải

glycoside esculine thành glucose và esculetine của 1 số
vi khuẩn khi có sự hiện diện của muối mật. Esculine là
hợp chất nhân tạo và Esculetine được phóng thích phản
ứng với tạo thành phức hợp màu đen.

• Sinh Hydosulfite: xác định khả năng VSV có khả năng

sinh H2S từ các acid amin chứa S tạo chất kết tủa màu
đen, được nhận biết từ các ion sắt, chì.

• Sinh Indol: Vi khuẩn có enzyme tryptophanase có khả

năng thủy phân acid amin tryptophan sinh indol, acid
pyruvic và NH3+. Indol sinh ra sẽ kết hợp với nhóm
(CHO) của p-dimethylaminobenzaldehyde có trong
thuốc thử Kovac hình thành nên phức hợp màu đỏ trên
bề mặt của dung dịch. Acetoin sẽ được tạo ra trong điều
kiện yếm khí hoàn toàn.

• Sử dụng Malonate: phát hiện các VSV khả năng sử

dụng sodium malonate làm nguồn Carbon. Khi vi khuẩn
sử dụng malonate sẽ sinh ra phản ứng kiềm, làm biến đổi
màu môi trường. Khi vi sinh vật phân hủy được malonate
thì cũng phân hủy được các nguồn đạm vô cơ khác, tạo
sản phẩm kiềm, làm tăng pH môi trường.
 • Lysin decarboxylase: Sử dụng để phát hiện vi khuẩn
sinh các ezyme decarboxylase, các enzyme này tương tác
với các amino acid có gốc carboxyl (-COOH) ở cuối, tạo
thành amine hay diamine và carbon dioxide (CO2). Các
sản phẩm tạo ra làm tăng pH môi trường, đổi màu chất
chỉ thị.

Voges- Proskauer: xác định VSV tạo sản phẩm trung gian
(acetoin) trong quá trình lên men glucose

Tại sao môi trường di động? Các vi khuẩn không di động là

do không có lông roi, chỉ phát triển ở trong đường cấy và
xung quanh môi trường trong. Các vi sinh vật di động, đã sử
dụng lông roi để di chuyển ra ngoài của đường cấy và xuất
hiện mờ khói trong môi trường. Lượng thạch trong môi
trường thấp làm cho môi trường không lỏng, không cứng để
cho phép phát hiện di động tốt nhất.